CN110607390A

CN110607390A - 一种鉴定枇杷黄肉性状基因纯合或杂合类型的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN110607390A
Application number: CN201911061160.6A
Authority: CN
Inventors: 杨向晖; 邹士成; 林顺权; 何业华; 赵崇斌; 王曼; 白昀鹭
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-11-01
Filing date: 2019-11-01
Publication date: 2019-12-24

Abstract

本发明公开了一种鉴定枇杷黄肉性状基因纯合或杂合类型的分子标记及其应用。当枇杷品种黄肉性状基因型为纯合时，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；当枇杷品种黄肉性状基因型为杂合时，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示。通过本发明所提供的分子标记可预先对枇杷品种黄肉性状基因型进行准确鉴定，针对白肉枇杷新品种选育，可在杂交亲本选择选配时，选择杂合类型与杂合类型或杂合类型与白肉类型进行杂交，其后代群体中就一定会出现白肉性状，进而可能获得白肉枇杷新品种，提高育种效率，降低育种成本。

Description

一种鉴定枇杷黄肉性状基因纯合或杂合类型的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及果树遗传育种技术领域，具体地，涉及一种鉴定枇杷黄肉性状基因纯合或杂合类型的分子标记及其应用。

背景技术

枇杷(Erobotrya Japonic Lindl.)原产于中国，已有2000多年的栽培历史，是我国重要的早春水果之一。我国枇杷的栽培面积和总产量均居世界第一，主要栽培区集中在长江流域及长江以南的各省，其中浙江、福建和四川的栽培面积较大，先后成为我国枇杷行业的领跑者。20世纪90年代以来，黄金松等首先利用杂交育种技术育成了中国首个杂交枇杷品种‘早钟6号’，并由此建立了枇杷有性杂交育种技术体系，而杂交育种也成为枇杷新品种选育的有效手段，因此，开展枇杷的性状遗传研究，可为杂交亲本的选配及后代选择提供理论依据。

枇杷果实的颜色是一个重要经济性状，依据果肉颜色的不同，大致可分为两类：黄肉枇杷和白肉枇杷。其中黄肉枇杷果实较大，抗逆性强，但果肉粗糙，口感较差；白肉枇杷果实较小，抗逆性弱，但果肉细腻，口感较佳。因此，消费者往往更喜欢白肉枇杷。从育种的角度来看，如何快速地选育白肉枇杷是一个重要的研究方向。目前若要获得白肉大果枇杷新品种，在选择亲本材料上，多选择大果黄肉品种与大果黄肉品种杂交，或大果黄肉品种与白肉品种杂交，希望在它们的后代中有白肉品种出现，但事实是这样的杂交组合有可能后代中根本无白肉性状的出现。因此，如果能在杂交工作进行之前就判断后代群体中是否会出现白肉性状，就能极大提高选育种效率。

分子标记辅助育种(MAS)可以缩短育种周期和提高育种效率，广泛应用于许多作物。目前，DNA标记广泛用于枇杷各项研究，如评估遗传多样性、遗传连锁图谱和种质鉴定，对枇杷果实颜色的分子标记研究较少，仅报道过利用枇杷白肉品种为研究材料，获得的部分特异标记可以区分‘贵妃’、‘新白1号’和‘新白8号’。而针对枇杷黄肉品种，目前尚未见有能区分黄肉枇杷的后代果实颜色性状遗传倾向的分子标记报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种鉴定枇杷黄肉性状基因纯合或杂合类型的分子标记。在杂交育种中，通过该分子标记可准确鉴定亲本枇杷品种黄肉性状的基因型，进而判断其杂交后代果肉颜色的类型。

本发明的另一目的在于提供上述分子标记在鉴定枇杷果肉颜色遗传倾向中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明以黄肉品种‘早钟6号’、‘梅花霞’和白肉品种‘白玉’为亲本，通过正反交和自交，获得了9个杂交后代群体(1166株)，利用枇杷果肉颜色特异分子标记对杂种后代个体果实颜色进行了鉴定，并对其遗传倾向进行分析，旨在探索枇杷果实颜色性状的遗传规律，为白肉枇杷新品种杂交育种亲本的选配和杂种后代选择提供参考依据。研究结果表明，枇杷果实颜色可能受到一对呈显隐关系的基因控制，其中黄肉性状为显性，其基因型可记为AA或Aa，其DNA分子标记分别表现为1013bp或1013bp和319bp；白肉性状为隐性，基因型为aa，其DNA分标记为319bp。

通过本发明的分子标记可对枇杷品种黄肉性状的基因型进行准确鉴定，因此，本发明请求保护一种鉴定枇杷黄肉性状基因纯合或杂合类型的分子标记，当枇杷品种黄肉性状基因型为纯合时，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；当枇杷品种黄肉性状基因型为杂合时，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示。

同时，上述分子标记在鉴定枇杷果肉颜色遗传倾向中的应用亦在本发明保护范围内。

优选地，利用上述分子标记鉴定枇杷果肉颜色遗传倾向的方法，包括如下步骤：

S1.提取枇杷样本基因组DNA；

S2.对步骤S1基因组DNA进行PCR扩增；

S3.电泳结果判断：若扩增产物仅为1013bp的电泳条带，则该枇杷样本基因型为纯合，果肉颜色为黄色，当其与黄肉纯合类型、或与黄肉杂合类型、或与白肉类型的枇杷进行杂交，其后代果实颜色均为黄色；

若扩增产物为1013bp和319bp的电泳条带，则该枇杷样本基因型为杂合，果肉颜色为黄色，当其与黄肉杂合类型进行杂交，其后代果实颜色为黄色或白色，黄肉与白肉分离比为3：1；当其与白肉类型进行杂交，其后代果实颜色为黄色或白色，黄肉与白肉分离比分别为1：1；

若扩增产物仅为319bp的电泳条带，则该枇杷样本基因型为纯合，果肉颜色为白色，当其与黄肉纯合类型进行杂交，其后代果实颜色均为黄色；当其与黄肉杂合类型杂交，其后代果实颜色为黄色或白色，黄肉与白肉分离比为1：1；当其与白肉类型杂交，其后代果实颜色均为白色。

其中，所述1013bp的电泳条带的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述319bp的电泳条带的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述PCR反应体系为Taq Mix 10μL，50ng/mL DNA模板2μL，10μmol/LPCR引物各0.5μL，双蒸水7μL。

优选地，所述PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

通过本发明所提供的分子标记可预先对枇杷品种黄肉性状基因型进行准确鉴定，针对白肉枇杷新品种选育，可在杂交亲本选择选配时，选择杂合类型与杂合类型或杂合类型与白肉类型进行杂交，其后代群体中就一定会出现白肉性状，进而可能获得白肉枇杷新品种，提高育种效率，降低育种成本，为白肉枇杷新品种杂交育种亲本的选择与选配提供参考依据。

附图说明

图1为所选亲本特异PCR扩增式样。其中，泳道M为Marker；泳道1为‘早钟6号’；泳道2为‘梅花霞’；泳道3为‘白玉’。

图2为RAPD分子标记引物的筛选结果。其中，泳道M为Marker；泳道1为‘早钟6号’；泳道2为‘梅花霞’；泳道3为‘白玉’。

图3为SRAP分子标记引物的筛选结果。其中，泳道M为Marker；泳道1为‘早钟6号’；泳道2为‘梅花霞’；泳道3为‘白玉’。

图4为9个杂交(自交)组合后代特异PCR扩增图谱。其中，泳道M为Marker；a为‘梅花霞’×‘白玉’杂交后代群体；b为‘白玉’×‘梅花霞’杂交后代群体；c为‘早钟6号’×‘白玉’杂交后代群体；d为‘白玉’×‘早钟6号’杂交后代群体；e为‘梅花霞’×‘早钟6号’杂交后代群体；f为‘早钟6号’×‘梅花霞’杂交后代群体；g为‘梅花霞’自交后代群体；h为‘白玉’自交后代群体；i为‘早钟6号’自交后代群体。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例

一、材料与方法

1、亲本的选择与选配

利用枇杷果实颜色特异的分子标记，可以准确地区分黄、白肉枇杷品种。不同黄肉枇杷品种中有两种不同扩增类型，一种类型可扩增出两条片段(1013bp和319bp)，另一种是只能扩增一条片段(1013bp)，而所有的白肉枇杷品种中只能扩增出一条片段(319bp)。因此，本发明选择两种类型的黄肉品种‘梅花’、‘早钟6号’和白肉品种‘白玉’进行正反交和自交，创建了9个杂交(自交)群体，分别是：‘梅花霞’×‘白玉’、‘白玉’×‘梅花霞’、‘早钟6号’×‘白玉’、‘白玉’×‘早钟6号’、‘梅花霞’×‘早钟6号’、‘早钟6号’×‘梅花霞’、‘梅花霞’‘白玉’‘早钟6号’所有材料均取自于华南农业大学枇杷种质资源圃。

所选亲本特异PCR扩增式样如图1所示。

2、方法

(1)田间杂交

2017～2018年创制了杂交(自交)群体，田间杂交的工作如下：杂交选取枇杷盛花期含苞待放的花蕾，每穗留8～10枚花朵，小心去除雄蕊，将收集的父本的花粉授在母本花朵的柱头上，授粉后立刻用双层纸袋隔离，待座果稳定后去掉一层纸袋，保留里面一层纸袋直至果实成熟。田间杂交工作在华南农业大学枇杷种质资源圃完成。

(2)真假杂种鉴定

利用两种分子标记(SRAP和RAPD)技术，对9个组合的实生后代进行了真假杂种的鉴定。经过三次重复，筛选获得可用于真假杂种鉴定的SRAP分子标记正向引物组合4对，RAPD分子标记引物1条，如表1所示。引物筛选好后，对杂交后代进鉴定，PCR扩增产物在2.0％琼脂糖、5V·cm^-1电压下电泳。电泳结果比较杂交后代中带有父本特异清晰条带，判断为真杂种。

表1真假杂种鉴定所用SRAP和RAPD引物序列

(3)特异PCR扩增

果实颜色特异分子标记扩增体系见下表2。

表2枇杷果实颜色特异分子标记扩增体系

反应组分	组分用量/μL
		Taq Mix	10
DNA模板(50ng·mL<sup>-1</sup>)	2
		引物1(10μmol·L<sup>-1</sup>)	0.5
引物2(10μmol·L<sup>-1</sup>)	0.5
		双蒸水	7

扩增体系反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃后延伸5min，4℃保存。1.5％琼脂糖电泳检测PCR产物。

二、结果与分析

1、真假杂种引物的筛选

利用RAPD和SRAP分子标记技术对杂交后代进行真假杂种的鉴定，结果表明：在RAPD-PCR反应中，引物S232(1500bp左右)可作为‘白玉’×‘梅花霞’、‘白玉’×‘早钟6号’的杂种鉴定(图2)；而在SRAP-PCR反应中，引物me2em3(1000bp左右)可作为‘梅花霞’×‘早钟6号’的杂种鉴定；引物me6em6(750bp左右)可作为‘梅花霞’×‘白玉’的杂种鉴定；引物me8em5(2000bp左右)可作为‘早钟6号’×‘白玉’的杂种鉴定；引物me2em5(1000bp左右)可作为‘早钟6号’×‘梅花霞’的杂种鉴定(图3)。

2、杂交后代群体真杂种率

从表3可以看出，各组合的真杂率存在差异，其中组合‘白玉’×‘早钟6号’获得了最高的真杂种率，为93.75％，而组合‘早钟6号’×‘梅花霞’的真杂种率最低，为85.91％。

表3 9个杂交(自交)组合后代真杂种率

3、杂交后代群体果实颜色的分离情况

卡方测验结果表明本实验结果所测得的数据均小于理论推测值，说明本试验数据可靠。在杂交组合‘梅花霞’×‘白玉’和‘白玉’×‘梅花霞’后代分子标记类型相同，均为两条扩增片段(1013bp和319bp)，表明后代未出现果实颜色性状的分离，果肉颜色全部表现为黄肉；在杂交组合‘早钟6号’×‘白玉’和‘白玉’×‘早钟6号’后代出现两种分子标记类型，分别是1013bp和319bp或319bp；说明果肉颜色性状产生了分离，经统计枇杷果肉黄白色的分离比分别为1:0.89和1:0.87，卡方检验表明遗传分离比符合孟德尔遗传定律；在杂交组合‘梅花霞’×‘早钟6号’和‘早钟6号’×‘梅花霞’中，杂交后代分子标记类型不同，表现为两种分子标记类型(1013bp和319bp或1013bp)，表明后代个体果实为黄肉类型。

在3个自交组合中，自交组合‘梅花霞’的后代分子标记类型相同，均为单一的扩增片段(1013bp)，说明果肉颜色性状没有发生分离，全部表现为黄色；同样，‘白玉’的自交后代分子标记类型相同，为一条扩增片段(319bp)，说明果肉颜色性状没有发生分离并且均表现为白色；而‘早钟6号’自交群体后代出现了三种分子标记类型，分别为1013bp(26％)、1013bp和319bp(49％)、319bp(25％)，其果肉颜色分离比例为2.94:1，卡方检验表明其分离符合孟德尔遗传定律(图4，表4)。

表4 9个杂交(自交)后代群体分离比及卡方测验

本发明以2个不同类型的黄肉枇杷品种和1个白肉品种为亲本，创制了9个杂交(自交)组合，利用已获得的枇杷果实颜色的特异分子标记，对不同组合的1166个后代个体果实的颜色进行了早期鉴定，并对其遗传倾向进行了研究，结果表明：枇杷果实颜色可能受到一对呈显隐关系的基因控制，其中黄肉性状为显性，白肉性状为隐性；同时，针对于果实的颜色，在黄肉枇杷品种中存在基因呈显性纯合或杂合类型，其基因型可记为AA或Aa，而白肉枇杷品种基因型为aa；同时，利用特异的DNA分子标记，可进一步区分枇杷黄肉性状基因纯合或杂合状态，其中基因型为AA时，其DNA分子标记为单一扩增条带(1013bp)，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；基因型为Aa时，其DNA分子标记为两条扩增条带(1013bp和319bp)，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示，这个研究结果为杂交亲本的选择与选配，特别是为白肉枇杷新品种选育提供了理论依据。

1013bp片段核苷酸序列：

TATGAACCATTGATTAGTCTAGCCTTTTCTTGAATGTGGTCGAGATTCAGTATGATAATATAAGTATTTATTTGGCAAGACAACATTGCACATCCAAAATAATATGGTTATTGTTCATGTCTAACTAAAATTTGCTCTTTGAATTGATCATTTTAGTGCTAGGAGAGGAAGAGTATATCTCCCCCAAGATGAGCTTGCCCAAGCCGGCCTATCAGACGATGACATCTTTCGCGGGAAGGTGACTGACAAGTGGCAAAGTTTCATGAAGGGACAAATACAGAGAGCTAGGATGTTCTTTGATGAGGCTGAGAAGGGTGTCTCAGAGCTCAACTCAGCTAGTAGATGGCCAGTATGGGCATCTTTGTTGCTGTATAGGCAGATTCTAGATGTAATTGAAGCAAATGGTTATGACAATTTCACAAAAAGGGCTTATGTGGGAAAAGCAAAGAAGTTTGTATCGTTGCCTGTGGCCTATGGAAGAGCCATTATAGGACCCTCTAAATTAACTAAGCAGTTGGTGCCTAGATGAATTAGATGATATTTGAAGTCTCAATCTCTAAATTTTTAGACAAAGTCCAACTTGAAGTTGGGTCTCAAGTCGAAATATGTAAATTTTTTATACTAAATTTTTTTTAGTCAATCTTTTAATTACCTGTGTTTGGATGACGGATATAAAAGTGGTAATTAGTGGCAGAGGTTAACAGATGTGTGGTGAGAGTGGTCGCCATGGACTGGTTGATAGATGTGTCAGTGGAGGTAGAGTGTCTCCTAGTGATAAGGTGGTAGCAATTGTGGTTGTGGCATTGGCGGTGGTGATGGTTGTGGGAGGTGGTGGTGACGGTGATGGTGGATATGATTGGAATGATGGTGGCAATAGCAATGACATTGGGGGTTCATGGTAGTACTTATGGTCATGAGAGTATGGATGTTGTGGTATAGAAAACGACGATAGTGGTGAGGATGGCTGCAATGACGGTTGTGGGGATGGTGGTGGCGACTACGGTGACAATAAC

319bp片段核苷酸序列：

TATGAACCATTGATTAGTCTAGCCTTTTCTTGAATGTGGTCGAGATTCAGTATGATAATATAAGTATTTATTTGGCAAGACAACATTGCACATCCAAAATAATATGGTTATTGTTCATGTCTAACTAAAATTTGCTCTTTGAATTGATCATTTTAGTGCTAGGAGAGGAAGAGTATATCTCCCCCAAGATGAGCTTGGTTCATGGTAGTACTTATGGTCATGAGAGTATGGATGTTGTGGTATAGAAAACGACGATAGTGGTGAGGATGGCTGCAATGACGGTTGTGGGGATGGTGGTGGCGACTACGGTGACAATAAC

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种鉴定枇杷黄肉性状基因纯合或杂合类型的分子标记，其特征在于，当枇杷品种黄肉性状基因型为纯合时，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；当枇杷品种黄肉性状基因型为杂合时，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示。

2.权利要求1所述分子标记在鉴定枇杷果肉颜色遗传倾向中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取枇杷样本基因组DNA；

S2.对步骤S1基因组DNA进行PCR扩增；

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述1013bp的电泳条带的核苷酸序列如SEQID NO：1所示；所述319bp的电泳条带的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述PCR反应体系为Taq Mix 10μL，50ng/mLDNA模板2μL，10μmol/LPCR引物各0.5μL，双蒸水7μL。

6.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。