KR20150036776A - 암컷 불임에 대한 치료학적 타겟 및 진단 마커로서의 세포-유리 dna - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암컷의 불임을 치료하기 위한 DNase의 용도 및 암컷 불임 마커로서의 cfDNA의 용도에 관한 것이다.

Description

암컷 불임에 대한 치료학적 타겟 및 진단 마커로서의 세포-유리 DNA {CELL-FREE DNA AS A THERAPEUTIC TARGET FOR FEMALE INFERTILITY AND DIAGNOSTIC MARKER}
본 발명은 암컷 불임 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 새로운 암컷 불임 마커 및 치료가 필요한 암컷 환자의 생식력을 높이는 새로운 치료 방법에 관한 것이다.
과거 수년간, 본 저자들은 원인 불명의 불임 발생률이 20% - 25% 정도로 높다는 것을 발표하고 있다. 불임은 커플이 만 일년 이상 임신을 시도하였지만 임신되지 않는 것을 의미한다.
불임의 진단은 병력과 신체 검사로 시작된다. 이 신체 검사가 임신 시도 일년 안에 임신이 되지 않은 커플에 대한 배란 기능, 난관조영술 및 복강경 검사에 대한 평가로 한정된다면, 수많은 불임 사례들이 원인 불명으로 남게 된다. 여러가지 분석법 (다양한 호르몬 및 사이토카인의 수준 측정, 여성 불임과 관련된 유전자에서 임의의 돌연변이를 검출하기 위한 유전자 검사 기법)을 추가하여 진단 검사를 확장하더라도, "원인 불명" 불임은 조금 줄어들 뿐이다.
흡연, 카페인 과다 섭취 또는 알코올 섭취에 따른 유해 효과는 알려져 있다. 그러나, 이들이 불임에 미치는 영향은 사람마다 크게 다르고, 오늘날 이러한 영향을 정량할 수 있는 생물 마커는 없는 실정이다. 그래서, 이러한 영향은 현재 이용가능한 검사법으로는 정확하게 평가할 수 없다.
임상 불임에 대한 치료법 중에서도, 보조생식기술 (ART)은 시술 건수 당 출산율이 가장 높다. ART는 시술된 이래로 전세계적으로 백만건 이상을 착상시키는데 기여하고 있다. 그러나, 이 기술의 실패율도 여전히 높은 수준이며, 커플이 ART를 시술하고자 하는 결정 또는 시술 시도 실패 후 ART 시술을 다시 받고자 하는 결정은 종종 시술에 따른 신체적 고통, 감정적 고통 및 재정 비용으로 인해 쉽지 않은 일이다.
시험관내 수정 (IVF)과 세포질내 정자 주입 (ICSI)과 관련된 데이타들은, 가장 성공적인 프로그램에서 조차도, 이식 배아의 수에 비해 이식율이 낮다는 것을 명확하게 보여준다. 이식시 문제를 일으키는 결함은 대개는 현재 판단되는 것 보다 훨씬 더 높은 빈도로 일어나므로, 원인 불명 불임의 다른 영역을 이루고 있다.
인테그린, LIF, G-CSF 또는 그외 성장 인자 등의 이식 인자 (implantation factor)를 분석해보면 다른 불임 사례들에 대한 이해를 도모함으로써, "원인 불명 불임"으로 분류되는 환자 퍼센트를 줄일 수 있지만, 대부분의 사례들에서는 치료법에 관한 초기 논의에 도움이 되지 않을 것이다. 프랑스에서 ART 성공율은 회수 난모세포 당 출산 건수 측면에서 25% 내지 28%이다.
전술한 바와 같이, 여성 불임과 관련있는 다수의 변수들은 현행 검사법에서 완전히 간과되고 있다.
인간 혈장에서 순환하는 세포-유리형 DNA의 존재는 1948년에 멘델 및 메타이스에 의해 발표되었다 [1]. 순환하는 세포-유리형 DNA (cfDNA)는 염증성 장애, 산화 스트레스 및 악성 종양 등의 다양한 생리학적 및 병리학적 병태들에서 연구되고 있다. 건강한 개체의 경우 이의 혈중 농도는 0 - 100 ng/ml이고, 평균적으로 30 ng/ml이다 [2]. 정상 세포의 DNA 함량을 6.6 pg으로 가정하면, 이 수치는 혈액 1 ml 당 평균 게놈 당량 (genome equivalent) 0-15,000에 해당하며, ml 당 게놈이 평균 5000이다. 이 DNA 대부분이 이중 가닥이고, 외관상 핵단백질 복합체 형태이다.
cfDNA의 저-농도 아가로스 겔 전기영동에서, DNA 단편들은 크기가 0.18 - 21 kb로 다양한 것으로 확인되며, DNA 단편들의 크기 분포는 샘플 마다 다르다. 공통적으로 거대한 준-게놈 (quasi-genome) 크기의 DNA 단편들이 검출된다.
유리형 DNA의 혈류 방출과 관련된 정확한 기전은 불확실하지만, 아마도 세포자살, 세포괴사 및 세포로부터의 능동적인 방출이 종합적으로 작용하는 것으로 보인다.
혈류에서 cfDNA 소거는 신속하게 이루어지는데: 태아의 DNA는 출산 후 산모의 혈액에서 사라지며, 반감기는 16.3분이다 [3]. cfDNA는 혈장 뉴클레아제 (예, DNase I)에 민감한 것으로 알려져 있으며, 신장 [4] 및 간 [5]의 소거 기전에 cfDNA의 제거가 포함되어 있다.
지금까지, cfDNA의 방출이 어떠한 생물학적 효과를 가지에 대해서는 알려져 있지 않다. 배양된 세포가 이중 가닥 DNA를 배지로 방출한다는 보고가 있으며 [6], cfDNA는 세포 안으로 편입될 수도 있다 [7]. 이러한 실험 결과들로 "게놈전이 (genometastasis)"라는 개념이 도입되었다 [8]. 하지만, 이 가설은 증명이 미제로 남아있다.
순환성 DNA는 혈장과 혈청 모두에서 분리될 수 있지만, 순환성 DNA의 농도는 혈청에서 대략 6배 높다. 최근, 우메타니 등은, 6배 높은 농도의 혈청 DNA 중 10% 미만이 다른 소스에 의한 오염 (즉, 혈청 분리 시 백혈구로부터의 방출)이 원인이라는 것을 밝혀내었다 [9]. 혈청내 수준이 높은 이유는 아직 알 수 없지만, 정제 공정 중에 혈장내 DNA가 소실되는 경우는 배제하였다 [9].
순환하는 세포-유리형 DNA는 잠재적으로 유용한 바이오마커이다. DNA 수준과 단편화 패턴은 진단 및 예후 예측 목적으로 흥미로운 가능성을 제시한다. 최근, 바르토브 등은 개체의 체액 샘플에서 측정된 cfDNA를 토대로 남성 개체의 생식성 상태를 평가하는 방법을 개시하였다 (WO2008/047364). 이들은, 또한, 생식력 저하 (sub-fertile) 남성에게 DNase를 투여함으로써 남성의 낮은 생식력을 치료하는 방법도 제안하였다. 또한, 세포-유리형 DNA는 악성 및 양성 증식과 염증성 병태, 예컨대 자궁내막증에 대한 비-침습적인 모니터링 바이오마커로서 제안된 바 있다 [10].
최근들어, 자만스키-코헨 등은, IVF 시술 중인 여성 37명으로 구성된 코호트에서, 혈장 cfDNA 농도가, 가임 여성과 비교해, 불임 여성에서 βHCg 검사 당일 통계학적으로 더 높다는 것을 발표하였다. 그러나, 저자들이 인정한 바와 같이, 이 연구에 참여한 여성 모두 IVF 시술을 진행 중에 있기 때문에, 이 연구는 여성 불임과 cfDNA 농도 간의 상관성을 확립할 수 없었다 [11].
Mandel P, Metais P. Les acides nucleiques du plasma sanguine chez l'homme. C R Acad Sci Paris 1948; 142: 241-3. Huang ZH, Li LH, Hua D. Quantitative analysis of plasma circulating DNA at diagnosis and during follow-up of breast cancer patients. Cancer Lett 2006; 243: 64-70. Lo YM, Zhang J, Leung TN, et al. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet 1999; 64: 218-24. Botezatu I, Serdyuk O, Potapova G, et al. Genetic analysis of DNA excreted in urine: a new approach for detecting specific genomic DNA sequences from cells dying in an organism. Clin Chem 2000; 46: 1078-84. Minchin RF, Carpenter D, Orr RJ. Polyinosinic acid and polycationic liposomes attenuate the hepatic clearance of circulating plasmid DNA. J Pharmacol Exp Ther 2001; 296: 1006-12. Anker P, Stroun M, Maurice PA. Spontaneous release of DNA by human blood lymphocytes as shown in an in vitro system. Cancer Res 1975; 35: 2375-82. Bergsmedh A, Szeles A, Henriksson M, et al. Horizontal transfer of oncogenes by uptake of apoptotic bodies. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 6407-11. Garcia-Olmo DC, Ruiz-Piqueras R, Garcia-Olmo D. Circulating nucleic acids in plasma and serum (CNAPS) and its relation to stem cells and cancer metastasis: state of the issue. Histol Histopathol 2004; 19: 575-83. Umetani N, Hiramatsu S, Hoon DS. Higher amount of free circulating DNA in serum than in plasma is not mainly caused by contaminated extraneous DNA during separation. Ann N Y Acad Sci 2006; 1075: 299-307. Zachariah R, Schmid S, Radpour R, Buerki N, Fan AX, Hahn S, Holzgreve W, Zhong XY. Circulating cell-free DNA as a potential biomarker for minimal and mild endometriosis. Reprod Biomed Online. 2009 Mar;18(3):407-11. Czamanski-Cohen J, Sarid O, Cwikel J, Lunenfeld E, Douvdevani A, Levitas E, Har-Vardi I. Increased plasma cell-free DNA is associated with low pregnancy rates among women undergoing IVF-embryo transfer. Reprod Biomed Online. 2013 Jan;26(1):36-41.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은, cfDNA 수준이 가임 여성 보다는 불임 여성에서 통계학적으로 더 높다는 것을 입증하게 되었다. 이에, cfDNA 수준은 불임을 진단 및 예측하는데 유용할 수 있다. 또한, cfDNA 수준은 자궁내막증을 앓고 있지 않은 여성에서 불임을 진단 및 예측하는데에도 유용할 수 있다. cfDNA가 침습적이거나 또는 통증을 동반한 시술없이도 얻을 수 있기 때문에, 특히 여성에서 불임을 진단하는데 사용하기 적합하다. 아울러, 후술하는 실험 부분에서 확인되는 바와 같이, 세포-유리형 DNA 수준의 저하를 유도하는 치료는 여성 환자의 생식력을 유의하게 향상시킨다.
본 발명의 제1 과제는 포유류 암컷의 불임을 시험관내 진단하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은,
(i) 상기 암컷의 체액 샘플에서 세포-유리형 DNA 수준을 측정하는 단계, 및
(ii) 상기 수준을 사전 결정된 역치와 비교하는 단계를 포함하며,
상기 세포-유리형 DNA 수준이 상기 사전 결정된 역치 보다 높은 것은 불임을 의미한다.
본 방법은, 인간 여성 또는 동물의 암컷, 바람직하게는 인간에서 불임을 진단하는데 사용할 수 있다. 이는, 커플의 불임 이유를 조사할 때 행해지는 1차 검사와 함께, 또는 이들 검사 후, 상기 검사에서 불임의 원인을 찾지 못한 환자를 대상으로 수행할 수 있다. 특히, 본 방법은 자궁내막증을 앓고 있지 않은 암컷에서 불임을 시험관내 진단하기 위해 사용할 수 있다.
물론, 앞서, "불임을 의미하는" cfDNA 수준을 가진 암컷이란, 이 암컷의 불임 가능성이 사전 결정된 역치 보다 낮은 cfDNA 수준을 가진 암컷에 비해 높다는 것을 의미한다.
상기 방법에서, 체액 샘플은 혈장, 혈청, 혈액 또는 난포액 (follicular fluid) 샘플일 수 있다.
아래 실험 부분에 나타낸 바와 같이, cfDNA 농도는 94명의 가임 여성과 96명의 불임 여성의 혈장에서 측정하였다. 이 코호트에서, 평균 cfDNA 혈장 농도는 가임 여성의 경우 약 50 ng/㎕, 불임 여성의 경우 약 109 ng/㎕이었다. 그래서, 상기 방법에서 인간 여성을 대상으로 하고, 체액 샘플이 혈장 샘플인 경우, 역치는 상기한 두가지 값 사이에서 선택되며, 바람직하게는 50 내지 약 100 ng/㎕이다. 물론, 당해 기술 분야의 당업자는 좀더 대규모의 환자 코호트에서 이들 파라미터를 추가로 조사함으로써, 이들 값을 세밀화하고 수정할 수 있을 것이다. 좀더 대규모의 환자들로부터 유래된 샘플에서 cfFNA 수준을 측정함으로써, 당해 기술 분야의 당업자는 cfDNA 수준에 대한 값의 범위와 그에 따른 불임 가능성을 확립하게 될 것이다. (연령 및/또는 흡연 여부와 같은 행동 파라미터 및/또는 체중, HbA1c 등의 생리학적 파라미터에 따른) 여성의 동질적인 서브 그룹으로 구성된 대규모 코호트에서 측정함으로써, 여러가지 상황을 반영하는 여러가지 역치들을 결정할 수 있다. 이 경우, 당해 기술 분야의 당업자는 다른 관련 파라미터들에 따라 그 여성의 cfDNA 수준을 해석함으로써 여성의 불임 가능성을 결정하게 될 것이다.
전술한 바와 같이, 본 방법은 혈장 샘플이 아닌 체액 샘플에서 cfDNA 수준을 측정함으로써 수행할 수 있다. 물론, 각 체액에 대해서는, 적정 역치를 결정하기 위해, 가임 암컷 및 불임 암컷을 포함한 대규모 여성 코호트에서 측정을 수행하여야 한다.
불임일 수 있는 암컷을 모두 또는 거의 모두 동정하기 위한 목적일 경우, 역치는 가임 암컷의 평균치에 가깝게 정해질 것이다. 이 경우, 가임 암컷도 불임으로 진단될 수도 있다 (위 양성). 반대로, 불임일 가능성이 가장 높은 암컷만을 동정하고자 한다면, 역치는 불임 암컷의 평균치에 가깝게 정해질 것이다.
일 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 암컷의 혈장 샘플에서 cfDNA 수준을 측정함으로써 상기 암컷의 불임을 시험관내 진단하기 위해 수행되며, 혈장내 cfDNA 수준이 60 ng/㎕ 보다 높으면 불임을 의미한다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 암컷의 혈장 샘플에서 cfDNA 수준을 측정함으로써 상기 암컷의 불임성을 시험관내 진단하기 위해 수행되며, 혈장내 cfDNA 수준이 70 ng/㎕ 보다 높으면 불임을 의미한다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 암컷의 혈장 샘플에서 cfDNA 수준을 측정함으로써 상기 암컷의 불임성을 시험관내 진단하기 위해 수행되며, 혈장내 cfDNA 수준이 80 ng/㎕ 보다 높으면 불임을 의미하며, 세포-유리형 DNA 수준이 사전 결정된 역치 보다 높으면 불임을 의미한다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 암컷의 혈장 샘플에서 cfDNA 수준을 측정함으로써 상기 암컷의 불임성을 시험관내 진단하기 위해 수행되며, 혈장내 cfDNA 수준이 90 ng/㎕ 보다 높으면 불임을 의미하며, 세포-유리형 DNA 수준이 사전 결정된 역치 보다 높으면 불임을 의미한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 암컷의 혈장 샘플에서 cfDNA 수준을 측정함으로써 상기 암컷의 불임을 시험관내 진단하기 위해 수행되며, 혈장내 cfDNA 수준이 100 ng/㎕ 보다 높으면 불임을 의미한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 생물 샘플에서 cfDNA 수준을 측정하기 위한 반응시약과, 생물 샘플에서 하나 이상의 다른 생리학적 파라미터를 측정하는 특이적인 반응시약을 포함하는 키트에 관한 것이며, 상기 생리학적 파라미터는 항-뮐러관 호르몬 (AMH: Anti-Mullerian Hormone) 농도, 텔로머라제 활성 및 호모시스테인 농도로 이루어진 군으로부터 선택된다.
생물 샘플내 cfDNA 수준은 비-제한적인 예로, 임의의 핵산 염료, 예컨대 인터칼레이터 등의 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기법으로 측정할 수 있다. cfDNA 수준을 측정하는데 사용될 수 있으며 본 발명에 따른 키트에 포함시킬 수 있는, DNA 인터칼레이터에 대한 비-제한적인 예로는, 베르베린 (berberine), 에티듐 브로마이라, 프로플라빈, 다우노마이신 (daunomycin), 독소루비신, 탈리도마이드 (thalidomide), Sybr® Green, Sybr® Gold 및 PicoGreen®을 포함한다.
또한, 항-뮐러관 호르몬 (AMH)은 MIS (뮐러관 저해 물질)라고도 한다. AMH는 난포에 의해 직접 생산되기 때문에, AMH 수준은 난소의 동난포 (antral follicle)의 수와 상관 관계를 보인다. AMH가 낮은 여성은 동난포 수가 낮고, AMH 수준이 높은 여성에 비해 난모 세포를 더 적게 생산한다는 것은 입증되어 있다. 혈중 AMH 수준은 남아있는 난자 공급 - 또는 "난소 예비력 (ovarian reserve)"의 크기를 반영하는 것으로 여겨진다. AMH는 ELISA 등의 면역 분석에 의해 측정할 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 그래서 항-AMH 항체를 포함할 수 있다.
텔로머라제는 DNA 변성을 복구하는 효소이다. 하지만, 텔로머라제가 충분하지 않은 농도로 존재하는 경우에는 효용이 없을 수 있다. 게다가, 매우 높은 농도로 존재하는 경우에도, 텔로머라제는 세포자살 요인들을 발생시킨다. 그 결과, 텔로머라제는 생식력과도 관련있으며, 초기 배아 발생에 영향을 미친다. 텔로머라제의 수준은 면역분석으로 측정할 수 있으며, 따라서, 본 발명에 따른 키트는 텔로머라제를 특이적으로 인지하는 항체를 포함할 수 있다.
호모시스테인은 추가적인 메틸렌 (-CH2-) 기 차이를 가진 아미노산 시스테인의 비-단백질 상동체이다. 호모시스테인은 산화 스트레스의 마커로서, 그 자체로서 개체의 생식력 상태에 대해 정보를 제공하는 것일 수 있다. 호모시스테인 수준은 효소적 분석에 의해 측정할 수 있으며: 결합되거나 이량체화된 호모시스테인 (산화된 형태)은 유리형 호모시스테인으로 환원된 다음 시스타티오닌 β-신타제 (CBS)에 의해 촉매화된 세린과 반응하여 L-시스타티오닌을 형성한다. 이후, 시스타티오닌은 시스타티오닌 β-리아제 (CBL)에 의해 분해되어, 호모시스테인, 피루베이트 및 암모니아가 된다. 피루베이트는 락테이트 데하이드로게나제 (LDH)에 의해 락테이트와 코엔자임으로서 NADH로 변환된다. NADH의 NAD로의 변환율은 호모시스테인 (ΔΔ340 nm)의 농도와 직접적으로 비례한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 키트는 하나 이상의 DNA 인터칼레이팅제와 AMH를 특이적으로 인지하는 항체를 포함한다.
아래 실험들에서 언급되는 바와 같이, 여러번의 IVF를 비롯한 수차례의 치료를 이미 받았지만 성공하지 못한 불임 여성에게 데옥시리보뉴클레아제를 처리하였다. 데옥시리보뉴클레아제를 단지 1회 처리한 후, ART를 시술하였을 때, 이들 환자의 50%가 임신되었다. 그래서, 본 발명은 암컷 불임, 특히 불임이 통계학적으로 가임 여성에서 관찰되는 세포-유리형 DNA 수준 보다 높은 세포-유리형 DNA 수준과 연관된 경우에, 암컷 불임을 치료하는데 사용하기 위한, 데옥시리보뉴클레아제에 관한 것이다.
데옥시리보뉴클레아제 (DNase)는 DNA 벡본내 포스포다이에스테르 결합에 대한 가수분해 절단을 촉매하는 효소이다. 즉, 데옥시리보뉴클레아제는 일종의 뉴클레아제이다. 매우 다양한 데옥시리보뉴클레아제들이 공지되어 있는데, 이들은 기질 특이성, 화학적 기전 및 생물학적 기능 측면에서 상이하다.
몇몇 DNase는 DNA 분자의 말단 잔기만 절단한다 (엑소데옥시리보뉴클레아제, 엑소뉴클레아제의 일종임). 나머지들은 체인내 어딘가를 절단한다 (엔도데옥시리보뉴클레아제, 리보뉴클레아제의 아종임). 일부는 제한효소 처럼 이들이 절단하는 DNA 서열에 대해 매우 서열-특이적인 반면, 일부는 거의 구분하지 않는다. 어떤 것은 이중 가닥 DNA만 절단하는 반면, 다른 것은 단일 가닥 분자에 특이적이고, 또 다른 것은 이들 둘다에 작용한다.
데옥시리보뉴클레아제 I은 우선적으로 피리미딘 뉴클레오티드에 인접한 포스포다이에스테르 결합에서 DNA를 절단함으로써, 3' 위치 상에 유리 하이드록시기를 가진 5'5'-포스페이트-말단의 폴리뉴클레오티드를 형성하여, 평균적으로 테트라뉴클레오티드를 만든다. 이 효소는 단일 가닥 DNA, dsDNA 및 크로마틴에 작용한다.
데옥시리보뉴클레아제 II (Acid DNase)는 네이티브 DNA와 변성된 DNA에서 데옥시리보뉴클레오티드 결합을 가수분해함으로써, 3'-포스페이트를 가진 산물을 만들어낸다. 이름에서 시사되는 바와 같이, 산성 pH에서 훨씬 효과적이다. alpha DNase II (통상 DNase II이라 함) 및 DNase II beta (통상 DLAD 또는 DNase II-Like Acid DNase라 함)를 비롯하여, 수종의 DNase II가 공지되어 있다.
임의 타입의 DNase가 본 발명에 사용될 수 있지만, DNase I이 바람직하다. 재조합 인간 DNase I은 이미 임상적으로 사용되고 있다. DNase 효소는 낭포성 섬유증 환자가 분무기를 이용하여 흡입할 수 있다. 점액에 축적된 백혈구 세포는 점액에 '점착성'을 부가하는 DNA를 파괴하여 방출하기 때문에, DNase 효소가 도움이 된다. DNase는 DNA를 분해하여, 점액을 폐에서 쉽게 제거한다.
또한, 본 발명은 암컷의 불임을 치료하는 방법에 관한 것이다. 구체적인 구현예에서, 본 발명은 자궁내막증을 앓고 있지 않은 암컷에서 암컷 불임을 치료하는 방법에 관한 것이다. 다른 구체적인 구현예에서, 본 발명은 가임 암컷에서 통계적으로 관찰되는 수준 보다 높게 세포-유리형 DNA 수준을 나타내는 암컷에서 암컷 불임을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이에 대한 임의 구현예들에서, 본 발명에 따른 방법은 가임 암컷에서 관찰되는 수준과 유사한 수준으로 세포-유리형 DNA 수준을 낮추는데 충분한 양으로 데옥시리보뉴클레아제를 암컷에게 투여하는 단계를 포함한다. 앞에서, "세포-유리형 DNA 수준"은 모든 해당되는 체액, 예컨대 혈장, 혈청, 혈액 또는 난포액내 세포-유리형 DNA의 농도로 이해되어야 한다. 앞에서, cfDNA 수준이 (가임 암컷과 비교해) 높은 불임 암컷은 본원에 기술된 바와 같은 치료를 "필요로 하는" 것으로 언급될 것이다. 본 발명은 특히 여성에서 불임을 치료하는데 유용하다.
본 발명에서, 재조합 인간 DNase가 특히 여성을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다. 물론, 다른 종의 암컷을 치료하는 경우에도, 그 종 유래의 재조합 DNase가 바람직하다. 전술한 바와 같이, 모든 DNase를 본 발명의 실시에 사용할 수 있지만, DNase I이 바람직하다.
본 발명을 수행함에 있어, 순환하는 세포-유리형 DNA의 감소를 달성하기 위한 충분량의 DNase를 전달할 수 있는 한, 모든 투여 경로가 이용될 수 있다. 예를 들어, DNase는 정맥내 또는 근육내 경로로 투여될 수 있다.
불임 치료를 위해, DNase는 혈중 및/또는 난포액내 세포-유리형 DNA의 수준을 저하시키는데 충분한 양으로 투여될 것이다. 예를 들어, DNase I 최소 2500 UI이 불임 암컷에게 적어도 2일간, 바람직하게는 적어도 3 또는 4일간 또는 그 이상 동안 매일 투여될 수 있다. 물론, 개체별 차이로 인해, 상이한 반응들이 관찰될 수 있으며, 투여할 투여량이 세포-유리형 DNA 수준을 낮추는데 충분하고, 따라서 가임 환자에서 관찰되는 수준과 비슷한 수준이 되어야 하도록, 투약 용법은 그에 따라 수정될 수 있다. cfDNA 수준은 수준 감소를 살피기 위해 추적할 수 있으며, 불필요한 치료는 피할 수 있다.
cfDNA 수준이 감소된 후, 그리고 치료를 중단한 후, cfDNA 수준이 빠르게 증가하여 그 이전의 수치에 도달하진 않는 것으로 관찰되고 있다. 적어도 수일간, cfDNA 수준은 거의 안정적으로 유지된다. 따라서, DNase는 후기 황체기 (late luteal phase)에 이를 필요로 하는 불임 암컷에게 투여하는 것이 유익할 수 있다.
아래 실험 파트에서 예시된 본 발명의 특정 구현예에서, DNase I 2500 UI을 후기 황체기에 7일간 하루에 2회로 이를 필요로 하는 불임 암컷에게 투여한다.
물론, 전술한 불임 치료 방법은 아래 실험들에서 언급된 바와 같이 ART와 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 아래 도면과 실시예들을 들어 추가로 설명된다.
도 1: 가임 남성 73명, 불임 남성 88명, 가임 여성 94명 및 불임 여성 96명의 혈장내 평균 cfDNA 농도.
도 2: 여성 37명에서 수득한 혈장 (검정 막대) 및 난포액 (회색 막대)내 cfDNA 농도. 이 그룹에서 임신이 된 여성은, 혈장 및/또는 난포액에서의 cfDNA 수준이 평균이었으며, 이 수치는 이 그룹의 모든 여성들 (임신이 된 여성과 임신이 되지 못한 여성의 합)에 대한 평균치 보다 낮았다.
실시예
실시예 1: 환자, 재료 및 방법
정액 샘플
50세 미만의 가임 남성과 불임 남성으로부터 금욕한지 3-6일 이후에 자위를 통해 정액 샘플을 채집하였다. 정자 수와 운동성, 활력 및 형태 분석을 세계 보건 기구 지침에 따라 수행하였다. 전체 남성 161명이 본 실험에 참여하였다: 가임 남성 73명 및 불임 남성 88명.
여성의 혈장 및 난포액 샘플
37세 미만의 가임 여성 94명 (AMH > 2ng/ml)과 불임 여성 96명을 대상으로 혈장에서 세포-유리형 DNA (cfDNA)의 양을 측정하였다. 게놈 실험을 수행하여, cfDNA의 기원을 특히 불임 여성에서 검증하였다.
샘플이 이용가능하다면, 해당 불임 여성의 난포액 샘플에서도 cfDNA 정량을 수행하였다. 전체 37개의 난포액 샘플이 본 실험에 포함되었다.
난소 자극 및 난포액 회수
ART를 위해, 대부분의 환자를 재조합 FSH (Gonal F® (Merck laboratory) 또는 Puregon® (Schering Plough laboratory)) 또는 HMG (Menopur®: Ferring laboratory)를 이용한 장기 작용제 프로토콜 (long agonist protocol) 또는 길항제 프로토콜로 자극하였다. 호르몬 및 초음파 검사 후, 재조합 또는 뇨 HCG로 배란을 촉발시키고, 36시간 후 널리 공지된 기법에 따라 난모세포를 회수하였다. 유력한 난포액 2 또는 3종을 분리하여, 원심분리한 후 보관한다. 그런 후, 혈장/혈청에서와 동일한 방법을 이용하여 cfDNA 함량을 평가하였다.
CfDNA 분리 및 PCR 증폭
혈장 cfDNA는 High Pure PCR 주형 제조 키트 (Roche)를 제조사의 권고안에 따라 사용하여 분리하였다. 용출 완충액을 ddH20로 20% 용액으로 희석한 다음, 70℃에서 예비가열하였다. 샘플은 16,000g에서 5분간 원심분리하고, 세포 파편을 조심하면서 혈장 400 ㎕를 2 ml 에펜도르프 튜브로 이동시켰다. 이 샘플에, 결합 완충액 400 ㎕와 재구성한 프로테아제 K 40 ㎕를 혼합하였다. 짧게 볼텍싱한 후, 튜브를 70℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 100% 이소프로판올 200 ㎕를 샘플에 혼합한 다음, High Pure PCR 주형 제조 키트에 구비된 고순도 필터 콜렉션 튜브의 상부 저장소로 이동시켰다. 컬럼을 1분간 실온에서 8,000g로 원심분리하였다. 통과 분획 튜브와 콜렉션 튜브는 버리고, 필터를 새로운 콜렉션 튜브에 결합시켰다. 이 로딩 단계는 샘플 전체가 이 필터에 로딩될 때까지 반복하였다. 상기 상부 저장소에 저해제 제거 완충액 500 ㎕를 넣고, 실온에서 1분간 8,000g로 원심분리하였다. 통과 분획 튜브와 콜렉션 튜브는 버리고, 필터를 새로운 콜렉션 튜브에 결합시켰다. 이 튜브는 세척 완충액 500 ㎕을 상부 저장소에 넣고 실온에서 1분간 원심분리함으로써, 2회 세척하였다. 컬럼을 10초간 최고 속도 (약 13,000g)로 원심분리하여 건조시킨 다음, 새로운 1.5 ml 에펜도르프 튜브로 옮긴 후, 인큐베이터에서 5분간 70℃에서 가열하였다. 예비-가열한 20% 용출 완충액 100 ㎕를 조심하면서 상기 필터에 주입하였다. 튜브와 필터를 70℃ 인큐베이터에 넣고, 5분간 저속 (대략 400rpm)으로 교반하였다. 컬럼을 5분간 8,000g로 원심분리하여 컬럼으로부터 DNA 샘플을 용출시킨 다음, 사용하기 전까지 4℃에 저장하거나 또는 장기간 보관하는 경우에는 -70℃에서 동결시켰다.
PCR 증폭
JmJC2 및 DXS1285 유전자 좌를 증폭하기 위해 사용되는 마스터 믹스에는, 각각의 dNTP 200mM, 1X Taq 중합효소 완충액, 각 프라이머 2 μM 씩, 1.5mM MgCl2 및 0.5U Biotaq™ DNA 중합효소 (Bioline)를 15 ㎕ 반응 부피로 포함한다. JmJC2 (Y 염색체의 마커) 및 DXS1285 (X 염색체의 마커)를 증폭하는데 사용되는 프라이머 서열은 각각 아래와 같으며:
5'-GAGTATGCGACCAGT-3' (서열번호 1),
5'-TGGCACACCATGGGA-3' (서열번호 2) 및
5'-CGTGCTTAGGCTTAATCCC-3' (서열번호 3),
5'-GAACTGACTGTAGAGAAGG-3' (서열번호 4), 60℃에서 어닐링한다.
cfDNA 정량
혈액 샘플은 EDTA-함유 진공채혈기 튜브로 채혈하였다. 혈액 샘플은 혈장 분리를 위해 원심 분리하였다 (3,400 rpm, 15분간). cfDNA를 정량하기 전에, 혈장 및 난포액 샘플을 20분간 3,400g로 원심분리하였다. 샘플은 적혈구 세포가 포함되지 않은 상태로 투명하여야 한다. 실제 cfDNA 정량은 유색 샘플에서 달라질 수 있다. 표준 DNA 용액을 166 ㎕ 중의 20, 50, 100 및 500ng/ml로 희석하여, 표준 그래프를 작성하였다. 1N HCLO4 (과염소산) 166 ㎕ 및 다이페닐아민 664㎕를 혈장 또는 난포액 상층액 샘플 각각의 166㎕에 첨가하였다. 샘플을 20시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 다음, 10분간 15,000g에서 원심분리하였다. 상층액 300 ㎕를 96웰 플레이트로 옮기고, 분광측정기 (Tecan, Genios)로 600 nm에서 측정하였다.
DNase 처리
서면으로 사전 동의를 받은 후 환자를 참여시켰다.
선행 사이클의 후기 황체기에, cfDNA 수준이 매우 높은 (> 100ng/㎕) 선정된 여성 10명에게 Dornase alpha (Pulmozyme®) 2.5 mg (2500IU) 앰플 1개를 1일 2회로 근육내 경로를 통해 7일간 처리하였다.
Pulmozyme® (dornase alfa) 흡입 용액은 선택적으로 DNA를 절단하는 재조합 인간 데옥시리보뉴클레아제 I (rhDNase)의 멸균된, 투명하고, 무색의 고도로 정제된 용액이다.
Pulmozyme®은 통상적으로는 압축 공기로 구동되는 분무기 시스템에 의해 발생되는 에어로졸 미스트를 흡입하는 방식으로 투여된다. 하지만, 흡입한 후 rhDNase의 전신 수준이 매우 낮기 (최대 15%) 때문에, 정맥내 경로에 의해서도 Pulmozyme의 독성 실험에서 부작용은 없다고 가정하여, DNase 농도를 높이기 위해 IM 주사용 동일 제품을 주문하기로 결정하였다.
통계
양측 t-검정을 이용하여, 가임 개체와 불임 개체 간의 cfDNA 수준 차이를 평가하였다. 상과 계수는 스피어만의 상관관계 양측 검정을 이용하여 계산하였다. 통계학적 차이는 P <0.05일 때 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 2: cfDNA 및 남성 불임
본 1차 예비 실험의 목표는 DNA 단편화가 cfDNA 증가에 관여할 수 있다는 점을 가정하여, 남성 불임과 고 수준의 cfDNA 간의 연관성을 검증하기 위한 것이었다.
cfDNA의 온전성 (integrity)을 평가하기 위해, 분리한 cfDNA 샘플에 대해 PCR을 수행하였다. X 염색체 마커는 남성 및 여성 둘다에서 유래된 혈장으로부터 분리한 cfDNA로 증폭시켰다. Y 염색체 마커는 여성 혈장이 아닌 남성 혈장에서 분리한 cfDNA로 증폭시켰다.
불임 개체의 혈장 샘플에서, 대응되는 가임 대조군과 비교해, cfDNA의 수준이 더 높게 검출되었다. 혈장내 cfDNA 함량은 가임 남성 73명 (60.7 ng/㎕ ±46.9)과 불임 남성 88명 (83.3 ng/㎕ ± 64.8)에서 측정하였다, p=8.7e-3 (도 1).
실시예 3: 여성의 혈장내 cfDNA
남성에서와 마찬가지로, 불임 여성의 혈장 샘플에서 대응되는 가임 대조군과 비교해 cfDNA 수준이 더 높게 검출되었다. 가임 개체와 불임 개체 간의 차이는 하지만 남성 보다는 여성에서 더 높았다.
실제, 가임 여성 94명의 혈장내 cfDNA 함량 (49.2 ng/㎕ ±58.0)이 불임 여성 96명 (109.4 ng/㎕ ± 88.1) 보다 2배 낮은 것으로 확인되었다, p=1.02e-7 (도 1).
실시예 4: 불임 여성 37명에서의 혈장 대 난포액내 cfDNA 함량
혈장내 cfDNA 농도를 난포액에서의 농도와 비교하였다. 통계학적으로 유의한 양의 상관관계가 혈장 cfDNA 농도와 난포액 사이에서 확인되었다 (r= 0.43, p=6.4e-3) (도 3). 예비 실험에서, 임신한 여성은 난포액과 혈청내 cfDNA가 임신하지 못한 여성 보다 낮았다 (데이타 도시 안함).
실시예 5: 혈장 cfDNA 농도 및 생식력에 대한 DNase 처리 효과
지금까지, 4년 이상 불임이거나 및/또는 어떠한 이유도 없이 수차례의 IVF/ICSI에 실패한 병력이 있는 환자 10명에게, 이전 사이클의 후기 황체기에 7일간 처리하고, 그 즉시, 다음 사이클의 2일째에 재조합 또는 뇨 FSH를 GnRH 작용제 또는 길항제와 함께 사용하여 배란 유도 처리를 시작하였다. 환자들 모두에게서 배아를 추출하고, 3일째에 배아 1개 또는 수개를 각 환자에게 이식하였다.
각 환자에 대해, 혈장내 cfDNA를 정량하기 위해 DNase I 처리 직전 및 직후에 채혈하였다.
이들 환자들 중 6명이 단 1회 처리만으로도 임신이 되어, 7명의 아이가 태어났다 (1명은 유산, 4명은 단산, 1명은 삼둥이 출산). 처리 환자에 해당 데이타는 아래 표 1과 표 2에 나타낸다:
표 1: 참여 ?자의 연령 및 불임 병력
환자 연령 불임 병력
# 1 28 5회 ART 실패
# 2 33 8회 ART 실패
# 3 32 4회 ART 실패
# 4 35 6회 ART 실패
# 5 37 4회 ART 실패
# 6 40 4회 ART 실패
# 7 34 2회 ART 실패
# 8 24 4회 ART 실패
# 9 37 2회 ART 실패; 10년간 원인불명의 불임; ICSI 후 1회 유산
# 10 37 2회 ART 실패
표 2: 처리 직전 및 직후의 cfDNA 농도 및 결과
환자 처리 전 cfDNA (ng/㎕) 처리 후 cfDNA (ng/㎕) 결과
# 1 103.3 65.2 단산 출산
# 2 91.0 61.8 단산 출산
# 3 161.2 140.7 삼둥이 출산
# 4 110.0 78.3 임신 안됨
# 5 116.1 56.0 단산 출산
# 6 153.5 124.9 임신 안됨
# 7 160.7 138.7 임신 안됨
# 8 151.8 92.2 단산 출산
# 9 127.9 85.2 TESE (생화학적 임신)
# 10 87.8 77.2 임신 안됨
표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 임신한 환자들은 모두 DNase I 치료를 받은 후 cfDNA 수준이 감소되었다. 유산 1건은 정소 정자의 품질 불량이 원인인 것으로 보였다. 임신되지 못한 일부 환자들의 경우, cfDNA 수준 감소가 보통 수준이었는데, 이는 cfDNA 수준이 매우 높은 경우에는 DNase I의 용량을 높여야 함을 시사한다.
고찰
IVF/ICSI 시술 전에, 유리형 DNA 수준에 따라, 불임 커플의 여성에 대한 DNase를 이용한 단순한 예방적 치료가, 50% 이상으로 임신을 성공시켰다. 치료된 여성들 모두 4년 이상 원인 불명의 불임이었거나 또는 발생 초기 단계에 여러번의 배아 이식하였으나 착상에 성공하지 못하였었다.

Claims (17)

  1. 암컷 불임을 치료하기 위한 DNase.
  2. 제1항에 있어서, 가임 암컷에서의 세포-유리형 DNA (cell-free DNA) 수준 보다 통계학적으로 높은 세포-유리형 DNA 수준과 연관된 암컷 불임을 치료하는데 사용되는 것을 특징으로 하는, DNase.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암컷은 자궁내막증을 앓고 있지 않은 것을 특징으로 하는, DNase.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 DNase가 재조합 DNase인 것을 특징으로 하는, DNase.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 DNase가 DNase I인 것을 특징으로 하는, DNase.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 DNase는 정맥내 또는 근육내 경로를 통한 투여용인 것을 특징으로 하는, DNase.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 상기 DNase는 후기 황체기 (late luteal phase)에 불임 암컷에게 투여되는 것을 특징으로 하는, DNase.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 인간 여성 불임의 치료용인 것을 특징으로 하는, DNase.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 2500 UI 이상의 DNase I이 4일 이상 동안 불임 암컷에게 매일 투여되는 것을 특징으로 하는, DNase.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 있어서, 2500 UI의 DNase I이 후기 황체기의 7일 이상 동안 불임 암컷에게 매일 2회 투여되는 것을 특징으로 하는, DNase.
  11. 포유류 암컷의 불임을 시험관내 진단하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    (i) 상기 암컷의 체액 샘플에서 세포-유리형 DNA의 수준을 측정하는 단계, 및
    (ii) 상기 수준을 사전 결정된 역치와 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 세포-유리형 DNA 수준이 상기 사전 결정된 역치 보다 높은 것은 불임을 의미하는 것임을 특징으로 하는 방법,
  12. 제11항에 있어서, 상기 암컷은 자궁내막증을 앓고 있지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 체액 샘플이 혈장, 혈청, 혈액 또는 난포액 (follicular fluid) 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한항에 있어서, 상기 암컷은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 체액 샘플은 혈장 샘플이고, 상기 사전 결정된 역치는 50 ng/㎕ - 100 ng/㎕인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한항에 따른 방법을 수행하기 위한 키트로서,
    생물 샘플에서 세포-유리형 DNA 수준을 측정하기 위한 반응시약과,
    생물 샘플에서 하나 이상의 다른 생리학적 파라미터를 측정하기 위한 반응시약을 포함하며,
    상기 생리학적 파라미터는 항-뮐러관 호르몬 (AMH: Anti-Mullerian Hormone)의 농도, 텔로머라제 활성 및 호모시스테인 농도로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 제16항에 있어서, 적어도 DNA 인터칼레이팅제 (intercalating agent)와 AMH를 특이적으로 인지하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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