CN107988212A - 水稻基因组重组核酸片段RecCR020429及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了水稻基因组重组核酸片段及其检测方法。本申请还提供了含有重组核酸片段的水稻植株的选育方法，利用分子标记对重组植株进行前景选择和背景选择，获得了含有重组核酸片段的水稻植株。

Description

水稻基因组重组核酸片段RecCR020429及其检测方法

技术领域

本申请涉及全基因组选择育种技术。具体而言，本申请涉及利用全基因组选择育种技术选育具有褐飞虱抗性功能的重组核酸片段的水稻植株，以及由此而获得的重组核酸片段及其检测方法。

背景技术

褐飞虱，学名Nilaparvata lugens属同翅目，飞虱科。褐飞虱是单食性害虫，仅取食水稻，具有喜温、抗寒能力弱、生长周期短、远距离迁飞、暴发性和猖獗性等特征。褐飞虱是典型的刺吸式害虫，以取食韧皮部和木质部汁液为生，取食量大、繁殖快，一旦大爆发，可造成受害区域颗粒无收。此外，还可以传播水稻病毒病(如：草状丛矮病和齿叶矮缩病)，对水稻生产也造成严重危害。

自20世纪80年代以来，从野生稻和栽培稻中已经鉴定超过30个抗褐飞虱位点。由于褐飞虱表型鉴定的复杂性，导致近几年才克隆Bph14、Bph26和Bph3等个别基因(Du等，PNAS.2009,106(52):22163-22168；Tamura等，Sci Rep.2014,4:5872；Liu等，NatureBiotechnology.2015,33:301-305)。另外，随着抗褐飞虱品种在生产中的不断利用，褐飞虱对品种的适应能力逐渐增强。一些在生产上广泛利用的抗性品种正逐渐丧失对褐飞虱的抗性(Deen等，Rice Genet Newsl.2010,25:70-72)。

目前，褐飞虱防治仍依靠化学农药，不仅增加生产成本，污染环境，而且促使褐飞虱抗药性增强。由此可见，抗褐飞虱新品种的培育需求非常迫切。

发明内容

一方面，本申请提供了水稻基因组重组核酸片段，其包含以下重组核酸片段，或者由以下重组核酸片段组成：

-第一重组核酸片段，其选自：i)包含SEQ ID NO:1所示序列第134至162位和第358至379位的核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列；ii)包含SEQ ID NO:1所示序列第144至368位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列；iii)包含SEQ ID NO:1所示序列第134至162位和第358至379位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列，以及SEQ ID NO:1所示序列第5至27位、第36至72位、第388至412位和第440至464位核苷酸中的至少一种序列或其片段或其变体或其互补序列；或iv)包含SEQ ID NO:1所示的序列或其片段或其变体或其互补序列；和/或

-第二重组核酸片段，其选自：v)包含SEQ ID NO:2所示序列第84至106位和第184至226位的核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列；vi)包含SEQ ID NO:2所示序列第99至186位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列；vii)包含SEQ ID NO:2所示序列第84至106位和第184至226位的核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列，以及SEQID NO:2所示序列第12至37位、第239至263位和第385至405位核苷酸中的至少一种序列或其片段或其变体或其互补序列；或viii)包含SEQ ID NO:2所示的序列或其片段或其变体或其互补序列。

在一实施方案中，本申请提供的水稻基因组重组核酸片段包含选自i)、ii)、iii)、iv)中任一序列的第一重组核酸片段，或者由选自i)、ii)、iii)、iv)中任一序列的第一重组核酸片段组成。

在另一实施方案中，本申请提供的水稻基因组重组核酸片段包含选自v)、vi)、vii)、viii)中任一序列的第二重组核酸片段，或者由选自v)、vi)、vii)、viii)中任一序列的第二重组核酸片段组成。

在又一实施方案中，本申请提供的水稻基因组重组核酸片段包含选自i)、ii)、iii)、iv)中任一序列的第一重组核酸片段与选自v)、vi)、vii)、viii)中任一序列的第二重组核酸片段的组合，或者由选自i)、ii)、iii)、iv)中任一序列的第一重组核酸片段与选自v)、vi)、vii)、viii)中任一序列的第二重组核酸片段的组合组成。

此外，本申请提供了检测所述重组核酸片段的引物，其中所述引物包含：

-检测第一重组核酸片段的引物，其选自：(I)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第134至162位核苷酸的序列的引物，和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第358至379位核苷酸的序列的引物；(II)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第144至368位核苷酸的序列的引物；(III)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第134至162位核苷酸的序列的引物，和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第358至379位核苷酸的序列的引物，以及特异性识别SEQ IDNO:1所示序列第5至27位、第36至72位、第388至412位和第440至464位核苷酸中至少一种序列的引物；或(IV)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列的引物；和/或，

-检测第二重组核酸片段的引物，其选自：

(V)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第84至106位核苷酸的序列的引物，和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第184至226位核苷酸的序列的引物；(VI)特异性识别SEQ IDNO:2所示序列第99至186位核苷酸的序列的引物；(VII)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第84至106位核苷酸的序列的引物，和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第184至226位核苷酸的序列的引物，以及特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第12至37位、第239至263位和第385至405位核苷酸中至少一种序列的引物；或(VIII)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列的引物。

在一实施方案中，用于扩增第一重组核酸片段的引物对，例如用于扩增SEQ IDNO:1所示序列的引物对为，例如，5’-TGTGGGAATGACTATCTAACCGAA-3’，和5’-TCTGCAACACGAACGTAAAAGGAA-3’。用于测序第一重组核酸片段的引物，例如，用于测序SEQID NO:1所示序列第5至27位、第36至72位和第134至162位的引物为，例如，5’-TGTGGGAATGACTATCTAACCGAA-3’；用于测序SEQ ID NO:1所示序列第358至379位、第388至412位和第440至464位的引物为，例如，5’-TCTGCAACACGAACGTAAAAGGAA-3’。

在另一实施方案中，用于扩增第二重组核酸片段的引物对，例如用于扩增SEQ IDNO:2所示序列的引物对为，例如5’-CAACCTGCTGCACTGCTTCGACTG-3’，和5’-TGGCCTGCTGGATGTGAGAATGTG-3’。用于测序第二重组核酸片段的引物，例如用于测序SEQ IDNO:2第12位至第37位、第84位至第106位、第184位至第226位、第239位至第263位、和第385位至第405位所示序列的引物为，例如，5’-CAACCTGCTGCACTGCTTCGACTG-3’。

另一方面，本申请提供了选育含有所述重组核酸片段的水稻植株的方法，其中所述重组核酸片段具有褐飞虱抗性功能，并且所述方法包括以下步骤：1)将轮回亲本水稻‘中种恢629’与供体水稻‘华130B’进行杂交，将所得到的杂交种与轮回亲本进行回交，获得回交一代，利用正向选择标记BphC03ID03和负向选择标记BphC03S20、BphC03S88对其进行抗褐飞虱基因组片段的单侧同源重组片段筛选，并利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择；2)选择背景回复较好的重组单株与轮回亲本再次进行回交，获得回交二代，利用正向选择标记BphC03ID03对其进行检测，选择具有褐飞虱抗性功能组片段的重组单株，然后利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择；3)选择背景回复好的重组单株与轮回亲本又一次进行回交，获得回交三代，利用正向选择标记BphC03ID03和负向选择标记BphC03S20、BphC03S88对其进行抗褐飞虱基因组片段的另一侧同源重组片段筛选，并利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择；以及4)选择导入片段小，且背景回复好的重组单株，将选中的重组单株自交一次，获得自交种，利用正向选择标记BphC03ID03对其进行检测，并利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择，最终获得含纯合基因组重组核酸片段且背景回复的水稻植株。

在一实施方案中，利用分子标记对重组植株进行前景选择时采用的扩增引物，包括用于扩增分子标记BphC03ID03的引物对，其中正向引物为5’-GCAAGAATCCGACGCCATAA-3’，反向引物为5’-CTCTGCTCCTTGCTCTAATCCTCT-3’；用于扩增分子标记BphC03S20的引物对，其中正向引物为5’-TGGCAGCATTTTGTTGTAG-3’，反向引物为5’-TTCCAGCCGTGTCTATTT-3’；以及扩增分子标记BphC03S88的引物对，其中正向引物为5’-GTGATGCATGCTTTACCACC-3’，反向引物为5’-ATACCGTAAACTTTGCACGC-3’。

又一方面，本申请提供了检测所述重组核酸片段的方法，其包括采用本申请所提供的引物，以待测基因组为模板进行PCR反应，并分析PCR产物的步骤。具体地，所述方法以待测样品基因组DNA为模板，利用前述扩增引物进行PCR扩增，然后利用前述测序引物对获得的扩增产物进行测序，若测序结果与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列或其区段一致或互补，则待测样品中含有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列的同源重组核酸片段。

通过检测确定了待测样品中含有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列或其区段的重组核酸片段，即可确定待测样品中包含具有褐飞虱抗性功能的重组核酸片段。

此外，本申请还提供了检测重组核酸片段的试剂盒，其包括如前述的引物。

进一步地，本申请还提供了筛选含有重组核酸片段的水稻植株或种子的方法，其包括检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段的步骤。

在一实施方案中，采用如前所述的引物来检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段。在另一实施方案中，采用如前所述的检测重组核酸片段的方法来检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段。在又一实施方案中，采用如前所述的试剂盒来检测待测水稻植株的基因组中是否含有如前所述的重组核酸片段。

在又一方面，本申请提供了通过所述方法筛选得到的含有本申请公开的重组核酸片段的水稻植株或其种子。

本申请提供的基于全基因组选择育种技术的选育含有抗褐飞虱基因组重组核酸片段的水稻植株的方法，具有快速、准确、稳定的优势。仅通过五世代转育，即可仅将目标基因组片段导入受体材料，并同时实现背景的回复。本申请改良的受体材料为‘中种恢629’，是高产、优质、强优广谱恢复系。利用上述方法，可以在保留‘中种恢629’原有优点的情况下大幅度提高其褐飞虱抗性。同时，本申请提供的重组核酸片段与褐飞虱抗性紧密相关，可作为抗性资源应用于其他品种的培育。

附图说明

图1为本申请实施例1中CR020429水稻RICE60K全基因组育种芯片检测结果；其中，横坐标数字所指示方框依次表示水稻12条染色体，纵坐标数字为水稻基因组上的物理位置[以兆碱基(Mb)为单位]，灰色线条代表受体亲本‘中种恢629’基因型，黑色线条代表供体亲本‘华130B’基因型，白色线条代表两亲本基因型一致即无多态性区段。图中第3号染色体黑色线条所示区段即为导入的抗褐飞虱基因组重组核酸片段RecCR020429。

图2为本申请实施例3中CR020429褐飞虱抗性室内鉴定结果；图中所示叶片依次为：(A)高感褐飞虱品种‘台中在来1号’；(B)原品种‘中种恢629’；(C)改良新品系CR020429；(D)供体亲本‘华130B’。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向从左向右书写，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。在某些实施方案中，可以依照单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

具体地，本申请涉及对SEQ ID NO:1或2进一步优化所得的核苷酸序列。该方法的更多细节描述于Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498。优化核苷酸序列可用于提高抗褐飞虱基因组重组核酸片段在水稻中的表达。

在一些实施方案中，本申请还涉及SEQ ID NO:1或2所示序列或其区段的变体。一般来讲，特定核苷酸序列的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互补序列。这样的变体序列包括一个或多个核酸残基的添加、缺失或替换，从而可以导致相应的氨基酸残基的添加、移除或替换。通过本领域内已知的序列比对程序包括杂交技术确定序列同一性。实施方案的核苷酸序列变体与本申请的序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4、3、2或甚至1个核苷酸。

本申请还涉及包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列中特定位点的序列或其片段或其变体或其互补序列，例如，包含SEQ ID NO:1所示序列第134至162位和第358至379位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列(包含上游同源重组区段的边界SNP/Indel位点)；包含SEQ ID NO:1所示序列第144至368位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列(包含上游同源重组区段及其边界SNP/Indel位点)；包含SEQ ID NO:1所示序列第134至162位和第358至379位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列，以及以下中的任一种或多种：SEQ ID NO:1所示序列第5至27位、第36至72位、第388至412位和第440至464位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列(包含上游同源重组区段的边界SNP/Indel位点，以及分别来源于受体片段和/或供体片段的SNP/Indel位点)。或者，包含SEQ IDNO:2所示序列第84至106位和第184至226位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列(包含下游同源重组区段的边界SNP/Indel位点)；包含SEQ ID NO:2所示序列第99至186位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列(包含下游同源重组区段及其边界SNP/Indel位点)；包含SEQ ID NO:2所示序列第84至106位和第184至226位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列，以及以下中的任一种或多种：SEQ ID NO:2所示序列第12至37位、第239至263位和第385至405位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列(包含下游同源重组区段的边界SNP/Indel位点，以及分别来源于供体片段和/或受体片段的SNP/Indel位点)。

根据包含上述特定位点的片段或区段，能够特异性地鉴定出相应的SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列。进一步地，通过鉴定出含有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列的重组核酸片段，即可确定待测样品中包含具有褐飞虱抗性功能的重组核酸片段。

如本文所用，“水稻”是任何水稻植株并包括可以与水稻育种的所有植物品种。如本文所用，“植株”或“植物”，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。

在本申请的方法可以适用于任何需要选育的水稻品种。也就是说，可以将任何缺少某种有利性状的优良品种(即综合性状较好，预计有发展前途的品种)用作轮回亲本。用另一具有该受体所缺少的有利性状的品种作为供体亲本，并且所提供的有利性状最好是显性单基因控制的。在本申请的实施方案中，采用水稻‘中种恢629’作为轮回亲本，采用已被证实具有良好的褐飞虱抗性的水稻‘华130B’作为供体。

在本申请所提供的重组植株的选育方法中，利用分子标记对重组植株进行前景选择。前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连锁的紧密程度，为提高选择的准确率，一般同时用两侧相邻的两个标记对目标基因进行跟踪选择。

在本申请的实施方案中，采用的前景选择标记包括正向选择标记和负向选择标记。在具体实施方案中，经优化筛选使用的正向前景选择标记是与目标基因组片段紧密连锁的标记BphC03ID03，负向选择标记是位于目标片段上游的标记BphC03S20，以及位于目标片段下游的标记BphC03S88。

在本申请的实施方案中，利用上述前景选择标记进行同源重组的检测时，一侧或单侧同源重组的判断标准是BphC03ID03检出与‘华130B’相同带型，且BphC03S20或BphC03S88检出与‘中种恢629’相同带型；两侧或双侧同源重组的判断标准是BphC03ID03检出与‘华130B’相同带型，且BphC03S20和BphC03S88检出与‘中种恢629’相同带型。

在本申请中，可以使用任何一种可利用的芯片进行本申请所提供的育种方法中的背景选择。在优选的实施方案中，可以采用本申请人在中国专利申请CN102747138A中公开的水稻全基因组育种芯片RICE6K，或者在PCT国际申请WO/2014/121419中公开的水稻全基因组育种芯片RICE60K。这两份申请文件中的全部内容整体并入本文作为参考。

以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecularcloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本申请中所使用的水稻植株材料信息均可参见中国水稻品种及其系谱数据库(http://www.ricedata.cn/variety/index.htm)。

本申请中所提到的水稻基因组物理位置均参照水稻日本晴基因组MSU/TIGR注释第6.1版(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

实施例1选育导入抗褐飞虱基因组片段的重组植株

本实施例中使用的材料为水稻‘中种恢629’及水稻‘华130B’。

水稻‘华130B’具有良好的褐飞虱抗性，推测可能是第3号染色体的QBph3(Hu等，Molecular Breeding.2015,35:3)和Bph14(Du等，PNAS.2009,106(52):22163-22168)所在的基因簇区域对该材料的褐飞虱抗性起了关键作用。

在重组植株的选育过程中，利用分子标记对重组植株进行前景选择，对所采用的前景选择分子标记进行了筛选。所使用的分子标记部分来源于网站http://www.gramene.org/，部分自行设计。设计方法为，参照水稻日本晴基因组MSU/TIGR注释第6.1版，下载前述区段DNA序列。使用SSRLocator软件对上述序列中的SSR位点进行扫描。利用Primer Premier 3.0软件对寻找出的SSR位点设计引物，共设计引物128对。通过PCR的方法，筛选上述引物对在‘华130B’及‘中种恢629’中的多态性，最终挑选出在两份材料中具有多态性、扩增效率高的前景选择分子标记，分别是正向选择标记BphC03ID03和负向选择标记BphC03S20、BphC03S88。用于PCR扩增上述分子标记的具体引物信息见表1。

表1前景选择分子标记引物信息

将水稻‘华130B’中前述基因所在的基因组片段导入到水稻‘中种恢629’中，具体过程如下：

以‘中种恢629’为轮回亲本，‘华130B’为供体亲本进行杂交，将所得到的杂交种与轮回亲本‘中种恢629’进行回交，获得BC₁F₁种子，育苗后利用正向选择标记BphC03ID03和负向选择标记BphC03S20、BphC03S88进行重组单株选择，筛选出7个在目标基因组DNA片段一侧同源重组的单株，即BphC03ID03检出与‘华130B’相同带型，且BphC03S20或BphC03S88检出与‘中种恢629’相同带型，并利用水稻全基因组育种芯片RICE6K(CN102747138A)对其进行背景选择(Yu等,Plant Biotechnology Journal.2014,12:28-37)。

在筛选出的7个单侧同源重组单株中比较芯片结果，选择背景回复最好的重组单株(此世代背景回复值超过75％)，使其与轮回亲本‘中种恢629’再次进行回交，获得BC₂F₁种子，育苗后利用正向选择标记BphC03ID03对其进行检测，选择含有目标基因组片段的重组单株，即BphC03ID03检出与‘华130B’相同带型，利用水稻全基因组育种芯片RICE6K对其进行背景选择。

选择背景回复较好的单株(此世代背景回复值超过87.5％)，使其与轮回亲本‘中种恢629’又一次进行回交，获得BC₃F₁种子，育苗后利用正向选择标记BphC03ID03和负向标记BphC03S20、BphC03S88对收获的种子进行目标基因组片段另一侧同源重组片段的筛选，获得11个在目标片段两侧重组的单株，即BphC03ID03检出与‘华130B’相同带型，且BphC03S20和BphC03S88检出与‘中种恢629’相同带型。

利用水稻全基因组育种芯片RICE60K(WO/2014/121419)对上述9个双侧交换单株进行背景和目标片段选择(Chen等，Molecular Plant.2014,7:541-553)，筛选到导入目标片段较小，且背景回复好的目标单株一个(此世代背景回复值超过93.75％)。

将选中的单株自交一次，获得BC₃F₂，育苗后利用正向选择标记BphC03ID03对其进行检测，选择含有目标基因组片段的单株，即BphC03ID03检出与‘华130B’相同带型，利用水稻全基因组育种芯片RICE60K对其进行背景选择。

最终获得目标片段纯合，且背景回复(背景回复值超过99％)的株系一个，命名为CR020429。芯片检测结果见图1。

实施例2导入褐飞虱抗性基因组片段后同源重组片段的确定

为了确定导入的褐飞虱抗性基因组片段大小，对‘中种恢629’导入片段的纯合单株进行了目标基因组片段两侧同源重组片段的测序。将CR020429所含的抗褐飞虱基因组重组核酸片段命名为RecCR020429。

通过水稻全基因组育种芯片RICE60K检测结果初步确定，RecCR020429上游同源重组片段位于标记F0335383337AG和R0335402302GT之间，下游同源重组片段位于标记R0335402302GT和F0335657380GA之间。

同时，使用Miseq测序技术对‘中种恢629’、‘华130B’和CR020429三个样本进行全基因组测序。使用TruSeq Nano DNA LT Kit(illumina)试剂盒进行文库建立，使用LibraryQuantification Kit–Universal(KAPA Biosystems)试剂盒进行定量，使用MiSeqV2Reagent Kit(illumina)试剂盒进行测序反应。使用Miseq台式测序仪(illumina)进行检测。具体步骤及方法参见各试剂盒及测序仪使用说明书。

根据前述SNP芯片及Miseq测序结果，将RecCR020429上游同源重组片段进一步确定在第3染色体的35393794bp到35397010bp区间，下游同源重组片段定位在第3染色体的35571703bp到35597012bp区间。

在此基础上，参照水稻日本晴基因组MSU/TIGR注释第6.1版，下载对应区段DNA序列。使用Primer Premier 5.0软件设计扩增及测序引物，设计要求为引物长22nt左右、GC含量40-60％且没有错配。

以受体亲本‘中种恢629’和供体亲本‘华130B’为对照，对RecCR020429上下游同源重组片段设计扩增引物，使用高保真酶KOD FX Neo(TOYOBO)进行扩增，使用两步法或三步法寻找最佳扩增条件，确保扩增产物在琼脂糖凝胶电泳检测中显示为单一明亮条带。筛选出1对引物用于上游同源重组片段的扩增，其反应条件为94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃60sec，37个循环；20℃1min。筛选出1对引物用于下游同源重组片段的扩增，其反应条件均为：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃60sec，37个循环；20℃1min。

另外，以扩增产物为模板，利用Sanger测序法进行测序，对上游同源重组片段共设计2条测序引物用于SNP或Indel位点的测序。对下游同源重组片段共设计2条测序引物用于SNP或Indel位点的测序。具体的扩增引物及测序引物序列见表2。

表2抗褐飞虱基因组重组核酸片段扩增及测序引物信息

RecCR020429上游同源重组片段长度为477bp(SEQ ID NO:1)。1-144bp为受体‘中种恢629’的基因组区段，与供体‘华130B’比较，存在4个SNP。145-367bp这一223bp区段为同源重组区段。368-477bp为供体‘华130B’基因组片段，与受体‘中种恢629’比较，存在3个SNP，1个Indel。

RecCR020429下游同源重组片段长度为413bp(SEQ ID NO:2)。1-99bp为供体‘华130B’的基因组区段，与受体‘中种恢629’比较，存在4个SNP。100-185bp这一86bp区段为同源重组区段。186-413bp为受体‘中种恢629’基因组片段，与供体‘华130B’比较，存在4个SNP。

CR020429、‘中种恢629’和‘华130B’SNP或Indel位点差异见表3。表中“位置”为：上游同源重组片段SNP或Indel位点差异的位置相对于SEQ ID NO：1而言，下游同源重组片段SNP或Indel位点差异的位置相对于SEQ ID NO：2而言。

表3CR020429、‘中种恢629’和‘华130B’SNP或Indel位点差异

实施例3‘中种恢629’导入抗褐飞虱基因组片段后的抗性鉴定

为了鉴定抗性效果，对本申请选育的新品系CR020429、受体亲本‘中种恢629’、供体亲本‘华130B’(作为阳性对照)，以及高感褐飞虱品种‘台中在来1号’(作为阴性对照)进行褐飞虱室内抗性鉴定，鉴定方法如下。

将各份材料在室内浸种、催芽，随后播种在划好格子线的塑料面盆中，每份材料分3行共播种45株，待两叶一心期时，每行保留10株共30株健康长势一致的植株用于接虫。虫源来自从田间采集到的褐飞虱，并在室内饲养繁殖。取2-3龄若虫到待鉴定的植株上，每株有5-10头若虫即可。待‘台中在来1号’死苗95％时开始记录各鉴定苗的抗性等级，取30株苗的抗性等级的平均值，作为该材料的抗性等级，根据抗性等级评价其抗性水平。其中，抗性等级共分10级：0或1级，叶片未受害或第一片叶叶尖发黄；2级，第一片叶1/2发黄或者叶尖皱缩；3级，第一片叶发黄或是枯萎；4级，第二片叶部分发黄或心叶叶尖发黄；5级，第二片叶发黄、皱缩或是枯萎、心叶青卷；6级，心叶卷曲，心叶叶尖枯萎；7级，心叶卷曲枯萎，植株未死亡；8级，心叶枯萎，稍微倒伏；9级，整株倒伏。根据上述抗性等级，0-0.9级判定为高抗，1.0-2.9级为抗，3.0-5.9级为中抗，6.0-6.9级为中感，7.0-7.9级为感，8.0-9.0级为高感。

褐飞虱室内抗性鉴定结果见图2，其中‘台中在来1号’为高感，原品种‘中种恢629’为中感，改良新品系CR020429为抗，供体亲本‘华2048B’为高抗。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。

序列表

<110> 中国种子集团有限公司

<120> 水稻基因组重组核酸片段RecCR020429及其检测方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 477

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> 来源于‘中种恢629’基因组区段

<222> (1)..(144)

<220>

<221> 同源重组区段

<222> (145)..(367)

<220>

<221> 来源于‘华130B’基因组区段

<222> (368)..(477)

<400> 1

ttattctcct atacttcctc cgtcccataa tataaaagat tttaactttt tacttgcact 60

gtttgatcac tcgtcttatt cataaaaaaa atgtgcaaat ataaaaaacg aaaagttgtg 120

cttaaaatac tttagataat aaaataagtc acaaataaaa taaataataa ttctaatttt 180

ttttaataag acgaatggta aataaaacaa ataaaaagtt aaaatcaacg gatggagtat 240

atcgctagct tctctttcaa ttctcacaca ctttatcatt actttgcaga tacaggtgtt 300

gcttccaaac ggtacatgcg atgtagggta tttacaacat tatagcttac actacaatgt 360

tgctctagtc agtacccatc acagttggaa tgctcctcct gtatgtactc ggcttgacca 420

gcacaattgt actccctccg tctaaaaaaa agtcaaacct tgggttttcg tgtccaa 477

<210> 2

<211> 413

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> 来源于‘华130B’基因组区段

<222> (1)..(99)

<220>

<221> 同源重组区段

<222> (100)..(185)

<220>

<221> 来源于‘中种恢629’基因组区段

<222> (186)..(413)

<400> 2

tagatatata tataaaatat taaatatata taaaataaaa aattaattgc acagtttgta 60

tgaaaatcac gagacgaatc ttttgaacct aactagtcca tgattagcca taagtgttac 120

agtaacccat atgtactaat gatggattaa ttatgcttaa taatttcatc tcgcggtttt 180

caggctagtt atgaaattag tttttcattc gtatccgaaa acttcttccg atattcagtc 240

aaacgtttgt tgttacaccc taaaattttc tttttcgaac taaacaagcc tttcatttca 300

tgcctctctc ccctacgttt tgctgctttg ctgttcaaca tctacatact tattgctcct 360

tcacagatgt actcctactt cataaattaa gattgggtga ttagaatgga ttg 413

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtgggaatg actatctaac cgaa 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctgcaacac gaacgtaaaa ggaa 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caacctgctg cactgcttcg actg 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tggcctgctg gatgtgagaa tgtg 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcaagaatcc gacgccataa 20

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctctgctcct tgctctaatc ctct 24

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tggcagcatt ttgttgtag 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttccagccgt gtctattt 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtgatgcatg ctttaccacc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ataccgtaaa ctttgcacgc 20

Claims (8)

1.水稻基因组重组核酸片段，其包含：

-第一重组核酸片段，其选自：

i)包含SEQ ID NO:1所示序列第134至162位和第358至379位的核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列；

ii)包含SEQ ID NO:1所示序列第144至368位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列；

iii)包含SEQ ID NO:1所示序列第134至162位和第358至379位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列，以及SEQ ID NO:1所示序列第5至27位、第36至72位、第388至412位和第440至464位核苷酸中的至少一种序列或其片段或其变体或其互补序列；或iv)包含SEQID NO:1所示的序列或其片段或其变体或其互补序列；和/或

-第二重组核酸片段，其选自：

v)包含SEQ ID NO:2所示序列第84至106位和第184至226位的核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列；

vi)包含SEQ ID NO:2所示序列第99至186位核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列；

vii)包含SEQ ID NO:2所示序列第84至106位和第184至226位的核苷酸的序列或其片段或其变体或其互补序列，以及SEQ ID NO:2所示序列第12至37位、第239至263位和第385至405位核苷酸中的至少一种序列或其片段或其变体或其互补序列；或

viii)包含SEQ ID NO:2所示的序列或其片段或其变体或其互补序列。

2.检测权利要求1所述重组核酸片段的引物，其中所述引物包含：

-检测第一重组核酸片段的引物，其选自：

(I)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第134至162位核苷酸的序列的引物，和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第358至379位核苷酸的序列的引物；

(II)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第144至368位核苷酸的序列的引物；

(III)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第134至162位核苷酸的序列的引物，和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第358至379位核苷酸的序列的引物，以及特异性识别SEQ IDNO:1所示序列第5至27位、第36至72位、第388至412位和第440至464位核苷酸中至少一种序列的引物；或

(IV)特异性识别SEQ ID NO:1所示序列的引物；和/或，

-检测第二重组核酸片段的引物，其选自：

(V)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第84至106位核苷酸的序列的引物，和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第184至226位核苷酸的序列的引物；

(VI)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第99至186位核苷酸的序列的引物；

(VII)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列第84至106位核苷酸的序列的引物，和特异性识别SEQ ID NO:1所示序列第184至226位核苷酸的序列的引物，以及特异性识别SEQ IDNO:2所示序列第12至37位、第239至263位和第385至405位核苷酸中至少一种序列的引物；或

(VIII)特异性识别SEQ ID NO:2所示序列的引物。

3.检测权利要求1所述重组核酸片段的引物，其中所述引物选自：

(I)扩增第一重组核酸片段的引物对

5’-TGTGGGAATGACTATCTAACCGAA-3’，

5’-TCTGCAACACGAACGTAAAAGGAA-3’；以及

(II)测序第一重组核酸片段的引物

5’-TGTGGGAATGACTATCTAACCGAA-3’；

5’-TCTGCAACACGAACGTAAAAGGAA-3’；和/或任选地，(III)扩增第二重组核酸片段的引物对

5’-CAACCTGCTGCACTGCTTCGACTG-3’，

5’-TGGCCTGCTGGATGTGAGAATGTG-3’；以及

(IV)测序第二重组核酸片段的引物

5’-CAACCTGCTGCACTGCTTCGACTG-3’。

4.选育含有权利要求1所述的重组核酸片段的水稻植株的方法，其中所述重组核酸片段具有褐飞虱抗性功能，并且所述方法包括以下步骤：

1)将轮回亲本水稻‘中种恢629’与供体水稻‘华130B’进行杂交，将所得到的杂交种与轮回亲本进行回交，获得回交一代，利用正向选择标记BphC03ID03和负向选择标记BphC03S20、BphC03S88对其进行抗褐飞虱基因组片段的单侧同源重组片段筛选，并利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择；

2)选择背景回复较好的重组单株与轮回亲本再次进行回交，获得回交二代，利用正向选择标记BphC03ID03对其进行检测，选择具有褐飞虱抗性功能组片段的重组单株，然后利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择；

3)选择背景回复好的重组单株与轮回亲本又一次进行回交，获得回交三代，利用正向选择标记BphC03ID03和负向选择标记BphC03S20、BphC03S88对其进行抗褐飞虱基因组片段的另一侧同源重组片段筛选，并利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择；以及

4)选择导入片段小，且背景回复好的重组单株，将选中的重组单株自交一次，获得自交种，利用正向选择标记BphC03ID03对其进行检测，并利用水稻全基因组育种芯片对其进行背景选择，最终获得含纯合基因组重组核酸片段且背景回复的水稻植株。

5.如权利要求4所述的方法，其中利用分子标记对重组植株进行前景选择时采用的扩增引物如下：

扩增分子标记BphC03ID03的引物对，其包括：

正向引物：5’-GCAAGAATCCGACGCCATAA-3’，

反向引物：5’-CTCTGCTCCTTGCTCTAATCCTCT-3’；

扩增分子标记BphC03S20的引物对，其包括：

正向引物：5’-TGGCAGCATTTTGTTGTAG-3’，

反向引物：5’-TTCCAGCCGTGTCTATTT-3’；以及

扩增分子标记BphC03S88的引物对，其包括：

正向引物：5’-GTGATGCATGCTTTACCACC-3’，

反向引物：5’-ATACCGTAAACTTTGCACGC-3’。

6.检测权利要求1所述的重组核酸片段的方法，其包括采用权利要求2或3所述的引物，以待测基因组为模板进行PCR反应，并分析PCR产物的步骤。

7.检测权利要求1所述的重组核酸片段的试剂盒，其包括权利要求2或3所述的引物。

8.筛选含有权利要求1所述的重组核酸片段的水稻植株或种子的方法，其包括检测待测水稻植株或种子的基因组中是否含有权利要求1所述的重组核酸片段的步骤；

优选地，采用权利要求2或3所述的引物，或者采用权利要求6所述的方法，或者采用权利要求7所述的试剂盒来进行检测。