CN107012223A

CN107012223A - 一种与唇腭裂易感性诊断相关的snp标志物及其应用

Info

Publication number: CN107012223A
Application number: CN201710251377.8A
Authority: CN
Inventors: 潘永初; 卢云; 马兰; 王林
Original assignee: Affiliated Stomatological Hospital of Nanjing Medical University
Current assignee: Affiliated Stomatological Hospital of Nanjing Medical University
Priority date: 2017-04-18
Filing date: 2017-04-18
Publication date: 2017-08-04

Abstract

本发明公开了一种与唇腭裂易感性辅助诊断相关的SNP标志物rs2262251的基因型，并据此开发了其在唇腭裂易感性的诊断试剂盒中的应用，本发明所述的标志物和应用可使得唇腭裂易感性的诊断更加方便易行，从而能够促进疾病的早期预防和诊断，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

Description

一种与唇腭裂易感性诊断相关的SNP标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种与唇腭裂易感性诊断相关的SNP标志物及其在制备唇腭裂易感性诊断试剂盒中的用途。

背景技术

唇腭裂是人类最常见的先天发育畸形之一，大约占新出生儿的1:700～4:1000。唇腭裂患儿终生深受疾病困扰、进食苦难、发音障碍等等。尽管有多学科联合治疗的措施，但仍给家庭和社会带来沉重的负担。2016年，最新的调查显示平均每个患儿的经济影响可达5510～50634美元。我国每500～600个新生儿就有一个唇腭裂患者，位居新生儿常见病第三位。唇腭裂的发病机制尚未完全阐明，但病因学研究已经表明，以往的研究证实唇腭裂是遗传和环境因素等因素共同致病的复杂过程。尽管研究已表明环境因素如：吸烟、X线等对于唇腭裂的重要性，然而接触相同的环境危险因素却只有极少数个体发生唇腭裂，说明个体遗传特征决定了对唇腭裂的易感性。因此，对唇腭裂易感因素进行研究，以寻找唇腭裂高风险基因或位点，对于实现唇腭裂早期诊断和预防具有重要的临床意义。

基因多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型(genotype)或等位基因(allele)，亦称遗传多态性(genetic polymorphism)或基因多态性。在已识别的遗传变异中，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是最为常见的变异类型，主要是指由于单个核苷酸的变异所引起的基因组DNA序列的变化。SNP一般只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)、颠换(transversion)或缺失等所引起，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，估计其总数超过300万个。

不同个体对环境危险因素的反应不同，唇腭裂的易感性也不同，这种易感性被认为与个体自身的遗传因素密切相关，其中大部分也是由SNPs引起。因此，探寻SNPs与唇腭裂的关联来进一步寻找其易感标志物，具有潜在的生物意义和临床意义。

发明内容

本发明提供了rs2262251位点G等位基因与唇腭裂的相关性，并据此开发了其在唇腭裂易感性的诊断试剂盒中的应用。

本发明的目的之一是提出一种与唇腭裂易感性辅助诊断相关的SNP标志物。

本发明的目的之二是提供检测上述SNP标志物的特异性引物对。

本发明的目的之三是提供上述SNP标志物在制备唇腭裂易感性诊断试剂盒中的应用。

本发明的目的之四是提供上述特异性引物对在制备检测rs2262251位点基因型试剂盒或唇腭裂易感性诊断试剂盒中的应用。

本发明的目的之五是提供唇腭裂易感性辅助诊断试剂盒。

发明人通过提供一组与唇腭裂易感性高度相关的SNP位点，并研制出可便于临床应用的唇腭裂易感性辅助诊断试剂盒，为唇腭裂易感性的筛查和诊断提供数据支持。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一方面本发明提供了一种与唇腭裂易感性辅助诊断相关的SNP标志物rs2262251，存在G/C多态性，当其基因型为GG时，判断个体为唇腭裂易感性个体。

另一方面，本发明提供了用于检测SNP位点基因型的试剂，所述试剂可以是采用本领域已知的任何技术检测SNP的试剂，只要其能够检测样本中rs2262251位点基因型即可。

本发明提供了一种检测rs2262251位点的方法，所述检测方法步骤如下：

(1)提取基因组DNA；

(2)使用Taqman检测法检测rs2262251位点基因型。使用用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物。

本发明还提供检测所述SNP标志物的特异性引物对：正向引物序列如SEQ ID No.1所示；反向引物序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供检测所述SNP标志物的探针：探针FAM序列如SEQ ID No.3所示，探针VIC序列如SEQ ID No.4所示。在本发明的一个具体实施方案中，检测SNP位点基因型的试剂包括使用Tanman检测SNP位点基因型所需的试剂，包括：使用Taqman检测SNP位点基因型所需的试剂包括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物，如下所示：探针FAM为5’-TACAGGGCCCCGCC-3’(如SEQ ID No.3所示)，探针VIC为5’-TTACAGGGGCCCGC-3’(如SEQ IDNo.4所示)，正向引物为5’-TGATCTCTGCTCCTGCAACCT-3’(如SEQ ID No.1所示)，反向引物为5’-GAAACCCCATCTCTACTGAAAATAACA-3’(如SEQ ID No.2所示)。

本发明还提供了所述SNP标志物对在制备唇腭裂易感性辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明还提供了所述SNP标志物的特异性引物对在制备检测rs2262251位点基因型试剂盒或唇腭裂易感性辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明还提供了所述SNP标志物的探针在制备检测rs2262251位点基因型试剂盒或唇腭裂易感性辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明还提供了检测rs2262251位点基因型的试剂在制备检测SNP位点基因型的试剂盒中的用途，所述试剂盒可以包括采用本领域已知的任何技术检测SNP的试剂，只要其能够检测样本中rs2262251位点基因型即可。在本发明的一个具体的实施方案中，用于检测rs2262251位点基因型的试剂盒包括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物。引物序列探针FAM为5’-TACAGGGCCCCGCC-3’，探针VIC为5’-TTACAGGGGCCCGC-3’，正向引物为5’-TGATCTCTGCTCCTGCAACCT-3’，反向引物为5’-GAAACCCCATCTCTACTGAAAATAACA-3’。

本发明还提供了用于检测rs2262251位点基因型的试剂在制备用于诊断唇腭裂易感性的试剂盒中应用，所述试剂盒可以为采用本领域已知的任何技术检测SNP的试剂，只要其能够检测样本中rs2262251位点基因型即可。在本发明的一个具体实施方案中，用于检测rs2262251位点基因型的试剂盒包括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物。引物探针FAM为5’-TACAGGGCCCCGCC-3’，探针VIC为5’-TTACAGGGGCCCGC-3’，正向引物为5’-TGATCTCTGCTCCTGCAACCT-3’，反向引物为5’-GAAACCCCATCTCTACTGAAAATAACA-3’。

又一方面，本发明提供了一种唇腭裂易感性辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中的rs2262251。

本发明所述的用于诊断唇腭裂易感性的试剂盒，该试剂盒可以包括采用本领域已知的任何技术检测SNP的试剂，只要其能够检测样本中rs2262251位点基因型即可。

优选地，所述的诊断试剂盒，该试剂盒还含有上述SNP标志物的特异性扩增引物。

优选地，所述的诊断试剂盒，该试剂盒还含有上述SNP标志物的探针。在本发明的一个具体实施方案中，用于诊断唇腭裂易感性的试剂盒包括用于SNP位点在内的核苷酸序列的引物，如下所示：探针FAM为5’-TACAGGGCCCCGCC-3’，探针VIC为5’-TTACAGGGGCCCGC-3’，正向引物为5’-TGATCTCTGCTCCTGCAACCT-3’，反向引物为5’-GAAACCCCATCTCTACTGAAAATAACA-3’。

优选地，本发明用于检测rs2262251位点基因型的试剂盒或用于诊断唇腭裂易感性的试剂盒还可以包括DNA提取常用试剂，如苯酚、氯仿、异戊醇或乙醇等。

本发明提供的SNP标志物作为唇腭裂易感性辅助诊断的标志物的优越性在于：

(1)SNP是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性；

(2)SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于唇腭裂易感性的辅助诊断，有助于反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持；

(3)通过SNP生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得唇腭裂易感性的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

图1表示Taqman基因分型样本处理步骤示意图；

图2表示Taqman基因分型结果示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明人群验证采用Tanqman基因分型平台。

Taqman等位基因分型技术是美国ABI公司研发的SNP分型技术，是目前较为公认的基因分型的标准之一。主要原理在PCR反应时加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因，探针序列的5’端为报告荧光基团(reporter),3’端为淬灭荧光基团(quencher)。在PCR过程中，两个探针能与模版等位基因序列特异的退火互补结合。此时探针序列完整，报告荧光基团被淬灭荧光基团抑制而无信号发出。当子链复制到探针与模版结合处时淬灭作用从而发出荧光。两个探针的5’端标有不同的荧光(FAM，VIC或HEX)，3’端标有MGB淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP等位基因型。

实施例1rs2262251与唇腭裂易感性相关性研究

1.研究对象

发明人于2001年开始至2012年从南京医科大学附属医院收集了大量的中国汉族唇腭裂患者及正常人群的血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了符合下列样本进行Taqman分型实验样品：

(1)诊断明确的无家族史散发型唇腭裂患者1398例；

(2)无唇腭裂家族史的健康对照1424例；

并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。

2.实验步骤

2.1血标本的收集及基因组DNA的提取

全部研究对象均采用真空EDTA抗凝采血管采集外周静脉血3ml，3000rpm/min离心6min，分离血浆、白细胞层和红细胞，将血浆分离之后，混合剩余血液，分别装于1.5ml冻存管，置-80℃冷冻储存备用，详细步骤见图1所示。

采用酚-氯仿法和QIAGEN试剂盒提取基因组DNA，采用紫外分光光度法(260/280比值)确定DNA纯度，OD₂₆₀测定DNA浓度，统一标化后-20℃贮存备用，采用酚-氯仿法提取基因组DNA具体步骤如下：

(1)将细胞悬液移入5ml离心管，加入溶血试剂，振荡混匀后4000rpm/min离心10min，弃上清，重复此过程一次；

(2)沉淀中加入1ml抽提液，混匀后加入8μl蛋白酶K，37℃水浴过夜；

(3)取出后稍冷却，加入1mlTris-饱和酚，上下颠倒混匀15min，4000rpm/min离心10min；

(4)小心吸取上清，加入3M pH5.0的醋酸钠60μl，再加入与上清液等体积的异戊醇，轻摇后可见白色絮状沉淀物，10000rpm/min离心2min；

(5)沉淀中加入75％乙醇约1ml，8000rpm/min离心2min，弃上清；

(6)沉淀中加入无水乙醇约1ml，8000rpm/min离心2min，弃上清后干燥；

(7)干燥产物加入TE缓冲液100μl溶解；

(8)测定所提DNA浓度；

(9)放入-80℃保存。

QIAGEN试剂盒提取基因组DNA具体步骤如下：

(1)在装有400μl血的1.5mlEP管中加40μl QIAGEN Protease，涡旋混匀使其充分反应，简要离心；

(2)加400μl Buffer AL至血样中，上下震荡，涡旋至颜色出现黄绿色；

(3)置于56℃烘箱15-20min后取出，简要离心；

(4)加400μl无水乙醇至血样中，涡旋15s，混匀后简要离心；

(5)将试剂盒中配有的离心柱摆好，混合液小心移至离心柱中，不要浸渍边缘，盖紧盖子，离心，8000r/min，2min；

(6)将柱移至一个新的2ml收集管；

(7)打开柱，加入500μl Buffer AW1，盖紧盖子，离心，8000r/min，2min，移至新的2ml收集管；(如有必要，重复此步骤)

(8)加入500μl Buffer AW2，盖紧盖子，离心，13000-14000r/min，5min；

(9)移至新的2ml收集管，离心，13000-14000r/min，2min；

(10)柱放入1.5mlEP管，打开柱，加入100μl Buffer AE，室温孵化15min；

(11)测定所提DNA浓度。

(12)放入-80℃保存。

2.2 Taqman基因分型

2.2.1探针与引物

探针及引物由南京骥骜生物公司合成。探针FAM：5’-TACAGGGCCCCGCC-3’,探针VIC：5’-TTACAGGGGCCCGC-3’；引物序列为F：5’-TGATCTCTGCTCCTGCAACCT-3’，R：5’-GAAACCCCATCTCTACTGAAAATAACA-3’。

2.2.2实时定量PCR扩增

使用ABI 7900HT型荧光定量PCR仪进行基因分型。每个384孔反应平板中5μl反应体系，含有MasterMix 2.0μl,正反向引物各0.25μl，Taqman探针各0.125μl，DNA样本0.3-0.5μl，去离子水1.25μl。采用高度透光度盖膜覆盖384板，短暂离心去泡，放入ABI7900HT荧光定量PCR仪上进行分型检测。反应程序为：

50℃，2min仪器启动预热；95℃，10min使DNA聚合酶活化；95℃，15sec使DNA变性，60℃，1min使引物和探针退火及延伸，共40个循环。

扩增循环结束后，读取扩增后荧光信号，运用SDS 2.0软件进行基因型判读，分型结果如图2(其中：GG野生型，·GC杂合型，◆CC突变型)和表1所示。

3.结果

表1 关联性研究

^aOR,比值比；CI.可信区间。

根据检测结果，病例组中三种基因型CC、GC、GG分布频率为9.51％、44.35％和46.14％，与对照组的基因型分布存在统计学差异。隐性模型发现，GG基因型与GC/CC基因型相比，能显著增加唇腭裂易感性的患病风险(OR＝0.82，95％CI＝0.70-0.96)。相加模型显示，G等位基因与唇腭裂的发病风险相关(OR＝0.83，95％CI＝0.74-0.93)。从而证实位点rs2262251突变能够显著增加中国汉族人群唇腭裂的患病风险，该位点的检测可用于对个体罹患唇腭裂风险的预测。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 南京医科大学附属口腔医院

<120> 一种与唇腭裂易感性诊断相关的SNP标志物及其应用

<130> 2017

<160> 4

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213>人工合成序列

<400> 1

tgatctctgc tcctgcaacc t 21

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213>人工合成序列

<400> 2

gaaaccccat ctctactgaa aataaca 27

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213>人工合成序列

<400> 3

tacagggccc cgcc 14

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213>人工合成序列

<400> 4

ttacaggggc ccgc 14

Claims

1.一种与唇腭裂易感性辅助诊断相关的SNP标志物rs2262251，其特征在于存在G/C多态性，基因型为GG时，判断为唇腭裂易感性个体。

2.一种检测权利要求1所述SNP标志物的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)提取基因组DNA；

(2)使用Taqman检测法检测rs2262251位点基因型。

3.权利要求2所述的方法，其特征在于，检测rs2262251位点基因型的特异性引物对为：正向引物序列如SEQ ID No.1所示；反向引物序列如SEQ ID No.2所示。

4.权利要求2所述的方法，其特征在于，检测rs2262251位点基因型的探针为：探针FAM序列如SEQ ID No.3所示，探针VIC序列如SEQ ID No.4所示。

5.一种检测权利要求1所述SNP标志物的特异性引物对，其特征在于，正向引物序列如SEQ ID No.1所示；反向引物序列如SEQ ID No.2所示。

6.一种检测权利要求1所述SNP标志物的探针，其特征在于，探针FAM序列如SEQ IDNo.3所示，探针VIC序列如SEQ ID No.4所示。

7.权利要求1所述SNP标志物在制备唇腭裂易感性辅助诊断试剂盒中的应用。

8.权利要求5所述引物对或权利要求6所述的探针在制备检测rs2262251位点基因型试剂盒或唇腭裂易感性辅助诊断试剂盒中的应用。

9.一种唇腭裂易感性辅助诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测外周血DNA中的rs2262251。

10.权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求5所述引物对和/或权利要求6所述的探针。