CN107811872B - 一种快速牙釉质矿化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速牙釉质矿化的方法。它包括如下步骤：1)将钙溶液与螯合剂混合，然后再与磷酸根溶液混合、调节pH值，得到混合溶液；2)将所述混合溶液与氟溶液混合，得到矿化液，所述矿化液中析出沉淀；3)将牙齿的处理面朝上放置于所述矿化液中，并让所述矿化液没过所述牙齿；4)采用激光对所述牙齿的处理面处理，即可使所述牙齿的处理面牙釉质快速矿化。本发明采用激光进行局部加热，结合螯合剂抑制晶体的生长，能使牙釉质快速矿化。

Description

一种快速牙釉质矿化的方法

技术领域

本发明涉及一种快速牙釉质矿化的方法，属于组织工程再生领域。

背景技术

牙釉质是牙齿最外层的组织，同时也是人体内最坚硬的组织。然而同其他钙化组织不同，牙釉质没有细胞成分，因此一旦出现损伤，便无法再生。而受损的牙釉质除了会对人咀嚼食物产生影响外，更有可能使得牙髓神经暴露在外部环境的刺激下，引发各类疼痛，或者发生细菌感染。因此如何在体修复受损牙釉质成为目前研究的重点。

目前关于在体修复牙釉质的文献非常少，大多都需要将钙离子和磷酸根离子按照一定的比例混合并形成凝胶，在其中添加适宜的添加剂之后使整个凝胶附着在牙齿表面，让其自然矿化。然而这一方法的弊端在于所花费的时间非常之长。通常需要1-2天的时间才能形成不到3微米厚度的晶体层，而且晶体取向不一致，矿化层的强度也没有保障。在3天以上才能形成排布整齐致密，晶柱表现出类似于牙釉质中的六棱柱式的羟基磷灰石晶体。毋庸置疑，这非常不利于临床上的使用。此外有一些实验方法可以短时间内在釉质表面进行矿化，但是其反应条件涉及超过100度的高温或者高压，溶液的性质也可能会对牙龈等产生影响。

晶体生长抑制剂通常由带有羧基或磷酸根的有机分子构成，可以与钙离子和钙磷灰石纳米晶簇结合，抑制晶体生长，减缓晶体成核速率。这种抑制剂可以有效地调控溶液中钙磷灰石生长的速度，提升溶液矿化效果。已成功使用HEDTA、EDTA等小分子生长抑制剂在生理环境下对牙釉质基底进行矿化，在几天的时间内可以生长5-10微米的结构有序的羟基磷灰石矿化层。这种矿化层强度和牙釉质强度相同，且不易脱落，对弱酸弱碱的腐蚀具有较好的保护作用。然而这种方法仍然不能直接用于牙釉质矿化，反应时间过长大大的限制了这种方法的使用。

激光作为牙科手术的重要手段之一，已经被广泛应用于临床软组织手术中，比如激光去除牙龈增生，激光切除软组织，激光辅助根管清除等。但是在硬组织处，由于激光具有较高的穿透特性，容易对牙髓腔加热，并导致牙髓神经细胞凋亡，因此在硬组织手术上使用较少。目前最常用的相关手术除了利用水激光进行牙体切除外，就是激光美白手术，利用激光对过氧化氢或其他试剂进行光化学作用，释放自由基，并使其对牙齿表面色素进行反应。如何将激光应用到其他硬组织手术中一直是想解决而未能解决的难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速牙釉质矿化的方法，本发明采用激光进行局部加热，结合螯合剂抑制晶体的生长，能使牙釉质快速矿化。

本发明提供的快速牙釉质矿化的方法，包括如下步骤：1)将钙溶液与螯合剂混合，然后再与磷酸根溶液混合、调节pH值，得到混合溶液；

2)将所述混合溶液与氟溶液混合，得到矿化液，所述矿化液中析出沉淀；

3)将牙齿的处理面朝上放置于所述矿化液中，并让所述矿化液没过所述牙齿；

4)采用激光对所述牙齿的处理面处理，即能使所述牙齿的处理面牙釉质快速矿化。

本发明中，所述牙齿具体是离体的牙齿。

上述的方法中，在所述矿化液中，所述钙溶液、所述磷酸根溶液和所述氟溶液中钙元素、磷元素和氟元素的摩尔比为5:3:1～5；

所述钙溶液包括氯化钙溶液或硝酸钙溶液；

所述磷酸根溶液包括磷酸一氢钠溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸一氢钾溶液或磷酸二氢钾溶液；

所述氟溶液包括氟化钠溶液或氟化钾溶液等。

上述的方法中，所述钙溶液中钙元素与所述螯合剂的摩尔比为1：1.1～1.2；

所述螯合剂包括HEDTA、EDTA、柠檬酸、谷氨酸、天冬氨酸和钙调蛋白中某些特定的片段中的至少一种；所述钙调蛋白中某些特定的片段包括DKDGDGTITTKE或DIDGDGQVNYEE；

所述pH值为6.0；

本发明中，钙溶液与所述螯合剂混合后再与磷酸根溶液混合，调节pH值，使混合的溶液成为澄清无沉淀的状态。

本发明中，由于采用HEDTA晶体抑制剂大幅减缓了晶体成核速率，因此降低了体系中均相成核的速率，为在釉质表面进行的异相成核提供了大量的钙磷离子簇和磷酸钙的前驱体--无定型磷酸钙。

上述的方法中，步骤1)中还包括将所述钙溶液与所述HEDTA混合后调节溶液的PH值至3.0～6.0的步骤；调节PH值为了加快所述HEDTA在所述钙溶液中的溶解速度。

上述的方法中，步骤3)中还包括将所述牙齿的处理面涂抹石墨涂层的步骤。

上述的方法中，所述牙齿的处理面与所述矿化液的液面之差可为5～10mm；具体可为10mm。

上述的方法中，所述激光采用980nm半导体激光；

所述激光的功率可为1～5W，具体可为2W；

采用所述激光单次处理时间在5min以内，具体可为3min，处理次数可为1～10次，具体可为1、3、5、9或1～9次。

本发明中，所述牙齿的处里面上涂抹所述石墨涂层为了提高牙齿对半导体激光的吸收率。

上述的方法中，步骤4)中对所述牙齿的处理面处理后还包括将所述牙齿用水清洗和干燥的步骤。

本发明具有以下优点：

本发明将激光引入牙科表面快速矿化的临床操作中，通过激光具备的快速局部加热的特点，结合了晶体生长抑制剂，实现生理环境下快速牙釉质矿化。由于采用HEDTA晶体抑制剂大幅减缓了晶体成核速率，因此降低了体系中均相成核的速率，为在釉质表面进行的异相成核提供了无定型磷酸钙。当激光对其进行加热的时候，温度的提高大幅提高了在界面的反应速率，从而加快了界面成核。本发明能在几分钟内实现微米级的晶体生长速率，大大提升了应用到临床的可行性。

附图说明

图1为牙齿表面矿化的氟羟基磷灰石晶体纳米压痕力-距离加载曲线。

图2为涂抹水性笔的釉质与矿化层的对比，其中图2(a)为水性笔侧和矿化层的正面对照，图2(b)为水性笔侧和矿化层的截面对比。

图3为不同浓度的矿化液分别被激光处理1次之后釉质表面的晶体生长情况；其中图3(a)使用的是常用的人工唾液；图3(b)为钙溶液浓度为0.1M；图3(c)为钙溶液浓度为0.2M；图3(a)为钙溶液浓度为0.3M。

图4为使用钙溶液浓度为0.2M的矿化液处理5次和9次之后的断面SEM图；其中图4(a)为处理5次的SEM图；图4(b)为处理9次的SEM图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，牙齿从北京大学校医院颌面外科处获取，已获得大夫和患者的同意；

人工唾液为如下浓度(最终溶液混合溶液中各组分的浓度)的试剂配置而成：50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，1.14mmol/L CaCl₂，0.59mmol/L KH₂PO₄，30mmol/LKCl，用KOH和HCl调节pH到7.00。

实施例1、一种在生理条件下快速牙釉质矿化的方法

1、试剂的准备：按最终矿化液中的Ca:P:F(即钙元素：磷元素：氟元素)的摩尔比为5:3:1分别配备相应浓度的氯化钙、磷酸二氢钠和氟化钠的反应溶液，搅拌至完全溶解。

在最终矿化液里钙离子的浓度设为0.1M、0.2M和0.3M三个组，配置的三组矿化液分别标记为1、2、3。

2、在已配好的氯化钙溶液中按照Ca:HEDTA＝1:1.1～1.2的摩尔比例，将HEDTA溶解在氯化钙溶液中。为加快溶解速度，在溶解过程中将PH值调至3.0-6.0之间。将已配好的氯化钙溶液与螯合剂组和磷酸二氢钠溶液混合在一起，并用氢氧化钠调解PH值至6.0，得到混合溶液，此时混合溶液应为澄清无沉淀的状态以备使用。

3、将未经过任何处理的牙齿利用硬组织切片机切成规整的长方体形状。在处理面用石墨棒轻轻刮擦，以便在牙齿切片(称为样品)上涂抹一层浅浅的石墨涂层，以便提高牙齿切片对于半导体激光的吸收率。

4、将2中的混合溶液与配好的氟化钠溶液混合在一起，得到矿化液，矿化液中会缓慢析出沉淀。此时将矿化液倒入烧杯中，并将样品正置于烧杯中(处理面朝上)使液面没过样品，确保液面和处理面之间的液体高度为10mm。

5、利用980nm半导体激光对牙齿的处理面进行处理。根据不同的激光器，预先调整光纤与样品的间距，使得样品尽量落在激光的焦点附近。激光的功率在2W左右，单次处理时间为3min。矿化液1、2和3中样品各自分别处理1、3、5次。

6、处理结束后取出牙齿，用流水反复清洗后烘干，即使牙齿的处理面牙釉质得到快速矿化。

性能测试：

1、矿化层硬度及弹性模量对比

力学测试使用TriboIndenter原位纳米力学测试系统(Hysitron公司，美国)上进行。选用50nm的Berkovich(三棱锥，金刚石)压头，以1000μN为最大载荷，进行载荷控制下的原位成像纳米压痕准静态测试。每个样品压3个点，所得结果用统计学方法进行计算。

为检验晶体本身的力学性能，将其与未经过处理的牙釉质做比较，进行纳米压痕实验。选取经过10％的过氧化氢溶液脱矿一个月的牙齿，切成两块后按本发明实施例1中步骤3中描述的方式对样品进行处理。其中一块样品作为空白组，流水清洗后烘干保存，而另一块作为激光处理组，样品激光处理5次，处理后流水清洗并烘干保存。随后两组样品用纳米压痕检测表面硬度和弹性模量的变化。图1所示为在1000μN载荷控制下的再生晶体表面进行纳米压痕的加载-卸载曲线。通过记录探头接触到材料表面之后向下制造压痕的过程中，压痕深度和所需力之间的关系，计算得到材料的弹性模量和硬度等相关力学性质。两组样品的弹性模量和硬度测试对比如表1所示。

表1激光处理晶体后的力学性质变化

经过过氧化氢溶液的长时间脱矿后，牙齿表面的弹性模量大幅降低，远小于通常牙釉质的模量(～90GPa)。在经过15min(5次)的激光处理后，表面的弹性模量回升到61GPa，已逐渐接近天然牙釉质的模量。但是硬度上则仍旧低于天然釉质，这与短时间内形成的晶体层结晶度尚不高有关。

2、矿化层的扫描电镜观察以及断面观测

为证明所生长的晶体层并不是釉质基底本身带有的，而是经过矿化得到的，选取一个经过本发明实施例1中步骤3处理过的牙釉质样品，一半用蓝色水性笔涂抹(蓝色水性笔具有明显的生长抑制效果，在矿化的时候完全不受影响。)，另一半只涂抹石墨，之后按本发明实施例1中步骤4-6处理样品。然后将牙齿沿垂直处理面的方向，从下往上慢慢用硬组织切片机垂直切开。在临近处理面时，用钳子沿裂缝将牙齿掰断，避免切片机对处理面的断面的磨损影响。用流水清洗断面，烘干后以待扫描电镜检测。其中激光处理样品时共处理3次，只处理石墨涂抹区域，从而用来对比处理与未处理的区别。处理结束后流水清洗并烘干保存，以便扫描电镜表征，表面扫描结果如图2所示，涂抹蓝色水性笔部分结果显示光滑平整，没有晶体生长。相比之下，本发明涂抹石墨之后的一部分则长满了致密晶体，晶体层厚度在500nm～1μm左右。

为比较不同浓度的矿化液对最终晶体生长的情况，试用了0.1M、0.2M、0.3M三组矿化液，按照本发明实施例中方法进行处理，分别在步骤5中矿化液处理1次3min。处理之后进行清洗并用SEM观察，结果如图3所示。本发明为与传统再矿化方法对照，对照组选用了人工唾液，将牙齿浸泡在其中3min。由图3可以看到本发明随着浓度提高，基底表面覆盖的晶体越来越多且越来越致密。随着浓度提高，单个晶体的尺寸也在逐渐变大。与本发明(实验组)相比，在相同的浸泡时间内，对照组浸泡在人工唾液中时间过短，表面几乎没有变化，仍与空白牙的表面相同，但本发明会形成致密的浸提覆盖，即能快速的矿化。

与上述1～6步骤相同，但在步骤5中矿化液只处理5次(15min)时，晶体的厚度只有1.5μm左右，但是当次数增加到9次(27min)时，晶体厚度接近4μm。结果如图4所示，随着反应次数的增加，矿化层的晶体厚度也显著增加。将不同浓度和不同处理次数下得到的矿化层厚度分别统计如表2所示。该实验表明，本发明中晶体生长的方法可以随着时间变长晶体逐渐长大，并且晶体生长的速度不会随着尺寸变大而减慢。传统方法进行晶体生长时，当晶体在釉质表面生长到一定高度后，就会缓慢生长，平均最快也只有2μm/天。本方法由于将成核和生长同时进行，因此不会受到晶体生长速率的限制。

表2不同浓度和反应次数对晶体生长高度的影响

Claims (6)

1.一种快速牙釉质矿化的方法，包括如下步骤：1)将钙溶液与螯合剂混合，然后再与磷酸根溶液混合、调节pH值，得到混合溶液；

所述螯合剂为HEDTA、EDTA、柠檬酸、谷氨酸和天冬氨酸中的至少一种；

2)将所述混合溶液与氟溶液混合，得到矿化液，所述矿化液中析出沉淀；

在所述矿化液中，所述钙溶液、所述磷酸根溶液和所述氟溶液中钙元素、磷元素和氟元素的摩尔比为5:3:1～5；

所述钙溶液为氯化钙溶液或硝酸钙溶液；

所述磷酸根溶液为磷酸一氢钠溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸一氢钾溶液或磷酸二氢钾溶液；

所述氟溶液为氟化钠溶液或氟化钾溶液；

3)将牙齿的处理面朝上放置于所述矿化液中，并让所述矿化液没过所述牙齿；

步骤3)中还包括将所述牙齿的处理面涂抹石墨涂层的步骤；

4)采用激光对所述牙齿的处理面处理，即能使所述牙齿的处理面牙釉质快速矿化；

所述激光采用980nm半导体激光；

所述激光的功率为1～5W。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述钙溶液中钙元素与所述螯合剂的摩尔比为1：1.1～1.2；

所述pH值为6.0。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)中还包括将所述钙溶液与所述HEDTA混合后调节溶液的PH值至3.0～6.0的步骤。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述牙齿的处理面与所述矿化液的液面之差为5～10mm。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：采用所述激光单次处理时间在5min以内，处理次数为1～10次。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤4)中对所述牙齿的处理面处理后还包括将所述牙齿用水清洗和干燥的步骤。

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