KR20230117058A - Egfr 돌연변이를 특이적으로 검출할 수 있는 형광 신호 기반 핵산 검출 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

EGFR 돌연변이 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 CRISPR/Cas 시스템 및 이의 암 진단 용도에 관한 것으로, CRISPR/Cas12a 증폭 시스템을 이용하여 혈액 시료에서 유래한 변이 DNA를 특이적이고 효과적으로 증폭시켜 시퀀싱 오류로 혼동될 수 있는 0.5% 미만의 비율을 갖는 돌연변이를 확인할 수 있다.

Description

EGFR 돌연변이를 특이적으로 검출할 수 있는 형광 신호 기반 핵산 검출 조성물 및 방법 {Fluorescent signal-based nucleic acid detection composition and method capable of specifically detecting EGFR mutation}
EGFR 돌연변이를 특이적으로 검출할 수 있는 형광 신호 기반 핵산 검출 조성물 및 방법에 관한 것이다.
다른 암에 비해 사망률이 높은 것으로 알려진 비소폐암(non-small lung cancer, NSCLC) 환자는 효과적인 치료를 위해 조기 진단이 요구된다. 비소폐암(non-small lung cancer, NSCLC)의 표적 암 치료제인 티로신 키나아제 억제제가 EGFR 돌연변이 양성 비소세포폐암에 강력한 치료 효과가 있는 것으로 나타났음을 감안할 때, 비소세포폐암(NSCLC)의 주요 바이오마커인 L858R 및 엑손19 결실의 EGFR 돌연변이를 조기에 안정적으로 검출하는 것이 효과적인 치료를 위해 매우 중요하다.
최근 종양 조직에서 방출되는 세포유리 순환 DNA(cell-free circulating DNA, cfDNA)의 DNA 돌연변이 검출을 통한 암 진단 가능성이 입증되었는데, 혈액 샘플을 사용하는 액체 생검 기반 진단은 조직 생검보다 훨씬 덜 침습적이고 빠르고 간단한 장점이 있다.
그러나 cfDNA(cell-free circulating DNA)에서 암을 진단하는 데는 몇 가지 장애물이 있다.
첫번째로 혈액 내 소량의 cfDNA는 정확한 진단을 방해하므로 PCR과 같은 추가 절차가 필요하는 것이고, 두번째로 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing, NGS)은 여전히 0.5%의 오류율을 보여 희귀 돌연변이 DNA와 구별할 수 없다는 것이다. 특히, 혈액 샘플에서 정상 DNA의 우세한 농도는 희귀 돌연변이 DNA를 민감하게 검출하는 데 주요 장애물이다.
이러한 문제를 해결하기 위해 CRISPR(Clustered regular interspaced short palindromic repeats) 및 CRISPR 관련 단백질(CRISPR Associated Protein,Cas) 시스템을 사용하여 발암성 돌연변이 진단의 민감도를 향상시키려는 여러 연구가 시도되었다.
기존의 방법은 PAM 모티프 서열 내에서 점 돌연변이를 찾아 PAM을 파괴하는 전략을 기반으로 하나, 점 돌연변이가 PAM 모티프 서열에 위치해야 하며, 돌연변이 근처에 PAM 서열(NGG)이 없는 EGFR L858R 돌연변이와 같은 일부 돌연변이에 적용하는 데 방해가 된다는 한계를 가지고 있다.
이에, 돌연변이를 타겟 DNA에 해당하는 프로토스페이서에 위치시켜 돌연변이 DNA를 고민감도로 검출할 수 있는 CRISPR 시스템에 대한 기술 개발이 필요한 실정이다.
일 양상은 표적 서열과 혼성화하고, EGFR(Epidermal growth factor receptor) 돌연변이 유전자 서열에 상보적인 연속적인 염기를 포함하는 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 상기 가이드 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산; CRISPR/Cas 이펙터 단백질(effector protein), 또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산; 및 단일 가닥이고, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드와 혼성화 되는 표지된 검출 핵산을 포함하는 EGFR 돌연변이를 검출하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 EGFR 돌연변이를 검출하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 시료를 상기 조성물과 접촉시키는 단계; 및 상기 CRISPR/Cas 이펙터 단백질에 의한 상기 단일 가닥의 검출 핵산의 절단에 의해 생성된 검출 가능한 신호를 측정하여, 상기 시료 내 표적 서열을 검출하는 단계를 포함하는, EGFR 돌연변이를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 암 진단 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 적어도 95% 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 가이드 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 조성물을 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암을 진단하는 방법 또는 암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 표적 서열과 혼성화하고, EGFR(Epidermal growth factor receptor) 돌연변이 유전자 서열에 상보적인 연속적인 염기를 포함하는 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 상기 가이드 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산; CRISPR/Cas 이펙터 단백질(effector protein), 또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산; 및 단일 가닥이고, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드와 혼성화 되는 표지된 검출 핵산을 포함하는 EGFR 돌연변이를 검출하기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 EGFR 돌연변이를 검출하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어 “프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif, PAM)”는 CRISPR/Cas 시스템의 Cas 단백질이 인식하는 서열이다. 상기 프로토스페이서 서열은 PAM 서열의 5’ 말단 또는 3’ 말단에 위치하는 서열로, PAM 이펙터 단백질 복합체가 관심이 있는 표적 유전자좌에 결합하는 것을 지시한다. 구체적으로 상기 PAM은 5' T-풍부 모티프를 포함할 수 있다. 상기 PAM은 2 내지 10 bp DNA 서열로 이루어질 수 있고, 바람직하게는 2내지 6 bp DNA서열로 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 용어 “가이드 폴리뉴클레오티드”는 CRISPR 시스템 기반 게놈 편집에 사용되는 짧은 합성 RNA 분자이다. “가이드 폴리뉴클레오티드”는 타겟 DNA에 결합하는 스페이서 시퀀스. gRNA 분자는 Cas의 결합을 위한 스캐폴드 서열, endonuclease로 구성된다.
상기 가이드 뉴클레오티드에는 가이드 RNA, gRNA, 또는 guide RNA를 포함한다. 또한 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 crRNA를 포함한다. 상기 crRNA는 tracrRNA 및/또는 이펙터 단백질과 결합 및/또는 상호작용하는 crRNA 내에 존재하는 일부 서열이다. 상기 crRNA는 야생형 crRNA 또는 엔지니어링된 crRNA 일 수 있다. 이때, 상기 crRNA은 직접반복부서열(direct repeat sequence) 및 스페이서를 포함할 수 있고, 직접반복부서열은 스페이서의 5’말단에 위치할 수 있다. 또한, 상기 crRNA는 tracrRNA의 3’ 말단에 위치할 수 있다. 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 tracrRNA을 포함한다. 상기 tracrRNA 스캐폴드 서열은 crRNA 및/또는 이펙터 단백질과 결합 및/또는 상호작용하는 tracrRNA 전체 또는 일부 서열이다.
상기 tracrRNA은 야생형 tracrRNA 또는 엔지니어링된 tracrRNA일 수 있다. 상기 엔지니어링된 crRNA 또는 tracrRNA은 상기 야생형 crRNA 또는 tracrRNA의 일부 뉴클레오티드 서열이 인위적으로 변형(치환, 결실 또는 삽입)되거나, 야생형 crRNA 또는 tracrRNA 서열보다 길이가 짧도록 변형된 서열일 수 있다. 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 링커를 더 포함할 수 있다. 상기 링커는 상기 tracrRNA 및 crRNA을 연결하는 역할을 하는 서열이다. 상기 링커는 1 내지 30개의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 일 구현예로서, 상기 linker는 1 내지 5개, 5 내지 10개, 10 내지 15개, 15 내지 20개, 20개 내지 25개 또는 25 내지 30개의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는 5’-GAAA-3’ 서열일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다. 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 야생형 가이드 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 뉴클레오티드 서열이 삭제, 치환 또는 추가된 엔지니어링된 가이드 RNA(engineered guide RNA)인 것일 수 있다.
가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고, 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하기에, 표적 폴리뉴클레오티드 서열과의 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 gRNA는 Cas 단백질과 복합체를 형성하여 프로토스페이서(protospacer) 인접 모티브("protospacer adjacent motif, PAM") 및 프로토스페이서를 갖는 표적 폴리뉴클레오티드 서열(상기 gRNA의 일부에 상보성인 서열)에 결합한다. 가이드 RNA (gRNA)는 gRNA:Cas 단백질 복합체의 표적 특이성을 부여하는 요소이다.
본 명세서에서 용어 "EGFR"은 Epidermal Growth Factor Receptor의 약어로써 상피세포 성장인자 수용체와 상호 교환적으로 사용할 수 있다. EGFR은 HER 또는 erbB family라고도 불리는 티로신 키나아제 수용체 그룹의 일부로, erbB family에는 EGFR (HER1/ErbB1), HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3) 그리고 HER4 (ErbB4)가 포함된다.
일 구체예에 있어서, 상기 EGFR 돌연변이 유전자 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 3' 말단에 연결된 것인 가이드 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 더욱 구체적으로 상기 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)는 5' T-풍부 모티프를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서의 용어 “돌연변이”는 기존 유전자의 염기 순서에 영구적인 변화가 있는 경우를 의미한다. 돌연변이는 유전물질의 구조에 미치는 영향에 따라 염색체 구조나 수에 이상이 있는 경우(염색체 이상) 및 유전자의 염기서열에 작은 규모로 변화가 일어나는 경우가 있다. 염색체의 구조에 이상이 있는 경우로는 결실(deletion), 중복(duplication), 역위(inversion), 전좌(translocation)가 있다. 본 명세서의 용어 “결실 돌연변이 (deletion mutation)”는 염색체의 일부가 손실된 경우를 말한다. 본 명세서의 용어 “점 돌연변이 (point mutation)”는 유전자자리를 구성하는 뉴클레오티드 배열이 1쌍 이상 수천 쌍에 걸쳐 결실되어 일어나는 것을 말한다.
본 명세서의 용어 “EGFR 돌연변이”는 G719S 돌연변이, G179C 돌연변이, G719A 돌연변이, S720F 돌연변이, T790M 돌연변이, D761Y 돌연변이, exon 19 결실 돌연변이, D770_N771 삽입 돌연변이, V765A 돌연변이, T783A 돌연변이, S761I 돌연변이, T790M 돌연변이, V769L 돌연변이, N771I 돌연변이, L858R 돌연변이, L861Q 돌연변이, L861R 돌연변이를 포함한다. 대표적인 EGFR 변이인 L858R은 858번째 아미노산을 루신(Leusine,L)에서 아르기닌 (Arginine,R)으로 바뀐 점 돌연변이 형태로서, 엑손 21번에 속하는 변이이다. 또한 비소세포폐암의 대표적인 바이오마커로서, EGFR Exon 19 결실 돌연변이는 EGFR을 암호화하는 유전자의 exon 19가 결실(deletion)된 것을 의미한다. EGFR Exon19 결실 돌연변이는 L858R 점 돌연변이와 달리 exon19의 9bp~18bp 등 다양한 결실 크기로 나타난다.
일 구체예에 있어서, 암은 EGFR 돌연변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 암은 고형암일 수 있다. 상기 고형암은 기관에서 유래하는 비정상적인 조직 덩어리를 의미한다. 고형암은 악성일 수 있다. 상이한 유형의 고형암은 이를 형성하는 세포 유형에 따라 명명된다. 고형암의 유형에는 육종, 암종 및 림프종이 포함된다. 고형암의 예로는 부신암, 항문암, 역형성 대세포 림프종, 혈관면역모세포 T 세포 림프종, B 세포 림프종, 담관암, 방광암, 뇌/CNS 종양, 유방암, 자궁경부암, 결장 암, 자궁 내막암, 식도암, 유잉(ewing) 계열의 종양, 안암, 담낭암, 위장 유암종, 위장관 간질 종양(gist), 임신 영양모세포 질환, 간비장 T 세포 림프종, 호지킨 림 프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 신장 암, 후두암 및 하인두암, 간암, 폐암(비소 세포 및 소세포), 폐 유암종 림프종 육아종증, 악성 중피종, 비강 및 부비동 암, 비인두암, 신경모세포종, 결절 변연부 B 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 구강 및 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 음경암, 뇌하수체 종양, 일차 삼출 림프종, 전 립선 암, 망막모세포종, 횡문근육종, 타액선 암, 육종, 피부암(기저 및 편평 세포, 흑색종 및 머켈 세포), 소장암, 위암, 고환암, 흉선암, 갑상선암, 자궁육종, 질암, 외음부 암, 발텐스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia) 및 빌 름스(Wilms) 종양 등이 있다. EGFR 돌연변이는 특히 결장직장암, 췌장암, 신경교종, 두경부암 및 폐암, 특히 비소세포 폐암(NSCLC)을 일으킬 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 결장직장암, 췌장암, 신경교종, 두경부암 및 폐암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 고형암의 진단에, 더욱 더 비소세포 폐암(NSCLC)의 진단에 특히 효과적이다.
일 구체예에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 5' 말단에서 3' 말단 순서로, scafold 서열, 표적서열로 구성되는 20 bp 내지 50bp 길이인 것인, 가이드 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 길이가 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 bp 이상이거나 이를 초과한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 길이가 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 개 이하의 뉴클레오티드 미만이다. 바람직하게 가이드 뉴클레오티드 서열은 길이가 20 bp 내지 50 bp, 더욱 바람직하게는 30 bp 내지 50 bp의 염기를 가진다.
일 구체예에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 cleavage 효율을 높이는 서열을 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 cleavage 효율을 높이는 서열은 T-풍부 테일링(T-rich tailing) 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 내지 6으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 2 내지 6으로 표시되는 뉴클레오티드에서 T(Thymine)은 U(uracil)인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 측정하는 단계(예를 들어, V형 CRISPR/Cas 효과기 단백질(예를 들어, Cas12 단백질, 예컨대 Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e)-매개 ssDNA 절단에 의해 생성되는 검출 가능한 신호를 측정하는 단계)를 포함한다. V형 CRISPR/Cas 효과기 단백질(예를 들어, Cas12 단백질, 예컨대 Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e)은, 가이드 RNA가 V형 CRISPR/Cas 효과기 단백질(예를 들어, Cas12 단백질, 예컨대 Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e)의 존재 하에 표적 DNA와 혼성화할 때 생기는 일단 활성화된 비표적화 ssDNA를 절단하기 때문에, 검출 가능한 신호는 ssDNA가 절단될 때 생긴 임의의 신호일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 측정하는 단계는, 금 나노입자 기반 검출, 형광 편광, 콜로이드 상 전이/분산, 전기화학적 검출, 반도체-기반 센싱; 예를 들어, 2'-3' 환식 포스파타제를 개방함으로써, 무기 포스파타제를 용액 내로 방출함으로써 ssDNA 절단 반응 후에 pH 변화를 생성하기 위해 포스파타제를 사용할 수 있음), 및 표지된 검출기 ssDNA의 검출 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 검출 방법의 판독은 임의의 편리한 판독일 수 있다. 가능한 판독의 예는 측정 가능한 양의 검출 가능한 형광 신호; 겔 상에서 밴드의 시각적 분석(예를 들어, 비절단 기질에 대해 절단된 생성물을 나타내는 밴드), 색의 존재 또는 부재의 시각적 또는 센서 기반 검출(즉, 색 검출 방법), 및 전기 신호의 (또는 특정 양의) 존재 또는 부재를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
측정하는 단계는 일부 경우에, 예를 들어, 검출되는 신호의 양이 샘플 내 존재하는 표적 DNA의 양을 결정하는 데 사용될 수 있다는 의미에서 정량적일 수 있다. 측정하는 단계는 일부 경우에, 예를 들어, 검출 가능한 신호의 존재 또는 부재가 표적화된 DNA의 존재 또는 부재를 나타낼 수 있다는 의미에서 정성적일 수 있다. 일부 경우에, 달리 표적화된 DNA(들) 가 특정 역치 농도 초과에서 존재하지 않는 한, 검출 가능한 신호는 (예를 들어, 주어진 역치 수준 초과에서) 존재하지 않을 것이다. 일부 경우에, 검출 역치는 CRISPR/Cas 효과기 단백질, 가이드 RNA, 샘플 용적 및/또는 검출기 ssDNA의 양을 (하나가 사용된다면) 변형시킴으로써 적정될 수 있다. 이렇게 해서, 예를 들어, 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 한 가지 이상의 반응을 셋업하기 위해 요망된다면, 다수의 대조군이 사용될 수 있으며, 각각은 표적 DNA의 상이한 역치 수준을 검출하도록 셋업하며, 따라서 이러한 일련의 반응은 샘플 내 존재하는 표적 DNA의 양을 결정하는 데 사용될 수 있다
일 구체예에 있어서, 본 개시내용의 방법은 표적 핵산(예를 들어, 표적 DNA 및 복수의 비-표적 DNA를 포함하는 샘플)의 양을 결정하는 데 사용될 수 있다. 샘플 내 표적 DNA 양을 결정하는 것은 시험 샘플로부터 생성된 검출 가능한 신호의 양을 기준 샘플로부터 생성된 검출 가능한 신호의 양과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 샘플 내 표적 DNA 양을 결정하는 것은 검출 가능한 신호를 측정하여 시험 측정치를 생성하는 단계; 기준 샘플에 의해 생성된 검출 가능한 신호를 측정하여 기준 측정치를 생성하는 단계; 및 시험 측정치를 기준 측정치와 비교하여 샘플 내 존재하는 표적 DNA의 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 경우에, 샘플 내 표적 DNA의 양을 결정하기 위한 본 개시내용의 방법은: a) 샘플(예를 들어, 표적 DNA 및 복수의 비-표적 DNA를 포함하는 샘플)을: (i) 표적 DNA와 혼성화하는 가이드 RNA, (ii) 샘플 내 존재하는 핵산을 절단하는 CRISPR/Cas 효과기 단백질, 및 (iii) 검출 ssDNA와 접촉시키는 단계; b) CRISPR/Cas 효과기 단백질-매개 ssDNA 절단(예를 들어, 검출기 ssDNA의 절단)에 의해 생성된 검출 가능한 신호를 측정하여, 시험 측정치를 생성하는 단계; c) 기준 샘플에 의해 생성된 검출 가능한 신호를 측정하여 기준 측정치를 생성하는 단계; 및 d) 시험 측정치를 기준 측정치와 비교하여 샘플 내 존재하는 표적 DNA의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상 조성물 및/또는 방법의 민감도는 검출을 핵산 증폭과 결합함으로써 증가될 수 있다. 일부 경우에, 샘플 내 핵산은 ssDNA를 절단한 CRISPR/Cas 효과기 단백질(예를 들어, Cas12 단백질)과의 접촉 전, 동시에 또는 후에 증폭된다. 일부 경우에, 샘플 내 핵산은 CRISPR/Cas 효과기 단백질(예를 들어, Cas12 단백질)과의 접촉과 동시에 증폭된다. 모든 성분이 동시에 첨가된다면(증폭 성분 및 검출 성분, 예컨대 CRISPR/Cas 효과기 단백질, 예를 들어, Cas12 단백질, 가이드 RNA, 및 검출기 DNA), CRISPR/Cas 효과기 단백질(예를 들어, Cas12 단백질)의 트랜스-절단 활성은 핵산이 증폭을 겪는 것과 동시에 샘플의 핵산을 분해하기 시작하는 것이 가능하다.
다양한 증폭 방법 및 성분은 당업자에게 공지되어 있고, 임의의 편리한 방법이 사용될 수 있다. 핵산 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역전사 PCR(RT-PCR), 정량적 PCR(qPCR), 역전사 qPCR(RT-qPCR), 네스티드 PCR(nested PCR), 다중복합 PCR, 비대칭 PCR, 터치다운 PCR, 무작위 프라이머 PCR, 헤미-네스티드 PCR, 중합효소 사이클링 어셈블리(PCA), 콜로니 PCR, 리가제 연쇄 반응(LCR), 디지털 PCR, 메틸화 특이적-PCR(MSP), 낮은 변성 온도에서의 공동-증폭-PCR(COLD-PCR), 대립유전자-특이적 PCR, 서열간-특이적 PCR(ISS-PCR), 전체 게놈 증폭(WGA), 역 PCR, 및 열 비대칭 엇갈림(thermal asymmetric interlaced PCR: TAIL-PCR)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 증폭은 등온 증폭이다. 용어 "등온　증폭"은 단일 온도 인큐베이션을 사용하여 열 순환기에 대한 필요를 제거할 수 있는 핵산(예를 들어, DNA) 증폭(예를 들어, 효소 연쇄 반응을 이용) 방법을 나타낸다. 등온 증폭은 증폭 반응 동안 표적 핵산의 열 변성에 의존하지 않으며 따라서 온도의 다중의 빠른 변화를 필요로 하지 않을 수 있는 핵산 증폭 형태이다. 따라서 등온 핵산 증폭 방법은 실험실 환경 내에서 또는 밖에서 수행될 수 있다. 역 전사 단계와 조합함으로써, 이들 증폭 방법은 RNA를 등온으로 증폭시키는 데 사용될 수 있다.
등온 증폭 방법의 예는 루프-매개 등온 증폭(LAMP), 헬리카제-의존적 증폭(HDA), 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification: RPA), 가닥 변위(strand displacement amplification: SDA), 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA), 전사 매개 증폭(TMA), 틈내기 효소 증폭 반응(NEAR), 구름원 증폭(rolling circle amplification: RCA), 다중 변위 증폭(MDA), 분지(Ramification: RAM), 원형 헬리카제-의존적 증폭(cHDA), 단일 프라이머 등온 증폭(SPIA), RNA 기술의 신호 매개 증폭(SMART), 자기-지속 서열 복제(3SR), 게놈 기하급수적 증폭 반응(GEAR) 및 등온 다중 변위 증폭(IMDA)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 경우에, 증폭은 재조합효소 중합효소 증폭(RPA)이다. 재조합효소 중합효소 증폭(RPA)은 2개의 마주보는 프라이머(PCR와 매우 유사)를 사용하고, 3종의 효소, 즉, 재조합효소, 단일-가닥 DNA-결합 단백질(SSB) 및 가닥-변위 중합효소를 사용한다. 재조합효소는 이중나선 DNA에서 상동성 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머와 쌍을 이루고, SSB는 변위된 DNA 가닥에 결합하여 프라이머가 변위되는 것을 방지하고, 가닥 변위 중합효소는 DNA 합성을 시작하며, 여기서 프라이머는 표적 DNA에 결합된다.
일부 경우에, 대상 방법은 샘플(예를 들어, 표적 DNA 및 복수의 비-표적 ssDNA를 포함하는 샘플)을: i) CRISPR/Cas 효과기 단백질; ii) 가이드 RNA(또는 전구체 가이드 RNA 어레이); 및 iii) 단일 가닥이며 가이드 RNA의 가이드 서열과 혼성화하지 않는 검출 DNA와 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, 대상 방법은 샘플을 형광-방출 염료쌍을 포함하는 표지된 단일 가닥 검출 핵산(검출 ssDNA)와 접촉시키는 단계를 포함하며; CRISPR/Cas 효과기 단백질(예를 들어, Cas12 단백질, 예컨대 Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e)은 (표적 DNA에 혼성화하는 가이드 RNA와 관련하여 가이드 RNA에 결합함으로써) 활성화된 후에 표지된 검출기 ssDNA를 절단하고; 측정되는 검출 가능한 신호는 형광-방출 염료쌍에 의해 생성된다. 예를 들어, 일부 경우에, 대상 방법은 형광 공명 에너지 전달(FRET) 쌍 또는 퀀처/플루오르(퀀처/플루오르) 쌍 또는 둘 다를 포함하는 표지된 검출 ssDNA와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 대상 방법은 FRET 쌍을 포함하는 표지된 검출 ssDNA와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 대상 방법은 플루오르/퀀처 쌍을 포함하는 표지된 검출 ssDNA와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다.
형광-방출 염료쌍은 FRET 쌍 또는 퀀처/플루오르 쌍을 포함한다. FRET 쌍과 퀀처/플루오르 쌍의 경우 둘 다에서, 염료 중 하나의 방출 스펙트럼은 쌍에서 다른 염료의 흡수 스펙트럼 영역과 중복된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "형광-방출 염료 쌍"은 "형광 공명 에너지 전달(FRET) 쌍"과 "퀀처/플루오르 쌍"을 둘 다 포함하기 위해 사용되는 일반적 용어이며, 이들 용어 둘 다 이하에 더 상세하게 논의한다. 용어 "형광-방출 염료 쌍"은 "FRET 쌍 및/또는 퀀처/플루오르 쌍"이라는 어구와 상호 호환적으로 사용된다.
일부 경우에 (예를 들어, 검출 ssDNA가 FRET 쌍을 포함할 때) 표지된 검출 ssDNA는 절단되기 전에 검출 가능한 신호의 양을 생성하고, 측정되는 검출 가능한 신호의 양은 표지된 검출 ssDNA가 절단될 때 감소된다. 일부 경우에, 표지된 검출 ssDNA는 (예를 들어, FRET 쌍으로부터) 절단되기 전에 제1 검출 가능한 신호를 생성하고, 표지된 검출 ssDNA가 (예를 들어, 퀀처/플루오르 쌍으로부터) 절단될 때 제2 검출 가능한 신호를 생성한다. 이렇게 해서, 일부 경우에, 표지된 검출 ssDNA는 FRET 쌍 및 퀀처/플루오르 쌍을 포함한다.
공여자-수용자 쌍(FRET 공여자 모이어티 및 FRET 수용자 모이어티)은 본 명세서에서 "FRET 쌍" 또는 "신호 FRET 쌍"으로서 지칭된다. 따라서, 일부 경우에, 하나의 신호 상대가 FRET 공여자 모이어티이고 다른 신호 상대가 FRET 수용자 모이어티일 때, 대상 표지된 검출 ssDNA는 2개의 신호 상대(신호 쌍)를 포함한다. 따라서 이러한 FRET 쌍(FRET 공여자 모이어티 및 FRET 수용자 모이어티)를 포함하는 대상 표지된 검출 ssDNA는 신호 상대가 매우 근위일 때(예를 들어, 동일한 RNA 분자 상에 있는 동안) 검출 가능한 신호(FRET 신호)를 나타낼 것이지만, 상대가 분리될 때(예를 들어, CRISPR/Cas 효과기 단백질(예를 들어, Cas12 단백질, 예컨대 Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e)의 RNA 분자의 절단 후에) 신호는 감소(또는 부재)될 것이다.
FRET 공여자 및 수용자 모이어티(FRET 쌍)는 당업자에게 공지될 것이며, 임의의 편리한 FRET 쌍(예를 들어, 임의의 편리한 공여자 및 수용자 모이어티 쌍)이 사용될 수 있다.
일부 경우에, 표지된 검출 ssDNA가 절단될 때 검출 가능한 신호가 생성된다(예를 들어, 일부 경우에, 표지된 검출 ssDNA는 퀀처/플루오르 쌍을 포함한다). 신호 퀀칭 쌍의 하나의 신호 상대는 검출 가능한 신호를 생성하며, 다른 신호 상대는 제1 신호 상대의 검출 가능한 신호를 퀀칭하는 퀀처 모이어티이다(즉, 신호 상대가 서로 근위일 때, 예를 들어, 신호쌍의 신호 상대가 근위일 때 신호 모이어티로부터의 신호가 감소(퀀칭)되도록 퀀처 모이어티는 신호 모이어티의 신호를 퀀칭시킨다).
예를 들어, 일부 경우에, 검출 가능한 신호의 양은 표지된 검출 ssDNA가 절단될 때 증가된다. 일부 경우에, 예를 들어, CRISPR/Cas 효과기 단백질에 의한 절단 전에 동일한 ssDNA 분자 상에 신호가 둘 다 존재할 때, 예를 들어, 하나의 신호 상대(신호 모이어티)에 의해 나타나는 신호는 다른 신호 상대(퀀처 신호 모이어티)에 의해 퀀칭된다. 이러한 신호 쌍은 본 명세서에서 "퀀처/플루오르 쌍", "퀀칭 쌍" 또는 "신호 퀀칭 쌍"으로서 지칭된다. 예를 들어, 일부 경우에, 하나의 신호 상대(예를 들어, 제1 신호 상대)는 제2 신호 상대(예를 들어, 퀀처 모이어티)에 의해 퀀칭되는 검출 가능한 신호를 생성하는 신호 모이어티이다. 따라서 이러한 퀀처/플루오르쌍의 신호 상대는 상대가 분리될 때(예를 들어, V형 CRISPR/Cas 효과기 단백질에 의한 검출 ssDNA의 절단 후) 검출 가능한 신호를 생성할 것이지만, 상대가 매우 근위일 때(예를 들어, CRISPR/Cas 효과기 단백질에 의한 검출 ssDNA의 절단 전에) 신호는 퀀칭될 것이다.
퀀처 모이어티는 신호 모이어티로부터(예를 들어, CRISPR/Cas 효과기 단백질에 의한 검출 ssDNA의 절단 전에) 다양한 정도로 신호를 퀀칭시킬 수 있다. 일부 경우에, 퀀처 모이어티는 퀀처 모이어티의 존재 하에(신호 상대가 서로 근위일 때) 검출된 신호가 퀀처 모이어티의 부재 하에(신호 상대가 분리될 때) 검출된 신호의 95% 이하인 경우 신호 모이어티로부터 신호를 퀀칭시킨다. 예를 들어, 일부 경우에, 퀀처 모이어티의 존재에서 검출된 신호는 퀀처 모이어티의 부재 하에 검출된 신호의 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하일 수 있다. 일부 경우에, 신호 없음(예를 들어, 배경 초과)은 퀀처 모이어티의 존재 하에 검출된다.
일부 경우에, 퀀처 모이어티의 부재 하에(신호 상대가 분리될 때) 검출된 신호는 퀀처 모이어티의 존재 하에(신호 상대가 서로 근위일 때) 검출된 신호보다 적어도 1.2배 초과(예를 들어, 적어도 1.3배, 적어도 1.5 배, 적어도 1.7 배, 적어도 2 배, 적어도 2.5 배, 적어도 3 배, 적어도 3.5 배, 적어도 4 배, 적어도 5 배, 적어도 7 배, 적어도 10 배, 적어도 20배, 또는 적어도 50배 초과)이다.
일부 경우에, 신호 모이어티는 형광 표지이다. 일부 이러한 경우에, 퀀처 모이어티는 (예를 들어, 표지의 방출 스펙트럼에서 에너지를 흡수함으로써) 형광 표지로부터의 신호(광 신호)를 퀀칭시킨다. 따라서, 퀀처 모이어티가 신호 모이어티에 근접하지 않을 때, 형광 표지로부터의 방출(신호)는 퀀처 모이어티에 의해 신호가 흡수되지 않기 때문에 검출 가능하다. 임의의 편리한 공여자 수용자 쌍(신호 모이어티/퀀처 모이어티 쌍)이 사용될 수 있고, 다수의 적합한 쌍은 당업계에 공지되어 있다.
일부 경우에, 퀀처 모이어티는 신호 모이어티(또한 본 명세서에서 "검출 가능한 표지"로서 지칭됨)로부터 에너지를 흡수하고, 이어서, 신호(예를 들어, 상이한 파장에서의 광)를 방출한다. 따라서, 일부 경우에, 퀀처 모이어티는 신호 모이어티 그 자체이고(예를 들어, 신호 모이어티는 6-카복시플루오레세인일 수 있는 한편, 퀀처 모이어티는 6-카복시-테트라메틸로다민일 수 있음), 일부 경우에, 쌍은 또한 FRET 쌍일 수 있다. 일부 경우에, 퀀처 모이어티는 다크 퀀처이다. 다크 퀀처는 여기 에너지를 흡수하며, 상이한 방법으로 (예를 들어, 열로서) 에너지를 소멸시킨다. 따라서, 다크 퀀처는 그 자체의 형광이 최소이거나 없다(형광을 방출하지 않는다).
형광 표지의 예는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(등록상표) 염료, ATTO 염료(예를 들어, ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Thio12, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxa12, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740), a DyLight 염료, 사이아닌 염료(예를 들어, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3b, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5), 플루오프로브(FluoProbes) 염료, 설포 Cy 염료, 세타(Seta) 염료, IRIS 염료, SeTau 염료, SRfluor 염료, 스퀘어(Square) 염료, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(FITC), 테트라메틸로다민(TRITC), 텍사스 레드(Texas Red), 오리건 그린(Oregon Green), 퍼시픽 블루(Pacific Blue), 퍼시픽 그린(Pacific Green), 퍼시픽 오렌지(Pacific Orange), 양자점 및 테더드(tethered) 형광 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 경우에, 검출 가능한 표지는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(등록상표) 염료, ATTO 염료(예를 들어, ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Thio12, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxa12, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740), a DyLight 염료, 사이아닌 염료(예를 들어, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3b, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5), 플루오프로브 염료, 설포 Cy 염료, 세타 염료, IRIS 염료, SeTau 염료, SRfluor 염료, 스퀘어 염료, 플루오레세인(FITC), 테트라메틸로다민(TRITC), 텍사스 레드, 오리건 그린, 퍼시픽 블루, 퍼시픽 그린 및 퍼시픽 오렌지로부터 선택된 형광 표지이다.
일부 경우에, 검출 가능한 표지는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(등록상표) 염료, ATTO 염료(예를 들어, ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Thio12, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxa12, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740), a DyLight 염료, 사이아닌 염료(예를 들어, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3b, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5), 플루오프로브 염료, 설포 Cy 염료, 세타 염료, IRIS 염료, SeTau 염료, SRfluor 염료, 스퀘어 염료, 플루오레세인(FITC), 테트라메틸로다민(TRITC), 텍사스 레드, 오리건 그린, 퍼시픽 블루, 퍼시픽 그린, 퍼시픽 오렌지, 양자점 및 테더드 형광 단백질로부터 선택된 형광 표지이다.
ATTO 염료의 예는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Thio12, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxa12, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725 및 ATTO 740.
알렉사플루오르 염료의 예는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 알렉사 플루오르(등록상표) 350, 알렉사 플루오르(등록상표) 405, 알렉사 플루오르(등록상표) 430, 알렉사 플루오르(등록상표) 488, 알렉사 플루오르(등록상표) 500, 알렉사 플루오르(등록상표) 514, 알렉사 플루오르(등록상표) 532, 알렉사 플루오르(등록상표) 546, 알렉사 플루오르(등록상표) 555, 알렉사 플루오르(등록상표) 568, 알렉사 플루오르(등록상표) 594, 알렉사 플루오르(등록상표) 610, 알렉사 플루오르(등록상표) 633, 알렉사 플루오르(등록상표) 635, 알렉사 플루오르(등록상표) 647, 알렉사 플루오르(등록상표) 660, 알렉사 플루오르(등록상표) 680, 알렉사 플루오르(등록상표) 700, 알렉사 플루오르(등록상표) 750, 알렉사 플루오르(등록상표) 790 등.
퀀처 모이어티의 예는 다크 퀀처(dark quencher), 블랙 홀 퀀처(Black Hole Quencher)(등록상표) (BHQ(등록상표)) (예를 들어, BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3), Qxl 퀀처, ATTO 퀀처(예를 들어, ATTO 540Q, ATTO 580Q, 및 ATTO 612Q), 다이메틸아미노아조벤젠설폰산(답실(Dabsyl)), 아이오와 블랙(Iowa Black) RQ, 아이오와 블랙 FQ, IRDye QC-1, QSY 염료(예를 들어, QSY 7, QSY 9, QSY 21), 앱솔루트퀀처(AbsoluteQuencher), 이클립스(Eclipse) 및 금속 클러스터, 예컨대, 금 나노입자 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 경우에, 퀀처 모이어티는 다크 퀀처, 블랙 홀 퀀처(등록상표) (BHQ(등록상표)) (예를 들어, BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3), Qxl 퀀처, ATTO 퀀처(예를 들어, ATTO 540Q, ATTO 580Q 및 ATTO 612Q), 다이메틸아미노아조벤젠설폰산(답실), 아이오와 블랙 RQ, 아이오와 블랙 FQ, IRDye QC-1, QSY 염료(예를 들어, QSY 7, QSY 9, QSY 21), 앱솔루트퀀처, 이클립스 및 금속 클러스터로부터 선택된다.
ATTO 퀀처의 예는 ATTO 540Q, ATTO 580Q 및 ATTO 612Q를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 블랙홀 퀀처(등록상표)(BHQ(등록상표))의 예는 BHQ-0(493㎚), BHQ-1(534㎚), BHQ-2(579㎚) 및 BHQ-3(672㎚)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 경우에, 표지된 검출 ssDNA의 절단은 비색 판독을 측정함으로써 검출될 수 있다. 예를 들어, 형광단의 유리(예를 들어, FRET 쌍으로부터의 유리, 퀀처/플루오르 쌍으로부터의 유리 등)는 검출 가능한 신호의 파장 이동(따라서 색 이동)을 초래할 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 대상 표지된 검출 ssDNA의 절단은 색-이동에 의해 검출될 수 있다. 이러한 이동은 한 가지 색 신호(파장)양의 상실, 다른 색의 양의 획득, 한 가지 색의 다른 색으로의 할당 변화 등으로서 표현될 수 있다.
본 명세서의 용어 “벡터”는 유전자를 편리하게 활용할 수 있도록 확보, 증식(증폭)하거나, 단백질을 발현시키는 데 이용하는 유전자 재조합 기술(recombinant DNA technology)에 필수적으로 필요한 DNA 전달체이다. 상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터일 수 있다. 예를 들어, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터(retroviral(retrovirus) vector), 렌티바이러스 벡터(lentiviral(lentivirus) vector), 아데노바이러스 벡터(adenoviral(adenovirus vector), 아데노-연관 바이러스 벡터(adeno-associated viral (adeno-associated virus; AAV) vector), 백시니아바이러스 벡터(vaccinia viral(vaccinia virus) vector), 폭스바이러스 벡터(poxviral(poxvirus) vector) 및 단순포진 바이러스 벡터(herpes simplex viral(herpes simplex virus) vector)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 벡터일 수 있다.
상기 비-바이러스 벡터는 플라스미드, 파지, 네이키드 DNA, DNA 복합체, mRNA(전사물) 또는 PCR 앰플리콘(amplicon)일 수 있다. 예를 들어, 상기 플라스미드는 pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, 및 pUC19으로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 파지는 λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, 및 M13으로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 벡터는 선택적으로 조절/제어 구성요소, 프로모터 및/또는 부가 발현 요소를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조절/제어 구성요소는 벡터에 포함된 각 구성요소를 암호화하는 서열(즉, 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 및/또는 이펙터 단백질을 암호화하는 핵산)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 상기 조절/제어 구성요소는 인핸서, 인트론, 종결 신호, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, 내부 리보솜 유입 부위(IRES, Internal Ribosome Entry Site), 스플라이스 억셉터, 2A 서열 및/또는 복제원점(replication origin)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, 및/또는 BBV 복제원점일 수 있다. 상기 벡터는 선택적으로 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 벡터에 포함된 각 구성요소를 암호화하는 서열(즉, 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 및/또는 이펙터 단백질을 암호화하는 핵산)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 상기 프로모터는 벡터에 포함된 각 구성요소를 암호화하는 서열(즉, 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 및/또는 이펙터 단백질을 암호화하는 핵산)을 적절히 발현시킬 수 있는 것이라면 제한되지 않는다. 일 구현예로서, 상기 프로모터 서열은 RNA 중합효소(예를 들어, pol I, pol II, 또는 pol III)의 전사를 촉진시키는 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 상기 프로모터는 SV40 초기 프로모터, mouse mammary tumor virus long terminal repeat(LTR) 프로모터, adenovirus major late 프로모터 (Ad MLP), herpes simplex virus (HSV) 프로모터, CMV immediate early promoter region (CMVIE)와 같은 cytomegalovirus (CMV) 프로모터, Chicken b-actin (CBA) 프로모터, rous sarcoma virus (RSV) 프로모터, human U6 small nuclear 프로모터 (U6) (Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497 - 500 (2002)), enhanced U6 프로모터 (e.g., Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep 1;31(17)), human H1 프로모터 (H1) 및 7SK 프로모터 (7SK) 중 하나 수 있다.
상기 벡터는 선택적으로 부가 발현 요소를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 외에 통상의 기술자가 필요에 의해 발현시키고자 하는 부가 발현 요소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고 있을 수 있다. 예를 들어, 상기 부가 발현 요소는, 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄 (glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자; 또는 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin) 또는 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자일 수 있다.
일 양상은 상기 가이드 폴리뉴클레오티드; 및 Cas 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, EGFR 돌연변이 유전자 서열을 포함하는 핵산을 절단(cleavage)할 수 있는 CRISPR/Cas 복합체를 제공한다.
본 명세서의 용어 “CRISPR/Cas 시스템”은 박테리오파지에 대한 박테리아 적응 면역 시스템에서 파생된 것으로, 특히 DNA 절단을 위한 강력한 도구로 사용된다. 모든 CRISPR-Cas 시스템은 CRISPR RNA (crRNA)를 통해 타겟에 대한 특이성을 가지는데, 실험적으로 사용되는 경우에는 가이드 RNA (guide RNA, gRNA)로 약간 변형되어 사용될 수 있다. crRNA의 스페이서(spacer)가 타겟 서열을 인지하고 결합하는데, 이때 타겟 서열은 Protospacer Adjacent Motif (PAM) 라는 서열에 인접하여 존재해야 한다. crRNA와 타겟의 결합 이후, Cas 단백질이 타겟 DNA를 절단한다. 따라서 crRNA 또는 gRNA의 스페이서 부분의 서열을 바꾸는 것만으로 원하는 타겟에 Cas 단백질이 작동하도록 조작할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Class 2에 해당하는 것 일 수 있다. 구체적으로, 상기 Class 2에 해당하는 Cas 단백질은 type Ⅴ에 해당할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 type Ⅴ에 해당하는 Cas 단백질은 Cas12a, mgCas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 및 Cas12i로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 이펙터 단백질(effector protein)일 수 있다.
또 다른 양상은 시료를 상기 조성물과 접촉시키는 단계; 및 상기 CRISPR/Cas 이펙터 단백질에 의한 상기 단일 가닥의 검출 핵산의 절단에 의해 생성된 검출 가능한 신호를 측정하여, 상기 시료 내 표적 서열을 검출하는 단계를 포함하는, EGFR 돌연변이를 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 조성물을 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암을 진단하는 방법 또는 암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
일 구현예에 있어서, 상기 분리된 환자 시료는 cfDNA(cell free DNA)를 포함할 수 있다.
본 명세서의 용어 “cfDNA”는 Circulating free DNA의 약어로 세포핵 안에 존재하지 않고 혈액속에 부유하는 DNA의 조각을 의미한다. “순환 자유 DNA” 또는 “세포 유리 DNA” 등과 상호 교환하여 사용할 수 있다. 순환 자유 DNA (cfDNA)는 혈장으로 방출된 DNA 단편 (50-200 bp)이다. cfDNA는 순환 종양 DNA(ctDNA), 무세포 미토콘드리아 DNA(ccf mtDNA) 및 무세포 태아 DNA(cffDNA)등을 포함하며, 혈류에서 자유롭게 순환하는 다양한 형태의 DNA를 설명하는 데 사용할 수 있다. cfDNA의 상승된 수준은 암이 진행된 경우 관찰된다. cfDNA의 분석을 통하여 암 환자의 혈장 DNA에 종양 관련 돌연변이가 포함되어 있는지 여부를 확인하여 암 진단 및 후속 조치에 사용될 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 적어도 95% 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 가이드 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
혈액 시료에서 유래한 변이 DNA를 일 양상에 따른 Cas 뉴클레아제를 이용한 CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 in-vitro 절단 및 PCR 증폭을 통해 돌연변이 DNA를 특이적으로 증폭시켜 시퀀싱 오류로 혼동될 수 있는 0.5% 미만의 비율을 갖는 돌연변이를 확인할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 정상 DNA와 일치하는crRNA을 통해 exon19 결실 돌연변이 DNA를 구별할 수 있음을 설명하는 모식도 이다.
도 2는 정상적인 DNA와 일치하는 crRNA 및 LbCas12a를 사용하여 정상 DNA와 Exon 19 결손 DNA를 in vitro 절단 분석한 결과 사진이다.
도 3은 Exon19 결실 돌연변이 DNA를 정상 DNA에 1/100,000까지 연속 희석한 DNA혼합물에 대해 CRISPR/Cas12a 증폭을 각각 3회씩 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4은 조직 생검을 통해 결실된 Exon19 결실 여부가 확인된 검체 중 CRISPR/Cas12a 증폭을 통해 Exon19 결실 여부 돌연변이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 LbCas12a의 부수적 효과를 통한 형광 신호 기반 핵산 검출 방법의 개략도이다.
도 6은 exon19 결실 돌연변이 DNA 검출을 위한 crRNA가 부수적 효과를 일으키는 기작을 설명하는 그림이다.
도 7은 LbCas12a/crRNA 복합체로부터 유도된 형광 신호를 통해 합성된 exon19 결실 돌연변이 DNA 검출 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 임상 폐암 환자 샘플에 의해 검증된 Exon19 결손 패턴의 개략도이다.
도 9는 NGS에 의한 하위 유형 1(subtype1) 결실을 포함하는 것으로 확인된 2개의 양성 샘플(P-1, P-11)과 돌연변이를 포함하지 않는 것으로 확인된 2개의 음성 샘플(N-25, N-26)의 형광 신호를 측정한 결과이다.
도 10은 NGS에 의한 하위 유형 2(subtype2) 결실을 포함하는 것으로 확인된 2개의 양성 샘플(P-9, P-10)과 돌연변이를 포함하지 않는 것으로 확인된 2개의 음성 샘플(N-25, N-26)의 형광 신호를 측정한 결과이다.
도 11은 NGS에 의한 하위 유형 3(subtype3) 결실을 포함하는 것으로 확인된 2개의 양성 샘플(P-4)과 돌연변이를 포함하지 않는 것으로 확인된 2개의 음성 샘플(N-25, N-26)의 형광 신호를 측정한 결과이다.
도 12는 NGS에 의한 하위 유형 4(subtype4) 결실을 포함하는 것으로 확인된 2개의 양성 샘플(P-8)과 돌연변이를 포함하지 않는 것으로 확인된 2개의 음성 샘플(N-25, N-26)의 형광 신호를 측정한 결과이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
참조예 1. LbCas12a 재조합 단백질의 정제 및 확인
LbCas12a 재조합 단백질을 발현하기 위해 대장균 BL21(DE3) 세포를 pET28a-LbCas12a(addgene No. #114070) 박테리아 발현 벡터로 형질전환시켰다. 배양액이 0.6의 O.D에 도달할 때까지 세포를 37°C에서 Luria Broth(LB)에서 배양하고 재조합 단백질은 isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG, GenDEPOT, Texas, USA)를 최종 농도 1mM로 첨가하여 18℃에서 18시간 동안 유도하였다. 세포 배양물을 원심분리(4000rpm, 30분)하여 배지를 제거하고, 펠릿화된 세포를 용해 완충액(20mM Tris-HCl(pH 8.0), 300mM NaCl, 10mM β-메르캅토에탄올(BioRad, California, U.S.A), 1% Triton X-100(Sigma) 및 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(Sigma, St. Louis, U.S.A) 초음파 처리(Qsonica, Newtown, U.S.A)에 의해 용해(lysis)하였다.
상기 초음파 처리에 의한 세포 용해물을 20,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하고, 수확한 가용성 분획을 Ni-NTA 수지(Takara, Nojihigashi, Japan)와 혼합하여 정제하였다. 혼합물을 결합 완충액(20mM Tris-HCl(pH 8.0), 300nM NaCl)에서 1시간 동안 4℃에서 교반하면서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, Ni-NTA 수지를 10 부피의 세척 완충액으로 세척하였다. 다음으로, Ni-NTA 수지에 결합된 단백질을 용출 완충액(20mM Tris-HCl(pH 8.0), 300nM NaCl 및 200mM 이미다졸)으로 용출(elution)시켰다.
용출된 단백질은 Centricon 필터(Amicon Ultra , 밀리포어, 벌링턴, 미국). 재조합 단백질의 순도는 SDS-PAGE(10%, Biorad, California, U.S.A) 및 Coomassie blue 염색(Biorad, California, U.S.A)으로 확인하였다.
참조예 2. crRNA의 시험관 내 전사
crRNA의 시험관 내(in vitro) 전사(transcription)를 위해, 표적 DNA에 해당하는 crRNA와 T7 프로모터 서열을 포함하는 DNA 올리고(DNA oligo)는 COSMO Genentech에서 구입하였다.
DNA oligo는 T7 RNA polymerase (NEB, Massachusetts, U.S.A), 50mM MgCl2, 100mM NTPs (ATP, GTP, UTP, CTP), 10X RNA polymerase reaction buffer, Murine RNase inhibitor, 100mM DTT 및 DEPC와 37℃에서8시간 동안 혼합하였다. DNA 올리고를 완전히 제거하기 위하여 상기 혼합물을 DNase와 함께 37°C에서 1시간 동안 배양하고, RNA 정제 키트(RBC, New Taipei City, Taipei)를 사용하여 RNA를 정제하였다. 정제된 RNA의 순도(purity)와 농도(concentration)는 Nanodrop™ 2000 Spectrophotometer(Thermo-Fisher, Massachusetts, U.S.A.)로 측정하였다. 정제된 RNA를 분취하여 -80°C에 보관하였다.
참조예 3. PCR 앰플리콘 및 시험관 내 절단의 준비
HEK293T의 genomic DNA 로부터 돌연변이를 포함하는 DNA 프라이머(primer)를 사용한 중첩 PCR(overlap PCR)에 의해 엑손 19 (exon 19)에 일부 서열이 삭제된 PCR 앰플리콘(PCR amplicon) 돌연변이 얻었다.
정제된 recombinant Cas12a와 돌연변이 DNA 이외의 DNA를 제거하도록 디자인된 crRNA를 미리 혼합하고 PCR 앰플리콘과 함께 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 90°C에서 1분 동안 Cas12a/crRNA 리보핵단백질 복합체(ribonucleoprotein complex)를 비활성화(inactivation)시켰다.
PCR 앰플리콘의 절단(cleavage)은 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)(2%)에 의해 확인하였다.
참조예 4. CRISPR/Cas12a 증폭을 통한 돌연변이 DNA 농축
돌연변이 DNA(mutant DNA)를 특이적으로 증폭(specifically amplify)하기 위해 정제된 재조합 LbCas12a 단백질과 인위적으로 합성된 crRNA를 미리 혼합하고, PCR 앰플리콘(PCR amplicon)과 함께 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 90°C에서 1분 동안 배양하여 Cas12a/crRNA 리보핵단백질 복합체를 비활성화하였다.
상기 과정을 통해 정상 DNA(normal DNA)를 절단(cleavage)한 후, 절단된 혼합물(the cleaved mixture)을 PCR 증폭을 통해 절단되지 않은 돌연변이 DNA를 증폭시켰다(98°C에서 30초 동안 변성(denaturation), 58°C에서 30초 동안 프라이머 어닐링(primer annealing), 72°C에서 30초 동안 신장(extension), 30 cycles).
높은 처리량 시퀀싱(High throughput sequencing)을 위해 nested PCR(98°C에서 30초 동안 변성(denaturation), 58°C에서 30초 동안 프라이머 어닐링(primer annealing) 및 72°C에서 30초 동안 신장(extension), 35 cycles)을 사용하여 enriched PCR production을 바코드 서열(barcode sequence)과 연결하였다. 높은 처리량 시퀀싱(High throughput sequencing)은 Illumina I-seq 100 시퀀싱 기기(Illumine, California, USA)로 수행하였다.
CRISPR 분석기 웹 도구(CRISPR analyzer web tool)를 통해 시퀀싱 원시 데이터(sequencing raw data)를 분석하여 돌연변이 DNA 비율(rate)을 계산하였다.
구체적으로, 무세포 순환 DNA(cfDNA)는 폐암 환자의 혈장에서 추출하였고, 추출된 cfDNA를 돌연변이 DNA(mutant DNA)를 특이적으로 증폭(specifically amplify)하기 위해 정제된 재조합 LbCas12a 단백질과 인위적으로 합성된 crRNA를 혼합하여 정상 DNA(normal DNA)를 절단(cleavage) 하였다. 절단된 혼합물(the cleaved mixture)을 PCR 증폭을 통해 절단되지 않은 돌연변이 DNA를 증폭시켰다. 높은 처리량 시퀀싱(High throughput sequencing)을 수행하고, CRISPR 분석기 웹 도구(CRISPR analyzer web tool)를 통해 시퀀싱 원시 데이터(sequencing raw data)를 분석하였다.
참조예 5. CRISPR/Cas12a 기반 형광 리포터 분석
LbCas12a의 부수적 효과(collateral effects)을 이용한 형광 신호는 형광단-소광제 리포터 분석(fluorophore-quencher reporter assay)을 통해 확인하였다. 안정적인 복합체 형성을 위해 정제된 LbCas12a 재조합 단백질(50nM)과 돌연변이된 DNA 서열(50nM)에 해당하는 crRNA를 NEBuffer 2.1에 미리 혼합하여 실온에서 5분 동안 두었다. DNA 혼합물과 FQ 리포터(5`/6-FAM/TTATT/BHQ1/3`)를 LbCas12a/crRNA 리보뉴클레아제 어셈블리 혼합물(LbCas12a/crRNA ribonuclease assembly mixture)에 첨가한 후 96 웰 블랙 플레이트(96 well black plate)에 로딩하고, 형광 신호를 1분 간격으로 1시간(FAM) 측정하였다. (FQ (λex: 483/30 nm, λem: 530/30 nm) Fluoroskan™ Microplate Fluorometer(Thermo-Fisher, Massachusetts, U.S.A).)
실시예 1. EGFR exon19 결실 돌연변이를 특이적으로 증폭하기 위한 crRNA 설계 및 활성 확인
실시예 1.1. EGFR exon19 결실 돌연변이를 특이적으로 증폭하기 위한 crRNA 설계
EGFR exon19 결실 돌연변이를 특이적으로 증폭하기 위한crRNA를 설계하였다.
구체적으로, L858R 점 돌연변이와 달리 exon19 결실 패턴은 9bp~18bp 등 다양한 결실 크기로 나타난다. 따라서 도 1에서 보는 바와 같이, EGFR exon19 결실 돌연변이의 경우 추가적으로 잘못된 페어링을 도입하지 않고도 효과적으로 정상 DNA와 exon19 결실 돌연변이 DNA를 구별할 수 있다. EGFR exon19 결실 돌연변이를 특이적으로 증폭하기 위한crRNA의 구성은 표 1에 기재하였다.
WT crRNA 구성 (서열번호 1)
AA TTTCT ACTAA GTGTA GAT GGAGA TGTTG CTTCT CTTAA TTT
AA TTTCT ACTAA GTGTA GAT 직접반복부(direct repeat) 서열
GGAGA TGTTG CTTCT CTTAA 표적 서열
TTT 절단(cleavage) 효율을 높이는 서열
실시예 1.2. EGFR exon19 결실 돌연변이 특이적 증폭을 위한crRNA의 in vitro 절단 활성 확인EGFR Exon19 유전자좌에서 15 bp로 결실된 DNA 단편을 합성하고 정상 DNA 서열과 완벽하게 일치하는 crRNA 및 LbCas12a 으로 시험관 내 절단 분석을 수행하였다. 상기 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이, 정상 DNA 특이적 crRNA는 정상 DNA를 상당히 절단하였으나, 15bp 결실을 포함하는 돌연변이 DNA는 전혀 절단되지 않았다.
상기 결과는 L858R point mutated DNA와 달리 crRNA에 mis-pairing을 도입하지 않고도 정상 DNA와 Exon19 결실 돌연변이 DNA를 구별하여 정상 DNA만을 절단할 수 있음을 의미한다.
실시예 2. EGFR exon19 결실 돌연변이를 특이적으로 증폭하도록 설계된 CRISPR/Cas시스템 및 EGFR exon19 결실 돌연변이 검출 감도 확인
실시예 2.1 EGFR exon19 결실 돌연변이를 특이적으로 증폭하도록 설계된 CRISPR/Cas시스템
매우 적은 양의 EGFR exon19 결실 돌연변이 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는지 확인하기 위해 실시예 1의 crRNA와 LbCas12a를 이용하여 참조예 3과 같은 방법으로 정상 DNA를 특이적으로 절단한 후 PCR을 돌연변이 DNA를 증폭시켰다.
구체적으로 15bp의 exon 19결실 DNA 단편을 정상 DNA 단편과 1:100,000이 되도록 희석하였다. 시험관 절단 및 PCR 증폭을 포함하는 CRISPR/Cas12a 증폭을 희석된 DNA 혼합물에 대해 각각 3회씩 수행하였다. Exon19 결실 돌연변이 빈도는 높은 처리량 시퀀싱으로 계산하였다. 상기 결과는 도 10에 나타내었다.
도 3에서 보는 바와 같이, 1:100,000 희석된 돌연변이 DNA는 일반적인 액체 생검을 사용하여 검출되지 않았다. 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 CRISPR/Cas 시스템을 통한 3회 증폭을 통해 Exon19 결실 돌연변이 DNA를 최대 12.6%까지 증폭할 수 있음을 확인하였다.
상기 결과는 일반적인 액체 생검(No amplification, N/A)을 사용하여서는 측정할 수 없는 돌연변이 DNA를 본 발명의 일 구체체예에 따른 CRISPR/Cas12a 시스템을 통하여 측정 민감도 확보할 수 있음을 의미한다.
실시예 2.2 폐암환자의 cfDNA에서 CRISPR/Cas12a 증폭을 통한 Exon19 결실 돌연변이 검출
임상 샘플에서 Exon19 결실 돌연변이 DNA 검출 효과를 확인하기 위하여 폐암환자의 cfDNA에서 Exon19 결실 돌연변이 DNA의 CRISPR/Cas12a 증폭을 수행하였다.
구체적으로 조직 생검으로 확인된 Exon 19 결실(+) 환자 11명과 Exon 19 결실(-) 환자 11명의 혈액에서 cfDNA를 추출하고, CRISPR/Cas12a 증폭을 수행하였다. 상기 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이, CRISPR/Cas12a 증폭은 조직 생검(P1, P4, P8, P9, P10 및 P11)을 통해 확인된 6개의 Exon 19 결실(+) 샘플에서 결실된 돌연변이 DNA를 99.1%로 크게 증폭함을 확인하였다. 이들 샘플 중 2개(P4 및 P9)는 증폭 전에는 1% 미만의 결실률을 보였지만, CRISPR/Cas12a 증폭을 통해 각각 91.4% 및 93.4%로 증폭되었다.
상기 결과는 일 구체예에 해당하는 CRISPR/Cas12a 증폭 시스템이 혈액 시료에서 유래한 변이 DNA를 효과적으로 증폭할 수 있어 EGFR 돌연변이 DNA 검출에 유용한 도구로 활용될 수 있음을 의미한다.
실시예 3. CRISPR/Cas12a 시스템을 통한 LbCas12a의 부수적 효과에 기반한 EGFR exon19 결실 돌연변이 DNA의 형광 신호 증폭 확인
실시예 3.1. 합성된 EGFR exon19 결실 돌연변이 DNA의 형광 신호 증폭 확인
Cas12a 단백질의 부수적 효과를 이용하여 소량의 표적 DNA 검출 시 Cas12a 단백질의 부수적 효과로 유도된 형광 신호와 배경 신호를 구별할 수 없는 문제를 해결하기 위해 본 발명의 일 구체예에 따른 CRISPR/Cas12a 증폭 시스템을 이용하여 합성된 EGFR exon19 결실 돌연변이 DNA의 형광 신호 증폭 확인하였다.
구체적으로 도 5에서 나타낸 바와 같이, LbCas12a/crRNA가 표적 DNA를 인식하면 LbCas12a의 부수적 효과인 비특이적 ssDNase가 활성화된다. 활성화된 LbCas12a/crRNA 리보핵단백질은 참조예5에 따라 혼합한 FQ ssDNA 리포터를 포함한 단일 가닥 DNA를 비특이적으로 절단한다. 표적 DNA의 양은 절단된 FQ 리포터로부터 유도된 형광 신호에 의해 정량화하였다. 도 6에서 나타낸 바와 같이 exon19 결실 DNA 서열과 일치하는 crRNA를 사용하여 EGFR exon19 결실 돌연변이 DNA의 형광 신호를 검출 할 수 있는지 37°C에서 20분 동안 측정하였다. 다양한 유형의 exon19 결실 DNA 서열과 일치하는 crRNA구성은 표 2 및 표 3에 나타내었고, 이 중, 서열번호 2에 해당하는 crRNA로 EGFR exon19 결실 돌연변이 DNA의 형광 신호를 검출 결과는 도 7에 나타내었다. 도 7에서"Blank"는 DNA 없이 Cas12a/crRNA 리보핵산단백질만 배양한 것을 나타낸다.
exon19 결실 DNA 서열과 일치하는 crRNA구성 (서열번호 2)
AA TTTCT ACTAA GTGTA GAT GGAGA TGTCT TGATA GCGAC TTT
AA TTTCT ACTAA GTGTA GAT 직접반복부(direct repeat) 서열
GGAGA TGTCT TGATA GCGAC 표적 서열
TTT TTT 서열
도 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 일 구체예에 따른 CRISPR/Cas12a 시스템을 이용한 증폭 절차 없이 exon19 결실 DNA 서열과 일치하는 crRNA를 사용하여 형광신호를 검출한 결과 합성된 exon19 결실 돌연변이 DNA를 정상 DNA에 1/10로 희석한 DNA 혼합물을 제외하고는 배경 신호와 구별되지 않음을 확인하였다. 반면 CRISPR/Cas12a 증폭을 사용한 경우 합성된 exon19 결실 돌연변이 DNA를 정상 DNA로 1/100,000 희석된 혼합물을 포함한 모든 혼합물에서 배경 신호로부터 뚜렷한 형광 신호를 관찰하였다.
상기 결과는 일 구체예에 따른 CRISPR/Cas12a 시스템이 배경 신호와 구별할 수 없었던 낮은 형광 신호를 효과적으로 높일 수 있음을 의미한다.
실시예 3.2. 환자의 cfDNA에서 Exon19 결실 하위 패턴 돌연변이 DNA의 형광 신호 증폭 확인
cfDNA에서 희귀 돌연변이 DNA 검출에 적용될 수 있는지 확인하기 위해 NGS를 통해 돌연변이가 있는 것으로 확인된 환자의 cfDNA에서 exon19 결실 돌연변이 DNA 검출을 위한 CRISPR/Cas12a 증폭을 수행하였다. 폐암 환자 시료에서 exon19 결실 돌연변이 DNA의 형광 신호를 검출하기 위해, NSCLC(비소세포폐암) 환자에서 발견되는 4개의 exon19 결실 돌연변이 하위 패턴 각각에 해당하는 crRNA를 설계하여 도 3에 나타내었다. 도 8에서 보는 바와 같이, exon 19 결실 돌연변이 하위 유형 1~4(subtype1~4)는 exon 19 에서 각각 18bp, 15bp, 16+2bp 및 9bp가 삭제된 형태를 나타낸다. 결실 돌연변이 하위 유형의 결실을 포함하는 LbCas12a 및 crRNA 해당 DNA 서열을 사용하여 37°C에서 40분 동안 형광 신호를 측정하였고, 그 결과를 도 9 내지 도 12에 나타내였다. 도 9 내지 도 12에서 P는 이전에 조직 생검에 의해 확인된 양성 샘플을 나타내고, N은 이전에 조직 생에 의해 확인된 음성 샘플을 나타낸다.
Subtype_1 crRNA 구성 (서열번호3)
AA TTTCT ACTAA GTGTA GAT GATTC CTTGA TAGCG ACGGG TTT
AA TTTCT ACTAA GTGTA GAT 직접반복부(direct repeat) 서열
GATTC CTTGA TAGCG ACGGG 표적 서열
TTT 절단(cleavage) 효율을 높이는 서열
Subtype_2 crRNA 구성 (서열번호 4)
AA TTTCT ACTAA GTGTA GAT GGAGA TGTTT TGATA GCGAC TTT
AA TTTCT ACTAA GTGTA GAT 직접반복부(direct repeat) 서열
GGAGA TGTTT TGATA GCGAC 표적 서열
TTT 절단(cleavage) 효율을 높이는 서열
Subtype_3 crRNA 구성 (서열번호 5)
AA TTTCT ACTAA GTGTA GAT GGAAT CTTGA TAGCG ACGGG TTT
AA TTTCT ACTAA GTGTA GAT 직접반복부(direct repeat) 서열
GGAAT CTTGA TAGCG ACGGG 표적 서열
TTT 절단(cleavage) 효율을 높이는 서열
Subtype_4 crRNA 구성 (서열번호 6)
AA TTTCT ACTAA GTGTA GAT GGAGA TGTTG GTTCC TTGAT TTT
AA TTTCT ACTAA GTGTA GAT 직접반복부(direct repeat) 서열
GGAGA TGTTG GTTCC TTGAT 표적 서열
TTT 절단(cleavage) 효율을 높이는 서열
도 9는 NGS에 의한 하위 유형 1(subtype1) 결실을 포함하는 것으로 확인된 2개의 양성 샘플(P-1, P-11)과 돌연변이를 포함하지 않는 것으로 확인된 2개의 음성 샘플(N-25, N-26)의 형광 신호를 측정한 결과이다. 도 9에서 보는 바와 같이, 본 발명의 일 구현예인 CRISPR/Cas12a 증폭 수행 전에 모든 샘플에서 형광 신호가 검출되지 않았다. 반면, CRISPR/Cas12a 증폭(3회)을 통해 증폭된 두 개의 양성 샘플(P1 및 P11)의 형광 신호는 유의하게 검출되었으나, 음성 샘플(N25 및 N26)의 형광 신호는 검출되지 않았다.
도 10은 NGS에 의한 하위 유형 2(subtype2) 결실을 포함하는 것으로 확인된 2개의 양성 샘플(P-9, P-10)과 돌연변이를 포함하지 않는 것으로 확인된 2개의 음성 샘플(N-25, N-26)의 형광 신호를 측정한 결과이다. subtype2 결실을 가진 임상 샘플의 형광 신호는 CRISPR/Cas12a 증폭없이도 양성 샘플(P10)과 음성 샘플(N25, N26)을 구별할 수 있었다. 이는 P10 샘플이 증폭 전에 이미 결실된 돌연변이 DNA의 높은 비율(50.4%)을 포함하고 있기 때문으로 보인다. 그럼에도 불구하고, subtype2 결실이 있는 샘플의 형광 신호는 음성 샘플과 CRISPR/Cas12a 증폭에 의해 더욱 명확하게 구별되는 것을 확인하였다.
도 11은 NGS에 의한 하위 유형 3(subtype3) 결실을 포함하는 것으로 확인된 2개의 양성 샘플(P-4)과 돌연변이를 포함하지 않는 것으로 확인된 2개의 음성 샘플(N-25, N-26)의 형광 신호를 측정한 결과이고, 도 12는 NGS에 의한 하위 유형 4(subtype4) 결실을 포함하는 것으로 확인된 2개의 양성 샘플(P-8)과 돌연변이를 포함하지 않는 것으로 확인된 2개의 음성 샘플(N-25, N-26)의 형광 신호를 측정한 결과이다. 도 11 및 도 12에서 보는 바와 같이, subtype3 및 4 결실 유형 돌연변이가 양성으로 확인된 P4 및 P8 샘플의 형광 신호는 CRISPR/Cas12a 시스템으로 증폭 전에는 음성 샘플(N25 및 N26)과 구분할 수 없었다. 반면, CRISPR/Cas12a 증폭을 통해 형광 신호가 강화되었음을 확인하였다.
상기 결과는 일 구체예의 CRISPR/Cas12a 증폭 시스템은 혈액 시료에서 유래한 변이 DNA를 효과적으로 증폭할 수 있음을 의미한다. 따라서 다양한 질병 진단에 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 진단 분야 외에도 정상 DNA와 변이 DNA의 구분이 병원성 대립유전자 특이적 유전체 편집을 통한 암 치료 등 다양한 분야에 적용될 수 있다.

Claims (19)

  1. 표적 서열과 혼성화하고, EGFR(Epidermal growth factor receptor) 돌연변이 유전자 서열에 상보적인 연속적인 염기를 포함하는 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 상기 가이드 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산;
    CRISPR/Cas 이펙터 단백질(effector protein), 또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산; 및
    단일 가닥이고, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드와 혼성화 되는 표지된 검출 핵산을 포함하는 EGFR 돌연변이를 검출하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일 가닥 검출 핵산은 DNA는 형광-방출 염료쌍을 포함하는 것인, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 형광-방출 염료쌍은 FRET 쌍 또는 퀸처/플루오르 쌍인 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 EGFR 돌연변이는 G719S 돌연변이, G179C 돌연변이, G719A 돌연변이, S720F 돌연변이, T790M 돌연변이, D761Y 돌연변이, exon 19 결실 돌연변이, D770_N771 삽입 돌연변이, V765A 돌연변이, T783A 돌연변이, S761I 돌연변이, T790M 돌연변이, V769L 돌연변이, N771I 돌연변이, L858R 돌연변이, L861Q 돌연변이, L861R 돌연변이 중 어느 하나인 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 5' 말단에서 3' 말단 순서로, 직접 반복부 서열, 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 3'말단에 절단 효율을 높이는 서열을 더 포함하는 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 이펙터 단백질은 Cas12a, mgCas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 및 Cas12i로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 이펙터 단백질인 것인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 상기 가이드 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산은 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  9. 제1 항의 조성물을 포함하는 EGFR 돌연변이를 검출하기 위한 키트.
  10. 제9항에 있어서, 핵산 증폭 성분을 더 포함하는 것인 키트.
  11. 시료를 제1 항의 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    CRISPR/Cas 이펙터 단백질에 의한 상기 단일 가닥의 검출 핵산의 절단에 의해 생성된 검출 가능한 신호를 측정하여, 상기 시료 내 표적 서열을 검출하는 단계를 포함하는, EGFR 돌연변이를 검출하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 시료는 cfDNA(cell free DNA)인 것인, EGFR 돌연변이를 검출하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 시료 내 존재하는 상기 표적 서열의 양을 결정하는 단계를 포함하는, EGFR 돌연변이를 검출하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 결정하는 단계는, 상기 검출 가능한 신호를 측정하여 시험 측정치를 생성하는 단계; 기준 샘플에 의해 생성된 검출 가능한 신호를 측정하여 기준 측정치를 생성하는 단계; 및 상기 시험 측정치를 상기 기준 측정치와 비교하여 상기 시료 내 존재하는 표적 서열의 양을 결정하는 단계를 포함하는 것인, EGFR 돌연변이를 검출하는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 CRISPR/Cas 이펙터 단백질은 Cas12a, mgCas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 및 Cas12i로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 이펙터 단백질인 것인, EGFR 돌연변이를 검출하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 검출 가능한 신호를 측정하는 단계는 금 나노입자 기반 검출, 형광 편광, 콜로이드 상 전이/분산, 전기 화학적 검출 및 반도체-기반 센싱 중 하나 이상을 포함하는 것인, EGFR 돌연변이를 검출하는 방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 검출 핵산은 형광-방출 염료쌍을 포함하는 것인, EGFR 돌연변이를 검출하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 형광-방출 염료쌍은 상기 검출 핵산의 절단 전에 검출 가능한 신호의 양을 생성하고, 검출 가능한 신호의 상기 양은 상기 검출 핵산의 절단 후에 감소되는 것인, EGFR 돌연변이를 검출하는 방법.
  19. 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 적어도 95% 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 가이드 폴리뉴클레오티드.
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