CN105132556B - 一种快速检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的方法及引物组合物 - Google Patents

一种快速检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的方法及引物组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN105132556B
CN105132556B CN201510570028.3A CN201510570028A CN105132556B CN 105132556 B CN105132556 B CN 105132556B CN 201510570028 A CN201510570028 A CN 201510570028A CN 105132556 B CN105132556 B CN 105132556B
Authority
CN
China
Prior art keywords
qoi
pathogen
botrytis cinerea
bactericidal agent
series bactericidal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510570028.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105132556A (zh
Inventor
段亚冰
周明国
陈长军
杨莹
王建新
张晓柯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Agricultural University
Priority to CN201510570028.3A priority Critical patent/CN105132556B/zh
Publication of CN105132556A publication Critical patent/CN105132556A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105132556B publication Critical patent/CN105132556B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于环介导恒温扩增技术快速检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的方法及引物组合物。该LAMP检测引物组合物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3组成。本发明的检测方法简便易行、实用性好、灵敏度高、特异性强、准确性高、实现了恒温扩增，为灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的检测提供了新的技术平台，能够对灰葡萄孢菌的QoI类杀菌剂抗性群体进行监测，及时了解抗性群体发展动态。本发明为作物灰霉病的抗性治理和对减少农药的环境污染、降低农业生产成本也具有重要的现实意义。

Description

一种快速检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的方法及引物 组合物
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及基于环介导恒温扩增技术检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性基因型G143A菌株的方法及引物组合物；可用于灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性群体发展的动态监测与抗性风险评估，为作物灰霉病的抗性预警、抗性治理及合理用药提供科学指导。
背景技术
由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病，是一种重要的世界性病害。该病害寄主广泛，可侵染235余种植物，在我国各地均有发生，它不仅侵染果实，也侵染茎、叶、花，还会引起大棚蔬菜上的果实腐烂，可造成产量损失20-30％，局部减产达到70％以上，严重时甚至是绝收，从而造成严重的经济损失。由于缺少有效的抗灰霉病品种，灰葡萄孢菌寄主专化性弱、产孢量大、传播速度快、极易产生遗传变异性，因此，目前灰霉病的防治仍以化学防治为主。该方法见效快，防效高，操作简便，能有效的减少灰霉病的发生与发展，降低经济损失，成为防控该病害的关键措施之一。但是随着单一杀菌剂使用年限的增长、药剂使用不规范及药剂剂量的增大，田间抗性菌株也不断出现，且呈现出逐年增加的趋势。根据国内外研究报道，灰葡萄孢菌已对很多常用杀菌剂产生了抗性，如苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、苯胺基嘧啶类、N-苯基氨基甲酸酯类、甲氧基丙烯酸酯类(QoIs)和琥珀酸脱氢酶类(SDHIs)等杀菌剂。随着灰霉病抗性问题日益突出，灰霉病的抗药性监测对抗性流行性预警及田间合理用药具有重要指导作用。检测或监测灰葡萄孢菌对杀菌剂的抗药性，通常是通过单孢分离菌株后采用菌丝生长法、孢子萌发法及微孔板法，然而这些传统的检测方法检测周期较长，从分离到鉴定长达1周，检测效率低，且在病原菌培养过程中存在杂菌污染，给实验结果带来误差；同时，还需投入大量的人力资源，增加检测成本。
近年来，随着核酸相关分子检测技术的发展，PCR技术为植物病原菌的抗药性检测提供了快速、灵敏、准确的优势，但是检测需要昂贵的实验仪器及繁琐的电泳过程，检测时间长，检测成本高昂等，不能满足经济高效检测的需求，并且在鉴定过程中还需要接触大量有毒有害试剂，对实验操作人员存在较大的安全隐患。因此，开发对植物病原菌抗药性检测的新技术已迫在眉睫。
环介导恒温扩增反应(LAMP)是日本学者Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，广泛应用于动物、植物等疾病的基因诊断。该技术原理是：利用一套(4种)特异性引物，在一种高活性链置换DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围30-80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增出产物)时为紫色，阳性(有产物扩增)时为天蓝色。LAMP方法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪、凝胶成像系统等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，极适于病原突变基因型的快速鉴定及检测。
已有研究表明，细胞色素b(cyt b)第143位是大多数病原体Qo抑制剂的一个结合位点。由于灰葡萄孢菌cty b基因存在结构多样性，在第143/144位氨基酸之间有内含子插入，也有无内含子插入的结构。其中，敏感菌株在这两种结构中均存在，抗性菌株仅出现在第143/144位氨基酸之间均没有内含子插入的结构中。在灰葡萄孢菌中，其对QoI类杀菌剂的抗性主要是通过对病原菌进行单基因突变，将cyt b基因第143位甘氨酸(G)变为丙氨酸(A)后，使得对QoI类杀菌剂表现出高抗。目前，这也是在灰葡萄孢菌中报道的唯一的QoI类杀菌剂抗性基因型。
本发明中，依据灰葡萄孢菌cyt b基因第143位氨基酸突变基因型(GGT→GCT)，基于环介导恒温扩增技术(LAMP)建立了灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的快速分子检测技术。该检测技术具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能大大提高检测效率，对灰霉病的抗药性检测、抗药性流行预警具有重要的现实意义。然而，经检索目前国内外尚未有灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP快速分子检测的相关报道。
发明内容
发明目的：针对已有灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性鉴定方法中存在费时、费力、成本高、准确性低等缺点及PCR检测技术需要昂贵的热循环仪器和繁琐的电泳操作过程，无法达到快速检测的需要。本发明的目的是提供一种灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测引物组合物及基于LAMP技术提供一种快速分子检测方法，该方法具有检测周期短、准确性和灵敏度高、肉眼可以直接观察检测结果等诸多优点。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测引物组合物：有正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3组成；各引物序列具体如下：
FIP：5’-CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’；
BIP：5’-TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTTAATGGCA-3’；
F3：5’-GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’；
B3：5’-GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。
所述的LAMP检测引物组合物在检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性中的应用。
一种检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测试剂盒：包括1mL检测溶液，所述的检测溶液包括：1.2μM正向内引物FIP，1.2μM反向内引物BIP，0.3μM正向外引物F3，0.3μM反向外引物B3，60μL 10×ThermoPol Buffer，1.5mM MgCl2，1.0mM dNTPs，0.2M甜菜碱，1.5mM羟基溴酚蓝(HNB)，160U Bst DNA聚合酶，加入无菌超纯水制备得到；其中，各引物序列如下：
FIP：5’-CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’；
BIP：5’-TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTAATGGCA-3’；
F3：5’-GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’；
B3：5’-GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。
所述的灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测试剂盒在检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性中的应用。
一种检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测方法：包括提取待检灰葡萄孢菌的DNA，以提取的DNA为模板，利用LAMP检测引物组合物或LAMP检测试剂盒进行LAMP扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下观察结果，若存在梯状条带，则证明所检测的灰葡萄孢菌为QoI类杀菌剂抗性菌株；若无梯状条带，则证明所检测灰葡萄孢菌为QoI类杀菌剂敏感菌株；或观察LAMP反应溶液颜色变化，若为天蓝色，判定为QoI类杀菌剂抗性菌株；若为紫色，判定为QoI类杀菌剂敏感菌株。
所述的检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测方法：提取待检灰葡萄孢菌的DNA，取1μL DNA溶液，加入9μL试剂盒中的检测溶液进行LAMP，LAMP反应参数为59-61℃60min，80℃10min。
本发明的检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测方法，包括提取待检灰葡萄孢菌的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的LAMP引物组合物进行LAMP；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下观察结果(羟基溴酚蓝不会影响电泳结果)，若存在梯状条带，所检测的灰葡萄孢菌为QoI类杀菌剂抗性菌株；若无梯状条带，则证明所检测灰葡萄孢菌为QoI类杀菌剂敏感菌株。羟基溴酚蓝(HNB)是Mg2+的滴定剂，其颜色随溶液pH变化而改变，因此可以通过监测LAMP反应体系中Mg2+浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg2+与LAMP反应的副产物P2O7 4-结合产生大量沉淀，溶液中Mg2+浓度降低，pH发生变化，从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断是否为灰葡萄孢菌的QoI类杀菌剂抗性菌株：天蓝色表示检测为阳性，是灰葡萄孢菌的QoI类杀菌剂抗性菌株；紫色表示检测结果为阴性，是灰葡萄孢菌的QoI类杀菌剂敏感菌株。
本发明的关键性技术之一是根据灰葡萄孢菌cyt b基因第143位氨基酸密码子GGT(Gly)→GCT(Ala)的突变来设计和优选出的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证能鉴定出灰葡萄孢菌的QoI类杀菌剂抗性基因型G143A的特异性引物序列，本发明分别选取灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂的敏感菌株、抗性基因型G143A菌株、核盘菌和禾谷镰刀菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株的DNA。具体方法如下：取少量菌丝，加500μL 2％CTAB提取液在球磨仪中研磨2min，加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀后，12000rpm离心5min；取上清于新离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，12000rpm离心5min；弃上清，沉淀用70％酒精洗涤，风干，加适量无菌蒸馏水溶解沉淀，4℃保存备用。该DNA提取方法在30min内即可提取到菌丝中的DNA。
当LAMP进行反应扩增时，产生大量的焦磷酸镁白色沉淀导致反应液的浊度上升，通过HNB的显色反应结果所示，灰葡萄孢菌的QoI类杀菌剂抗性菌株反应管均为天蓝色，其为阳性结果，而灰葡萄孢菌的QoI类杀菌剂敏感菌株、其它抗性基因型和其它病原菌的抗性基因型等阴性对照反应管均为紫色，为阴性结果，证明设计和优选的LAMP引物组合物具有特异性。同时，反应产物经3％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察扩增的反应产物，灰葡萄孢菌的QoI类杀菌剂抗性菌株出现了典型的梯状条带，而其它阴性对照无梯状条带。这说明该LAMP引物组合物可被用于灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性菌株快速可靠的试剂盒鉴定，为灰葡萄孢菌的抗性监测及抗性评估提供理论基础和技术支撑，对我国作物灰霉病的发生流行和抗性治理具有重要的理论指导意义。
本发明提供的快速检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是：
1、简便易行：本发明提供的检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP方法克服了现有检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，不能实现快速检测的问题。本发明在59～61℃的任一等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性菌株，不需要复杂和昂贵的仪器，能较好满足对抗性菌株的现场检测。
2、实用性好：PCR检测方法需要进行凝胶电泳，很容易造成产物扩散，成为实验室气凝胶污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(EB)有毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，可以直接通过颜色变化即可直接判断结果，省去了昂贵的仪器设备及繁琐的电泳过程，增加了在农业生产中抗性监测的应用价值。
3、恒温扩增：本发明提供的检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP方法，不像PCR法必须要热循环仪，这样就摆脱了对热循环仪的依赖，只要有稳定的热源LAMP反应就可以发生，极大的扩展了LAMP使用的范围，LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。
4、灵敏度高：将构建的质粒载体稀释成不同的浓度，作为模板，分别用LAMP法和PCR法进行灵敏度检测，本发明提供的检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP方法检测下限为104拷贝数，是普通PCR的100倍；
5、特异性强：本发明在设计和优选引物时，对灰葡萄孢菌cyt b基因的143位的突变位点上尝试了多种碱基的错配，最终优选出一套能特异性鉴定灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP引物组合物，该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之降低；
6、准确性高：该方法几乎不受反应混合液中存在的大量外源DNA和杂质的影响，不需要从样本中纯化DNA，可直接利用发病组织提取DNA进行快速检测，大大提高检测准确度；
7、本发明为灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的检测提供了新的技术平台，可用于灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的快速检测，是国内外首次利用LAMP技术检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性菌株，这种方法简便快捷，对抗性菌株的准确诊断、及时了解抗性群体发展动态、指导科学用药、降低成本及减少环境污染具有重要的现实意义。
附图说明
图1是灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性检测的LAMP反应温度优化颜色显色图。
图2是灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性检测的LAMP反应温度优化凝胶电泳图。
图3是灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性检测的LAMP反应时间优化颜色显色图。
图4是灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性检测的LAMP反应时间优化凝胶电泳图。
图5是灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性检测的LAMP特异性颜色显色图。其中，1：灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂的敏感菌株BT3-17；2-3：野生抗性菌株BT13-15和NJ5-1；4：灰葡萄孢菌对SDH类杀菌剂的抗性菌株B29；5：核盘菌HA61；6：禾谷镰刀菌2021；7：阴性对照ddH2O。
图6是灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性检测的LAMP特异性凝胶电泳图。其中M为DNAMarker；1：灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂的敏感菌株BT3-17；2-3：野生抗性菌株BT13-15和NJ5-1；4：灰葡萄孢菌对SDH类杀菌剂的抗性菌株B29；5：核盘菌HA61；6：禾谷镰刀菌2021；7：阴性对照ddH2O。
图7是灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性检测的LAMP重复性颜色显色图。其中，1为灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂敏感菌株，2-14均为灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性菌株。
图8是灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性检测的LAMP重复性凝胶电泳图。其中，M为DNA Marker；1为灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂敏感菌株，2-14均为灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性菌株。
具体实施方式
实施例1 LAMP反应引物组合物的特异性实验
为了验证LAMP反应引物组合物的特异性，以灰葡萄孢菌cyt b基因(AB262969.1)第143位氨基酸密码子GGT(Gly)→GCT(Ala)的突变为依据，设计LAMP引物，其突变位点位于正向内引物FIP的3’端，在突变位点上下游各3个碱基间进行任一或任二碱基进行错配突变，共设计7套LAMP引物，以灰葡萄孢菌敏感菌株和灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性基因型G143A菌株的DNA为模板进行LAMP实验，优选出能特异性检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP引物组合物。
各引物序列具体如下：
FIP：5’-CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’；
BIP：5’-TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTAATGGCA-3’；
F3：5’-GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’；
B3：5’-GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。
其中，在正向内引物FIP的3’端碱基中，加粗的“C”碱基为灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性基因型G143A的点突变碱基。
实施例2 LAMP反应体系及检测试剂盒体系优化
为了节省鉴定成本，保证该鉴定方法的稳定性和可靠性，对反应体系中Bst DNA聚合酶(8U/μL)(0.8-4.0U)、Mg2+(25mM)浓度(0.6-2.0μL)、引物FIP/BIP(40μM)及F3/B3(10μM)浓度(0.1-0.5μL)，甜菜碱(8M)浓度(0.4-2.0μL)、HNB(2.5mM)浓度(0.4-1.2μL)进行了优化，确定了试剂盒中各成分的最佳体系(1mL检测溶液)为：包括1mL检测溶液，所述的检测溶液包括：1.2μM正向内引物FIP，1.2μM反向内引物BIP，0.3μM正向外引物F3，0.3μM反向外引物B3，60μL 10×ThermoPol Buffer，1.5mM MgCl2，1.0mM dNTPs，0.2M甜菜碱，1.5mM羟基溴酚蓝(HNB)，160U Bst DNA聚合酶，加入无菌超纯水制备得到，100次包装，低温运输，-20℃保存，有效期1年。
其中各引物序列具体如下：
FIP：5’-CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’；
BIP：5’-TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTAATGGCA-3’；
F3：5’-GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’；
B3：5’-GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。
实施例3 LAMP反应参数优化
为了得到最适的反应温度和时间，保证该检测方法的高效性，当时间设为60min，对反应温度52-68℃进行优化；当温度设为60℃，对反应时间15-120min进行优化；经过观察颜色变化及凝胶电泳梯状条带，得出在反应温度为59-61℃(图1，图2)和反应时间为45～120min(图3，图4)时均能实现LAMP扩增。
实施例4 LAMP反应特异性试验
以灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂的敏感菌株BT3-17、野生抗性基因型G143A菌株BT13-15和NJ5-1、灰葡萄孢菌SDHB_H272R菌株B29、核盘菌HA61、禾谷镰刀菌2021等不同抗性基因型及病原菌为供试材料，进行LAMP反应。取上述供试菌株的DNA溶液1μL，加入10μL实施例2制备的检测溶液进行LAMP反应，反应程序是60℃60min。结果显示基于反应体系颜色反应作为结果判定标准，当DNA模板为灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性菌株时，呈现天蓝色；当模板为灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂非抗性菌株时，呈现紫色(图5)；同时用凝胶成像系统进行检测时，阳性出现梯状DNA条带，阴性无条带(图6)。
实施例5 LAMP反应灵敏度试验
为了确定LAMP反应的检测下限，将灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性基因型G143A菌株的含有第143位突变位点的DNA片段克隆至载体pEASY-T3上，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子，提取质粒后，测定其浓度，计算拷贝数，以10倍梯度稀释作为模板。分别取10倍稀释后的各浓度DNA稀释液1μL作为模板进行PCR扩增，同时以上述稀释液1μL作为模板，加入9μL实例2制备的检测溶液进行LAMP扩增，反应程序为60℃60min。HNB显色反应表明LAMP反应的最低检测下限为104拷贝数；同时分别取PCR和LAMP扩增产物3μL上样，在3％琼脂糖凝胶上电泳，结果显示LAMP的检测下限是普通PCR的100倍。
实施例6 LAMP反应重复性试验
为了测定LAMP的稳定性和重复性，本发明对经过测序验证的13个灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性菌株的基因组DNA为模板进行LAMP检测，以野生型作为阴性对照。取上述供试菌株的DNA溶液1μL，加入9μL实施例2制备的检测溶液进行LAMP反应，反应程序是60℃60min。结果显示基于反应体系颜色反应作为结果判定标准，当DNA模板为灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性菌株时，呈现天蓝色；当模板为灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂非抗性菌株时，呈现紫色(图7)；同时用凝胶成像系统进行检测时，阳性出现梯状DNA条带，阴性无条带(图8)。上述结果表明该鉴定方法结果可靠，重复性好。
实施例7从田间采集的灰葡萄孢菌菌株中检测对QoI类杀菌剂的抗性菌株
实施例2中的检测试剂盒用于检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的方法，包括：
1)田间灰葡萄孢菌的采集与分离。
2)采用CTAB法提取分离菌株的DNA，4℃保存备用，用于LAMP扩增的模板。
3)LAMP检测：包括：灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性基因型G143A的检测：取1μLDNA溶液，加入9μL的检测溶液进行LAMP反应，反应程序是60℃60min。以HNB作为反应指示剂，扩增结束后LAMP反应体系的颜色呈现天蓝色，以此判断田间采集的菌株为QoI类杀菌剂抗性菌株。

Claims (2)

1.一种用于检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测引物组合物：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3和反向外引物B3组成；各引物序列具体如下：
FIP：5’-CCAATTCATGGTACAGCACTCATGCAAATGTCACTGTGAGC-3’；
BIP：5’-TTAACAACAGATTGTTTAACGATGCTACGTATTTTGCAATTTTTTAATGGCA-3’；
F3：5’-GTTTGTATTTTGTATGTTCTGCC-3’；
B3：5’-GAAAGATATTCATTATTGTCTGGTT-3’。
2.一种检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的LAMP检测方法，步骤为：
(1)运用权利要求1所述的两对特异性引物对待测样品的基因组DNA进行LAMP恒温扩增，反应体系为10μL，包括1.2μM正向内引物FIP，1.2μM反向内引物BIP，0.3μM正向外引物F3，0.3μM反向外引物B3，0.6μL 10×ThermoPol Buffer，1.5mM MgCl2，1.0mM dNTPs，0.2M甜菜碱，1.5mM羟基溴酚蓝(HNB)，1.6U Bst DNA聚合酶，加入无菌超纯水；反应参数为59-61℃ 60min，80℃ 10min；
(2)对上述LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下观察结果，若存在梯状条带，则证明所检测的灰葡萄孢菌为QoI类杀菌剂抗性菌株；若无梯状条带，则证明所检测灰葡萄孢菌为QoI类杀菌剂敏感菌株；或观察LAMP反应溶液颜色变化，若为天蓝色，判定为QoI类杀菌剂抗性菌株；若为紫色，判定为QoI类杀菌剂敏感菌株。
CN201510570028.3A 2015-09-08 2015-09-08 一种快速检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的方法及引物组合物 Active CN105132556B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510570028.3A CN105132556B (zh) 2015-09-08 2015-09-08 一种快速检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的方法及引物组合物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510570028.3A CN105132556B (zh) 2015-09-08 2015-09-08 一种快速检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的方法及引物组合物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105132556A CN105132556A (zh) 2015-12-09
CN105132556B true CN105132556B (zh) 2017-12-12

Family

ID=54718121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510570028.3A Active CN105132556B (zh) 2015-09-08 2015-09-08 一种快速检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的方法及引物组合物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105132556B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106755538A (zh) * 2017-03-03 2017-05-31 浙江农林大学 灰霉病菌对QoIs杀菌剂抗性风险的快速评定方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101760554A (zh) * 2009-12-18 2010-06-30 浙江大学 检测灰霉病菌群体对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性频率的引物序列及方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101760554A (zh) * 2009-12-18 2010-06-30 浙江大学 检测灰霉病菌群体对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性频率的引物序列及方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development and Evaluation of a Novel and Rapid Detection Assay for Botrytis cinerea Based on Loop-Mediated Isothermal Amplification;Duan et al;《Plos One》;20141031;第9卷(第10期);e111094,1-9 *
Evaluation of the incidence of G143A mutation and cytb intron presence in the cytochrome bc-1 gene conferring QoI resistance in Botrytis cinerea populations from several hosts;Samuel et al;《Pest Management Science》;20110623;第67卷;1029-1036 *
甲氧丙烯酸酯类杀菌剂的研究进展;骆焱平 等;《中国科技论文在线》;20060831;第1卷(第1期);20-26 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105132556A (zh) 2015-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106399490B (zh) 检测植原体的lamp引物组及其试剂盒和应用
CN104164491A (zh) 用于幽门螺杆菌23S rDNA基因突变分型的ARMS-qPCR的检测方法及试剂盒
CN108220474A (zh) 一种禾谷镰刀菌的lamp检测引物及其应用
CN105331714A (zh) 一种荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速检测方法
CN103497998A (zh) 枣疯病植原体环介导等温扩增快速检测方法
CN106381340B (zh) 番茄灰霉病菌lamp检测引物、检测试剂盒及其应用
CN104372099B (zh) 一种恶疫霉菌的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法
JP5522820B2 (ja) イチゴ重要病害の病原菌検出方法および検出用プライマー
CN105132556B (zh) 一种快速检测灰葡萄孢菌对QoI类杀菌剂抗性的方法及引物组合物
CN104313177B (zh) 一种快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型f200y菌株的分子检测方法
CN105063187B (zh) 一种快速检测灰葡萄孢菌对sdhi类杀菌剂抗性的方法及引物组合物
CN105603067A (zh) 基于多重pcr快速鉴定我国外来入侵福寿螺的特异引物对及其应用
CN107828905A (zh) 烟草野火病菌lamp检测引物及检测方法
CN102329864A (zh) 一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光pcr试剂盒
CN104293971B (zh) 一种基于lamp技术对多菌灵高抗灰葡萄孢菌株的快速检测方法
CN116516058A (zh) 可视化检测大豆疫霉菌的方法及试剂盒
CN103773867A (zh) 转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
CN103614474A (zh) 花生青枯病菌环介导等温扩增检测引物及检测方法
CN103451294B (zh) 黄曲霉菌lamp检测引物及其可视化检测方法
CN102399897B (zh) 水产品中金黄色葡萄球菌的双重pcr-dhplc检测方法
CN108315391A (zh) 一种用于石榴干腐病菌lamp快速检测的引物组合物及其应用
CN104388577A (zh) 一种检测梨火疫病菌的环介导恒温扩增引物及试剂盒
CN101343664B (zh) 一种快速检测转基因玉米bt11的方法
CN104059909A (zh) 马铃薯金线虫scar标记和lamp快速检测方法及应用
CN106884048A (zh) 一种检测鱼类海豚链球菌荧光pcr试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant