CN102172334B - 体外诱导牙本质再矿化的方法 - Google Patents
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Abstract
诱导牙体组织再矿化的方法，步骤为：牙片的制备；诱导牙本质再矿化的矿化体系溶液的配制；牙本质的再矿化。本发明仿生牙体组织在凝胶基质中钙化的微环境，构建扩散钙磷离子的水凝胶体系，体外诱导牙本质的仿生矿化。通过体外在酸蚀的牙本质表面构建琼脂凝胶矿化体系，通过扫描电镜(SEM)，微区傅里叶红外光谱(micro-FTIR)对表面的沉积物进行定性表征。结果显示含磷酸盐的琼脂凝胶-CaCl2溶液矿化体系能在酸蚀的牙本质表面，诱导条带状纳米晶体的沉积生长，沉积的磷灰石晶体呈编织状致密排列。本发明方法简便、耗时少、成本低，可为牙本质的仿生矿化提供有效的技术方法。
Description
技术领域
本发明属于仿生生物材料工程技术领域，具体地说涉及非治疗目的的体外诱导体外牙体硬组织再矿化的方法。
背景技术
目前关于牙本质矿化的研究集中在：树脂粘接混合层（hybrid layer）脱矿牙本质胶原纤维再矿化。树脂牙本质粘结混合层老化后脱矿的胶原纤维很容易被内源性的基质金属蛋白酶（MMP）降解，或增加微渗漏产生继发龋，或使树脂脱出而造成树脂修复的失败。树脂牙本质粘接修复的持久性问题受到了美国国立牙科和颅面研究院2009-2013年战略计划的高度关注。提高牙本质与树脂粘结寿命的潜在方法是用新沉积的磷灰石矿物取代没有被树脂浸润的脱矿的胶原纤维间残留的水分，新形成的磷灰石矿物可使内源性的基质金属蛋白酶固定失活，从而阻止胶原纤维被酶降解。
天然的牙本质胶原纤维由于纤维内和纤维间的磷灰石晶体保护, 所以在体内才保持稳定不被降解，也赋予牙本质较好的机械强度。因此，牙本质再矿化必须实现脱矿的胶原纤维内（intrafibrillar remineralisation）以及胶原纤维之间（interfibrillar remineralisation）的再矿化。Jongryul Kim等，在没有被树脂完全浸润的完全脱矿的牙本质上再沉积出了纤维内和纤维间矿物。但矿化量仍然有限：未见在牙本质内部胶原纤维网矿化的同时引起牙本质表面外生性矿化结构生长的报导；未见有封闭牙本质小管的报导，并且矿化的速率较低。我们希望有一种矿化体系不仅可以引导牙本质纤维网内的矿化，而且可以引导矿物盐在牙本质表面的有序沉积，封闭牙本质小管，保护牙髓－牙本质复合体。
凝胶体系是比本体溶液更接近生物矿化的模拟体系,以凝胶作为介质,在体外模拟生物矿化过程越来越受到关注。多数凝胶体系侧重于体外模拟釉质矿化，很少有利用凝胶体系再矿化牙本质的报道。牙本质与釉质的显著区别:一是它含有比釉质多很多的有机质，约占总重量的20%，主要是Ⅰ型胶原，而成熟的釉质有机质则不到1%；二是牙本质具有特殊的牙本质小管结构，与牙髓的关系很密切。
Yuwei Fan等，把酸蚀的牙齿横断磨片浸泡在仿生矿化溶液中16h后，釉质表面形成了一层约50um厚多孔片状结构的磷酸钙涂层，而牙本质表面则没有形成涂层，只在管间牙本质表面上有少许孤立片状结构聚集而成的簇状结构，可能是牙本质富含胶原纤维的抑制特性所致。可见牙本质在钙磷过饱和溶液中很难沉积磷灰石晶体。
发明内容
技术问题：本发明旨在提供一种诱导体外牙本质再矿化的矿化体系构建方法，通过含磷酸盐的琼脂凝胶——CaCl2溶液的矿化体系，在经酸蚀脱矿的牙本质表面沉积出了一层呈编织状的致密磷灰石晶体，增加矿化循环，能最终封闭牙本质小管，保护牙本质-牙髓复合体，为牙本质的矿化提供了新的离子输送体系。
技术方案：非治疗目的的体外诱导牙体组织再矿化的方法，步骤为：牙片的制备：将收集到的牙齿用慢速切割机垂直于牙齿纵轴切成薄片，去除牙齿薄片外围的釉质后再打磨平整光滑，用磷酸酸蚀牙片后，用水冲洗，得到一定厚度的完全脱矿的牙本质层；诱导牙本质再矿化的矿化体系溶液的配制：配制两组质量百分比浓度为0. 5%的琼脂凝胶，其中一组为空白凝胶；另一组琼脂凝胶内添加有磷酸盐，加热溶解后将凝胶的pH值调解为7.2；配制0.13mol/L CaCl2溶液，pH=5～6；牙本质的再矿化：将酸蚀好的牙齿薄片平放在用空白琼脂垫平的离心管内，先在牙片上面覆盖含磷酸盐的琼脂凝胶，等凝胶冷却凝固后再在其上覆盖空白琼脂凝胶，待凝胶冷却凝固后，向离心管中滴加CaCl2溶液，置于37℃恒温箱，24h更换CaCl2溶液，48h更换琼脂凝胶，循环矿化2～7次。
所述含有磷酸盐的琼脂凝胶中，磷酸盐为Na2HPO4，浓度为0.26mol/L。
所述加热溶解后调整pH值的试剂为0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH 溶液。
所述覆盖含磷酸盐的琼脂凝胶的厚度为2mm。
所述覆盖空白琼脂凝胶的厚度为2mm。
所述CaCl2溶液的滴加量为10mL。
有益效果：本发明仿生牙体组织在凝胶基质中钙化的微环境，构建扩散钙磷离子的水凝胶体系，体外诱导牙本质的仿生矿化。通过体外在酸蚀的牙本质表面构建琼脂凝胶矿化体系，通过扫描电镜（SEM），微区傅里叶红外光谱（micro-FTIR）对表面的沉积物进行定性表征。结果显示含磷酸盐的琼脂凝胶-CaCl2溶液矿化体系能在酸蚀的牙本质表面，诱导条带状纳米晶体的沉积生长，沉积的磷灰石晶体呈编织状致密排列。本发明方法简便、耗时少、成本低，可为牙本质的仿生矿化提供有效的技术方法。
附图说明
图1为对照（a,b）为酸蚀的牙本质；（c，d）酸蚀牙本质浸泡在SBF（模拟体液）中2个循环后表面沉积了少量的无定型矿物，分布不均匀；（e，f）酸蚀牙本质浸泡在SBF中5.5个循环，无定型矿物沉积的范围有所扩大，分布亦不均匀；
图2为酸蚀的牙本质在含磷酸盐的琼脂凝胶——CaCl2溶液矿化体系中矿化的SEM图。两个循环后（a、b）在牙本质表面沉积出了长宽径比例较大的条带状晶体，较致密， 呈编织状排列，呈现矿化分布的不均性，有些部位沉积较多，完全将牙本质小管覆盖；有些部位沉积较少，晶体围绕牙本质小管层层沉积。5.5个循环后（c、d、e、f、g、h），这种现象更加明显；
图3为 ATR-FTIR图谱，酸蚀的牙本质在SBF及琼脂凝胶矿化体系矿化的红外图谱，a酸蚀后的牙本质；b浸泡在SBF中5.5个循环；c在凝胶矿化体系中5.5个循环。
具体实施方式
本发明技术方案只针对离开生物活体组织的牙齿进行处理，该方法用于非治疗目的。
实施例1
1.1牙片的制备
将收集到的第三磨牙（牙冠完整且无龋坏无充填）用低速切割机垂直于牙齿的纵轴将牙齿切成厚约1mm左右的薄片，切割过程中用大量水冷却。切好的横断牙片去除外围的釉质后再用磨料极细的金刚砂纸将牙齿薄片的处理面在流水下打磨平整光滑。用质量浓度20%的磷酸酸蚀牙片的处理面60秒后，用足够的去离子水冲洗，得到一层约5μm厚完全脱矿（纤维间和纤维内的磷灰石晶体被溶解，只剩下脱矿后的Ⅰ型胶原纤维）的牙本质层。
1.2琼脂及溶液的配制
配制两组质量百分比浓度为0. 5%的100mL琼脂凝胶，其中一组为空白凝胶，不含有矿物盐离子；一组为含有磷酸盐的琼脂凝胶（[Na2HPO4]=0.26mol/L），加热溶解后用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液将凝胶的pH值调解为7.2。
配制0.13mol/L CaCl2溶液，pH=5.5；模拟体液SBF（依次将NaCl 7.996 g 、 NaHCO3 0.350 g 、KCl 0.224 g 、K2HPO4・3H2O 0.228 g 、MgCl2・6H2O 0.305 g 、10mol/LHCl 4mL 、CaCl2 0.278 g、 Na2SO4 0.071 g、 (CH2OH)3CNH26.057 g溶于1000mL去离子水中，将10mol/L的HCl逐滴加入，使PH值降到7.0-7.4，温度降至室温）。
1.3牙本质的再矿化
含磷酸盐的凝胶矿化组：将酸蚀好的牙片平放在用空白琼脂垫平的15mL离心管内，先在牙片上面覆盖2mm厚的含磷酸盐的琼脂凝胶，等凝胶冷却凝固后再在其上覆盖2mm厚的空白琼脂水凝胶，待凝胶冷却凝固后，滴加10mL的CaCl2溶液，置于37℃恒温箱。24h更换CaCl2溶液，48h更换琼脂凝胶，定义为一个矿化循环。
SBF组：将酸蚀好的牙片平放在用空白琼脂垫平的15mL离心管内，滴加10mL的SBF溶液，置于37℃恒温箱中。24h更换SBF液，48h定义为一个矿化循环。
本发明的含磷酸盐琼脂凝胶——CaCL2溶液的矿化体系可以引导牙本质纤维网内的矿化，而且可以引导矿物盐在牙本质表面的有序沉积，封闭牙本质小管，保护牙髓－牙本质复合体这将为牙本质的再矿化研究提供实验基础。
实施例2
诱导牙体组织再矿化的方法，步骤为：牙片的制备：将收集到的牙齿用慢速切割机垂直于牙齿纵轴切成薄片，去除牙齿薄片外围的釉质后再打磨平整光滑，用磷酸酸蚀牙片后，用水冲洗，得到一定厚度的完全脱矿的牙本质层；诱导牙本质再矿化的矿化体系溶液的配制：配制两组质量百分比浓度为0. 5%的琼脂凝胶，其中一组为空白凝胶；另一组琼脂凝胶内添加有磷酸盐，加热溶解后将凝胶的pH值调解为7.2；配制0.13mol/L CaCl2溶液，pH=5～6；牙本质的再矿化：将酸蚀好的牙齿薄片平放在用空白琼脂垫平的离心管内，先在牙片上面覆盖含磷酸盐的琼脂凝胶，等凝胶冷却凝固后再在其上覆盖空白琼脂凝胶，待凝胶冷却凝固后，向离心管中滴加CaCl2溶液，置于37℃恒温箱，24h更换CaCl2溶液，48h更换琼脂凝胶，循环矿化2～7次。所述含有磷酸盐的琼脂凝胶中，磷酸盐为Na2HPO4，浓度为0.26mol/L；所述加热溶解后调整pH值的试剂为0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH 溶液；所述覆盖含磷酸盐的琼脂凝胶的厚度为2mm；所述覆盖空白琼脂凝胶的厚度为2mm；所述CaCl2溶液的滴加量为10mL。
Claims (6)
1.非治疗目的的体外诱导牙体组织再矿化的方法，其特征在于步骤为：
a.牙片的制备：将收集到的牙齿用慢速切割机垂直于牙齿纵轴切成薄片，去除牙齿薄片外围的釉质后再打磨平整光滑，用磷酸酸蚀牙片后，用水冲洗，得到一定厚度的完全脱矿的牙本质层；
b.诱导牙本质再矿化的矿化体系溶液的配制：配制两组质量百分比浓度为0. 5%的琼脂凝胶，其中一组为空白凝胶；另一组琼脂凝胶内添加有磷酸盐，加热溶解后将凝胶的pH值调解为7.2；配制0.13mol/LCaCl2溶液，pH=5～6；
c.牙本质的再矿化：将酸蚀好的牙齿薄片平放在用空白琼脂垫平的离心管内，先在牙片上面覆盖含磷酸盐的琼脂凝胶，等凝胶冷却凝固后再在其上覆盖空白琼脂凝胶，待凝胶冷却凝固后，向离心管中滴加CaCl2溶液，置于37℃恒温箱，24h更换CaCl2溶液，48h更换琼脂凝胶，循环矿化2～7次。
2.根据权利要求1所述非治疗目的的体外诱导牙体组织再矿化的方法，其特征在于所述含有磷酸盐的琼脂凝胶中，磷酸盐为Na2HPO4，浓度为0.26mol/L。
3.根据权利要求1所述非治疗目的的体外诱导牙体组织再矿化的方法，其特征在于所述加热溶解后调整pH值的试剂为0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH 溶液。
4.根据权利要求1所述非治疗目的的体外诱导牙体组织再矿化的方法，其特征在于所述覆盖含磷酸盐的琼脂凝胶的厚度为2mm。
5.根据权利要求1所述非治疗目的的体外诱导牙体组织再矿化的方法，其特征在于所述覆盖空白琼脂凝胶的厚度为2mm。
6.根据权利要求1所述非治疗目的的体外诱导牙体组织再矿化的方法，其特征在于所述CaCl2溶液的滴加量为10mL。
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