CN106432420A - 多肽修饰的单宁酸及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了三种结构的多肽修饰的单宁酸及其制备方法，并通过实验证实了所述多肽修饰的单宁酸对羟基磷灰石具有牢固的吸附作用，并能在羟基磷灰表面吸附聚集成膜，所述多肽修饰的单宁酸能在模拟唾液中诱导羟基磷灰石在磨损牙釉质块表面沉积和结晶，具有促进牙釉质再矿化的能力，并且，将所述多肽修饰的单宁酸与三价铁离子配合使用能进一步提升所述多肽修饰的单宁酸在模拟唾液中对牙釉质再矿化的能力；所述多肽修饰的单宁酸能有效防止细菌在牙釉质上粘附，阻止粘附的细菌在其上繁殖。说明本发明所述多肽修饰的单宁酸可作为牙釉质原位再矿化诱导剂以及牙科植入体表面抗菌材料应用。
Description
技术领域
本发明属于牙釉质原位修复材料及牙科植入体表面抗菌材料领域，特别涉及多肽修饰的单宁酸素及其制备方法与应用。
背景技术
人类的牙釉质由96％的无机材料和4％的有机材料组成，由纳米棒高度有序排列成层次分明的微观结构的羟基磷灰石是牙釉质的主要无机组成材料。研究表明，造釉细胞分泌的牙釉蛋白是形成牙釉质有机成分的主要材料，约占在牙釉质生物矿化过程中所有有机基质的90％。虽然牙釉质是人体中最坚硬的组织，但牙釉质依旧会受到口腔中细菌的侵蚀，或者会因其他机械力而受损。龋齿是一种细菌引起的疾病，主要表现为牙齿的脱矿现象，龋齿被认为是最主要的人类口腔疾病，全世界大约有80％～90％的人口遭受过龋齿的困扰。为了修复受损的牙釉质，用于填充龋齿患处的材料包括金属材料、陶瓷材料和树脂材料，然而由于牙齿基质与填充材料之间性质差异巨大，两者界面间相互作用力不强，填充材料容易在首次治疗后不久脱落。近年来，生物矿化手段成为修复受损牙釉质的研究热点，为了模仿自然生成牙釉质，研究者采用牙釉蛋白、两亲化合物、树枝状大分子等新材料作为生物活性的有机基质去诱导牙釉质再生。
单宁酸为一种多酚类物质，主要分布在茶叶和红酒中，具有抗菌性。已有研究者单独采用单宁酸，以及将单宁酸与三价铁离子络合体系用于修复牙本质，结果发现前者虽有一定作用，但效果不佳，而后者能快速封堵牙小管并诱导牙本质再矿化再生羟基磷灰石(OhDX,Prajatelistia E,Ju SW,et al..Scientific reports.2015；5:10884.)。单宁酸与三价铁离子络合体系主要依靠多酚与牙本质上的蛋白质的络合作用于牙本质表面，而与牙本质相比，牙釉质中的胶原等有机成分的含量明显更低，因而单宁酸与三价铁离子络合体系无法牢固地作用于牙釉质上，难以用于牙釉质的修复。
基于以上技术现状，若能对单宁酸的结构进行改进并利用单宁酸的抑菌特点，开发出对牙釉质具有靶向特异性吸附效果、能有效提升新生釉质层与受损釉质层的界面间作用力且具有抑菌作用的牙釉质原位修复材料，对于牙釉质龋齿修复和牙科植入体表面抗菌都将产生重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供多肽修饰的单宁酸及其制备方法，并证明所述多肽修饰的单宁酸可作为牙釉质原位再矿化诱导剂以及牙科植入体表面抗菌材料应用。
本发明提供的多肽修饰的单宁酸，结构式如式(Ⅰ)、式(Ⅱ)或者式(Ⅲ)所示：
上述结构式(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)中，R1、R2、R3分别为结构式如式(Ⅳ)所示的单宁酸分子中的任意一个R4、任意两个R4、任意三个R4的酯基对位羟基被去掉后形成的基团，式(Ⅳ)中，R4＝，
本发明还提供了上述多肽修饰的单宁酸的制备方法，步骤如下：
(1)丙烯酰基修饰的单宁酸的合成
①配制第一种溶液
将单宁酸溶解于二甲基甲酰胺中形成第一种溶液，第一种溶液中单宁酸的浓度为0.04～0.05g/mL；
②配制第二种溶液
将三乙胺溶解于第一种溶液中形成第二种溶液，所述三乙胺与第一种溶液中单宁酸的摩尔比为(1～3.2):1；
③合成
在氩气保护条件下于-5～5℃将丙烯酰氯加入到第二种溶液中，在室温反应至少24h，然后经透析、冷冻干燥，即得丙烯酰基修饰的单宁酸；所述丙烯酰氯与第二种溶液中单宁酸的摩尔比为(1～3.2):1；
(2)带保护基团的多肽修饰的单宁酸的合成
①配制第三种溶液
以步骤(1)制备的丙烯酰基修饰的单宁酸为溶质，将所述溶质溶解于去离子水中形成第三种溶液，所述去离子水的量以溶质能在去离子水中完全溶解为限；
②配制第四种溶液
以结构式如式(Ⅴ)所示的多肽为溶质，将所述溶质溶解于去离子水中形成第四种溶液，所述去离子水的量以溶质能在去离子水中完全溶解为限；
③合成
将二甲基苯基磷加入第三种溶液中并混合均匀，然后加入第四种溶液并混合均匀，在密封条件下于室温反应至少24h，经透析、冷冻干燥，即得带保护基团的多肽修饰的单宁酸；
所述第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为(1～3.2):1，所述二甲基苯基磷与第四种溶液中的巯基的摩尔比为(0.000001～0.00001):1；
(3)多肽修饰的单宁酸的合成
①配制第五种溶液
将氨水、二氧六环、浓度为2～6mol/L的氢氧化钠水溶液混合均匀得到第五种溶液，第五种溶液中，氨水、二氧六环、氢氧化钠的摩尔比为(15～25):(4～14):(1～6)；
②合成
以步骤(2)制备的带保护基团的多肽修饰的单宁酸为溶质，将所述溶质溶解于第五种溶液中并混合均匀，在密封条件下于室温反应至少24h，然后经透析、冷冻干燥，即得多肽修饰的单宁酸；所述第五种溶液的量以溶质能在第五种溶液中完全溶解为限。
上述方法中，制备结构式如式(Ⅰ)所示多肽修饰的单宁酸时，步骤(1)的第二种溶液中三乙胺与第一种溶液中单宁酸的摩尔比为(1～1.2):1，丙烯酰氯与第二种溶液中单宁酸的摩尔比为(1～1.2):1；步骤(2)的第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为(1～1.2):1。制备结构式如式(Ⅱ)所示多肽修饰的单宁酸时，步骤(1)的第二种溶液中三乙胺与第一种溶液中单宁酸的摩尔比为(2～2.2):1，丙烯酰氯与第二种溶液中单宁酸的摩尔比为(2～2.2):1；步骤(2)的第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为(2～2.2):1。制备结构式如式(Ⅲ)所示多肽修饰的单宁酸时，步骤(1)的第二种溶液中三乙胺与单宁酸的摩尔比为(3～3.2):1，控制丙烯酰氯与第二种溶液中单宁酸的摩尔比为(3～3.2):1；步骤(2)的第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为(3～3.2):1。
上述方法中，在制备结构式(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)所示的多肽修饰的单宁酸时，位阻越小的R4的酯基对位羟基越容易被丙烯酰基修饰，进而被所述多肽修饰形成多肽修饰的单宁酸的合成。
本发明提供了上述多肽修饰的单宁酸作为牙釉质原位再矿化诱导剂以及作为牙科植入体表面抗菌材料的应用。实验表明：本发明所述多肽修饰的单宁酸对羟基磷灰石具有牢固的吸附作用，并能在羟基磷灰表面吸附聚集成膜；本发明所述多肽修饰的单宁酸能在模拟唾液中诱导羟基磷灰石在磨损牙釉质块表面沉积和结晶，即具有促进牙釉质再矿化的能力，并且，将本发明所述多肽修饰的单宁酸与三价铁离子配合使用，能进一步提升所述多肽修饰的单宁酸在模拟唾液中对牙釉质再矿化的能力，说明三价铁离子可与本发明所述多肽修饰的单宁酸配合作为牙釉质原位再矿化诱导剂应用。本发明所述多肽修饰的单宁酸能有效防止细菌(包括死细菌和活细菌)在牙釉质上粘附，阻止粘附的细菌在其上繁殖，从而体现出抑菌作用，基于该特性，本发明所述多肽修饰的单宁酸可作为牙科植入体表面抗菌材料应用。
应用时，将所述多肽修饰的单宁酸配制成水溶液使用，所述水溶液中，多肽修饰的单宁酸的浓度为500～5000ppm。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供了一类新型结构的牙釉质原位修复材料—多肽修饰的单宁酸，丰富了牙齿定点再矿化的材料的种类。
2.实验表明：本发明所述多肽修饰的单宁酸对羟基磷灰石具有牢固的吸附作用，并能在羟基磷灰表面吸附聚集成膜，所示多肽修饰的单宁酸能在模拟唾液中诱导羟基磷灰石在磨损牙釉质块表面沉积和结晶，即具有促进牙釉质再矿化的能力，并且，与三价铁离子配合使用，能进一步提升所述多肽修饰的单宁酸在模拟唾液中对牙釉质再矿化的能力，可作为牙釉质原位再矿化诱导剂中应用(见实施例4～10)；本发明所述多肽修饰的单宁酸能有效防止细菌(包括死细菌和活细菌)在牙釉质上粘附，阻止粘附的细菌在其上繁殖，表现出抑菌作用，可作为牙科植入体表面抗菌材料应用(见实施例11)。
3.本发明所述多肽修饰的单宁酸在应用时，直接配制水溶液即可，应用方式简单、应用浓度低，具有简化治疗操作和降低治疗成本的优势，容易在实际应用中推广。
4.本发明还提供了上述多肽修饰的单宁酸的制备方法，该方法采用常规原料及设备即可实现，易于实现工业化生产。
附图说明
图1为本发明所述结构式如式(Ⅰ)所示的多肽修饰的单宁酸的合成过程示意图；
图2是实施例1中单宁酸、步骤(1)和步骤(3)中合成的产物的红外谱图，其中，曲线a、b、c分别为单宁酸、步骤(1)和步骤(3)中合成的产物的红外谱图；
图3是实施例1的步骤(1)和(3)中合成的产物的核磁氢谱图，其中，图(A)为步骤(1)合成的产物的核磁氢谱图，图(B)为步骤(3)合成的产物的核磁氢谱图；
图4是实施例1步骤(2)合成的产物的飞行时间质谱图；
图5是实施例3中单宁酸、步骤(1)和步骤(3)中合成的产物的红外谱图，其中，曲线a、b、c分别为单宁酸、步骤(1)和步骤(3)中合成的产物的红外谱图；
图6是实施例3的步骤(1)和(3)中合成的产物的核磁氢谱图，其中，图(A)为步骤(1)合成的产物的核磁氢谱图，图(B)为步骤(3)合成的产物的核磁氢谱图；
图7是实施例3步骤(2)合成的产物的飞行时间质谱图；
图8是实施例4中不同浓度的SAP-1-TA在羟基磷灰石粉末上的吸附量汇总图；
图9是实施例5中不同浓度的SAP-3-TA在羟基磷灰石粉末上的吸附量汇总图；
图10是实施例6中SAP-1-TA在羟基磷灰石片上吸附成膜后SEM照片，其中，图(A)～(C)是SAP-1-TA在羟基磷灰石片上吸附成膜后不同放大倍数的SEM照片；
图11是实施例7中SAP-1-TA在羟基磷灰石片上吸附成膜后SEM照片，其中，图(A)～(C)是SAP-1-TA在羟基磷灰石片上吸附成膜后不同放大倍数的SEM照片；
图12是实施例8中酸蚀牙釉质块表面的荧光分布图，其中，图(A)、图(B)分别为经罗丹明B标记的SAP-1-TA处理的酸蚀牙釉质块以及空白酸蚀牙釉质块表面的荧光分布图；
图13是实施例9中酸蚀牙釉质块表面的荧光分布图，其中，图(A)、图(B)分别为经罗丹明B标记的SAP-3-TA处理的酸蚀牙釉质块以及空白酸蚀牙釉质块表面的荧光分布图；
图14是实施例10中空白组、对照组和实验组的牙釉质块的SEM照片，其中，图(A1)(A2)(A3)、图(B1)(B2)(B3)和图(C1)(C2)(C3)分别为空白组、对照组和实验组的牙釉质块在模拟唾液中浸泡1天、1周和2周后的SEM图；
图15是实施例10中实验组和空白组在波长600nm处测吸光度值柱状图；
图16是实施例10中实验组和空白组的羟基磷灰石片表面的SEM照片，其中，图A、图B分别为实验组和空白组羟基磷灰石表面的SEM照片；
图17是实施例10中空白组与实验组样品的共聚焦显微镜图，其中，图A、图B分别为空白组的样品表面的活菌和死菌被染色后的共聚焦显微镜图，图C、图D分别为实验组的样品表面的活菌和死菌被染色后的共聚焦显微镜图。
具体实施方式
以下通过实施例并结合附图对本发明所述多肽修饰的单宁酸及其制备方法与应用作进一步说明。
下述实施例1～3中，步骤(2)中使用的多肽购买自上海波泰生物科技有限公司，其结构式如式(Ⅴ)所示：
实施例1
本实施例中，提供一条多肽链修饰单宁酸的制备方法，其合成路线如图1所示，步骤如下：
(1)丙烯酰基修饰的的单宁酸的合成
①配制第一种溶液
在室温、常压条件下将4g单宁酸溶解于100mL无水二甲基甲酰胺形成第一种溶液，第一种溶液中单宁酸的浓度为0.04g/mL；
②配制第二种溶液
在室温、常压条件下将三乙胺(TEA)溶解于第一种溶液中形成第二种溶液，所述三乙胺与第一种溶液中单宁酸的摩尔比为1:1；
③合成
在0～5℃的冰水浴及氩气保护条件下将丙烯酰氯(Acryloyl chloride)滴加到第二种溶液中，在室温、常压条件下反应24h，然后在去离子水中用截留分子量为1000道尔顿的透析袋透析1天，再冷冻干燥，即得丙烯酰基修饰的单宁酸；所述丙烯酰氯与第二种溶液中单宁酸的摩尔比为1:1。
(2)带保护基团的多肽修饰的单宁酸的合成
①配制第三种溶液
以36.1mg步骤(1)制备的丙烯酰基修饰的单宁酸为溶质，在常压、室温条件下将所述溶质溶解于10mL去离子水中形成第三种溶液；
②配制第四种溶液
以40mg结构式如式(Ⅴ)所示的多肽为溶质，在室温、常压条件下将所述溶质溶解于10mL去离子水中形成第四种溶液；
③合成
将二甲基苯基磷(Dimethylphenyl phosphine)加入第三种溶液中，在室温、常压搅拌混合均匀，然后加入第四种溶液并混合均匀，在密封条件下于室温、常压反应24h，然后在去离子水中用截留分子量为2000道尔顿的透析袋透析1天，冷冻干燥，即得带保护基团的多肽修饰的单宁酸；所述第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为1:1，所述二甲基苯基磷与第四种溶液中的巯基的摩尔比为0.000004:1。
(3)多肽修饰的单宁酸的合成
①配制第五种溶液
在室温、常压条件下将氨水、二氧六环、浓度为4mol/L的氢氧化钠水溶液混合均匀得到第五种溶液，第五种溶液中，氨水、二氧六环、氢氧化钠的摩尔比为20:9:1；
②合成
以38mg步骤(2)制备的带保护基团的多肽修饰的单宁酸为溶质，在室温、常压条件下将所述溶质溶解于40mL第五种溶液中并混合均匀，在密封条件下于室温、常压反应24h，然后在去离子水中用截留分子量为1000道尔顿的透析袋透析72h，冷冻干燥，即得一条多肽链修饰的单宁酸，记作SAP-1-TA。
单宁酸、上述步骤(1)和步骤(3)中合成的产物的红外谱图分别如图2中曲线a、b、c所示，图2的曲线b中新出现的在波数为1652.73cm-1处的峰即为C＝C震动峰，说明成功合成丙烯酰基修饰的单宁酸，图2的曲线c中出现在波数为1401.10cm-1处的峰为酰胺键N-H键震动峰，说明成功合成了多肽修饰的单宁酸。上述步骤(1)和步骤(3)中合成的产物的核磁氢谱图分别如图3的(A)(B)所示，图(B)中在6～8ppm间新出现的峰为仲酰胺键上氢的峰，成功合成了多肽修饰的单宁酸。图4为步骤(2)中合成的产物的飞行时间质谱图，其中分子离子峰为3076.079，恰好为一条带保护基团的多肽修饰的单宁酸的分子量与质子化过程中结合的钠离子的相对分子质量之和，表明成功合成了一条带保护基团的多肽修饰的单宁酸。本实施例制备的一条多肽链修饰的单宁酸的结构式如下式所示：
实施例2
本实施例中，提供两条多肽链修饰单宁酸的制备方法，步骤如下：
(1)丙烯酰基修饰的的单宁酸的合成
①配制第一种溶液
在室温、常压条件下将5g单宁酸溶解于100mL无水二甲基甲酰胺形成第一种溶液，第一种溶液中单宁酸的浓度为0.05g/mL；
②配制第二种溶液
在室温、常压条件下将三乙胺溶解于第一种溶液中形成第二种溶液，所述三乙胺与第一种溶液中单宁酸的摩尔比为2.1:1；
③合成
在0～5℃的冰水浴及氩气保护条件下将丙烯酰氯滴加到第二种溶液中，在室温、常压条件下反应24h，然后在去离子水中用截留分子量为1000道尔顿的透析袋透析1天，再冷冻干燥，即得丙烯酰基修饰的单宁酸；所述丙烯酰氯与第二种溶液中单宁酸的摩尔比为2.1:1。
(2)带保护基团的多肽修饰的单宁酸的合成
①配制第三种溶液
以22mg步骤(1)制备的丙烯酰基修饰的单宁酸为溶质，在常压、室温条件下将所述溶质溶解于10mL去离子水中形成第三种溶液；
②配制第四种溶液
以40mg结构式如式(Ⅴ)所示的多肽为溶质，在室温、常压条件下将所述溶质溶解于10mL去离子水中形成第四种溶液；
③合成
将二甲基苯基磷加入第三种溶液中，在室温、常压搅拌混合均匀，然后加入第四种溶液并混合均匀，在密封条件下于室温、常压反应24h，然后在去离子水中用截留分子量为3000道尔顿的透析袋透析1天，冷冻干燥，即得带保护基团的多肽修饰的单宁酸；所述第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为2.1:1，所述二甲基苯基磷与第四种溶液中的巯基的摩尔比为0.000001:1。
(3)多肽修饰的单宁酸的合成
①配制第五种溶液
在室温、常压条件下将氨水、二氧六环、浓度为6mol/L的氢氧化钠水溶液混合均匀得到第五种溶液，第五种溶液中，氨水、二氧六环、氢氧化钠的摩尔比为25:4:6；
②合成
以38mg步骤(2)制备的带保护基团的多肽修饰的单宁酸为溶质，在室温、常压条件下将所述溶质溶解于80mL第五种溶液中并混合均匀，在密封条件下于室温、常压反应24h，然后在去离子水中用截留分子量为2000道尔顿的透析袋透析72h，冷冻干燥，即得两条多肽链修饰的单宁酸，记作SAP-2-TA，其结构式如下式所示：
实施例3
本实施例中，提供三条多肽链修饰单宁酸的制备方法，步骤如下：
(1)丙烯酰基修饰的的单宁酸的合成
①配制第一种溶液
在室温、常压条件下将4.5g单宁酸溶解于100mL无水二甲基甲酰胺形成第一种溶液，第一种溶液中单宁酸的浓度为0.045g/mL；
②配制第二种溶液
在室温、常压条件下将三乙胺溶解于第一种溶液中形成第二种溶液，所述三乙胺与第一种溶液中单宁酸的摩尔比为3.2:1；
③合成
在-5～5℃及氩气保护条件下将丙烯酰氯滴加到第二种溶液中，在室温室温、常压条件下反应30h，然后在去离子水中用截留分子量为1000道尔顿的透析袋透析1天，再冷冻干燥，即得丙烯酰基修饰的单宁酸；所述丙烯酰氯与第二种溶液中单宁酸的摩尔比为3.2:1。
(2)带保护基团的多肽修饰的单宁酸的合成
①配制第三种溶液
以12.8mg步骤(1)制备的丙烯酰基修饰的单宁酸为溶质，在常压、室温条件下将所述溶质溶解于10mL去离子水中形成第三种溶液；
②配制第四种溶液
以40mg结构式如式(Ⅴ)所示的多肽为溶质，在室温、常压条件下将所述溶质溶解于10mL去离子水中形成第四种溶液；
③合成
将二甲基苯基磷加入第三种溶液中，在室温、常压搅拌混合均匀，然后加入第四种溶液并混合均匀，在密封条件下于室温、常压反应30h，然后在去离子水中用截留分子量为3000道尔顿的透析袋透析1天，冷冻干燥，即得带保护基团的多肽修饰的单宁酸；所述第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为3.2:1，所述二甲基苯基磷与第四种溶液中的巯基的摩尔比为0.00001:1。
(3)多肽修饰的单宁酸的合成
①配制第五种溶液
在室温、常压条件下将氨水、二氧六环、浓度为2mol/L的氢氧化钠水溶液混合均匀得到第五种溶液，第五种溶液中，氨水、二氧六环、氢氧化钠的摩尔比为15:14:5；
②合成
以38mg步骤(2)制备的带保护基团的多肽修饰的单宁酸为溶质，在室温、常压条件下将所述溶质溶解于120mL第五种溶液中并混合均匀，在密封条件下于室温、常压反应30h，然后在去离子水中用截留分子量为2000道尔顿的透析袋透析72h，冷冻干燥，即得三条多肽链修饰的单宁酸，记作SAP-3-TA。
单宁酸、上述步骤(1)和步骤(3)中合成的产物的红外谱图分别如图5中曲线a、b、c所示，图5的曲线b中新出现的在波数为1651.26cm-1处的峰即为C＝C震动峰，说明成功合成丙烯酰基修饰的单宁酸，图5的曲线c中出现在波数为1403.15cm-1处的峰为酰胺键N-H键震动峰，说明成功合成了多肽修饰的单宁酸。上述步骤(1)和步骤(3)中合成的产物的核磁氢谱图分别如图6的(A)和(B)所示，图(B)6～8ppm间新出现的峰为仲酰胺键上氢的峰，1～2ppm间出现新峰为邻近羰基的亚甲基上的氢的峰，说明成功合成了多肽修饰的单宁酸。图7为步骤(2)中合成的产物的飞行时间质谱图，该飞行时间质谱图中的最大峰值为5843.71(在图上未标出)，而三条带保护基团的多肽链修饰的单宁酸其理论分子量为5754.89，最大峰值为5843.71为三条带保护基团的多肽链修饰的单宁酸结合一个季铵盐的分子量，说明步骤(2)成功合成了带保护基团的多肽修饰的单宁酸。本实施例制备的三条多肽链修饰的单宁酸的结构式如下式所示：
实施例4
本实施例中，测定实施例1制备的SAP-1-TA在羟基磷灰石(HA)粉末上的吸附情况，所述羟基磷灰石粉末的规格为HA/M30，其含水量低于0.1％。
将SAP-1-TA分别在中性、碱性和酸性和条件下配制成水溶液，其中，中性条件直接用去离子水配制，碱性条件在去离子水的基础上加氨水配制，酸性条件在去离子水的基础上加盐酸配制成SAP-1-TA浓度分别为0.25mg/mL、0.75mg/mL、1.25mg/mL、1.75mg/mL、2.25mg/mL的SAP-1-TA水溶液，分别用紫外可见分光光度计测量前述5个浓度的SAP-1-TA中性水溶液在波长为348nm处的吸光度值，SAP-1-TA碱性水溶液在波长为400nm处的吸光度值，SAP-1-TA酸性水溶液在波长为338nm处的吸光度值，得到三种条件下SAP-1-TA浓度与吸光度值之间的线性关系，即标准曲线。
将SAP-1-TA分别在中性、碱性和酸性和条件下配制成水溶液，其中，中性条件直接用去离子水配制，碱性条件在去离子水的基础上加氨水配制，酸性条件在去离子水的基础上加盐酸配制成SAP-1-TA浓度分别为0.25mg/mL、0.75mg/mL、1.25mg/mL、1.75mg/mL、2.25mg/mL、2.75mg/mL、3.25mg/mL及3.75mg/mL的SAP-1-TA水溶液。取量程为10mL的离心PE管24支，分别向其中加入50mg羟基磷灰石粉末，然后取中性、碱性、酸性条件下配制的各浓度的SAP-1-TA水溶液各1mL加入离心PP管中，加入转子，在37℃振荡搅拌24h，然后对各离心PP管中的混合液以10000r/min的转速离心4min，取离心所得上清液用紫外分光光度计测量上清液中SAP-1-TA的浓度，对照标准曲线，计算出吸附在羟基磷灰石粉末上的SAP-1-TA的量。
结果如图8所示，在中性条件下，SAP-1-TA在羟基磷灰石粉末(50mg)上的饱和吸附量为2.9mg(在浓度为3.75mg/mL时达吸附饱和)；在碱性条件下，SAP-1-TA在羟基磷灰石粉末(50mg)上的饱和吸附量为1.5mg(在浓度为3.25mg/mL时达吸附饱和)；在酸性条件下，SAP-1-TA在羟基磷灰石粉末上的饱和吸附量为2.6mg(在浓度为3.75mg/mL时达吸附饱和)。
实施例5
本实施例中，测定实施例3制备的SAP-3-TA在羟基磷灰石粉末上的吸附情况，所述羟基磷灰石粉末的规格为HA/M30，其含水量低于0.1％。
将SAP-5-TA在中性条件下直接用去离子水配制成SAP-3-TA浓度分别为0.25mg/mL、0.75mg/mL、1.25mg/mL、1.75mg/mL、2.25mg/mL、2.75mg/mL及3.25mg/mL的SAP-3-TA水溶液，用紫外可见分光光度计测量前述7个浓度的SAP-3-TA水溶液在波长为347nm处的吸光度值，得到SAP-3-TA浓度与吸光度值之间的线性关系，即标准曲线。
将SAP-3-TA溶解在去离子水中配制成SAP-3-TA浓度分别为0.25mg/mL、0.75mg/mL、1.25mg/mL、1.75mg/mL、2.25mg/mL、2.75mg/mL及3.25mg/mL的SAP-3-TA水溶液。取量程为10mL的离心PP管6支，分别向其中加入50mg羟基磷灰石粉末，然后取上述各浓度的SAP-3-TA水溶液各1mL加入离心PP管中，加入转子，在37℃振荡搅拌24h，然后对各离心PP管中的混合液以10000r/min的转速离心4min，取离心所得上清液用紫外分光光度计测量上清液中SAP-3-TA的浓度，对照标准曲线，计算出吸附在羟基磷灰石粉末上的SAP-3-TA的量。结果如图9所示，SAP-3-TA在羟基磷灰石粉末(50mg)上的饱和吸附量为2.06mg(在浓度为2.75mg/mL时达吸附饱和)。
实施例6
本实施例中，测定实施例1制备的SAP-1-TA在羟基磷灰石片上聚集成膜的情况，所述羟基磷灰石片的尺寸为8mm*2mm且含水量低于0.1％。
采用扫描电镜观察SAP-1-TA在羟基磷灰石片片表面的聚集成膜情况。将SAP-1-TA溶解在去离子水中，配制成SAP-1-TA浓度为3.75mg/mL的SAP-1-TA水溶液，用移液枪量取25μL SAP-1-TA水溶液滴加到羟基磷灰石片上，重复4次，自然干燥后用扫描观察SAP-1-TA在羟基磷灰石片表面的聚集成膜情况。结果如图10所示，其中，图(A)～(C)是SAP-1-TA在羟基磷灰石片上聚集成膜后不同放大倍数的扫描电镜照片，由图10可知，SAP-1-TA具有良好的在羟基磷灰石片上聚集成膜的性能。
实施例7
本实施例中，测定实施例3制备的SAP-3-TA在羟基磷灰石片上聚集成膜的情况，所述羟基磷灰石片的尺寸为8mm*2mm且含水量低于0.1％。
采用扫描电镜观察SAP-3-TA在羟基磷灰石片片表面的聚集成膜情况。将SAP-3-TA溶解在去离子水中，配制成SAP-3-TA浓度为4.25mg/mL的SAP-3-TA水溶液，用移液枪量取30μL SAP-3-TA水溶液滴加到羟基磷灰石片上，重复5次，自然干燥后用扫描观察SAP-3-TA在羟基磷灰石片表面的聚集成膜情况。结果如图11所示，图11(A)～(C)是SAP-3-TA在羟基磷灰石片上聚集成膜后不同放大倍数的扫描电镜照片，由图11可知，SAP-3-TA具有在羟基磷灰石片上聚集成膜的性能。
实施例8
本实施例中，测定实施例1制备的SAP-1-TA在牙釉质上的吸附情况，具体使用激光共聚焦显微镜观察荧光标记了的SAP-1-TA在牙釉质表面的吸附情况。
(1)荧光标记
荧光标记物质选择罗丹明B，标记方法为：将罗丹明B溶于10mL二甲基亚砜中，加入与罗丹明B等摩尔的SAP-1-TA、以及与罗丹明B等摩尔的EDC，在避光、25℃搅拌反应72h，即得罗丹明B标记的SAP-1-TA。
(2)酸蚀牙釉质块的制备
①取因正畸拔除的正常前磨牙，肉眼观察大小均匀、色泽相近、无龋坏、无白斑、无隐裂，于30min内除去牙根、牙髓，置于含0.1wt的％麝香草酚的生理盐水溶液中，4℃保存备用。
②用高速硬组织切割机将牙冠切成4×4×2mm大小的牙齿块，切割牙釉质面暴露，其余部分用甲基丙烯酸甲酯树脂包埋，将暴露面用依次用800#、1200#、2400#碳化硅砂纸在流水下磨平、抛光，去除表层约150μm，以消除表面有机污染物和表面的不规则，自然干燥后置于含0.1wt的％麝香草酚的生理盐水溶液中。使用前，在牙釉质块表面开窗约5×5mm大小，然后将树脂包裹的牙釉质块置于去离子水中，用超声波清洗器中处理30min，取出放入37wt％的磷酸中浸泡45s(每颗树脂包埋的牙釉质块用10mL磷酸浸泡)，再将其置于去离子水中，用超声波清洗器中处理5min，将得到的酸蚀牙釉质块保存于去离子水中待用。
(3)用移液枪量取1mL罗丹明B标记的SAP-1-TA溶液滴加在酸蚀牙釉质块上，室温自然干燥24h后用PBS冲洗3遍，干燥后用激光共聚焦显微镜观察酸蚀牙釉质块表面的荧光分布情况，结果如图12所示。图(A)、图(B)分别为经罗丹明B标记的SAP-1-TA处理的酸蚀牙釉质块以及空白酸蚀牙釉质块表面的荧光分布图，由图12可知，经罗丹明B标记的SAP-1-TA处理的酸蚀釉质块表面有明显的红色荧光分布，说明SAP-1-TA在牙釉质表面的吸附性能良好。
实施例9
本实施例中，测定实施例3制备的SAP-3-TA在牙釉质上的吸附情况，具体使用激光共聚焦显微镜观察荧光标记了的SAP-3-TA在牙釉质表面的吸附情况。
(1)荧光标记
荧光标记物质选择罗丹明B，标记方法为：将罗丹明B溶于10mL二甲基亚砜中，加入与罗丹明B等摩尔的SAP-3-TA、以及与罗丹明B等摩尔的EDC，在避光、25℃搅拌反应72h，即得罗丹明B标记的SAP-3-TA。
(2)酸蚀牙釉质块的制备
具体操作与实施例8的步骤(2)相同。
(3)用移液枪量取1mL罗丹明B标记的SAP-3-TA溶液滴加在酸蚀牙釉质块上，室温自然干燥24h后用PBS冲洗3遍，干燥后用激光共聚焦显微镜观察酸蚀牙釉质块表面的荧光分布情况，结果如图13所示。图(A)、图(B)分别为经罗丹明B标记的SAP-3-TA处理的酸蚀牙釉质块以及空白酸蚀牙釉质块表面的荧光分布图，由图13可知，经罗丹明B标记的SAP-3-TA处理的酸蚀釉质块表面有明显的红色荧光分布，说明SAP-3-TA在牙釉质表面的吸附性能良好。
实施例10
本实施例中，考察三价铁离子对实施例1制备的SAP-1-TA对牙釉质再矿化能力的促进作用。
(1)酸蚀牙釉质块的制备
具体操作与实施例8的步骤(2)相同。
(2)①用去离子水将SAP-1-TA配制成浓度为3.75mg/mL的SAP-1-TA水溶液。
②按如下配方配制模拟唾液：CaCl2 0.1665g、KCl 9.685g、NaH2PO40.1224g、NaN3·0.065g、HEPES 4.766g，在37℃溶于用750mL去离子中，用1mol/L的KOH溶液调节pH至7.02，用去离子水定容至1000mL。
(3)配制Fe3+缓冲液
①配制Tris.HCl缓冲液，配方为：50mL 0.1mol/L Tris水溶液、45.7mL 0.1mol/LHCl水溶液用去离子水定容至100mL，用0.1mol/L的NaOH调节pH值至8；
②用Tris.HCl缓冲液将SAP-1-TA配制成SAP-1-TA浓度为6.25mg/mL的SAP-1-TA溶液，用Tris.HCl缓冲液将FeCl3.6H2O配制成Fe3+浓度为3.1mg/mL的Fe3+溶液。
③取300μL上述SAP-1-TA溶液于3mL PP离心管中，再加入86μL上述Fe3+溶液，补加Tris.HCl缓冲液至总溶液体积为500μL，用0.1mol/L的NaOH水溶液调节混合液的pH值至8，即得Fe3+缓冲液。
(4)①空白组：取3块酸蚀牙釉质块，分别用移液枪移取25μL去离子水滴加至酸蚀牙釉质块上，重复4次并干燥，将所得牙釉质块浸泡于5mL模拟唾液中，每天更换一次模拟唾液，3块牙釉质块分别在模拟唾液中浸泡1天、1周和2周。
②对照组：取3块酸蚀牙釉质块，分别用移液枪移取25μL步骤(2)配制的SAP-1-TA水溶液滴加至酸蚀牙釉质块上，重复4次并干燥，将所得牙釉质块浸泡于5mL模拟唾液中，每天更换一次模拟唾液，3块牙釉质块分别在模拟唾液中浸泡1天、1周和2周。
③实验组：取3块酸蚀牙釉质块，分别用移液枪移取25μL步骤(3)配制的Fe3+缓冲液滴加至酸蚀牙釉质块上，重复4次并干燥，将所得牙釉质块浸泡于5mL模拟唾液中，每天更换一次模拟唾液，3块牙釉质块分别在模拟唾液中浸泡1天、1周和2周。
用扫描电镜观察各组酸蚀牙釉质块表面羟基磷灰石的沉积和结晶的情况，结果如图14所示，其中，图(A1)(A2)(A3)、(B1)(B2)(B3)和(C1)(C2)(C3)分别为空白组、对照组和实验组的牙釉质块在模拟唾液中浸泡1天、1周和2周后的SEM图，由图14可知，空白组、对照组和实验组的牙釉质块的表面均有羟基磷灰石的沉积，随着浸泡时间的增加，各组的沉积量都增加，然而，相对于空白组而言，对照组和实验组的牙釉质块表面羟基磷灰石沉积量更多，同时羟基磷灰石沉积的有序性明显优于空白组，相对于空白组和对照组，实验组显示出更快的矿化速度，在相同的时间内形成了明显更致密的羟基磷灰石层，说明Fe3+能促进SAP-1-TA诱导羟基磷灰石在酸蚀牙釉质块表面沉积和结晶的能力。
本实施例说明Fe3+可与本发明所述多肽修饰的单宁酸配合作为牙釉质原位再矿化诱导剂应用。
实施例11
本实施例中，考察实施例3制备的SAP-3-TA对口腔变异链球菌生物膜的抑制作用。
(1)将SAP-3-TA溶解在去离子水中，配制成SAP-3-TA浓度为2.75mg/mL的SAP-3-TA水溶液，用移液枪量取2mL的SAP-3-TA水溶液浸泡羟基磷灰石片1天，得到带SAP-3-TA涂层的在羟基磷灰石片。
(2)以步骤(1)制备的带SAP-3-TA涂层的羟基磷灰石片作为实验组试样，以羟基磷灰石片作为空白组试样，实验组和空白组的操作如下：
实验组：将带SAP-3-TA涂层的羟基磷灰石片置于孔板中，将口腔变异链球菌接种到所述带SAP-3-TA涂层的羟基磷灰石片表面，在厌氧培养箱中培养24h，然后将所述带SAP-3-TA涂层的羟基磷灰石片移到新孔板，用PBS冲洗3次，将浓度为5mg/mL的MTT加入到放有所述带SAP-3-TA涂层的羟基磷灰石片的孔板中，在厌氧培养箱中培养1h，将孔板中的MTT吸尽，加DMSO，放入摇床振摇至所述带SAP-3-TA涂层的羟基磷灰石上的甲瓒完全溶解，吸取所得溶液到96孔板中，用酶标仪在波长600nm下测吸光度值OD600。
空白组：将羟基磷灰石片置于孔板中，将口腔变异链球菌接种到羟基磷灰石片表面，在厌氧培养箱中培养24h，然后将羟基磷灰石片移到新孔板，用PBS冲洗3次，将浓度为5mg/mL的MTT加入到放有羟基磷灰石片的孔板中，在厌氧培养箱中培养1h，将孔板中的MTT吸尽，加DMSO，放入摇床振摇至羟基磷灰石上的甲瓒完全溶解，吸取所得溶液到96孔板中，用酶标仪在波长600nm下测吸光度值OD600。
实验组和空白组的实验结果如图15所示，由图15可知，空白组的吸光度值明显大于实验组，说明SAP-3-TA具有抑菌作用。
(3)以步骤(1)制备的带SAP-3-TA涂层的羟基磷灰石片作为实验组试样，以羟基磷灰石片作为空白组试样，实验组和空白组的操作如下：
分别将口腔变异链球菌接种到带SAP-3-TA涂层的羟基磷灰石片和羟基磷灰石片表面，在厌氧培养箱中培养24h，用戊二醛固定过夜，然后分别依次用体积浓度分别为60％、70％、80％、90％的乙醇脱水10min分钟。用扫描电镜观察，结果如图16所示，其中，图A、B分别为实验组的带SAP-3-TA涂层的羟基磷灰石片和空白组的羟基磷灰石片表面的SEM照片，由图16可知，与空白组相比，带SAP-3-TA涂层的羟基磷灰石片表面粘附的变异链球菌数量明显减少。
(4)以步骤(1)制备的带SAP-3-TA涂层的羟基磷灰石片作为实验组试样，以羟基磷灰石片作为空白组试样，实验组和空白组的操作如下：
分别将口腔变异链球菌接种到带SAP-3-TA涂层的羟基磷灰石片和羟基磷灰石片表面，在厌氧培养箱中培养24h，然后分别将细胞死活染染料滴到经过上述处理的带SAP-3-TA涂层的羟基磷灰石片和羟基磷灰石片上，染色15min，用共聚焦显微镜观察，结果如图17所示。
图17中，图A、B分别为空白组的羟基磷灰石片表面的活菌和死菌被染色后的共聚焦显微镜图，图C、D分别为实验组的带SAP-3-TA涂层的羟基磷灰石片表面的活菌和死菌被染色后的共聚焦显微镜图，将图A与B，C与D比较可知，活菌和死菌的位置基本一致，说明活菌和死菌都会粘附在羟基磷灰石片上，将图A与C、图B与D比较可知，实验组带SAP-3-TA涂层的羟基磷灰石片上比空白组的羟基磷灰石片上粘附的活细菌和死细菌数量都明显减少，说明SAP-3-TA具有良好的抑菌作用是由于其能有效防止细菌粘附，进而阻止粘附的细菌在其上繁殖。本实施例说明本发明所述多肽修饰的单宁酸可作为牙科植入体表面抗菌材料应用。
Claims (6)
1.多肽修饰的单宁酸，其特征在于结构式如式(Ⅰ)、式(Ⅱ)或者式(Ⅲ)所示：
上述结构式中，R1、R2、R3分别为结构式如式(Ⅳ)所示的单宁酸分子中的任意一个R4、任意两个R4、任意三个R4的酯基对位羟基被去掉后形成的基团，式(Ⅳ)中，
2.权利要求1所述多肽修饰的单宁酸的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)丙烯酰基修饰的单宁酸的合成
①配制第一种溶液
将单宁酸溶解于二甲基甲酰胺中形成第一种溶液，第一种溶液中单宁酸的浓度为0.04～0.05g/mL；
②配制第二种溶液
将三乙胺溶解于第一种溶液中形成第二种溶液，所述三乙胺与第一种溶液中单宁酸的摩尔比为(1～3.2):1；
③合成
在氩气保护条件下于-5～5℃将丙烯酰氯加入到第二种溶液中，在室温反应至少24h，然后经透析、冷冻干燥，即得丙烯酰基修饰的单宁酸；所述丙烯酰氯与第二种溶液中单宁酸的摩尔比为(1～3.2):1；
(2)带保护基团的多肽修饰的单宁酸的合成
①配制第三种溶液
以步骤(1)制备的丙烯酰基修饰的单宁酸为溶质，将所述溶质溶解于去离子水中形成第三种溶液，所述去离子水的量以溶质能在去离子水中完全溶解为限；
②配制第四种溶液
以结构式如式(Ⅴ)所示的多肽为溶质，将所述溶质溶解于去离子水中形成第四种溶液，所述去离子水的量以溶质能在去离子水中完全溶解为限，
③合成
将二甲基苯基磷加入第三种溶液中并混合均匀，然后加入第四种溶液并混合均匀，在密封条件下于室温反应至少24h，经透析、冷冻干燥，即得带保护基团的多肽修饰的单宁酸；
所述第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为(1～3.2):1，所述二甲基苯基磷与第四种溶液中的巯基的摩尔比为(0.000001～0.00001):1；
(3)多肽修饰的单宁酸的合成
①配制第五种溶液
将氨水、二氧六环、浓度为2～6mol/L的氢氧化钠水溶液混合均匀得到第五种溶液，第五种溶液中，氨水、二氧六环、氢氧化钠的摩尔比为(15～25):(4～14):(1～6)；
②合成
以步骤(2)制备的带保护基团的多肽修饰的单宁酸为溶质，将所述溶质溶解于第五种溶液中并混合均匀，在密封条件下于室温反应至少24h，然后经透析、冷冻干燥，即得多肽修饰的单宁酸；所述第五种溶液的量以溶质能在第五种溶液中完全溶解为限。
3.权利要求2所述多肽修饰的单宁酸的制备方法，其特征在于制备结构式如式(Ⅰ)所示多肽修饰的单宁酸时，步骤(1)的第二种溶液中三乙胺与第一种溶液中单宁酸的摩尔比为(1～1.2):1，丙烯酰氯与第二种溶液中单宁酸的摩尔比为(1～1.2):1；步骤(2)的第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为(1～1.2):1；
制备结构式如式(Ⅱ)所示多肽修饰的单宁酸时，步骤(1)的第二种溶液中三乙胺与第一种溶液中的单宁酸的摩尔比为(2～2.2):1，丙烯酰氯与第二种溶液中单宁酸的摩尔比为(2～2.2):1；步骤(2)的第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为(2～2.2):1；
制备结构式如式(Ⅲ)所示多肽修饰的单宁酸时，步骤(1)的第二种溶液中三乙胺与第一种溶液中的单宁酸的摩尔比为(3～3.2):1，丙烯酰氯与第二种溶液中单宁酸的摩尔比为(3～3.2):1；步骤(2)的第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为(3～3.2):1。
4.权利要求1所述多肽修饰的单宁酸作为牙釉质原位再矿化诱导剂以及牙科植入体表面抗菌材料的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于将所述多肽修饰的单宁酸配制成水溶液使用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述水溶液中，多肽修饰的单宁酸的浓度为500～5000ppm。
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