KR20160026441A - 홍합접착 단백질을 포함하는 하이드로젤 제조용 조성물 및 이를 이용한 하이드로겔의 생산방법 - Google Patents

홍합접착 단백질을 포함하는 하이드로젤 제조용 조성물 및 이를 이용한 하이드로겔의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 홍합접착 단백질 기반의 광반응성 하이드로젤에 관한 것으로, 본 발명에 따른 광반응성 하이드로젤은 즉각적인 젤화 반응으로 형성될 수 있으며, 우수한 생체 접착력을 가지므로 원하는 생체 부위 내에 생체 접착제, 조직 충전제, 조직공학용 지지체, 또는 약물 전달용 담체 등으로서 이용될 수 있다.

Description

홍합접착 단백질을 포함하는 하이드로젤 제조용 조성물 및 이를 이용한 하이드로겔의 생산방법 {Composition for preparing hydrogel comprising mussel adhesive protein and method for preparing hydrogel using the same}
본 발명은 홍합접착 단백질을 포함하는 하이드로젤 제조용 조성물 및 이를 이용한 하이드로겔의 생산방법, 홍합접착 단백질 기반의 생체 접착성 하이드로젤에 관한 것이다.
하이드로젤(hydrogel)은 물 또는 체액 내에서 가교된 격자 안으로 많은 양의 물 또는 체액을 흡수하여 팽윤되며 삼차원적인 구조를 유지하는 재료를 의미한다. 팽윤된 이후에도, 열역학적으로 안정하게 존재하여 액체와 고체의 중간 형태에 해당하는 기계적 및 물리화학적 특성을 갖는다. 이러한 하이드로젤은 대게 생체 적합성, 높은 다공성 및 산소 투과도를 보이며, 생체 연조직과의 비슷한 물리적 특성을 나타낼 수 있다. 천연 및 합성 고분자 기반의 하이드로젤의 초기 응용분야는 렌즈 및 상처 드레싱 정도였지만, 현재에는 지혈제, 조직 접착제, 약물 전달용 담체, 조직 충전제, 세포 및 성장인자를 포함하는 조직 재생제 등의 조직 공학 분야로 그 폭이 넓어지고 있다.
이러한 하이드로젤을 제조하기 위해 다양한 가교 방법이 사용되는데, 대부분의 가교방법은 화학적 가교제를 사용하는 것이다. 구체적인 예로, 글루타알데하이드를 이용한 단백질의 가교의 경우, 글루타알데하이드는 아민기의 단백질 가교에 역할을 한다고 알려져 있지만, 라이신, 타이로신, 트립토판, 페닐알라닌을 비롯하여 히스티딘, 시스테인, 프롤린, 글라이신 등 다양한 아미노산 잔기들의 가교에 관여하는 것으로 알려져 있다.
그러나 글루타알데히드를 비롯한 대부분의 화학적 가교방법은 단백질 구조에 커다란 변화를 주고 세포 및 조직 독성을 갖기 때문에 세포와 함께 사용될 수 없다. 따라서, 화학적 가교방법은 세포 독성을 피하기 위해, 가교가 이미 형성된 지지체에 세포를 코팅하거나 주입해주기 때문에, 일정하게 세포가 분배된 지지체를 바로 얻을 수 없다.
다른 예로, 광가교(photo cross-linking) 방법이 있는데 이는 쉬운 접근성, 짧은 시간내의 경화뿐만 아니라, 빛 투사 세기와 시간, 개시제(initiator) 및 모노머(monomer) 등의 함량 조절을 통한 물성 조절이 쉬우므로 조직 공학용 기술에서 많이 사용된다.
그러나 주로 사용되는 자외선(UV)에 의한 중합방법은 세포의 생존에 치명적이므로 세포와 함께 사용할 수 없으며, 또한 이렇게 형성된 합성고분자들은 단백질 기반의 소재들보다 생친화성과 생분해성 및 생체 활성 물질과의 반응도 뒤떨어지므로, 나아가 궁극적으로는 in situ 생체 접착 소재로는 적합하지 않다.
생체 접착제는 세포벽, 세포막, 단백질, DNA, 성장인자, 조직 등과 같은 다양한 생체 실에 부착 특성을 갖는 물질을 말하며, 지혈제 또는 조직 접착제, 조직 충전제, 조직 재생제 및 약물 전달 담체 등의 의학적 응용이 가능하다.
그러나 현재 의료용 생체 접착소재는 외과 수술 시에 발생하는 상처를 봉합하기 위한 보조제 역할을 할 뿐, 실제 의료용 생체 접착소재로 활용하기에 그 기능성과 물성이 부족한 수준이다.
따라서, 가장 기본적으로 의료용 접착제는 조직에 직접 접촉하므로 생체 적합성이 요구되며, 체내 환경 속에서 순간적으로 접착이 종결될 수 있는 접착력과 용이성 뿐만 아니라 오랜 기간 그 기능을 유지해야 한다.
현재 상용화 및 실용화되고 있는 대표적인 생체 접착제로는 시아노아크릴레이트 계열의 순간 접착제, 피브린(fibrin) 글루 및 폴리우레탄계 접착제 등이 있다.
시아노아크릴레이트는 빠른 시간에 개시제 없이 경화되고 높은 접착 강도를 갖지만, 충격에 약하고 내열성 및 내수성이 떨어지고 독성으로 인한 면역 반응을 야기시킨다.
또한, 피브린 기반의 생체 접착제는 실제의 실제 혈액응고 과정을 이용한 방법이기 때문에 비교적 우수한 생체 적합성과 생분해성을 가지지만, 합성 고분자 기반 접착제에 비해 현저히 낮은 수준의 접착력을 가지므로 수중 접착을 요하는 부위에는 사용이 매우 제한적이다.
폴리우레탄계 생체 접착제는 조직과의 높은 밀착성 및 유연성을 가지나, 합성 원료의 생체 독성을 줄여야 하는 문제점이 남아있다. 이처럼 현재 접착 소재들은 대부분이 화학합성 기반의 소재로 수분에 약하고 독성을 갖고 그 대안으로 제기되고 있는 생합성 기반의 바이오 접착 소재는 접착력 측면에서 크게 부족하다.
따라서, 생합성 기반의 생체 접착제를 하이드로젤의 원료로 사용하여 기존의 시아노아크릴레이트 계열의 순간 접착제, 피브린 글루 및 폴리우레탄계 접착제와 같은 화학합성 기반의 생체 접착제의 문제점을 개선하고, 화학적 가교 시 문제점을 해소한 하이드로젤에 대한 요구가 절실하다.
따라서, 본 발명에서는, 종래에 사용되는 시아노아크릴레이트 계열의 순간 접착제, 피브린(fibrin) 글루 및 폴리우레탄계 접착제와 같은 생체 접착제의 문제점들을 극복하기 위해 기존의 우수한 접착력과 생물학적 기능성 및 생체 적합성을 가진 홍합접착 단백질 기반의 하이드로젤 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 가시광선을 이용한 가교 반응을 통해 홍합접착 단백질 기반의 하이드로젤 제조용 광가교성 조성물 및 이를 이용한 하이드로젤의 제조방법을 제공하고, 나아가 생체 접착력을 갖는 상처 치료 및 재생, 지혈제, 조직 접합, 조직공학용 지지체 등으로의 응용이 가능한 하이드로젤을 제공하는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 광반응성 및 생체접착성을 갖는 홍합접착 단백질과 전자수용체 및 광반응성 금속 리간드를 포함하는 하이드로젤 제조용 광가교성 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 광가교 반응을 통해 홍합접착 단백질에 포함된 타이로신 잔기가 다이-타이로신(di-tyrosine) 잔기를 형성하여 가교화하는 단계를 포함하는, 하이드로젤 제조용 조성물을 이용한 생체 접합성 하이드로젤의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 하이드로젤 제조용 조성물의 홍합접착 단백질에 포함된 타이로신 잔기가 광반응을 통해 다이-타이로신(di-tyrosine) 잔기를 형성하여 가교 된 단백질을 포함하는 생체 접합성 하이드로젤을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 하이드로젤을 포함하는 생체접착제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 하이드로젤을 포함하는 조직공학용 지지체 또는 조직 충진재를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 하이드로젤을 포함하는 약물 전달용 담체를 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 가시광선을 이용한 빠르고 손쉬운 가교반응을 통해 홍합접착 단백질을 포함하는 광가교성 하이드로젤 제조용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 홍합접착 단백질의 타이로신 잔기을 고려하여, 가시광선 영역 대의 빛에 의한 광반응성 금속 리간드와 전자수용체 사이의 전자 흐름을 이용한 타이로신 잔기 간의 결합을 유도하여 광가교물을 제조하고, 이를 포함하는 하이드로젤을 형성하였다. 이와 같이 제조된 홍합접착 단백질 하이드로젤이 생체 접착제로서의 우수한 효능을 나타낸다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 의료용 생체접착소재에 적합한 제형 개발을 위해 홍합접착 단백질 기반의 광가교성 하이드로젤을 제조하였다. 상기 하이드로젤은 기존의 홍합접착 단백질의 생체 안정성 및 우수한 접착 능력을 갖추면서도, 홍합접착 단백질 용액과는 다르게 일정한 형태를 갖추고 있으므로 다루기 쉽고, 수 초에서 수 분내에 빠르고 효율적으로 제조가 가능하며, 하이드로젤 자체가 실제 조직과 비슷한 기계적 유연성을 가지고 있기 때문에 외과용 봉합사를 대신하는 등 실제 의료용 소재로의 개발 및 다양한 응용이 가능하다.
본 발명에서 용어, "하이드로젤(hydrogel)"이란, 물 또는 체액 내에서 가교된 격자 안으로 많은 양의 물 또는 체액을 흡수하여 팽윤되며 삼차원적인 구조를 유지하는 재료를 의미한다. 팽윤된 이후에도, 열역학적으로 안정하게 존재하여 액체와 고체의 중간 형태에 해당하는 기계적 및 물리화학적 특성을 갖는다. 이러한 하이드로젤은 대게 생체 적합성, 높은 다공성 및 산소 투과도를 보이며, 생체 연조직과의 비슷한 물리적 특성을 나타낼 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일구현에 따라, 홍합접착 단백질을 포함하는 하이드로젤 제조용 광가교성 조성물을 제공한다.
상기 홍합접착 단백질의 농도가 10wt% 미만인 경우, 절대적인 타이로신 잔기의 양이 적어 전자 수용체의 농도를 높인다 해도 견고한 하이드로젤을 만들 수 없고, 단백질 농도가 30wt% 초과인 경우 점도가 급격히 높아져 다루기 불편하고, 전체적인 광가교가 아니라 빛을 쬐어주기 전부터 강렬하고 국소적인 결합이 일어나므로 균일한 결합으로 이루어진 하이드로젤을 만들 수 없다. 따라서, 다루기 쉽고 균일한 광가교를 유도할 수 있는 바람직한 홍합접착 단백질의 농도는 전체 조성물을 기준으로 10 내지 30wt%, 바람직하게는 20 내지 30wt%이다.
본 발명에서 "홍합접착 단백질"은 홍합에서 유래한 접착 단백질로, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스 (Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스 (Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스 (Mytilus coruscus) 에서 유래한 홍합접착 단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mefp-4, Mefp-5, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mgfp-2, Mgfp-3, Mgfp-4 및 Mgfp-5, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mcfp-2, Mcfp-3, Mcfp-4, Mcfp-5, 및 Mcfp-5 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으며,
바람직하게는 fp(foot protein)-1 (서열번호 1), fp-2 (서열번호 5), fp-3 (서열번호 6), fp-4 (서열번호 7), fp-5(서열번호 8), 및 fp-6 (서열번호 9)로 이루어진 군에서 선택된 단백질, 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 단백질이 연결되어 있는 융합 단백질, 또는 상기 단백질의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합접착 단백질은 WO2006/107183호 또는 WO2005/092920에 기재된 모든 홍합접착 단백질을 포함한다. 바람직하게, 상기 홍합접착 단백질은 fp-151(서열번호 10), fp-131(서열번호 12), fp-353(서열번호13), fp-153(서열번호 14), fp-351(서열번호 15) 등의 융합 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 홍합접착 단백질은 fp-1(서열번호 1)에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드(서열번호 2)가 1 내지 12회 또는 그 이상으로 연속하여 연결된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 서열번호 2의 데카펩타이드가 12회 연속하여 연결된 fp-1 variant 폴리펩타이드(서열번호 3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 홍합접착 단백질은 접착력을 유지하는 전제 하에 상기 홍합접착 단백질의 카르복실 말단이나 아미노 말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD(Arg Gly Asp)를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산은, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는, RGD(Arg Gly Asp, 서열번호 16), RGDS(Arg Gly Asp Ser, 서열번호 17), RGDC(Arg Gly Asp Cys, 서열번호 18), RGDV(Arg Gly Asp Val, 서열번호 19), RGDSPASSKP(Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro, 서열번호 20), GRGDS(Gly Arg Gly Asp Ser, 서열번호 21), GRGDTP(Gly Arg Gly Asp Thr Pro, 서열번호 22), GRGDSP(Gly Arg Gly Asp Ser Pro, 서열번호 23), GRGDSPC(Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys, 서열번호 24) 및 YRGDS(Tyr Arg Gly Asp Ser, 서열번호 25)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 홍합접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 홍합접착 단백질의 변이체의 예로는, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 fp-1 variant-RGD 폴리펩타이드 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 fp-151-RGD 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게, 본 발명은 타이로신 잔기들 사이의 가교 결합을 이용하므로, 5% 이상의 타이로신 잔기를 포함한 단백질이 바람직하다. 대부분의 홍합접착 단백질의 전체 아미노산 서열에서 타이로신이 차지하는 비중은 약 20 내지 30%이다. 천연 홍합접착 단백질 내의 타이로신은 수화과정을 통하여 OH기가 첨가된 DOPA의 형태로 존재하지만, 대장균에서 생산된 홍합접착 단백질은 타이로신 잔기들이 변형 없이 존재하므로, 그대로 이용하는 것이 가능하다.
또한, 홍합접착 단백질을 용매에 용해시킬 때 산성 수용액에 20wt% 이상의 우수한 용해도로 용해될 수 있는 홍합접착 단백질을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 용매는 산성 수성용매 또는 중성 수성용매일 수 있고, 상기 산성 수성용매는 인산, 아세트산, 포름산, 염산, 황산, 질산, 시트르산 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 하이드로젤 제조용 광가교성 조성물은 가시광선을 강하게 흡수하는 분자를 제공하기 위한 광반응성 금속 리간드 및 전자 수용체를 포함할 수 있다.
상기 광반응성 금속 리간드는 루테니움(Ru(II)), 팔라디움(Pd(II)), 구리(Cu(II)), 니켈(Ni(II)), 망간(Mn(II)), 및 철(Fe(III))로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예를 들어 [Ru(II)bpy3]Cl2를 이용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지는 않는다.
상기 광반응성 금속 리간드의 농도가 광가교의 속도나 견고함에 미치는 영향은 미미하나 광가교가 견고하게 이루어지는 최소농도는 1 mM이고, 이 이상으로 사용해도 광가교에는 영향을 주지 않으나 세포를 활용하여 함께 사용될 경우 세포의 생존율을 높이기 위해 낮은 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 광반응성 금속 리간드의 농도는 1 내지 10 mM, 1 내지 5 mM, 또는 1 내지 2 mM, 바람직하게는 1 mM이다.
또한 상기 전자 수용체는 과황산염(sodium persulfate), 과아이오딘산염(periodate), 과브롬산염(perbromate), 과염소산염(perchlorate), 비타민(B12), 펜타아민클로로코발트(Pentaamminechlorocobalt(III)), 암모늄 세륨 질산염(ammonium cerium(IV) nitrate), 옥살산(oxalic acid), 및 이디티에이(EDTA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 전자 수용체의 함량은 하이드로젤의 견고성 및 단백질의 사용 가능한 모든 함량구간에서 균일한 광가교를 유도하기 위해서 5내지 80 mM, 5 내지 20 mM, 또는 10 내지 40 mM, 바람직하게는 10 내지 20 mM이다.
또한 상기 홍합접착 단백질을 포함하는 하이드로젤 제조용 광가교성 조성물은 생리활성물질을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 생리활성 물질은 세포, 단백질, 효소, 및 당으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일구현예는 광가교성 및 생체접착성을 갖는 홍합접착 단백질 기반의 하이드로젤을 제공하는 것이다.
바람직하게, 본 발명에서 홍합접착 단백질 기반의 하이드로젤은 홍합접착 단백질에 포함된 타이로신 잔기들 사이의 가교결합으로 형성된 하이드로젤일 수 있다.
본 발명의 원료가 되는 해양 생명체인 홍합(mussel)은 접착 단백질을 생산 및 분비함으로써 홍합 자신을 바다 속의 바위 및 선박과 같은 젖은 고체 표면에 단단히 부착할 수 있어, 파도 와 같은 격변하는 환경 속에서 영향을 받지 않는다. 기존의 연구 결과, 홍합접착 단백질은 강력한 자연 접착제로, 화학합성 기반의 에폭시 수지보다 약 두 배 정도의 높은 인장강도를 나타내면서도 유연성을 지니고 있다. 또한 홍합접착 단백질은 플라스틱, 유리, 금속 및 생체 물질 등의 다양한 표면에 접착뿐만 아니라 젖은 표면에서의 접착도 가능하다.
본 발명자들은 이전의 연구에서 fp-1(서열번호 1)의 10 개 반복 아미노산이 6번 반복된 구조를, fp-5(서열번호 8)의 N- 말단과 C- 말단에 유전자 수준에서 연결시킨 새로운 형태의 홍합접착 단백질 fp-151(서열번호 10)을 개발하였으며, 상기 재조합 홍합접착 단백질은 대장균에서 성공적으로 발현하여 대량생산이 가능하고, 아세트산을 이용한 단순한 정제 분리과정 덕분에 산업적 이용 가능성이 매우 높음을 확인한 바 있다 (WO2006/107183호 또는 WO2005/092920).
따라서, 바람직한 양태로서, 본 발명은 홍합접착 단백질의 타이로신 잔기들 사이의 결합을 개시 및 촉진시키는 단계를 포함하는, 상기 광반응성 및 생체 적찹성하이드로젤의 제조방법을 제공한다.
상기 방법은 홍합접착 단백질에 포함된 높은 비율의 타이로신 잔기들 사이의 결합을 유도하여 하이드로젤을 제조하는 것이다. 타이로신 잔기 간의 결합은 ruthenium tris-bipyridyldication(Ru(II)bpy3 2+)과 같은 금속 리간드가 녹아있는 수용액상에서 특히 449 내지 455 nm 파장을 가지는 가시광선을 강하게 흡수하여 분자의 광분해를 통해 이루어지는 것으로 알려져 있다. 420 내지 480 nm, 또는 449 내지 455 nm, 더욱 바람직하게는 약 452 nm 파장의 빛의 존재 하에, 이러한 금속 복합체(metal complex)는 과산화황산염과 같은 전자 수용체에 전자를 줄 수 있는 흥분된 상태로 광분해 된다. 이러한 광분해의 결과로, 산화제 역할을 하는 Ru(III)bpy3 3+및 sulfate 라디칼이 형성되는 것으로 알려져 있다. 생성된 Ru(III)bpy3 3+는 단백질 수용액 상에서 타이로신을 산화시켜 불안정한 타이로신 라디칼을 형성하고, 이 라디칼은 주변의 또 다른 타이로신 잔기와 반응하여 다이타이로신(dityrosine) 결합을 형성할 수 있다. 이때, 안정한 다이타이로신 결합을 형성하기 위해서는 수소 원자 제거가 필수적인데, 이 역할을 sulfate 라디칼이 하는 것으로 알려져 있다.
상기 방법에서, 가시광선을 강하게 흡수하는 분자를 제공하기 위한 광반응성 금속 리간드는 루테니움(Ru(II)), 팔라디움(Pd(II)), 구리(Cu(II)), 니켈(Ni(II)), 망간(Mn(II)), 및 철(Fe(III))로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예를 들어 [Ru(II)bpy3]Cl2를 이용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지는 않는다.
또한 전자 수용체를 제공하기 위해 과황산염(sodium persulfate), 과아이오딘산염(periodate), 과브롬산염(perbromate), 과염소산염(perchlorate), 비타민(B12), 펜타아민클로로코발트(Pentaamminechlorocobalt(III)), 암모늄 세륨 질산염(ammonium cerium(IV) nitrate), 옥살산(oxalic acid), 및 이디티에이(EDTA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예를 들어 과황산나트륨을 이용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지는 않는다.
보다 바람직하게 상기 홍합접착 단백질이 10 내지 50wt%로 용해되어 있는 용액에 Ru(II)bpy3 2+과 과산화황산염 용액을 첨가시키고, 420 내지 480 nm 파장 대의 빛을 쬐어주면 수 초에서 수 분내에 하이드로젤을 형성시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 광조사 전의 수용액 상태를 도 1에, 광반응을 통해 형성된 하이드로젤의 사진을 도 2에 나타내었다.
또한 상기 방법에 의해서 제조된 하이드로젤의 유변학적 성질로서, 시간(time), 진동수(frequency), 변형율(strain)에 따른 저장탄성율(storage modulus), 손실 탄성율(loss modulus) 값을 알 수 있으며, 구성성분들의 농도에 따라 이값을 조절할 수 있다 (도 3 내지 도 4). 구체적으로, 구성성분은 타이로신 잔기간의 결합에 영향을 주는 홍합 접착 단백질과 전자수용체를 말한다.
유변학적 분석 방법의 예로서, 25mm 지름의 페러렐 플레이트 (parallel plate)가 회전하는 형태의 유변학 분석기기를 사용하였다. 상기 방법에 의해서 제조된 하이드로젤의 유변학적 성질을 분석한 결과, 젤화가 되었을 때 가지는 성질을 가지고 있음을 알 수 있었다 (도 3 내지 도 4).
하이드로젤은 생체 내에서도 결합이 빠른 시간 내에 끊어지지 않고 그 형태를 유지하며 실제 조직과 비슷한 기계적 유연함을 지니므로 내수성 및 우수한 접착력을 필요로 하는 의료용 접착제 등으로의 응용이 활발하게 이루어지고 있다. 따라서, 본 발명에 따른 광반응성 및 조직 접착성을 갖는 하이드로젤은 원하는 부위에 즉각적으로 젤화가 가능하여 조직 접착제뿐만 아니라 지혈제, 조직 충진재 및 상처치료 등의 다양한 생의학적 응용이 가능하다.
따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 홍합 접착 단백질 기반의 광반응성 및 생체 접착성 하이드로젤을 포함하는 생체 접착제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 생체 접착제용 조성물은 생체 내에 국소적으로 적용되어 외과 수술용 봉합사를 대체해 손쉽고, 즉각적으로 상처를 봉합할 수 있고, 피부, 혈관, 신경 등의 연조직과 뼈, 치아 등의 경조직을 포함하는 생체 조직의 접합에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "생체 조직"은 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어 피부, 신경, 뇌, 폐, 간, 신장, 위, 소장, 직장 및 뼈 등을 포함한다.
본 발명의 생체 적합성 생체접착제의 다양한 응용 분야를 정리하면 다음과 같다. 상기 생체접착제는 봉합사를 대체하여 즉각적으로 상처를 봉합할 수 있고, 조직의 손상된 부분을 접착시키거나, 조직에서 공기 및 혈액의 누출을 즉각적으로 봉하거나, 의료기구를 생체 조직에 접착시키거나, 조직의 결함부분을 채우는 구조물로서 이용될 수 있다.
다른 구현 예로, 본 발명의 생체 접착제는 상처 치유에 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 생체 접착제는 상처에 적용되는 드레싱 및 혈관의 지혈 및 봉합 등에 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 홍합접착 단백질 기반의 광반응성 하이드로젤을 포함하는 조직공학용 지지체에 관한 것이다.
조직 공학 기술이란 환자의 조직으로부터 분리된 세포를 지지체 위에 배양하여 또는 지지체가 되는 구성물과 함께 지지체를 형성하여 세포를 포함한 지지 복합체를 제조한 후 다시 이를 인체 내에 이식하는 것을 말한다. 조직 공학 기술은 인공피부, 인공연골, 인공뼈, 인공혈관, 인공근육 등 인체의 거의 모든 장기의 재생에 적용될 수 있으며, 세포에 무해하고 실제 생체조직과 비슷한 물성을 갖는 지지체를 형성하는 것이 중요하다. 본 발명의 광반응성 및 생체 접착성 하이드로젤은 조직공학 기술에서 조직의 결함을 채우는 역할뿐만 아니라 생체 조직 및 장기의 재생을 촉진시키는 생체조직과 유사한 지지체를 제공할 수 있다.
또한, 상기 하이드로젤에 세포의 성장 및 분화를 촉진시키고, 주변 조직과의 상호작용을 통해 조직의 재생을 도와주는 역할을 하는 각종 생리활성물질들을 쉽게 부착시킬 수 있다. 상기 생리활성 물질은 세포, 단백질, 효소, 당 등을 포함하며, 바람직하게는 세포를 들 수 있다. 상기 세포는 원핵세포 및 진핵 세포를 포함하는 모든 세포일 수 있고, 일 예로 섬유세포(fibroblast), 조골세포(osteoblast), 신경세포(neurons), B cell 등을 포함한 면역세포 및 배아세포 등일 수도 있다. 본 발명의 지지체가세포를 포함하여 배양이 가능하므로 다양한 장기로의 이식 및 재생에 이용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 홍합접착 단백질 기반의 광반응성 하이드로젤을 포함하는 약물 전달용 담체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조직 접착성 하이드로젤은 약물 전달용 유효 골격(scaffold)으로서 원하는 생체조직에 부착되어 사용될 수 있다. 상기 약물은 특별하게 제한되지 않으며, 단백질 의약품, 펩타이드, 항암제 및 항염증제 등을 포함한다.
본 발명은 광반응성 및 생체 접착성 홍합접착 단백질 기반의 하이드로젤 제조용 조성물, 하이드로젤 및 이의 제조방법, 그리고 하이드로젤을 이용한 다양한 용도에 관한 것으로, 본 발명에 하이드로젤 제조용 조성물은 즉각적인 젤화 반응으로 형성될 수 있으며, 우수한 생체 접착력을 가지므로 원하는 생체 내에 생체 접착제, 조직 충진제, 조직공학용 지지체, 또는 약물 전달용 담체 등의 조성물로 이용될 수 있다.
도 1은 실시예 1-2의 젤화 전, 홍합접착 단백질 fp-151(서열번호 10)이 30wt%로 녹아있는 용액 모습을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1-2의 Ru(II)bpy3 2+과 과산화황산염을 포함하고 있는 홍합접착 단백질 fp-151(서열번호 10) 용액을 450 nm 파장 대의 치과용 램프로 조사하여 형성된 하이드로젤 모습을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1-2의 2 mM의 Ru(II)bpy3 2+과 5 mM의 과산화황산염과 10wt%의 홍합접착 단백질 fp-151(서열번호 10)을 기반으로 형성된 하이드로젤의, 시간에 따른 저장탄성률 및 손실탄성률을 유동계(rheometer)로 측정한 결과이다.
도 4는 실시예 1-2의 2 mM의 Ru(II)bpy3 2+과 40 mM의 과산화황산염과 20wt%의 홍합접착 단백질 fp-151(서열번호 10)을 기반으로 형성된 하이드로젤의, 시간에 따른 저장탄성률 및 손실탄성률을 유동계로 측정한 결과이다.
도 5는 실시예 1-2의 2 mM의 Ru(II)bpy3 2+과 5 mM의 과산화황산염과 10wt%의 홍합접착 단백질 fp-151(서열번호 10)을 기반으로 형성된 하이드로젤의, 진동수에 따른 저장탄성률 및 손실탄성률을 유동계로 측정한 결과이다.
도 6은 실시예 1-2의 2 mM의 Ru(II)bpy3 2+과 40 mM의 과산화황산염과 20wt%의 홍합접착 단백질 fp-151(서열번호 10)을 기반으로 형성된 하이드로젤의, 진동수에 따른 저장탄성률 및 손실탄성률을 유동계로 측정한 결과이다.
도 7은 실시예 2의 홍합접착 단백질 fp-151(서열번호 10)의 광가교 반응으로 형성된 하이드로젤의 쥐 피부에서의 조직 접착력을 알아보기 위해 인장강도기를 통해 측정한 접착력을 광가교가 일어나지 않은 홍합접착 단백질 fp-151용액의 접착력과 비교하여 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 3의 홍합접착 단백질 fp-151(서열번호 10)의 광가교 반응으로 형성된 하이드로젤을 이용하여, 실제 쥐 피부의 창상 실험에서 창상을 만든 직후, 상기 하이드로젤을 통한 상처 지혈(왼쪽 아래) 및 봉합(오른쪽 아래)를 나타낸 것이다. 비교군으로써, 자연치유(왼쪽 위)와 봉합사를 이용한 치료군(오른쪽 위)를 나타내었다.
도 9는 실시예 3의 하이드로젤을 실제 쥐 피부의 창상 실험에서 상처 부위에 도포한지 7일째에 비교군(왼쪽 위 및 오른쪽 위)과 비교하여 하이드로젤의 상처 봉합 및 재생 효과의 결과(왼쪽 아래 및 오른쪽 아래)를 나타낸 사진이다.
도 10은 홍합접착 단백질 fp-151(서열번호 10)기반의 광반응성 하이드로젤 안에 NIH/3T3 세포가 내포되어 있는 형상을 광학 현미경을 통해 나타낸 모습이다.
도 11은 NIH/3T3 세포를 포함하고 있는 홍합접착 단백질 fp-151(서열번호 10) 기반의 광반응성 하이드로젤을 7일간 배양한 뒤, 형광 염색 기법으로 살아있는 세포를 초록색 형광으로 염색하여 세포의 생존을 확인한 사진이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 홍합접착 단백질 기반의 광가교 하이드로젤 제조
1-1. 재조합 홍합접착 단백질 fp -151의 생산
본 발명에서 사용한 홍합접착 단백질 fp-151(서열번호 10)은 fp-1의 10 개 반복 아미노산(서열번호 2)이 6번 반복된 구조를 fp-5(서열번호 8)의 N-말단과 C-말단에 유전자 수준에서 연결시킨 새로운 형태의 홍합접착 단백질로 대장균에서 성공적으로 발현하여 아세트산을 이용한 단순한 정제 분리과정을 통해 생산한 것이다. 상기 홍합접착 단백질의 구체적 제조는 국제특허공개 제WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에 나타낸 바와 동일하며, 상기 특허 문헌은 전체로서 참고문헌으로 본 발명에 포함된다.
1-2. 하이드로젤의 제조
상기 실시예 1-1을 통해 생산된 홍합접착 단백질 fp-151(서열번호 10)을 이용하여 하이드로젤을 제조하기 위해 광가교를 유도하였다.
구체적으로, 광반응성 하이드로젤을 제조하기 위해서, 홍합접착 단백질 fp-151(서열번호 10)이 용해되어 있는 용액에 Ru(II)bpy3 2+와 과황산나트륨(sodium persulfate) 용액을 첨가시킨 후, 450 nm 파장대의 치과용 램프를 30초간 쬐어주어 하이드로젤을 형성시켰다.
구체적으로, 하기와 같은 구성요소 농도의 하이드로젤을 제조하였다:
a) 10wt% 홍합접착 단백질, 2 mM Ru(II)bpy3 2+ 및 5 mM 과산화황산염
b) 20wt% 홍합접착 단백질, 2 mM Ru(II)bpy3 2+ 및 40 mM 과산화황산염
젤화가 되기 전의 홍합접착 단백질 용액과 젤화가 된 후 하이드로젤의 사진을 각각 도 1과 도 2에 나타내었으며, 도 2의 하이드로젤은 Ruthenium 이온으로 인해 노란색을 띠며, 가교 정도에 따라 투명도에도 차이를 보임을 알 수 있다.
1-3. 하이드로젤의 유변학적 분석
상기 실시예 1-2에서 제조된 물질이 젤이 맞음을 확인하기 위해 유동계(rheometer)를 이용한 유변학적 분석을 실시하였다. 즉, 시료의 저장탄성률(storage modulus)과 손실탄성률(loss modulus) 값을 비교하여 저장탄성률(G')값이 손실탄성률(G'')보다 클 때 젤이라고 알려져 있으므로, 상기 실시예 1-2에서 얻어진 시료를 유변학적 분석을 위해 시간(time), 진동수(frequency), 및 변형율(strain)을 각각 달리한 세 가지 모드에서 저장탄성률 값과 손실탄성률을 측정하였다.
구체적으로, 시간에 따른 저장탄성률은 20%의 변형률, 80 Hz의 진동수로 일정하게 유지시켜주면서 측정하였고 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 다음으로는 변형률을 일정하게 유지시켜주면서 진동수의 변화에 따라 저장탄성률과 손실탄성률을 분석하기 위해, 20%의 변형률을 유지시켜주고 0.1 내지 100 Hz까지 진동수를 변화시켜주면서 저장탄성률 및 손실탄성률을 측정하였고 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 3 및 도 4에서 볼 수 있듯이 모든 측정 지점에서의 저장탄성률 값이 손실탄성률 값보다 크게 측정되어, 상기 실시예 1-2의 시료 a 및 시료 b가 광가교를 통해 형성된 물질이 젤임을 알 수 있으며, 값들이 일정하게 유지되는 것을 통해 하이드로젤 내의 결합이 국소적으로 이루어진 것이 아니라, 일정하고 견고하게 형성됨을 확인할 수 있었다.
또한, 도 5 및 도 6에서 볼 수 있듯이 전체 진동수 영역에서 일정한 저장탄성률 값을 보여줌으로써, 시료 a 및 b의 하이드로젤 내의 견고한 결합을 확인할 수 있었다.
또한 하이드로젤을 구성하는 구성요소들의 농도의 변화를 통해 하이드로젤의 기계적 물성을 조절할 수 있음을 유변학적 분석을 통해 알아보았다. 구체적으로, 상기 실시예 1-2의 시료 a 및 b를 변형률을 일정하게 유지시켜주면서 진동수의 변화에 따라 저장탄성률과 손실탄성률을 분석하기 위해, 20%의 변형률을 유지시켜주고 0.1 내지 100 Hz까지 진동수를 변화시켜주면서 저장탄성률 및 손실탄성률을 측정하였다.
각 시료의 저장탄성률과 손실탄성률을 도 5(시료 a)와 도 6(시료 b)에 나타내었으며, 시료 b(도 6)의 저장탄성률(9.54kPa)이, 시료 a(도 5)의 저장탄성률(0.688kPa)에 비해 약 14배 더 높음을 알 수 있었다.
실시예 2. 하이드로젤의 생체접착력 측정
본 발명의 하이드로젤이 실제 조직과 유사한 표면에서 접착력을 얼마나 갖는지 알아보기 위하여 접착 실험을 수행하였다. 젤화 조건은 홍합접착 단백질 50wt% 용액을 시편 면적 1cm²에 약 8.8ul를 도포하여 면적단위당 도포 된 단백질 양이 4.4 mg/cm2, Ru(II)bpy3 2+ 2 mM, 과산화황산염 40 mM이 되도록 처리하였다.
구체적으로 지방 등이 제거된 쥐 피부를 PBS에 담궈서 아크릴 시편에 시아노아크릴레이트 본드로 고정시킨 후, 피부 샘플 사이에 젤화가 일어나기 전의 Ru(II)bpy3 2+과 과산화황산염을 포함하고 있는 홍합 접착 단백질 용액을 도포한 후, 피부 샘플을 접합시킨 후 450 nm 파장 대의 치과용 램프를 50초간 투사하여 하이드로젤을 형성했다. 곧바로 PBS에 2시간 동안 담근 후, 인장강도 측정기(Instron)을 이용하여 접착력을 측정하였고, 비교군으로 홍합접착 단백질 fp-151(서열번호 10) 용액을 같은 농도로 도포하여 비교하였다.
그 결과, 홍합접착 단백질 용액이 약 37 kPa, 홍합접착 단백질 기반의 하이드로젤이 72 kPa 정도의 힘을 보임을 확인하였고, 이를 도 7에 나타내었다.
실시예 3. 하이드로젤의 랫트의 피부 창상 접착 및 재생 실험
본 발명의 하이드로젤이 실제 조직의 접착 및 재생에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 실험용 랫트(rat)를 이용한 창상 실험을 수행하였다. 젤화 조건은 최종 농도 홍합접착 단백질 30wt%, Ru(II)bpy3 2+ 2 mM, 및 과산화황산염 40 mM이 되도록 처리하였다.
구체적으로 약 200 g의 랫트(rat)의 등에 약 2 cm의 창상을 만들고, 곧바로 이러한 상처에 Ru(II)bpy3 2+과 과산화황산염을 포함하고 있는 홍합접착 단백질 용액을 도포한 후, 450 nm 파장 대의 치과용 램프를 약 100초간 투사하여 하이드로젤을 형성하여 상처 봉합을 유도하였다. 비교군으로, 자연 치유와 봉합사를 이용한 상처봉합을 이용하였다.
그 결과 광반응성 및 생체 접착성의 하이드로젤을 이용하여 즉각적인 상처 봉합이 가능함을 확인하였고, 이를 도 8에 나타내었다. 또한, 약 7일 후, 상처 치유 및 재생을 육안으로 확인해본 결과, 하이드로젤을 이용한 창상 치료에서 더 빠른 재생이 확인되었고, 이를 도 9에 나타내었다.
실시예 4. 세포를 포함하는 하이드로젤 제조
미리 배양된 섬유아세포(fibroblast cell) 계열인 NIH/3T3 세포를 함께 첨가한 후, 하이드로젤을 제조하고, 하이드로젤 속의 세포의 생존 여부를 확인하였다 .젤화 조건은 최종 농도 홍합접착 단백질 10wt%, Ru(II)bpy3 2+ 1 mM, 과산화황산염 10 mM이고, 세포의 수는 총 용액 부피 1 ml당 5 X 105 개가 되도록 처리하였다.
구체적으로, NIH/3T3 세포, Ru(II)bpy3 2+과 과산화황산염을 포함하고 있는 홍합접착 단백질 용액에 450 nm 파장 대의 치과용 램프를 약 30초간 쬐어준 후 세포-하이드로젤 복합체를 형성하였다. 형성 직후, 세포를 포함하고 있는 하이드로젤의 모습을 광학 현미경으로 확인하였고 이를 도 10에 나타내었다.
실시예 5. 세포를 포함하는 하이드로젤 내 세포 생존 확인
상기 실시예 4의 하이드로젤을 7일간 배양하여 하이드로젤 속 세포 생존을 calcein AM 염색시약을 사용한 형광 염색기법으로 확인하였다. 살아있는 세포와 죽은 세포의 구분은 세포생존의 지표에 의해 결정되는 데, 바로 이 지표는 세포 내에서 일어나는 에스테라아제 활성(esterase activity)과 원형질막 온정성(plasma membrane integrity)이다. 이 염색기법에서 살아있는 세포의 경우 calcein AM은 살아있는 세포 내로 투과가 가능하고 살아있는 세포 안에서 에스테라아제 활성에 의해 강렬하고 일정한 초록색 형광을 나타낸다. 그 결과 상기 실시예 4의 하이드로젤 속 대부분의 세포가 살아있음이 초록색의 형광을 통해 확인하였고, 이를 도 11에 나타내었다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Mussel adhesive protein-based adhesive hydrogel <130> DPP20144693KR <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 565 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 <400> 1 Met Glu Gly Ile Lys Leu Asn Leu Cys Leu Leu Cys Ile Phe Thr Phe 1 5 10 15 Asp Val Leu Gly Phe Ser Asn Gly Asn Ile Tyr Asn Ala His Val Ser 20 25 30 Ser Tyr Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala Tyr Lys Lys Leu Pro Asn Ala 35 40 45 Tyr Pro Tyr Gly Thr Lys Pro Glu Pro Val Tyr Lys Pro Val Lys Thr 50 55 60 Ser Tyr Ser Ala Pro Tyr Lys Pro Pro Thr Tyr Gln Gln Leu Lys Lys 65 70 75 80 Lys Val Asp Tyr Arg Pro Thr Lys Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Gly Ser 85 90 95 Lys Thr Asn Tyr Leu Pro Leu Ala Lys Lys Leu Ser Ser Tyr Lys Pro 100 105 110 Ile Lys Thr Thr Tyr Asn Ala Lys Thr Asn Tyr Pro Pro Val Tyr Lys 115 120 125 Pro Lys Met Thr Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Lys Pro Ser Tyr Pro 130 135 140 Pro Thr Tyr Lys Ser Lys Pro Thr Tyr Lys Pro Lys Ile Thr Cys Pro 145 150 155 160 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 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Claims (21)

  1. 홍합접착 단백질, 전자수용체, 및 광반응성 금속 리간드를 포함하는 하이드로젤(gel) 제조용 광가교성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 홍합접착 단백질은 전체 조성물 기준으로 10 내지 30wt% 포함된 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 전자수용체는 5 내지 80 mM 포함된 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 광반응성 금속 리간드는 1 내지 10 mM 포함된 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 홍합접착 단백질은 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 융합 단백질인 것인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 및 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질인 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열이 1회 내지 12회 연속하여 연결된 단백질인 것인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD(Arg Gly Asp)를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것인, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 RGD를 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호 16 내지 서열번호 25로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 전자수용체는 과황산염(persulfate), 과아이오딘산염(periodate), 과브롬산염(perbromate), 과염소산염(perchlorate), 비타민(B12), 펜타아민클로로코발트(Pentaamminechlorocobalt(III)), 암모늄 세륨 질산염(ammonium cerium(IV) nitrate), 옥살산(oxalic acid), 및 이디티에이(EDTA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 광반응성 금속 리간드는 루테니움(Ru(II)), 팔라디움(Pd(II)), 구리(Cu(II)), 니켈(Ni(II)), 망간(Mn(II)), 및 철(Fe(III))로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 생리활성물질을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 생리활성 물질은 세포, 단백질, 효소, 및 당으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 하이드로젤 제조용 조성물에 가시광선을 조사하여 다이-타이로신(di-tyrosine) 잔기를 형성하여 가교화하는 단계를 포함하는 하이드로젤의 생산방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 광반응은 파장범위 449 내지 455 nm의 가시광선을 사용하는 것인, 생산방법.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 하이드로젤 제조용 조성물에 가시광선을 조사하여 다이-타이로신(di-tyrosine) 잔기를 형성하여 제조된 가교화물을 포함하는 하이드로젤.
  18. 제17항의 하이드로젤을 포함하는 생체접착제.
  19. 제17항의 하이드로젤을 포함하는 조직공학용 지지체.
  20. 제17항의 하이드로젤을 포함하는 약물 전달용 담체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 약물은 단백질 의약품, 펩타이드, 항암제, 및 항염증제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 담체.
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