CN106987635A

CN106987635A - Ntn1基因易感snp位点及其应用

Info

Publication number: CN106987635A
Application number: CN201710253298.0A
Authority: CN
Inventors: 潘永初; 李丹丹; 马兰; 王林
Original assignee: Affiliated Stomatological Hospital of Nanjing Medical University
Current assignee: Affiliated Stomatological Hospital of Nanjing Medical University
Priority date: 2017-04-18
Filing date: 2017-04-18
Publication date: 2017-07-28
Anticipated expiration: 2037-04-18
Also published as: CN106987635B

Abstract

本专利为NTN1基因易感SNP位点及其应用，公开了一种与非综合征型唇腭裂辅助诊断相关的SNP标志物rs4791331的基因型，存在T和C两种等位基因，其中，T等位基因为风险等位基因，并据此开发了其在非综合征型唇腭裂的诊断试剂盒中的应用。该发明有助于综合评价遗传变异在中国汉族人群NSOC发生发展及转归中的作用，而且对于指导NSOC高危人群的预防和筛查具有重要的意义。

Description

NTN1基因易感SNP位点及其应用

技术领域

本发明属于基因工程及出生缺陷辅助诊断领域，涉及NTN1基因rs4791331突变及其在非综合征型唇腭裂辅助诊断中的应用。

背景技术

非综合征型唇腭裂(nonsyndromicorofacial cleft，NSOC)是一种常见的不伴发其它系统器官畸形的的先天性颅颌面发育异常。它是人类最常见的先天性畸形之一。唇腭裂的发病率因民族、地区及社会经济状况而异，约为1/1000～1/500。据报道，我国NSCL/P的发病率高达0.142‰，居各类新生儿出生缺陷第二位，是导致新生儿死亡的五大病因之一。非综合征唇腭裂不仅影响了患儿的口腔功能，也对患儿的心理健康和生活质量产生了重大的危害，严重影响出生人口素质。虽然完善的多学科综合治疗可以重建口腔功能，但NSOC给患者个人、家庭和社会带来的沉重负担，迫使我们尽快揭示其病因并积极预防。虽然对NSOC的确切病因尚无定论，但遗传和环境两大因素是目前公认的主要病因。根据以往的研究，NSOC的发病具有明显的家族集中性。NSOC的遗传率为60％-78％。这说明，遗传因素在NSOC发病中发挥着重要作用。

NSOC是多基因遗传性疾病，参与其发病的基因不止一个，每个基因的作用程度和方式不同，不同基因之间、基因和环境之间都存在交互作用，各个致病基因作用于发育的不同环节。因此，研究NSOC的易感基因，探索易感基因与NSOC之间的相互联系，检测易感人群的基因对提高我国人口素质，降低NSOC的发生率有重要意义。

NTN1是编码轴突诱向因子-1(Netrin-1，NTN1)的基因。NTN1是一种高度保守的分泌蛋白，它与其受体DCC和UNC5结合能够介导轴突生长导向，调节轴突的生长，在生长发育中发挥重要作用。它还与神经系统发育、血管形成、癌症发生等生命活动息息相关。在细胞凋亡、破细胞分化、细胞迁移、细胞形态发生中发挥作用。NTN1参与了Netrin信号通路、PKA信号通路等多个信号通路转导，并与年龄相关性黄斑病变、前列腺癌等多种疾病相关。目前国内外对于NTN1基因与NSOC易感性的研究仍在起步阶段，但根据免疫荧光染色结果发现，NTN1蛋白在小鼠胚胎发育时期腭突上皮基底层内侧高表达，这说明在小鼠唇腭部发育过程中，NTN1可能在该部位发挥调控作用。

目前的研究表明，其中，位于染色体17p13上的突变被反复证明了与亚洲人群NSOC易感性相关。该区域的rs4791774在中国汉族人群中与NSOC的关联达到了GWAS水平。这个位点位于NTN1基因的内含子区。Leslie等人对GWAS发现的易感性区域进行的测序研究也发现该区域的突变与NSOC风险相关。这说明NTN1基因内含子区的突变可能是影响NSOC易感性的一个重要因素。进一步探寻该区域与非综合征型唇腭裂相关联的SNPs，具有潜在的生物意义和临床意义。

发明内容

本发明的目的之一是提出一种与非综合征型唇腭裂辅助诊断相关的SNP标志物。本发明提供了SNP位点rs4791331，与亚洲人群NSOC易感性显著相关，rs4791331位点在人群中存在C和T两种等位基因。其中，T等位基因为风险等位基因，就是说携带T等位基因的个体罹患NSOC的风险高于C等位基因携带者。

本发明的目的之二是提供检测上述SNP标志物的特异性引物对。

本发明的目的之三是提供上述SNP标志物在制备非综合征型唇腭裂诊断试剂盒中的应用。

本发明的目的之四是提供上述特异性引物对在制备非综合征型唇腭裂诊断试剂盒中的应用。

本发明的目的之五是提供非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种与非综合征型唇腭裂辅助诊断相关的SNP标志物rs4791331，存在C/T多态性，当基因型为TT时，判断个体为非综合征型唇腭裂易感性个体。

本发明还提供了一种检测rs4791331位点的方法，所述检测方法步骤如下：

(1)提取基因组DNA；

(2)使用TaqMan检测法检测rs4791331位点基因型。

本发明还提供检测所述SNP标志物的特异性引物对：上游引物序列如SEQ ID No.1所示；下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供检测所述SNP标志物的探针：探针C allele序列如SEQ ID No.3所示，探针T allele序列如SEQ ID No.4所示。

所述SNP标志物对在制备非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒中的应用。

所述SNP标志物的特异性引物对在制备检测rs4791331位点基因型试剂盒或非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒中的应用。

所述SNP标志物的探针在制备检测rs4791331位点基因型试剂盒或非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒中的应用。

一种非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中的rs4791331。

本发明的目的是提供一种检测NSOC易感性的基因多态性位点rs4791331，辅助评估NSOC遗传风险性的试剂盒。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒还含有上述SNP标志物的特异性扩增引物。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒还含有上述SNP标志物的探针。

作为一种具体方案，本发明采用的技术方案为：

试剂盒包含NSOC易感基因rs4791331位点检测引物及探针各一对。引物及探针序列如下：

引物序列：上游引物F:CCATCAAGATAACATGAGTAACAATCC

下游引物R:TGAGATGAGTTGTGCTTTTCATTAAGT

探针序列：C allele：FAM-TGTAAACATGAAAGTCTATTA-MGB

T allele：VIC-AAGTGTAAACATAAAAGTCTATTA-MGB

目前，对于NSOC的遗传风险评估领域，已发现了若干与NSOC相关的SNP位点。然而，NSOC属于一种复杂的多基因遗传病，涉及到的易感性位点比较多。本发明的发明人通过对大样本量的中国人群进行病例-对照研究，提供了一个新的NSOC易感性位点。该发明有助于综合评价遗传变异在中国汉族人群NSOC发生发展及转归中的作用，而且对于指导NSOC高危人群的预防和筛查具有重要的意义。

附图说明

图1为rs4791774上下游位点LD图。

具体实施方式

以下结合实例，介绍本发明的具体实施流程。特别声明，实施案例仅用于说明，而不用于限制本发明的适用范围。如无特殊说明，以下实施案例中使用的试剂和仪器均为商业化产品。

实施例1

根据中国汉族人群GWAS研究发现的rs4791774位于NTN1基因内含子区。为进一步筛选功能位点，根据Hapmap数据库对rs4791774上下游200kb展开LD分析，发现rs4791331(r²＝0.99)、rs9891446(r²＝0.85)与其存在高度连锁(图1)。其中，rs4791331与rs4791774完全连锁。我们采用RegulomeDB对其功能进行预测，发现rs4791774评分为4(不结合)，rs4791331评分为2b(可能影响结合)，而rs9891446无预测结果。采用F-SNP预测，rs4791774评分为0.192，rs4791331评分为0.714，rs9891446评分为0.5，分值越高表明该位点具有功能意义的可能性越大。综合两个软件的功能预测结果，rs4791331可能是该区域的功能性位点，它的C>T突变能改变该位置转录因子结合能力。这说明，rs4791331可能才是该区域真正的功能位点。

为进一步预测rs4791331突变对转录因子结合能力的影响，Alibaba2、Patch、Jasper和TFSEARCH软件在本研究中被用于预测突变对转录因子结合能力的改变。其中，被两个或两个以上数据库预测到的转录因子包括：使用Alibaba2、Patch和Jasper三个数据库进行预测都发现当rs4791331位点突变为T等位基因时，能够产生转录因子TBP(The TATAbinding protein)的结合；而TFSEARCH和Jasper数据库同时预测到，当该位点突变为T等位基因时，能产生转录因子SRY(Sex-determining region Y protein)的结合，如表1。

表1 生物信息学预测与rs4791331 C/T等位基因结合的转录因子

实施例2 rs4791331位点与非综合征型唇腭裂遗传风险的关联研究

检测材料：

实验涉及615例经颌面外科确诊的NSOC病例和582例对照。所有研究对象均签署知情同意书(18岁以下者，由其监护人代签)，完成相应流行病学调查，并提供1-3mL外周血标本。血液样本采集后，使用QIAGEN公司的DNA Blood Mini Kit试剂盒提取采用提取基因组DNA。

实验所用引物使用PAGE纯化。引物浓度稀释到10ng/μl备用。q-PCR Mix为Takara公司产品，内含TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg²⁺，TliRNaseH等。ROX试剂用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。

检测流程：

在TaqMan-MGB探针法的定量PCR反应体系中，包括上述rs4791331的一对PCR引物和两条探针。根据表1所示，配制反应体系。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。使用美国ABI公司的PRISM 7900HT型荧光定量PCR仪进行DNA扩增。第一步：50℃，预热仪器2min。第二步：95℃，酶活化10min。第三步：95℃，15sDNA变性；60℃，60s引物和探针退火延伸；共45个循环。随后对实验数据进行处理分析。Taqman real-time PCR扩增反应体系如表2所示：

表2、Taqman real-time PCR扩增反应体系

探针的5′端标记有报告基团，为FAM、VIC，3′端标记有荧光淬灭基团。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，只有一条探针能特异性地与相应的模板结合，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。因此可以根据发出的荧光判断特定位点的基因型。

根据检测结果，病例组分型成功率为98.1％(856/873)，对照组分型成功率为99.2％(823/830)。对照组样本中基因型CC、CT、TT基因型分布情况为71.1％、26.0％和2.9％，三种基因型的分布情况符合HWE(P＝0.412)。病例组中基因型CC、CT、TT基因型分布情况为62.0％、33.1％和4.9％，与对照组的基因型分布存在显著统计学差异(P<0.001)(表3)。如表3所示，根据Logistic回归分析发现T等位基因显著提高了罹患NSOC的风险，相加模型分析显示OR＝1.43，95％CI＝1.20-1.70，P<0.001。其中杂合突变型CT(OR＝1.46，95％CI＝1.18-1.80，P<0.001)和纯合突变型TT(OR＝1.93，95％CI＝1.15-3.23，P＝0.013)均具有提高NSOC易感性的效应。根据显性遗传模型发现，CT/TT基因型与CC基因型相比，提高了NSOC易感性(OR＝1.50，95％CI＝1.23-1.85，P＜0.001)。而隐性遗传模型表明，TT基因型与CT/CC基因型相比，也能提高NSOC风险(OR＝1.72，95％CI＝1.03-2.86，P＝0.038)。

表3、rs4791331基因型分布列表

NSOC，非综合征型唇腭裂；CLO，单纯唇裂；CLP，唇裂伴腭裂；

CL/P，唇裂伴或不伴腭裂；CPO，单纯腭裂；

^c采用双侧卡方检验。

我们根据NSOC三种不同的临床亚型进行了分层分析。相加模型分析发现rs4791331与CLO、CLP以及CL/P易感性存在关联(CLO：OR＝1.46，95％CI＝1.14-1.87；CLP：OR＝1.58，95％CI＝1.27-1.96；CL/P：OR＝1.53，95％CI＝1.27-1.85)，而与CPO风险无明显相关性(OR＝1.21，95％CI＝0.93-1.59)。

如表4所示，对于CLO来说，CT基因型与CC基因型相比能显著提高CLO易感性(OR＝1.58，95％CI＝1.17-2.14)，CT/TT基因型与CC基因型相比，也使CLO风险显著提高(OR＝1.59，95％CI＝1.19-2.13)。对于CLP来说，CT和TT基因型都能显著提高发病风险(CTvs.CC：OR＝1.64，95％CI＝1.25-2.16；TT vs.CC：OR＝2.23，95％CI＝1.22-4.12)，显性遗传模型(OR＝1.71，95％CI＝1.32-2.21)和隐性遗传模型(OR＝1.91，95％CI＝1.05-3.50)均提示突变能增加CLP易感性。因此也显而易见，T等位基因具有提高CL/P风险的效应(CTvs.CC：OR＝1.61，95％CI＝1.28-2.03；TT vs.CC：OR＝1.99，95％CI＝1.15-3.44；CT/TTvs.CC：OR＝1.66，95％CI＝1.33-2.06)。而在CPO组中，通过显性模型、隐性模型，以及杂合比较和纯合比较，发现rs4791331与CPO易感性没有显著关联。

总之，本研究技术平台对615例NSOC临床病例和582例对照标本的rs4791331位点进行了多态性检测，依据Taqman方法进行基因分型。证实SNP rs4791331突变能够显著增加中国汉族人群NSOC患病风险，该位点的检测可用于对个体罹患NSOC风险的预测。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明一个方面的例子。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。

序列表

<110> 南京医科大学附属口腔医院

<120> NTN1基因易感SNP位点及其应用

<130> 2017

<160> 4

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213>人工合成序列

<400> 1

ccatcaagat aacatgagta acaatcc 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213>人工合成序列

<400> 2

tgagatgagt tgtgcttttc attaagt 27

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213>人工合成序列

<400> 3

tgtaaacatg aaagtctatt a 21

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213>人工合成序列

<400> 4

aagtgtaaac ataaaagtct atta 24

Claims

1.一种NTN1基因易感SNP位点rs4791331，其特征在于存在T/C多态性，基因型为TT时，判断为非综合征型唇腭裂个体。

2.一种检测权利要求1所述SNP位点的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)提取基因组DNA；

(2)使用Taqman检测法检测rs4791331位点基因型。

3.权利要求2所述的方法，其特征在于，检测rs4791331位点基因型的特异性引物对为：上游引物序列如SEQ ID No.1所示；下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

4.权利要求2所述的方法，其特征在于，检测rs4791331位点基因型的探针为：探针Callele序列如SEQ ID No.3所示，探针T allele序列如SEQ ID No.4所示。

5.一种检测权利要求1所述SNP位点的特异性引物对，其特征在于，上游引物序列如SEQID No.1所示；下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

6.一种检测权利要求1所述SNP位点的探针，其特征在于，探针C allele序列如SEQ IDNo.3所示，探针T allele序列如SEQ ID No.4所示。

7.权利要求1所述SNP位点在制备非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒中的应用。

8.权利要求5所述引物对或权利要求6所述的探针在制备检测rs4791331位点基因型试剂盒或非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒中的应用。

9.一种非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测外周血DNA中的rs4791331。

10.权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求5所述引物对和/或权利要求6所述的探针。