CN105087553A - 水稻抗褐飞虱QBph3和QBph4基因的分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明属于水稻分子标记制备技术领域，具体涉及同时来自抗虫导入系IR02W101的两个水稻抗褐飞虱主效基因QBph3和QBph4的分子标记，将感虫品种珍汕97与IR02W101杂交、回交和自交获得BC₁F₂各单株的基因型，结合F_2:3各家系的苗期褐飞虱抗性级别作遗传连锁分析，将IR02W101的抗性基因QBph3精细定位于第3染色体长臂标记t6和f3之间，得到共分离标记c3-14、紧密连锁标记q1和m3；将QBph4精细定位于第4染色体短臂标记p17和xc4-27之间，得到紧密连锁标记p6、p9、c4-5、xc4-7、HJ16、J417和IN156。本发明可有效检测抗虫导入系IR02W101及衍生品种中是否含有该主效基因位点。

Description

水稻抗褐飞虱QBph3和QBph4基因的分子标记

技术领域

本发明属于植物分子标记制备技术领域。具体涉及到同时来源于导入系IR02W101中两个水稻抗褐飞虱基因QBph3和QBph4紧密连锁的分子标记的制备，以及所述的分子标记在水稻褐飞虱抗性育种和品种改良上的应用。

背景技术

水稻是我国的主要粮食作物，褐飞虱是目前活跃于东南亚稻区的主要害虫。它是一种典型的刺吸式害虫，通过其口针吸食稻株韧皮部汁液，轻者引起水稻营养物质运输受阻，影响千粒重，重则引起稻株下部干枯、腐烂、倒瘫，称之为“虱烧”，导致水稻大面积减产甚至绝收。目前防治褐飞虱主要依靠化学杀虫剂，但是这种方法费时费工，且污染环境。同时，杀虫剂的过量使用还会杀死其天敌及增强抗药性，最终会引起飞虱的再次猖獗。利用水稻自身的抗性基因来培育抗虫品种是目前最为经济有效的防控褐飞虱的方法。

迄今，已经在籼稻和野生稻中共发现和报道了至少29个褐飞虱抗性基因(Wuetal.2014)。其中有14个基因(Bph1、bph2、Bph3、Bph6、Bph9、Bph12、Bph14、Bph15、Bph18、Bph19、Bph20、Bph21、Bph27和Bph28)已经应用分子标记精细定位到水稻染色体某一特定区段内。最近一个较大的进展是Bph14的克隆，该基因属于CC-NBS-LRR基因家族，编码的蛋白质与植物抗病性相关(Duetal.2009)。但是褐飞虱抗性基因的遗传基础研究依然进展缓慢，而可供育种应用的基因更是少之甚少。因此迫切需要挖掘更多的优良抗性基因，并将其导入到常规品种中以增强其褐飞虱抗性。

一般来说，野生稻中富含优良的抗性基因，特别是褐飞虱抗性基因。但是野生稻往往带有其它不良性状，且由于与栽培稻亲缘关系较远，很难与栽培稻杂交或是杂交后代种子育性较低甚至不育。因此直接利用野生稻中的抗性基因将难于操作。通过回交育种和抗性筛选将野生稻中的抗性基因导入到栽培种中，获得一系列抗性明显改良的导入系，并通过感虫亲本与导入系杂交构建F₂分离群体，结合分子标记遗传图谱来定位褐飞虱抗性基因是目前从野生稻中发掘褐飞虱抗性基因的一种有效方法。目前已利用导入系定位了很多来自野生稻的优良抗性基因，如来自于小粒野生稻的Bph20、Bph21(Rahmanetal.2009)，来自于澳洲野生稻的Bph10、Bph18(Ishiietal.1994；Jenaetal.2006)，来自于药用野生稻的Bph14、Bph15、bph11、Bph13(Huangetal.2001；Hirabayashietal.1998；Renganayakietal.2002)等。

目前，只有很少的褐飞虱抗性基因被用于水稻育种而在生产上应用。且已有证据表明单个主效抗性基因的导入并不能持久解决褐飞虱逐年爆发的问题。多个抗性基因的聚合以及轮换能够获得持久抗性，并有效地遏制褐飞虱频繁爆发。由于抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效导入或聚合多个抗褐飞虱基因以培育抗虫品种。本发明通过构建遗传群体和发展分子标记，成功发现了两个新的褐飞虱抗性基因，并开发了一系列与抗性基因紧密连锁或共分离的分子标记，借助分子标记辅助选择(Marker-assistedselection,MAS)技术可以有目的地将抗虫基因精确导入和聚合，从而高效率快速选育持久抗褐飞虱品种，有效抑制褐飞虱种群数量，节约人工和农药成本，保持水稻稳产和增产。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻抗褐飞虱主效基因新位点QBph3和QBph4的分子标记，通过实验检测与这些抗性基因位点连锁或共分离的分子标记，可以在苗期就能准确预测水稻植株的褐飞虱抗性，从而加快褐飞虱抗性水稻品种的选择。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过是筛选获得一个水稻抗褐飞虱主效基因QBph3的分子标记，它由下述之一的引物对通过PCR程序扩增获得，所述的引物对的DNA序列如下所示：

1)标记引物q1，

左端引物序列，CGGACATGGACAGTACAC，

右端引物序列，AACAAATTTCGTATAGAAAC；

2)标记引物m3，

左端引物序列，GATCTCGGTGAAACGAC，

右端引物序列，GGAGACACGAAAGAGCTGAG；

3)标记引物t6，

左端引物序列，GGATTTTCCGCGCGGAGGC，

右端引物序列，CAGTGCGGCGATTGGATG；

4)标记引物c3-14，

左端引物序列，GGCAAAATTAGACGGCACG，

右端引物序列，GAATATGCATTTTGTTTGGAG；

5)标记引物f3，

左端引物序列，GTCGTTAACCTGGAGAACAAG，

右端引物序列，CATTCGATCCGTTGCGTGTG；

申请人通过筛选在上述同一材料中获得另一个水稻抗褐飞虱主效基因QBph4的分子标记，其由下述之一的引物对通过PCR程序扩增获得，所述的引物对的DNA序列如下所示：

1)标记引物J409，

左端引物序列，GTAATATGATGTGGTTTATG，

右端引物序列，GATGATTATTCTATGGCTC；

2)标记引物p6，

左端引物序列，CCAACAGATAAGTTAGTG，

右端引物序列，CCAATATCAAAATGTGCG；

3)标记引物p9，

左端引物序列，GAATTACAGTAACTGAGAC，

右端引物序列，GGAACTCCATGAGAGGT；

4)标记引物p17，

左端引物序列，CACCAGAGATAAAAAGAGG，

右端引物序列，GGCGACATTAATTAGGCGG；

5)标记引物xc4-27，

左端引物序列，GCATAAGCGCCCTAGCC，

右端引物序列，GCTAGTTGCAGGCACGC；

6)标记引物c4-5，

左端引物序列，TTCAGATTGCACAACGCC，

右端引物序列，GCTACGTGTCACTGTTCC；

7)标记引物xc4-7，

左端引物序列，CGGCCTAATTCTAGAGTTC，

右端引物序列，TGTGACTGCATTAATAAAGG；

8)标记引物HJ16，

左端引物序列，CACATGTATTTGATCGAG，

右端引物序列，GGGATTCAGGAGTAGCGGG；

9)标记引物J417，

左端引物序列，CCATCTTCCGAATCGGC，

右端引物序列，GTCGCCGACCCCCTCCC；

10)标记引物IN156，

左端引物序列，AGGTGAAGCTGATGTGCTTG，

右端引物序列，CGATACTTATTGCAACACAC。

显然上述两个分子标记可应用于选育抗褐飞虱水稻的遗传改良中。

申请人提供了一种筛选水稻抗褐飞虱主效基因QBph3的分子标记方法，其要点是：利用上述涉及主效基因QBph3的引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测所得的扩增产物，若利用标记引物q1能扩增出134bp的DNA片段，或利用标记引物m3能扩增出85bp的DNA片段，或是利用标记引物t6能扩增出1197bp的DNA片段，或是利用标记引物c3-14能扩增出242bp的DNA片段，或是利用标记引物f3能扩增出133bp的DNA片段，均标志着水稻抗虫导入系IR02W101抗褐飞虱基因位点QBph3的存在。QBph3被精细定位在水稻第3染色体长臂t6和f3之间，与c3-14共分离，因此利用标记c3-14筛选目的基因的单株效率最高，其它标记如q1和m3均能用于筛选含有目的基因的抗褐飞虱水稻品种。

与此同时，申请人提供了另一种筛选水稻抗褐飞虱主效基因QBph4分子标记方法，其要点是：利用上述基因QBph4构建的引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测所得的扩增产物，若利用标记引物J409能扩增出137bp的DNA片段，或是利用标记引物p6能扩增出141bp的DNA片段，或是利用标记引物p9能扩增出145bp的DNA片段，或是利用标记引物p17能扩增出168bp的DNA片段，或是利用标记引物xc4-27能扩增出207bp的DNA片段，或是利用标记引物c4-5能扩增出133bp的DNA片段，或是利用标记引物xc4-7能扩增出118bp的DNA片段，或是利用标记引物HJ16能扩增出152bp的DNA片段，或是利用标记引物J417能扩增出136bp的DNA片段，或是利用标记引物IN156能扩增出173bp的DNA片段，均标志着水稻抗虫导入系IR02W101抗褐飞虱基因位点QBph4的存在。QBph4被精细定位在水稻第4染色体短臂P17和xc4-27之间，也就是说这两个标记与褐飞虱抗性基因QBph4距离最近，利用这两个标记筛选目的基因的单株可靠性最高，其它分子标记均能用于筛选该目的基因的单株。

此外，申请人还提出了利用主效基因QBph3和QBph4构建的的分子标记在水稻改良中的应用的方法，该方法在于用于筛选褐飞虱抗性水稻：在杂交分离后代中，利用上述QBph3的紧密连锁标记引物(如c3-14)扩增待检水稻的基因组DNA,并检测所得的扩增产物,若扩增产物的片段与上述检测的一致，均标志着杂交后代中存在QBph3位点；或/和通过QBph4紧密连锁标记引物(如xc4-27)扩增后代单株的DNA，若扩增产物的片段与上述检测的一致，均标志着杂交后代中存在QBph4位点。

本发明的优点在于：

(1)本发明首次在水稻抗褐飞虱导入系IR02W101中利用分子标记精细定位了两个新主效抗性基因QBph3和QBph4。

(2)本发明中与抗性基因紧密连锁或共分离的分子标记可靠性高，鉴定方便。这些分子标记都是在坚实的遗传实验结果上验证的，且引物特异性高，多态性广，可操作性强，扩增出的目标片段单一，容易检测。因此只要通过简单的实验检测这些分子标记，就可以准确预测水稻植株中褐飞虱抗性的存在与否，进而预测其褐飞虱抗性，不受环境影响，检测方便、快捷、高效。

(3)本发明可以大大提高常规育种的辅助选择效率，节约成本。常规育种特别是抗性育种中，经常是通过表型选择来筛选抗性单株用于后续的杂交或回交转育。但是水稻的褐飞虱抗性鉴定程序非常复杂，同时受到环境和人力财力的限制。比如，在抗性鉴定之前，要先准备虫源并饲养褐飞虱群体；在人工接虫前还要保证褐飞虱群体单一、生物型一致、虫龄适当一致并与秧苗同步；此外接虫后还要用纱网罩住，控制室内湿度和温度，防雨防风防天敌；最后鉴定标准大多是肉眼观察，主观性太强，可靠性就很低。因此利用常规手段进行抗性育种难度较大，成本高。然而通过分子标记检测水稻植株中的褐飞虱抗性基因位点，仅在苗期就能快速鉴定出高抗纯合基因型的单株，及时淘汰感虫单株，不仅节约生产成本，而且大大提高抗性材料的选择效率，极大地缩短水稻品种的育种周期。

附图说明

图1.本发明的总体技术路线图。

图2.亲本珍汕97B和IR02W101以及BC₁F₁和BC₁F₂的抗性分数次数频率分布图。图中标记：A，接虫10天后。B，接虫12天后。

图3.水稻品种IR02W101抗褐飞虱主效基因QBph3在第3染色体上的定位。图中标记：A，QBph3初步定位。染色体上面表示分子标记，下面的数值代表标记间的遗传距离(cM)。B和C，QBph3的精细定位。标记上面括号里的数值表示此标记与目标基因之间发生交换的重组单株的个数。n表示筛选的BC₁F₂和BC₂F₂单株数。根据重组单株的基因型和表型，QBph3最终被定位在t6和c3-14之间47kb的区域。

图4.水稻品种IR02W101抗褐飞虱主效基因QBph4在第4染色体上的定位。图中标记：A和B,QBph4初步定位。C和D,QBph4的精细定位。图标注参考图3所示，根据重组单株的基因型和表型，QBph4最终被定位在p17和xc4-27之间200kb的区域。

图5.QBph3和QBph4在珍汕97背景下的基因效应。图中标记：横坐标上的字母A代表其所对应的基因位点(QBph4和QBph3)为纯合基因型，H为杂合基因型，B为不含抗性基因。这样一共有9个基因型组合。例如HA代表QBph4基因位点为杂合，且QBph3基因位点为纯合的一种基因型。TN1为感虫对照，IR为IR02W101的简写，为抗虫对照。标准误上的字母A,B,C表示利用ducan测验，统计上多重比较分析在p值小于0.01水平上有显著差异，a,b,c,d表示在p值小于0.05水平上有显著差异。比如Aa与Bc比较，在0.01水平上表现极显著差异；Aa与Ab比较，在0.01水平上差异不显著，但在0.05水平上有显著差异。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明的总体技术路线如下：

本发明按照以下总体技术路线来进行：其包括：1)基因的初步定位；2)基因的精细定位；3)基因效应分析(其流程见图1)。

1)基因的初步定位是按照遗传学上常用的基因连锁遗传分析方法而实施的(具体参考下面的实施例1)。即先利用抗虫亲本和感虫亲本杂交得到F₁，F₁自交得到F₂，F₂经抗虫筛选后挑选抗性最好的单株再与感虫亲本回交，得到BC₁F₁，然后自交得到BC₁F₂，每个BC₁F₂单株自交而获得相应的BC₁F_2：3家系。然后利用全基因组的分子标记对BC₁F₂群体的基因型进行分析，进而利用连锁图软件绘画出针对本群体的全基因组遗传连锁图谱(见图3中A和图4中A和B)。同时，利用改进的苗期集团抗性鉴定法(Huangetal.2001)对BC₁F₃群体的各个家系进行褐飞虱抗性鉴定，得出每个对应的F₂家系的表型值。然后，结合表型值和标记的基因型数据，利用数量性状位点(QTL)分析方法基于上述的遗传连锁图进行QTL扫描，获得的主效QTL即为对应在连锁图上两个标记之间且与抗性极显著相关。

2)主效基因的精细定位同样是按照遗传学上常用的染色体步移或着陆(ChromosomeWalkingorLanding)的方法实施的(具体参考下面的实施例2)。即先构建仅包含主效QTL，而排除其它QTL干扰的在感虫亲本背景下的近等基因系(NIL)，即挑选BC₁F₃家系中主效QTL为抗虫亲本基因型，且其它主效QTL为感虫亲本基因型的单株，与感虫亲本进一步回交，获得BC₂F₁，然后利用该主效QTL两侧标记鉴定BC₂F₁的基因型，挑选在两标记基因型均为杂合的单株进一步自交，得到BC₂F₂群体。然后种植BC₂F₂分离群体，鉴定每个单株在目标QTL两侧标记的基因型，找出出现差异基因型的单株，即在此位点发生染色体片段交换的重组单株。然后在这两个标记之间以均匀物理位置开发新的在抗感亲本之间表现差异的多态性标记，然后鉴定每个重组单株在这些新标记位点的基因型，以此构建覆盖目标QTL的高密度物理图谱(见图3中的B和C以及图4中的C和D)。同时，利用苗期集团法鉴定每个重组单株对应的后代的褐飞虱抗性，从而推出其当代的表型以及真实存在的基因基因型，然后利用重组单株在上述新标记的基因型和基因的基因型的对应关系，找出对应最好的新标记区间，即目标QTL的精细定位区间。

3)基因效应分析即主效基因在感虫亲本背景下的真实效应的分析(具体参考下面的实施例3)。即首先利用上述基因的初步定位和精细定位的结果，找出与基因紧密连锁或共分离的分子标记用于抗感亲本杂交后代的筛选，以此建立基因的分子标记辅助选择(MAS)体系。然后利用这一MAS体系，通过常规育种即杂交、回交和自交手段将主效基因导入到感虫亲本中，从而提高感虫亲本的抗性。这个过程的选择唯一标准就是MAS体系，从而替代了较为繁琐且不利于控制的表型鉴定工作，真正达到了高效实用。

实施例1：抗虫导入系IR02W101中QBph3和QBph4的初步定位

1.构建珍汕97/IR02W101BC₁F₂群体及表型鉴定

(1)抗虫亲本水稻导入系IR02W101(曾用名IR54751-1-2-44-15-2-B)是早期国际水稻研究所(英文简称“IRRI”，菲律宾)培育而来，并由该所IRRI的Brar博士惠赠。他们通过一个常规籼稻品种IR31917-45-3-2与一个药用野生稻品种(Acc号：100896)杂交，经过后代表型鉴定以及回交育种，最终获得了高抗4种褐飞虱生物型的导入系IR02W101(见文献：JenaandKhush，1990；BrarandKhush，1997)。本实施例用的另一个亲本珍汕97(珍汕97B)，对我国的褐飞虱种群表现高感。为了定位IR02W101中的褐飞虱抗性基因，本发明将珍汕97与IR02W101杂交，得到的F₁，经真假杂种鉴定(为常规方法)后，选择真杂种自交，获得F₂分离群体。然后在温室中随机播种F₂家系，共得384苗，待三叶期时按每苗10头接种2-3龄褐飞虱若虫，待感虫对照TN1完全死亡后(接虫后12天测定)，挑选抗性最强的36株苗移栽至大田，在抽穗期时与珍汕97进一步回交，得到的BC₁F₁，经真假杂种鉴定后，选取真杂种自交，最终得到BC₁F₂分离群体；然后在大田种植BC₁F₂群体共166个单株，每个单株取足够的叶片用于后续的全基因组标记分析以构建遗传连锁图(见图3中的A，图4中的A和图4中的B)，且每个单株自交后得到的种子即BC₁F_2:3家系(何途径能获得该BC₁F_2:3家系)用于后续的褐飞虱抗性鉴定以获得每个家系的表型值。

(2)采用改进后的苗期集团鉴定法(Huangetal.2001)对亲本、BC₁F_2:3家系进行褐飞虱抗性鉴定。为确保亲本和BC₁F_2:3家系在苗期接虫前生长一致，以供式材料先进行预发芽试验，然后根据发芽时间长短来分别浸种催芽。每个家系(品种)取各40粒左右种子播种于一个长50cm、宽30cm、高10cm，且盛有8cm厚营养土的面包盒中。每盒每个材料种2行，其中感虫对照TN1随机种3行。播种7天后开始定苗，移除病弱苗，保留长势一致且健壮的苗，每行保证12苗。待苗长到两叶一心或快到三叶期时，按10头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，然后罩上尼龙纱网。整个过程在温室中进行，温室温度保持在24-28℃。当感虫品种TN1全部死亡或死亡90％以上时(接虫10天到12天)，参照Huang等的方法对每个单株进行0、1、3、5、7或9的抗性评级(见表1)，然后通过加权平均来计算每个家系或品种的抗性级别，最后得到每个家系的抗性分数，即表型值。分别在接虫10天和12天后进行抗性调查，并分别计算表型值。

结果表明，在接虫10至12天时，亲本IR02W101、珍汕97以及BC₁F₁的抗性分数分别为2.5-3、4.5-5.5和8.5-9，抗性水平分别为抗、中抗和感。166个BC₁F_2:3家系对褐飞虱的抗性分数频率分布呈连续分布，最小为2，最大为9，并在3.5、5.5和9三个位置出现3个明显的峰值。初步表明可能受到多个抗性QTL的控制(见图2)。

表1水稻苗期抗褐飞虱水平分级标准

2分子标记鉴定

(1)用CTAB法(Murray&Thompson1980NucleicAcidRes8:4321-4325)提取亲本和BC₁F₂群体各单株的基因组DNA。

(2)本发明中所用到的SSR标记信息全部来自于Gramene网站数据库(http://www.gramene.org/)。此外，还根据网上公布的粳稻品种Nipponbare的基因组序列(http://rgp.dna.affrc.go.jp)以及籼稻品种93-11的基因组序列(http://rise.genomics.org.cn/)设计和鉴定多态性的插入缺失(Indel)标记，设计原则是在两者间有2-5bp缺失的、PCR扩增片段大约有100-200bp长度、目标片段上平均分布。且引物特异性高、GC含量不低于60％且均匀分布。

(3)分子标记的分析方法为PCR标准程序，参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社介绍的方法。PCR采用20μl的反应体系，包含：20-50ngDNA模板(2μl)，ddH₂O10μl,再加上8μl的mixture(混合物)：10mMTris-HCl,50mMKCl,0.1％TritonX-100,1.8mMMgCl₂,0.1mMdNTP,0.2μM引物和1UTaqDNApolymerase。最后在加上矿物油20μl。PCR扩增的条件为：94℃预变性4min；94℃20sec，55℃30sec，72℃40sec，32个循环；72℃延伸7min。PCR产物在4％的聚丙烯酰胺胶上分离后进行银染(Bassam等,1991,Anal.Biochem.196:80-83)。

3遗传图谱的构建

首先利用华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室订购(生工生物工程(上海)股份有限公司)的约共1200对SSR标记在亲本珍汕97和IR02W101之间筛选多态性，总共检测出212对标记在双亲之间表现多态性，最后根据标记扩增的质量和在染色体上的均匀分布，确定一共有178个标记能够用于构建遗传连锁图谱。然后根据连锁交换规律，利用MAPMAKER/EXP3.0软件对各个分子标记的群体基因型数据构建水稻的遗传连锁图谱。遗传连锁图总长1920cM，分为12个连锁群，分别对应水稻的12条染色体，标记之间的平均遗传距离为10.1cM，没有出现大于30cM的标记区间。

4基因定位

基于基因型和表型数据，根据遗传连锁图谱，利用WindowsQTLCartographerV2.0软件复合区间作图法(Compositeintervalmapping，CIM)(WangandZeng,2004http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)，以2cM为步长在全基因组范围内进行扫描。QTL的检测采用5％总体显著水平，相应LOD统计量的显著阈值用排列测验方法进行估计，共重复抽样1000次。结果显示在第3染色体长臂RM514和J412之间也有一个主效QTL，LOD值为12.61，解释表型变异率为27.59％；此外在第4染色体短臂RM261和RM307之间有一个主效QTL位点，LOD值为13.99，解释表型变异率为35.42％。初步将这两个QTL分别命名为为QBph3和QBph4，申请人于2014年5月8日将所述的水稻QBph3OryzaSativaQBph3送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCP201406；于2014年5月8日将所述的水稻QBph4OryzaSativaQBph4送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCP201407，为准备构建更大的分离群体进行精细定位。

实施例2：QBph3和QBph4的精细定位

1.QBph3的精细定位

(1)为进一步精细定位QBph3，提高选择效率，挑选BC₁F₃家系中QBph3的位点为IR02W101基因型，且QBph4位点为珍汕97基因型的单株，与珍汕97进一步回交，获得BC₂F₁，然后利用QBph3两侧标记RM514和J412鉴定BC₂F₁的基因型，挑选在两标记基因型均为杂合的单株进一步自交，得到BC₂F₂群体。然后以QBph3位点两侧标记RM514和J412检测总共6000个BC₂F₂家系，总共找到220个在两侧标记之间发生交换的重组单株。并对每个重组单株相对应的F_2:3家系进行抗虫鉴定，获得其抗性分数，然后根据抗性分数进行后代测验来推测此单株的基因型。

(2)根据工具公共数据库中提供的粳稻品种日本晴和籼稻品种9311的基因组序列，在标记RM514和J412之间以均匀距离开发多特性标记，再用这些标记鉴定上述每个重组单株，得到每个重组单株在这些标记位点的基因型。

(3)根据每个重组单株的表型和基因型结果，最终将QBph3精细定位在t6和f3之间47kb的区间，与标记c3-14共分离。因此，利用上述分子标记来鉴定QBph3抗性基因的存在具有非常高的效率(见表2，图3)。

表2与QBph3紧密连锁的分子标记筛选的BC₂F₂部分重组单株的基因型和表型

^a表中所列单株当中，珍汕97和IR02W101是两个亲本，其它的为标记RM261到HJ28之间的重组单株；^b表中所列是根据每一个重组单株后代的表型来推测其上一代的基因型；^c表中所列为抗性分数±标准误。其中R和H分别为在此位点为纯合和杂合的IR02W101基因型，S为在此位点为纯合珍汕97基因型。

2.QBph4的精细定位

(1)为进一步精细定位QBph4，提高选择效率，按照QBph3的定位方法，挑选BC₁F₃家系中QBph4的位点为IR02W101基因型，且QBph3位点为珍汕97基因型的单株，与珍汕97进一步回交获得BC₂F₁，利用QBph4两侧标记RM261和RM307鉴定BC₂F₁的基因型，挑选在两标记基因型均为杂合的单株进一步自交，得到BC₂F₂群体。然后以QBph4位点两侧标记RM261和HJ28检测总共14000个BC₂F₂单株，总共找到92个在两侧标记之间发生交换的重组单株。并对每个重组单株相对应的F_2:3家系进行抗虫鉴定，获得其抗性分数，然后根据抗性分数进行后代测验来推测此单株的基因型。

(2)同样，在标记RM261和HJ28之间以均匀距离开发多特性标记，再用这些标记鉴定上述92个重组单株，得到每个重组单株在这些标记位点的基因型。

(3)根据每个重组单株的表型和基因型结果，最终将QBph4精细定位在p17和xc4-27之间。在测序的日本晴品种中，这两个标记之间的物理距离仅有200kb，因此，利用上述分子标记来鉴定QBph4抗性基因的存在具有非常高的效率(见表3，图4)。

表3与QBph4紧密连锁的分子标记筛选的BC₂F₂部分重组单株的基因型和表型

实施例3：QBph3和QBph4在珍汕97背景下的基因效应分析

1.材料构建与抗性鉴定

按照分子标记辅助选择(MAS)结合常规回交育种方法，将IR02W101中的两个主效抗褐飞虱基因QBph3和QBph4同时导入到感虫亲本珍汕97中。首先挑选珍汕97/IR02W101的BC₂F₃家系中在两个基因位点同时为IR02W101基因型的单株，与珍汕97进一步回交得到BC₃F₁，分别利用与QBph3和QBph4紧密连锁的标记c3-14和xc4-27对单株进行基因型鉴定，筛选出标记基因型在QBph3和QBph4位点均为杂合的单株进一步自交得到BC₃F₂分离群体，此时QBph3和QBph4两个基因应该是同时分离，后代基因型遵循孟德尔的基因自由组合规律。然后种植96个家系的BC₃F₂群体，对每个家系的相应的F_2:3家系进行抗性鉴定，得到每个家系的抗性分数。

2.标记分析

利用分子标记引物m3、t6、c3-14和f3(见序列表“3-10”)对96个BC₃F₂家系的QBph3基因位点进行检测，同时用分子标记引物p9、p17、xc4-27、c4-5和xc4-7(见序列表“15-24”)对QBph4基因位点进行检测，最后确定每个家系在QBph3和QBph4位点的基因型。一共筛选出总共9个不同的基因型组合，分别为：AA，AH，HA，AB，BA，BH，HB，HH和BB。其中A代表其所对应的基因位点(QBph3和QBph4)为纯合基因型，H为杂合基因型，B为不含抗性基因(见图5)。

3.结果及分析

根据96个家系的基因型和表型结果(见图5)，两个基因纯合且为IR02W101基因型的组合(AA)，以及QBph4位点为纯合IR02W101基因型且QBph3位点为杂合IR02W101基因型的组合(AH)，以及抗性对照IR02W101的抗性分数为同一个等级，大约为2.3，为抗的水平。此外，QBph4位点为纯合IR02W101基因型且QBph3位点为纯合珍汕97基因型的组合(AB)的抗性分数为3.3，略低于QBph4位点为纯合珍汕97基因型且QBph3位点为纯合IR02W101基因型的组合(BA，抗性分数为4.2)，但是两个基因位点同时为珍汕97基因型的组合(BB)的抗性分数为8.5，接近于感虫对照TN1的水平。这些结果表明来自于IR02W101的QBph3和QBph4均对褐飞虱的抗性起到加性贡献作用，且QBph4的效应大于QBph3。两个基因均为显性基因且两个基因聚合后抗性进一步加强，因此这两个主效基因在水稻尤其是杂交水稻抗性改良上有很大的应用前景。

主要参考文献

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Claims (3)

1.一个水稻抗褐飞虱主效基因QBph3的分子标记，其特征在于，它由下述之一的引物对通过PCR扩增获得，如下所示引物对的DNA序列如下所示：

1)标记引物q1，

左端引物序列：CGGACATGGACAGTACAC，

右端引物序列：AACAAATTTCGTATAGAAAC；

2)标记引物m3，

左端引物序列：GATCTCGGTGAAACGAC，

右端引物序列：GGAGACACGAAAGAGCTGAG；

3)标记引物t6，

左端引物序列：GGATTTTCCGCGCGGAGGC，

右端引物序列：CAGTGCGGCGATTGGATG；

4)标记引物c3-14，

左端引物序列：GGCAAAATTAGACGGCACG，

右端引物序列：GAATATGCATTTTGTTTGGAG；

5)标记引物f3，

左端引物序列：GTCGTTAACCTGGAGAACAAG，

右端引物序列：CATTCGATCCGTTGCGTGTG。

2.如权利要求1所述的与水稻抗褐飞虱主效基因QBph3来自同一个水稻材料的另一个主效抗褐飞虱基因QBph4的分子标记，其特征在于，它由下述之一的引物对通过PCR扩增获得，如下所示引物对的DNA序列如下所示：

标记引物J409，

左端引物序列，GTAATATGATGTGGTTTATG，

右端引物序列，GATGATTATTCTATGGCTC；

2)标记引物p6，

左端引物序列，CCAACAGATAAGTTAGTG，

右端引物序列，CCAATATCAAAATGTGCG；

3)标记引物p9，

左端引物序列，GAATTACAGTAACTGAGAC，

右端引物序列，GGAACTCCATGAGAGGT；

4)标记引物p17，

左端引物序列，CACCAGAGATAAAAAGAGG，

右端引物序列，GGCGACATTAATTAGGCGG；

5)标记引物xc4-27，

左端引物序列，GCATAAGCGCCCTAGCC，

右端引物序列，GCTAGTTGCAGGCACGC；

6)标记引物c4-5，

左端引物序列，TTCAGATTGCACAACGCC，

右端引物序列，GCTACGTGTCACTGTTCC；

7)标记引物xc4-7，

左端引物序列，CGGCCTAATTCTAGAGTTC，

右端引物序列，TGTGACTGCATTAATAAAGG；

8)标记引物HJ16，

左端引物序列，CACATGTATTTGATCGAG，

右端引物序列，GGGATTCAGGAGTAGCGGG；

9)标记引物J417，

左端引物序列，CCATCTTCCGAATCGGC，

右端引物序列，GTCGCCGACCCCCTCCC；

10)标记引物IN156，

左端引物序列，AGGTGAAGCTGATGTGCTTG，

右端引物序列，CGATACTTATTGCAACACAC。

3.权利要求1或2所述分子标记在抗褐飞虱水稻改良中的应用。