CN105567793A - 含抗稻瘟病基因重组dna片段植株的选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种含抗稻瘟病基因重组DNA片段植株的选育方法，即利用正向及负向选择标记、水稻全基因组育种芯片技术通过五世代获得背景与受体亲本‘空育131’完全一致，且仅含供体亲本‘K22’抗稻瘟病基因DNA片段的稳定的目标植株。另外本发明还提供利用该方法获得的一个抗稻瘟病基因重组DNA片段及其检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及遗传学、基因组学和分子育种领域，具体地说，涉及全基因组选择育种技术以及利用该技术快速精确选育含抗稻瘟病基因重组DNA片段植株的方法。
背景技术
稻瘟病是水稻最严重的病害之一，全球每年由稻瘟病引起的水稻产量损失占11％～30％，因此稻瘟病及其抗性的研究显得尤为重要。随着对稻瘟病研究的逐步深入，许多水稻抗稻瘟病基因DNA片段相继被定位和克隆。其中，水稻第6染色体的Pi2区间被定位和克隆了很多稻瘟病抗性基因，如Pi2、Piz-t、Pi9、Pigm、Pi50，该区间包含一个稻瘟病抗性基因的基因簇(Dai等，2010；Qu等，2006；Wang等，2012；Zhou等，2006；Xiao等，2012；Liu等，2002；Liu等，2011；Jiang等，2012；Zhu等，2012；Deng等，2006)。
发明内容
本发明的目的是提供含抗稻瘟病基因重组DNA片段的水稻植株的选育方法，包括以下步骤：
(1)以水稻‘空育131’为轮回亲本，含抗稻瘟病基因DNA片段的‘K22’为供体亲本进行杂交和回交，获得BC1F1代；利用正向选择标记Pi2-4和负向选择标记RM19814、RM19835对BC1F1代进行抗稻瘟病基因DNA片段单侧同源重组片段筛选，并用水稻全基因组育种芯片RICE6K对其进行背景选择；
(2)选择背景回复较好的重组单株与受体亲本‘空育131’进行回交，获得BC2F1代，利用正向选择标记Pi2-4对其进行检测，选择含有抗稻瘟病基因DNA片段的重组单株，然后用水稻全基因组育种芯片RICE6K对其进行背景选择；
(3)选择背景回复好的重组单株再次与受体亲本‘空育131’进行回交，获得BC3F1代，利用正向选择标记Pi2-4和负向标记RM19814、RM19835对BC3F1代进行抗稻瘟病基因DNA片段另一侧同源重组片段筛选，并利用水稻全基因组育种芯片RICE60K对其进行背景选择，筛选到导入目标片段小，且背景回复好的重组单株；
(4)选中的重组单株自交一次，获得BC3F2代；利用正向选择标记Pi2-4对BC3F2代进行检测，并利用水稻全基因组育种芯片RICE60K对其进行背景选择，最终获得目标基因组DNA片段纯合，且背景完全回复的含抗稻瘟病基因重组DNA片段的水稻植株；
其中，所述抗稻瘟病基因重组DNA片段两侧的同源重组片段的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。
本发明还提供利用上述方法获得的一个抗稻瘟病基因重组DNA片段，该片段两侧的同源重组片段的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。
本发明还提供用于检测上述抗稻瘟病基因重组DNA片段的方法。根据该片段两侧的同源重组片段的核苷酸序列，分别设计特异性PCR扩增引物，以待测水稻基因组为模板，进行PCR反应，并分析PCR扩增产物。
优选地，采用Sanger测序法分析PCR扩增产物。
用于扩增及检测SEQIDNo.1所示同源重组片段的引物组合为：
组合I
扩增引物：A08X27F:5’-GATTCCTTGTAACTGCGAGAC-3’
A08X27R:5’-CTCACAATACCTTACCCACC-3’
测序引物：A08X27F:5’-GATTCCTTGTAACTGCGAGAC-3’
组合II
扩增引物：A08X15F:5’-TTGAGTTGTAATGCTGGTGAC-3’
A08X15R:5’-TTAGCTTACCTCAAATTACCG-3’
测序引物：A08X15F:5’-TTGAGTTGTAATGCTGGTGAC-3’
组合III
扩增引物：A08X16F:5’-CTGTCCCCAAAAGCTTGATG-3’
A08X16R:5’-CACGCCCTAATACTACTACCTCC-3’
测序引物：A08X16F:5’-CTGTCCCCAAAAGCTTGATG-3’。
以待测样品基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，然后利用上述测序引物对获得的扩增产物进行测序，若测序结果与SEQIDNo.1序列一致或互补，则待测样品中含有SEQIDNo.1所示同源重组片段。
用于扩增及检测SEQIDNo.2所示同源重组片段的引物组合为：
组合IV
扩增引物：A08X23F:5’-TCGAATTTACTACCCGTGAGC-3’
A08X23R:5’-TTTGGCTCTGACCCGCTTG-3’
测序引物：A08X23F:5’-TCGAATTTACTACCCGTGAGC-3’
组合V
扩增引物：A08X42F:5’-CAGTTGGGTCGGAAAGCTC-3’
A08X42R:5’-GATACATACCCGCACATTCG-3’
测序引物：A08X42F:5’-CAGTTGGGTCGGAAAGCTC-3’
A08X42R:5’-GATACATACCCGCACATTCG-3’
组合VI
扩增引物：A08X40F:5’-TCCATGGTGGTAACTGGTATG-3’
A08X40R:5’-AAAGTTGAGGGCGATTGTG-3’
测序引物：A08X40F:5’-TCCATGGTGGTAACTGGTATG-3’
组合VII
扩增引物：A08X36F:5’-TGGACTACATTAGACGCATTG-3’
A08X36R:5’-AAAGTACATCGAGTCCTTGAG-3’
测序引物：A08X36F:5’-TGGACTACATTAGACGCATTG-3’。
以待测样品基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，然后利用上述测序引物对获得的扩增产物进行测序，若测序结果与SEQIDNo.2序列一致或互补，则待测样品中含有SEQIDNo.2所示同源重组片段。
附图说明
图1为本发明实施例1中A08-19水稻Rice60K全基因组育种芯片检测结果；其中，横坐标数字所指示方框依次表示水稻12条染色体，纵坐标数字为水稻基因组上的物理位置[以兆碱基(Mb)为单位]，图中第6号染色体上黑色线条显示区段即为导入一个抗稻瘟病基因重组DNA片段的RecA08-19。
图2为本发明实施例2中RecA08-19抗稻瘟病基因重组DNA片段上游同源重组片段测序比对结果；图中所示星号代表比对结果中相同碱基，图中A08-19为获得的新品系，KY131为受体亲本‘空育131’，‘K22’为供体亲本。
图3为本发明实施例2中RecA08-19抗稻瘟病基因重组DNA片段下游同源重组片段测序比对结果。
图4为本发明实施例2中RecA08-19抗稻瘟病基因重组DNA片段两侧同源重组片段的结构图；其中，(A)为基因上游同源重组片段结构图；(B)为基因下游同源重组片段结构图，上方碱基为供体‘K22’的SNP或InDel标记，下方碱基为受体‘空育131’的SNP或InDel标记。灰色区段为来源于‘空育131’基因组区段，黑色区段为来源于‘K22’基因组区段，白色区段为同源重组区段，横坐标为片段长度，以碱基对数目(bp)为单位。
图5为本发明实施例3中A08-19稻瘟病抗性室内鉴定结果；图中所示叶片依次为：(A)稻瘟病感病品种丽江新团黑谷；(B)原品种‘空育131’；(C)改良新品系A08-19；(D)稻瘟病抗病品种谷梅4号。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
本发明中所提到的水稻基因组物理位置均参照水稻日本晴基因组MSU/TIGR注释第6.1版(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。
实施例1水稻‘空育131’导入抗稻瘟病基因DNA片段重组单株筛选
本实施例中使用的材料为水稻‘空育131’及‘K22’。‘K22’已被证实具有良好的稻瘟病抗性，并推测可能是第6号染色体的Pi2、Pi9和Pigm所在的基因簇区域对该材料的稻瘟病抗性起到了关键作用。
发明人将‘K22’中上述基因簇所在的基因组DNA片段导入到‘空育131’中，具体过程如下：
前景选择标记的筛选：正向选择标记是在距目标基因组DNA(抗稻瘟病基因DNA)片段上、下游50kb(在水稻中其遗传距离为0.2cM)范围内筛选多型性分子标记，获得与目标基因组DNA片段紧密连锁的标记Pi2-4。负向选择标记是在距目标基因组DNA片段上、下游500kb(在水稻中其遗传距离为2cM)范围内筛选多型性分子标记，获得位于目标片段上游约300kb的标记RM19814，以及位于目标片段下游约430kb的标记RM19835。用于PCR扩增上述分子标记的具体引物信息见表1。
表1前景选择标记信息
以‘空育131’为轮回亲本，‘K22’为供体亲本进行杂交和回交一代，获得BC1F1种子，育苗后利用正向选择标记Pi2-4和负向选择标记RM19814、RM19835进行重组单株选择，筛选出5个在目标基因组DNA片段一侧同源重组的单株，并用水稻全基因组育种芯片RICE6K(ZL201210055775.X)对其进行背景选择(Yu等，2014)。
选择背景回复较好的重组单株与受体亲本‘空育131’再次回交，获得BC2F1种子，育苗后利用正向选择标记Pi2-4对其进行检测，选择含有目标基因组DNA片段的重组单株，利用水稻全基因组育种芯片RICE6K对其进行背景选择。
选择背景回复较好的单株再次与轮回亲本‘空育131’进行回交，获得BC3F1种子，育苗后利用正向选择标记Pi2-4和负向标记RM19814、RM19835对收获的种子进行目标基因组DNA片段另一侧同源重组片段的筛选，获得19个在目标片段两侧重组的单株。利用水稻全基因组育种芯片RICE60K(PCT/CN2013/000131)对上述19个双侧交换单株进行背景和目标片段选择(Chen等,2014)，筛选到导入目标片段较小，且背景回复好的目标单株一个。
选中的单株自交一次，获得BC3F2，育苗后利用正向选择标记Pi2-4对其进行检测，选择含有目标基因组DNA片段的单株利用水稻全基因组育种芯片RICE60K对其进行背景选择。最终获得目标片段纯合，且背景完全回复的株系1个，命名为A08-19，芯片检测结果见图1。
实施例2‘空育131’导入稻瘟病抗性基因后同源重组片段的确定
为了确定导入的稻瘟病抗性基因片段大小，同时为了保护该导入片段，发明人对‘空育131’导入稻瘟病抗性基因DNA片段的纯合单株进行了目标基因组DNA片段两侧同源重组片段的测序。首先，通过SNP芯片检测结果初步确定，A08-19抗稻瘟病基因重组DNA片段区段上游同源重组片段位于两个SNP标记R0610016649CT和R0610132417TC之间约115.7kb区域(第6染色体10016649bp～10132417bp)，下游同源重组片段位于两个SNP标记R0610424502CT和F0610565956CA之间约141.5kb区域(第6染色体10424502bp～10565956bp)。
根据上述确定的两个区间，通过筛选多态性标记和测序手段，最终将A08-19抗稻瘟病基因重组DNA片段上游同源重组片段定位于第6染色体的10086549bp到10089163bp区间，下游同源重组片段定位于10438405bp到10441229bp区间。
在此基础上，设计引物，以受体亲本‘空育131’和供体亲本‘K22’为对照，对A08-19、‘空育131’和‘K22’的上述各区段进行扩增，以扩增产物为模板，利用Sanger测序法进行测序，扩增引物及测序引物见表2，测序结果见图2和图3。
A08-19抗稻瘟病基因重组DNA片段上游同源重组片段测序长度为2422bp(SEQIDNo.1)。1-768bp为受体‘空育131’的基因组区段，与供体‘K22’比较，存在18个SNP，4个Indel，其中在680-700bp区间存在一个较大的Indel，为(GGT)3。769-1111bp这一343bp区段为同源重组区段。1112-2422bp为供体‘K22’基因组片段，与‘空育131’比较，存在27个SNP包括3个连续2个碱基的差异，1个Indel。
A08-19抗稻瘟病基因重组DNA片段下游同源重组片段测序长度为2338bp(SEQIDNo.2)。1-158bp为供体‘K22’的基因组区段，与‘空育131’比较，存在2个SNP，1个Indel其序列为ACTC。159-1613bp这一1455bp区段为同源重组区段。1614-2338bp为受体‘空育131’的基因组区段，与供体‘K22’比较，存在2个SNP，1个Indel其序列为TT。
将A08-19所含的抗稻瘟病基因重组DNA片段命名为RecA08-19。图4为RecA08-19抗稻瘟病基因重组DNA片两侧同源重组片段的结构图。(A)为基因上游同源重组片段结构图；(B)为基因下游同源重组片段结构图。上方碱基为供体‘K22’的SNP或InDel标记，下方碱基为受体‘空育131’的SNP或InDel标记。灰色区段为来源于‘空育131’基因组区段，黑色区段为来源于‘K22’基因组区段，白色区段为同源重组区段。横坐标为片段长度，以碱基对数目(bp)为单位。
表2RecA08-19抗稻瘟病基因重组DNA片段同源重组片段扩增及测序引物信息
实施例3‘空育131’导入抗稻瘟病基因重组DNA片段后抗性鉴定
为了鉴定目标单株的抗性效果，对A08-19、‘空育131’、谷梅4号及丽江新团黑谷进行室内种植，将其培养至3-4叶期后采用如下方法进行鉴定：
从2013年采集至黑龙江省农科院病圃以及黑龙江省七星农场的稻瘟病病叶中分离的10株稻瘟菌菌株作为接种菌株。编号分别为13-7101、13-7102、13-7103、13-7104、13-7105、13-7201、13-7202、13-7203、13-7204和13-7205。菌株采用纸片法-20℃保存，使用前将纸片取出至PDA培养基活化(去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g)，5天后取边缘1厘米见方大小的新鲜菌丝块转接至高粱粒培养基中(高粱粒500g加入1.5L蒸馏水，煮至沸腾后滤去液体，将高粱粒捞出装入三角瓶，湿热灭菌20分钟)，28℃黑暗培养10天至菌丝长满高粱粒，期间每隔一天将高粱粒摇散。然后将高粱粒摊在无菌纱布上，盖上无菌的潮湿纱布，在25℃，12h光照条件下培养4-5天至大量孢子产生，用无菌水(含0.02％吐温20)洗下孢子，等浓度混合13-7101、13-7102、13-7103、13-7104、13-7105以及13-7201、13-7202、13-7203、13-7204、13-7205成为两组接种菌株，调整浓度至5×105个/ml。
用两组孢子分别喷雾接种A08-19、‘空育131’、谷梅4号及丽江新团黑谷，每组孢子混合液接种三个重复。接种后罩上透明罩子，28℃黑暗培养24h，然后16h光照培养6天后调查。调查标准为0级(高抗，HR)：没有症状；1级(抗，R)：很小的褐色病斑；2级(中抗，MR)：直径约为1mm的褐色病斑；3级(MS，中感)：直接约为2-3mm的带圆形病斑，中央灰色，边缘褐色；4级(感，S)：长约1-3cm的椭圆形病斑，中央灰色，边缘褐色；5级(高感，HS)：长且宽的大椭圆形病斑，病斑融合成片，至叶片病死。其中0-2级为抗病，3-5级为感病。接种结果见表3和图5。
表3A08-19接种稻瘟菌抗性表现
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献：
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Claims (6)
1.含抗稻瘟病基因重组DNA片段植株的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以水稻‘空育131’为轮回亲本，含抗稻瘟病基因DNA片段的‘K22’为供体亲本进行杂交和回交，获得BC1F1代；利用正向选择标记Pi2-4和负向选择标记RM19814、RM19835对BC1F1代进行抗稻瘟病基因DNA片段单侧同源重组片段筛选，并用水稻全基因组育种芯片RICE6K对其进行背景选择；
(2)选择背景回复较好的重组单株与受体亲本‘空育131’进行回交，获得BC2F1代，利用正向选择标记Pi2-4对其进行检测，选择含有抗稻瘟病基因DNA片段的重组单株，然后用水稻全基因组育种芯片RICE6K对其进行背景选择；
(3)选择背景回复好的重组单株再次与受体亲本‘空育131’进行回交，获得BC3F1代，利用正向选择标记Pi2-4和负向标记RM19814、RM19835对BC3F1代进行抗稻瘟病基因DNA片段另一侧同源重组片段筛选，并利用水稻全基因组育种芯片RICE60K对其进行背景选择，筛选到导入目标片段小，且背景回复好的重组单株；
(4)选中的重组单株自交一次，获得BC3F2代；利用正向选择标记Pi2-4对BC3F2代进行检测，并利用水稻全基因组育种芯片RICE60K对其进行背景选择，最终获得目标基因组DNA片段纯合，且背景完全回复的含抗稻瘟病基因重组DNA片段的水稻植株；
其中，所述抗稻瘟病基因重组DNA片段两侧的同源重组片段的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。
2.利用权利要求1所述方法获得的抗稻瘟病基因重组DNA片段，其特征在于，该片段两侧的同源重组片段的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。
3.用于检测权利要求2所述抗稻瘟病基因重组DNA片段的方法，其特征在于，根据该片段两侧的同源重组片段的核苷酸序列，分别设计特异性PCR扩增引物，以待测水稻基因组为模板，进行PCR反应，并分析PCR扩增产物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用Sanger测序法分析PCR扩增产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，用于扩增及检测SEQIDNo.1所示的同源重组片段的引物组合为：
组合I
扩增引物：A08X27F:5’-GATTCCTTGTAACTGCGAGAC-3’
A08X27R:5’-CTCACAATACCTTACCCACC-3’
测序引物：A08X27F:5’-GATTCCTTGTAACTGCGAGAC-3’
组合II
扩增引物：A08X15F:5’-TTGAGTTGTAATGCTGGTGAC-3’
A08X15R:5’-TTAGCTTACCTCAAATTACCG-3’
测序引物：A08X15F:5’-TTGAGTTGTAATGCTGGTGAC-3’
组合III
扩增引物：A08X16F:5’-CTGTCCCCAAAAGCTTGATG-3’
A08X16R:5’-CACGCCCTAATACTACTACCTCC-3’
测序引物：A08X16F:5’-CTGTCCCCAAAAGCTTGATG-3’。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，用于扩增及检测SEQIDNo.2所示的同源重组片段的引物组合为：
组合IV
扩增引物：A08X23F:5’-TCGAATTTACTACCCGTGAGC-3’
A08X23R:5’-TTTGGCTCTGACCCGCTTG-3’
测序引物：A08X23F:5’-TCGAATTTACTACCCGTGAGC-3’
组合V
扩增引物：A08X42F:5’-CAGTTGGGTCGGAAAGCTC-3’
A08X42R:5’-GATACATACCCGCACATTCG-3’
测序引物：A08X42F:5’-CAGTTGGGTCGGAAAGCTC-3’
A08X42R:5’-GATACATACCCGCACATTCG-3’
组合VI
扩增引物：A08X40F:5’-TCCATGGTGGTAACTGGTATG-3’
A08X40R:5’-AAAGTTGAGGGCGATTGTG-3’
测序引物：A08X40F:5’-TCCATGGTGGTAACTGGTATG-3’
组合VII
扩增引物：A08X36F:5’-TGGACTACATTAGACGCATTG-3’
A08X36R:5’-AAAGTACATCGAGTCCTTGAG-3’
测序引物：A08X36F:5’-TGGACTACATTAGACGCATTG-3’。
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