CN1307304C - 用于鉴定黄瓜霜霉病抗性的引物序列及其鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于鉴定黄瓜霜霉病抗性的引物序列及其鉴定方法，引物序列是由具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列的上游引物和具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列的下游引物组成；一种鉴定黄瓜霜霉病抗性的方法，它的步骤是(1)提取黄瓜基因组DNA；(2)用序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列及序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列进行PCR扩增；(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜霜霉病的抗性，本发明鉴定结果与田间抗病吻合率达94.7%，而且具有快速、准确、不受环境条件影响等优点，在黄瓜霜霉病抗性筛选上具有很大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术中的DNA序列，及其利用DNA序列鉴定黄瓜霜霉病抗性的方法。
背景技术
黄瓜霜霉病[Pseudoperonospora cubensis]是一种广泛发生的世界性植物病害。该病靠气流传播，其发生和流行与植物生长环境有关，特别是与空气的温、湿度的关系最大，特别是湿度。该病主要为害叶片，偶尔也能为害茎、卷须和花梗等。在适宜发病的环境下，黄瓜幼苗便可感病，成株期发病多在植株进入开花结果以后。发病初期，叶上出现水渍状浅绿色斑点，扩大后受叶脉限制成多角形，其色泽变为黄绿、黄色，最后为褐色，但病斑边缘仍呈黄绿色，病部与健部交界处不明显。潮湿环境下叶背部病斑上长出紫黑色的霉层(孢子囊及孢囊梗)。此病发展迅速，一、两周内即可使整株叶片(除顶端数片嫩叶外)枯死，直接影响结瓜，流行年份减产可达30-50％，有的田块因此发生只采1-2次瓜后即提早拔秧，给生产造成很大威胁，已成为影响世界各国黄瓜产量的重要问题。
我国十分重视黄瓜的抗病育种研究。从上个世纪50年代末，育种家就通过常规杂交、自交等育种方法进行抗霜霉病和抗白粉病等的选育工作，并取得了显著成就，先后育成了一批优良品种，在生产上取得了可观的经济效益。
常规的抗病育种方法虽然取得了显著的成就，但也存在许多缺点。在传统的育种工作中，育种家们首先得进行品种或品系间的杂交，然后从分离后代中通过表型观察选择理想的重组基因型，由于抗病材料的选择和田间鉴定过程复杂，周期相对较长，而且可靠性差，使得这个过程大量的消耗人力、物力和财力。加之黄瓜霜霉病的病原(Pseudoperonosporacubensis(Berk.et Curt.)Rostov.)——古巴假霜霉菌(属鞭毛菌亚门假霜霉菌属真菌)为专性寄生菌，只能在活体寄主上存活，由于黄瓜霜霉病的发生受季节限制，在非发病季节对该病的田间鉴定工作则难以进行。
RFLP、RAPD、SCAR等分子标记技术的问世，为育种提供了一条新途径。分子标记可以直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题。
分子标记技术在寻找与目标性状连锁的分子标记方面已有诸多报道，与黄瓜霜霉病抗性相关基因紧密连锁的分子标记目前尚未见报道。在利用分子标记进行抗性鉴定的过程中，特异性的引物序列是关键。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于鉴定黄瓜霜霉病抗性的引物序列；
本发明的另一个目的是提供一种鉴定黄瓜霜霉病抗性的方法；
本发明的第三个目的是提供另一种用于鉴定黄瓜霜霉病抗性的引物序列；
本发明的最后一个目的是提供另一种鉴定黄瓜霜霉病抗性的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种用于鉴定黄瓜霜霉病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物组成，上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
一种鉴定黄瓜霜霉病抗性的方法，它是使用上述引物序列鉴定黄瓜霜霉病的抗性，它包括如下步骤：(1)提取黄瓜基因组DNA；(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入：所述黄瓜基因组DNA15～30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列20～40ng、dNTP0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性180～300秒，94℃变性60秒，50～59℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35个循环，再72℃延伸300～420秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95℃变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜霜霉病的抗性。
第二种用于鉴定黄瓜霜霉病抗性的引物序列，它包括两组引物，第一组引物由第一组上游引物和第一组下游引物组成，所述第一组上游引物具有序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列，所述第一组下游引物具有序列表中SEQ ID No4所述的核苷酸序列，第二组引物由第二组上游引物和第二组下游引物组成，所述第二组上游引物具有序列表中SEQ ID No5所述的核苷酸序列，所述第二组下游引物具有序列表中SEQ ID No6所述的核苷酸序列。
第二种鉴定黄瓜霜霉病抗性的方法，它是使用第二种用于鉴定黄瓜霜霉病抗性的引物序列来鉴定黄瓜霜霉病的抗性，它包括如下步骤：(1)提取黄瓜基因组DNA；(2)进行PCR扩增，在两支PCR扩增专用薄壁管中分别放入：所述黄瓜基因组DNA15～30ng、在第一支扩增专用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ IDNo4所述的核苷酸序列20～40ng，在第二支扩增专用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No5所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No6所述的核苷酸序列20～40ng，再在两支PCR扩增专用薄壁管中分别加入dNTP0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述两支PCR扩增专用薄壁管进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性180～300秒，94℃变性60秒，48～55℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35个循环，再72℃延伸300～420秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析：将两个扩增产物均采用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，然后点样于事先准备好的含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶上，采用5V/cm的电压进行电泳使溴酚蓝泳至凝胶的2/3，紫外观察箱观察照相。(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜霜霉病的抗性。
有益效果：
本发明鉴定结果与田间抗病吻合率达94.7％，而且具有快速、准确、不受环境条件影响等优点，在黄瓜霜霉病抗性筛选上具有很大的应用价值。
附图说明
图1为第一种鉴定黄瓜霜霉病抗性的电泳图；
图2为第二种鉴定黄瓜霜霉病抗性的第一支扩增产物的电泳图；
图3为第二种鉴定黄瓜霜霉病抗性的第二支扩增产物的电泳图；
图4显示了22bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No1)；
图5显示了20bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No2)；
图6显示了20bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No3)；
图7显示了21bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No4)；
图8显示了20bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No5)；
图9显示了22bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No6)。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步的说明，下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
一种鉴定黄瓜霜霉病抗性的方法
(1)提取黄瓜基因组DNA；(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入：所述黄瓜基因组DNA20ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列30ng、序列表中SEQ IDNo2所述的核苷酸序列30ng、dNTP0.2mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1.0单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性200秒，94℃变性60秒，55℃退火50秒，72℃延伸90秒，30个循环，再72℃延伸350秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95℃变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜霜霉病的抗性。由于抗病单株、感病单株或中间类型单株经扩增以后产生不同分子量的DNA片段，在凝胶上分离时其在凝胶上的迁移速率不同，从而形成位置上存在差异的条带，通过条带在凝胶上的相对位置就可对黄瓜霜霉病材料的抗性进行快速鉴定。如图1所示：1为指示DNA标准条带的分子量180bp；2为指示DNA标准条带的分子量160bp，3为抗性带，4为感性带，1～8为抗病单株；9～16为感病单株，17～27为中间类型单株，M为DNA标准，纯合抗性株仅有抗性带，纯合感性株仅有感性带，杂合类型同时具有抗性带和感性带。
实施例2
一种鉴定黄瓜霜霉病抗性的方法
(1)提取黄瓜基因组DNA；(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入：所述黄瓜基因组DNA15ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20ng、序列表中SEQ IDNo2所述的核苷酸序列20ng、dNTP0.15mM、Mg2+1.2mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性180秒，94℃变性60秒，50℃退火40秒，72℃延伸60秒，25个循环，再72℃延伸300秒，扩增完成：(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离：在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95℃变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜霜霉病的抗性。
实施例3
一种鉴定黄瓜霜霉病抗性的方法
(1)提取黄瓜基因组DNA；(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入：所述黄瓜基因组DNA30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列40ng、序列表中SEQ IDNo2所述的核苷酸序列40ng、dNTP0.25mM、Mg2+2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性300秒，94℃变性60秒，59℃退火60秒，72℃延伸120秒，35个循环，再72℃延伸420秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入变性凝胶上样缓冲液，于95℃变性300秒，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯胺凝胶上，70W恒功率电泳至溴酚兰刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后在可见光下观察、照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜霜霉病的抗性。
实施例4
第二种鉴定黄瓜霜霉病抗性的方法
(1)提取黄瓜基因组DNA；(2)进行PCR扩增，在两支PCR扩增专用薄壁管中分别放入：所述黄瓜基因组DNA20ng、在第一支扩增专用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列30ng、下游引物序列表中SEQ ID No4所述的核苷酸序列30ng、在第二支扩增专用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No5所述的核苷酸序列30ng、序列表中SEQ IDNo6所述的核苷酸序列30ng、再在两支PCR扩增专用薄壁管中分别加入dNTP0.20mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1.0单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述两支PCR扩增专用薄壁管进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性250秒，94℃变性60秒，51℃退火50秒，72℃延伸90秒，30个循环，再72℃延伸350秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析：将两个扩增产物均采用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，然后点样于事先准备好的含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶上，采用5V/cm的电压进行电泳使溴酚蓝泳至凝胶的2/3，紫外观察箱观察照相。(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜霜霉病的抗性，图2所示的是第一支扩增产物，1为指示DNA标准条带的分子量200bp；2为抗性带；M为DNA标准；泳道1及3～9为抗病单株；泳道2及10～16为感病单株；17～27为中间类型单株，在图2中，抗病单株和中间类型单株具有抗性带，而感病单株无此条带，据此可鉴定出纯合感病个体；图3所示的是第二支扩增产物，1为指示DNA标准条带的分子量200bp；2为指示DNA标准条带的分子量100bp；3为感性带；M为DNA标准；泳道1及3～9为抗病单株；泳道2及10～16为感病单株；17～28为中间类型单株，在图3中，感病单株和中间类型单株均具有感性带，而抗病单株无此条带，据此可鉴定出纯合抗病个体。将图2和图3结合在一起观察和分析，可以作为一个共显性标记。在第一组中无带的为纯合感性带，在第二组中无带的为纯合抗性株，在两组中均有条带的为杂合中间类型，据此可快速鉴定出纯合抗性株、纯合感性株及杂合中间类型，实现黄瓜霜霉病抗性的快速鉴定。
实施例5
第二种鉴定黄瓜霜霉病抗性的方法
(1)提取黄瓜基因组DNA；(2)进行PCR扩增，在两支PCR扩增专用薄壁管中分别放入：所述黄瓜基因组DNA15ng、在第一支扩增专用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列20ng、序列表中SEQ ID No4所述的核苷酸序列20ng、在第二支扩增专用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No5所述的核苷酸序列20ng、序列表中SEQ ID No6所述的核苷酸序列20ng、再在两支PCR扩增专用薄壁管中分别加入dNTP0.15mM、Mg2+1.2mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述两支PCR扩增专用薄壁管进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性180秒，94℃变性60秒，48℃退火40秒，72℃延伸60秒，25个循环，再72℃延伸300秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析：将两个扩增产物均采用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离：在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，然后点样于事先准备好的含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶上，采用5V/cm的电压进行电泳使溴酚蓝泳至凝胶的2/3，紫外观察箱观察照相。(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜霜霉病的抗性。
实施例6
第二种鉴定黄瓜霜霉病抗性的方法
(1)提取黄瓜基因组DNA；(2)进行PCR扩增，在两支PCR扩增专用薄壁管中分别放入：所述黄瓜基因组DNA30ng、在第一支扩增专用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列40ng、序列表中SEQ ID No4所述的核苷酸序列40ng、在第二支扩增专用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No5所述的核苷酸序列40ng、序列表中SEQ ID No6所述的核苷酸序列40ng、再在两支PCR扩增专用薄壁管中分别加入dNTP0.25mM、Mg2+2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述两支PCR扩增专用薄壁管进行PCR扩增，扩增条件为；94℃预变性300秒，94℃变性60秒，55℃退火60秒，72℃延伸120秒，35个循环，再72℃延伸420秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析：将两个扩增产物均采用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，然后点样于事先准备好的含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶上，采用5V/cm的电压进行电泳使溴酚蓝泳至凝胶的2/3，紫外观察箱观察照相。(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜霜霉病的抗性。
Claims (2)
1.一种用于鉴定黄瓜霜霉病抗性的引物序列，其特征是它包括两组引物，第一组引物由第一组上游引物和第一组下游引物组成，所述第一组上游引物具有序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列，所述第一组下游引物具有序列表中SEQ ID No4所述的核苷酸序列，第二组引物由第二组上游引物和第二组下游引物组成，所述第二组上游引物具有序列表中SEQ ID No5所述的核苷酸序列，所述第二组下游引物具有序列表中SEQ ID No6所述的核苷酸序列。
2.一种鉴定黄瓜霜霉病抗性的方法，它包括如下步骤：
(1)提取黄瓜基因组DNA；
(2)进行PCR扩增，在两支PCR扩增专用薄壁管中分别放入：所述黄瓜基因组DNA15～30ng、在第一支扩增专用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No4所述的核苷酸序列20～40ng，在第二支扩增专用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No5所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No6所述的核苷酸序列20～40ng，再在两支PCR扩增专用薄壁管中分别加入dNTP0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述两支PCR扩增专用薄壁管进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性180～300秒，94℃变性60秒，48～55℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35个循环，再72℃延伸300～420秒，扩增完成；
(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析：将两个扩增产物均采用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，然后点样于事先准备好的含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶上，采用5V/cm的电压进行电泳使溴酚蓝泳至凝胶的2/3，紫外观察箱观察照相。
(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜霜霉病的抗性。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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