CN104000736A - 一种牙科修复材料及其酸性氨基酸诱导脱矿牙釉质体外釉柱原位再生的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种牙科修复材料及其酸性氨基酸诱导脱矿牙釉质体外釉柱原位再生的方法，属于牙釉质体外原位再生技术领域。本发明首先在牙釉质表面进行表面钙活化，即接枝钙离子，然后逐步形成碳酸钙稳定钙离子，最后以此为基础模板，合成羟基磷灰石晶体。全过程均有氨基酸参与，两步法中添加的氨基酸浓度前后一致。此种方法在脱矿牙釉质表面沉积的羟基磷灰石晶体排列有序，紧密，晶体形貌均一，能看到人工层明显的延续生长趋势。降低了提取蛋白的成本和应用环境苛刻的限制，具有广泛前景。由该方法制备的材料可应用于牙齿美容，填补脱矿空隙，也可用于早期牙釉质脱矿的修复，亦可作为垫底盖髓窝沟封闭等组合材料。

Description

一种牙科修复材料及其酸性氨基酸诱导脱矿牙釉质体外釉柱原位再生的制备方法

技术领域

本发明属于牙釉质体外原位再生技术领域，具体涉及一种牙科修复材料及其酸性氨基酸诱导脱矿牙釉质体外釉柱原位再生的方法，由该方法制备的材料可应用于牙齿美容，填补脱矿空隙，也可用于早期牙釉质脱矿的修复，亦可作为垫底盖髓窝沟封闭等组合材料。

背景技术

龋齿是牙釉质缺损的首要原因，也是人类最普遍的口腔疾病，早期未成洞釉质龋的发病率明显高于已形成龋洞的发病率，且成熟釉质受损时没有细胞可以对其进行修复，因此龋病的早期是施行防治的有效阶段，借助外界条件诱导产生羟磷灰石来填满牙体脱矿组织之间的空隙，产生非手术的逆转。

釉质基本结构是釉柱，每个釉柱内含数十万沿c轴生长的羟基磷灰石微晶，是釉质具有耐磨性，保证釉质硬度的关键因素。这种高度有序的结构决定了釉质具有超凡的力学性质和抗磨损能力。同时，由于釉质基本上是无机生物矿物，通过单纯的化学的而非细胞的方法来修复或再生釉质是可能的。

仿生矿化是指在一定条件下，在有机基质(例如胶原蛋白、牙本质涎磷蛋白、骨形态蛋白等物质)影响下，材料经历成核、长大等过程，并接受生物的化学、空间和结构控制，最终形成结构高度有序的生物矿物的过程。例如牙釉质中的釉原蛋白，被证实可以促进牙釉质表面再矿化。但是这些有机大分子，分子结构复杂，具体应用时环境条件要求苛刻，同时蛋白的生产提纯费用昂贵。因此找出能够与无机物晶体特异性结合并能调控其矿化过程的小分子具有相当的应用前景。牙体自然生长矿化的有机基质除胶原蛋白外多为牙釉基质蛋白和牙本质涎磷蛋白等，多为酸性蛋白，富含有高比例的天门冬氨酸和谷氨酸。牙釉基质蛋白随牙体的成熟含量逐渐减少，在成熟釉质中几乎消失。磷蛋白(DPP)，约占牙本质非胶原蛋白的50％，含量仅次于胶原蛋白；牙本质涎磷蛋白(DSPP)属于牙本质特异性蛋白之一，含量次于牙本质磷蛋白，其C端与DPP一致，为酸性蛋白，均对羟基磷灰石晶体的形成和生长可谓一个强大的启动器和稳压器。并且在人体中作用蛋白多降解为小分子，蛋白质的基本单位是氨基酸，对矿化相关主要蛋白进行序列分析后发现，主要的氨基酸多为天门冬氨酸和磷酸化的丝氨酸。

当前公开的有关牙体组织再矿化实验方法的专利为数不多，而具有利用酸性氨基酸(天门冬氨酸和谷氨酸)作软模板，碳酸钙为活化层，诱导脱矿牙釉质表面原位再矿化的文章更是少见。简要介绍几种与本发明密切相关的技术方法。

1.CN101444454A发明公开了一种制备牙科修复材料的方法，方法是将脱矿牙釉质置于(HEDTA:N-β-羟基乙基乙二胺三乙酸)HEDTA-Ca-P溶液中加入氟离子，得到覆盖有修复材料的牙釉质。发明的制备方法条件温、过程简单、原料便宜。但考虑到HEDTA对人体有害，实际应用需要在一个隔离的装置中进行，避免HEDTA与口腔直接接触，以降低对人体的危害。所以该项目组正在考虑用一种肽来代替HEDTA，以最大程度地减少毒性。现在仍未见明确的替代品，在应用上遇到了困难。

2.CN1192673A公开了一种牙齿一元再矿化的组合物及其方法，可被水稀释成用于牙齿损害再矿化的含水产品。采用牙膏和凝胶的形式，以互不反应的水溶性钙盐、磷酸盐和氟化物释放剂为原料。但是由于此材料在口腔内稀释量大，漱掉大量的药液，很难短时间内在牙体表面形成一层矿化层，造成牙体再矿化时间较长。

3.CN101410022B公开了一种涉及含有钙的磷酸盐和在口腔中具有不同溶解度的酸的组合的口腔用口香糖组合物。在口腔中被消耗或咀嚼时最初60秒具有大于约3小于6的唾液pH值，几乎全部过程具有酸性pH值，促进唾液的流出。但口香糖并不适于口腔中已做树脂充填或是修复的牙齿，由于口香糖在咀嚼过程中有一定的粘合力，容易粘掉充填物；同时，专利中组合物在糖果或是糖制品的应用中也涉及到龋易感人群和控制糖量人群限制，应用范围有限。

4.CN1714864A公开了纳米级多肽防龋齿材料及制造方法以及含有该材料的牙膏。其由羟基磷灰石微晶(HAP)与酪蛋白磷酸肽(CPP)进行交联复合制得。两者协同作用，应用于牙膏中，促进牙齿再矿化。酪蛋白磷酸多肽已知广泛应用于口腔再矿化中，CPP可以明显的促进牙釉质表面HAP沉积，但电镜下显示牙釉质表面多为不规则的矿化物沉积，填补釉质柱间质的膜矿病损以及釉质表面局限性的小凹陷。形成的是一种膜状“涂层”，与自然牙釉质物理化学性质仍有较大的区别。

5.CN200980104481和CN200980104884分别公开了一种包含碱性氨基酸和钙盐的饮料和包含碱性氨基酸肽和蛋白酶的组合物和方法。利用精氨酸及其碱性氨基酸来产生氨，由此提高环境pH值，精氨酸和其他碱性氨基酸能被某些类型的细菌如血链球菌(S.sanguis)代谢，这些类型的细菌不会造成龋齿，且能与龋齿细菌如变形链球菌(S.mutans)在牙齿上和口腔中竞争位置，长时间规律的使用，可以有效地使得牙齿不敏感，来抵抗生龋细菌和它们的有害效应。但是，碱性氨基酸可提高pH和促进钙离子的解离，而钙离子可与氟离子反应形成不溶性沉淀物，而且精氨酸对牙体组织的亲和力较差，此外，较高的pH具有造成刺激的潜在可能。

6.CN102286073B公开了一种与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽序列及其应用。其氨基酸序列为：Asn-Asn-His-Tyr-Leu-Pro-Arg。对牙釉质表面再矿化具有促进作用，可用于龋坏牙体再矿化修复。形成了一层致密的矿物沉积，但其中应用了噬菌体表面展示技术，筛选出能与釉质表面轴向特异性结合的多肽，过程费用较高，用时较长，不宜筛选。给广泛应用带来了不便。

7.CN103408653A发明公开了一种仿生防龋多肽及其制备方法和用途，该多肽分子量较小，可提高在牙釉质表面的吸附，进而更好地发挥其作用，促进早期脱矿牙釉质(早期龋)的再矿化，该专利提供了一种多肽的合成方法，但实验中选用的标本为牛牙，应用人体牙釉质仍有待商议。

虽然蛋白质等有机质(尤其是釉基质蛋白)对牙釉质表面再矿化最接近自然牙体矿化过程，但是由于蛋白质提取较为困难，成本较高，分子结构复杂，具体应用时环境条件要求苛刻。因此找出能够与无机物晶体特异性结合并能调控其矿化过程的小分子具有相当的应用前景。蛋白质在人体内多降解成为小分子结构，其主要的基本单位是氨基酸。而目前以独立的、对钙离子有很强吸附作用的氨基酸作用于脱矿牙釉质表面再矿化的专利研究虽有少数报道，但使牙釉质表面类釉质样矿物沉积再生的方法仍少见，而能在合适的温度，时间和合适的氨基酸浓度、种类条件下合成沿自然牙釉质釉柱原生长方向继续延续生长的案例尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种牙科修复材料及其酸性氨基酸作为有机软模板诱导脱矿牙釉质体外再生的制备方法。本发明充分结合了碳酸钙活化衔接层和氨基酸强亲和力的优良特性，从而实现脱矿牙釉质的体外再生。

本发明首先在牙釉质表面进行表面钙活化，即接枝钙离子，然后逐步形成碳酸钙稳定钙离子，最后以此为基础模板，合成羟基磷灰石晶体，全过程均有氨基酸参与。此种方法在脱矿牙釉质表面沉积的羟基磷灰石晶体排列有序，紧密，晶体形貌均一，能看到人工层明显的延续生长趋势。本发明所述方法降低了提取蛋白的成本和应用环境苛刻的限制，具有广泛前景。

本发明所述一种牙科修复材料的酸性氨基酸诱导脱矿牙釉质体外釉柱原位再生制备方法，其步骤如下：

(1)牙釉质片的处理

将去净软垢、牙石和软组织的牙釉质切割成牙釉质片，依次用360目～2000目的磨砂纸打磨抛光，然后将牙釉质片浸入到无水乙醇中(75wt％)，超声清洗10～20min；再用去离子水反复冲洗牙釉质片，之后将牙釉质片浸入到去离子水，超声清洗10～20min；最后将牙釉质片浸入到质量分数为35～37％的磷酸溶液中浸泡40～60s，再用去离子水反复冲洗后自然干燥；

(2)氨基酸溶液的配制

所述的有机模板为天门冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu)，配制浓度范围为1～20.00mmol/L的天门冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu)的水溶液；

优选能够使脱矿釉质体外延续釉柱方向排列生长填补凹陷的氨基酸溶液的浓度为10～20mmol/L。

(3)在密闭的反应条件下，将步骤(1)的牙釉质片置于含有钙离子和步骤(2)的有机模板氨基酸溶液的混合溶液中，60～80℃恒温水浴反应1～3h，反应过程中采用碳酸盐粉末作为CO₂扩散源，稳定釉质表面钙离子，从而在酸性氨基酸模板诱导下在牙釉质片表面形成有序碳酸钙薄层。

所述的含钙离子的溶液可以选择氯化钙水溶液，浓度为0.05～0.15mol/L。

所述的碳酸盐可以选择NH₄HCO₃，NH₄HCO₃与钙离子的摩尔比为1.2～1.5：1。

(4)羟基磷灰石晶体的制备

在40～60℃恒温磁力搅拌下，将磷酸根溶液与氨基酸溶液混合后缓慢滴加到步骤(3)的反应体系中，所选的氨基酸溶液的种类、浓度与步骤(2)相同，然后用碱性溶液调节反应液的pH＝9～11，反应时间为1.5～2.5h，在牙釉质片上制备得到羟基磷灰石晶体，从而实现以酸性氨基酸作为有机软模板诱导脱矿牙釉质体外釉柱原位再生。

磷酸根溶液可以是Na₂HPO₄·12H₂O的水溶液，Ca与P的摩尔比为1.60～1.70：1，滴加速度为1～3mL/min。

碱性溶液是NaOH溶液，质量分数为20％～25％，优选pH值为10。

本发明还涉及一种薄膜状牙科修复材料，其由上述方法制备得到。

本发明的构思：

磷和钙共同承担构成人体支架和负重的任务，本发明以氯化钙作为Ca²⁺源，磷酸氢二钠作为磷源，通过合成富含钙、磷酸盐的稳定组合物来填补脱矿釉质表面缺损。首先在羟基磷灰石矿物沉积前构造一个有组织的反应环境：牙釉质表面形成薄层的碳酸钙活化层，该环境决定了羟基磷灰石的成核位置。酸性氨基酸的加入促使该活化层在釉质表面有序沉积，溶液中氨基酸可以相互聚合形成聚合体，聚合体的空间结构起到了模板效应，有序的碳酸钙层是羟基磷灰石再矿化晶体沉积的预模板，排列愈好，下一步的羟基磷灰石无缝外延生长效果愈好。

发生如下反应(其中氨基酸不参加化学反应，但影响晶体排列的空间构象)：

(NH₄)HCO₃→NH₃↑+CO₂↑+H₂O

CO₂+CaCl₂+H₂O→CaCO₃↓+2HCl

10CaCO₃+6HPO₄ ^2-+8OH^-→Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂+10CO₃ ^2-+6H₂O

研究表明，有机物在无机矿物矿化过程中的作用主要体现在有效控制无机成核，结晶，生长，晶型转变等方面。氨基酸对晶体矿化的影响主要是电荷吸引和空间与化学结构匹配等方面，不同的氨基酸可通过调节HA表面极性而吸引不同的蛋白质。本发明中的氨基酸在溶液中带负电，改变了HA表面极性，对溶液中的Ca²⁺或CO₃ ^2-产生吸引，使得局部离子浓度过饱和，晶体成核沉积。若将氨基酸视为配位体，则其侧链长度可作为配位体的空间尺寸，当氨基酸的侧链长度与Ca²⁺的空间尺寸相匹配时，根据不同的配位数产生不同模板效应，诱导CO₃ ^2-与Ca²⁺结合生成稳定的晶型，进而促进HA形成，以填补釉质表面空缺钙晶体的位置，填补牙釉质，促进其完整性。水溶性的天冬氨酸和谷氨酸可看作为无机矿物的结晶过程中的有机模板，在形态修饰和多晶型物的选择上重要的作用。当加入低浓度的氨基酸时，由于运动的分子倾向于彼此分开，它产生的模板效果不佳。随着氨基酸浓度增加(氨基酸浓度范围在1-20mmol/L，当酸性氨基酸浓度超过25mmol/L时，溶液pH值呈强酸性，碳酸钙开始溶解，反应无法进行)，模板效应越来越显著。已经发现，酸性氨基酸可以有效的促进和介导聚合系晶体生长。

通过本方法在牙釉质表面制备出的羟基磷灰石晶体形貌均一且呈长棒状，表面光滑，粒径约为60nm宽、300nm～400nm长，晶体排列延续原有自然牙釉质釉柱生长长轴方向，有序而紧密。在釉柱基质和釉柱表面都呈现出有序的人工层，不仅能够有效的填补釉质表面脱矿凹陷孔隙，达到牙齿“美容”的效果，还能延续原自然釉质生长方向形成原位“再生”，达到一定的缓冲作用，一定程度上类似于自然釉质承担外力，由于磷和钙共同承担构成人体支架和负重的任务，自然牙釉质表面的钙磷比(摩尔比)是1.67，而脱矿(30s)后的牙釉质表面钙磷比经实验测得在1.48左右，通过实验所得的谷氨酸组的牙釉质表面钙磷比摩尔是1.61，很大程度上提高了钙磷含量比，钙离子相对增加，初步确定制备的晶体产物具有一定的硬度，提高了釉质自身的性能，优化了釉质表面晶体沉积形貌与效果。

具体的应用前景：

本发明采用简单的化学方法，在离体的人牙釉质表面直接长出了致密的、具有人牙釉质仿生结构的薄膜状牙科修复材料，在体外初步实现了牙齿原位再矿化。该薄膜状的牙科修复材料的结构与天然的人牙釉质十分类似，具有磷灰石棒状晶体，形态均一，排列紧密有序，在釉质断端延续生长，釉柱和柱间釉质的这种排列方式取向垂直于牙齿咬合面，组成牙釉质的HA晶体呈纤维条状，长径比大，这种纤维可以依靠桥接、裂纹偏转和拔出效应来消除裂纹尖端应力，阻碍机体位错运动，吸收断裂能，对于防止微小裂纹的扩展非常重要，合成类牙釉质成分和排列对牙齿机械性能的增强具有重要作用。

本发明的制备牙科修复材料的方法过程简单、原料便宜，具有临床应用价值，所制备的牙科修复材料有望替代现有的牙科修复材料来修补龋齿或是其他牙科疾病造成的釉质损伤，主要在牙齿美容和牙齿脱矿表面填补矿物方面有很大的进展，也可以远期作为窝沟封闭材料用于龋齿的预防。

附图说明

FEI XL30ESEM-FEG场发射扫描电镜(FESEM)观察产物晶体形貌，D/max-2200/PC型X射线衍射仪(日本Rigaku，Corporation)对粉末和牙釉质表面进行结构测试，采用FTIR-8400型傅立叶变换红外光谱仪(日本岛津公司SHIMADZU)对粉末的化学组成进行分析，采用FEI XL30ESEM-FEG场发射扫描电镜(FESEM)相匹配的Genesis2000EDAX能谱分析仪(荷兰FEI公司)对元素半定量分析进行检测。其大小、结构、形貌、组成等性能表征如下：

图1：牙釉质表面CaCO₃活化层的FESEM照片；

图2：20mmol/L Asp作用下HA的FESEM照片；

图3：20mmol/L Glu作用下HA的FESEM照片；

图4：空白组与谷氨酸实验组对比FESEM谱图；

图5：氨基酸影响下的HA的红外谱图；

图6：牙釉质表面的XRD谱图；

图7：酸蚀处理的牙釉质表面(A)与20mmol/L谷氨酸添加浓度牙釉质表面修复层(B)FESEM对比图(酸蚀时间延长至90s)；

图8：一步法牙釉质表面合成羟基磷灰石晶体FESEM图片

图1是本发明中所采用的两步矿化法中的第一步牙釉质表面制备CaCO₃活化层的场发射扫描电子显微镜的照片，图1显示了两步法中牙釉质表面均匀的且薄片状的薄层碳酸钙层形成，自然牙釉质基底的鱼鳞状结构变得模糊，但外形和趋势仍可识别出来。该方法制备出的CaCO₃粒子晶体均一，分布均匀，层薄。

图2是20mmol/L L-Asp作用下HA的FESEM照片，从照片中可以看出添加了20mmol/L的天门冬氨酸后，晶体形貌为长棒状，排列紧密，走向趋势也一致，隐约仍能见到鱼鳞状结构。晶体束间距减小，晶体在釉柱间质间排列有序紧密。

图3是在20mmol/L谷氨酸作用下的HA的场发射扫描电镜照片，呈棒状晶体在牙釉质表面沉积，这些晶体的宽约60nm，长为300-400nm之间。产物晶体排列方向基本一致，此外，晶体长轴方向与自然牙釉质的方向还相互延续，排列紧密有序。

图4显示了可见类釉质样物沉积于脱矿牙釉质表面，该人工层大规模的保留了原有自然牙釉质的鱼鳞状排列结构，提示该再矿化层有与自然牙釉质相似的晶体和装配结构，其中白色箭头表明人工层沿着自然牙釉质釉柱方向延续生长，下面的虚线指自然釉质与人工层的界限。修复层的厚度是5.0-7.0μm。在箭头处可见明显的延续生长的“痕迹”，人工层生长方向同原自然牙釉质相同。

图5是氨基酸影响下的HA的红外谱图。其中A：a-d对应天门冬氨酸浓度为1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L；B：a-d对应谷氨酸的浓度为1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L。在560、600、1030、1100cm^-1处均出现PO₄ ^3-振动吸收峰，在3430、3560cm^-1处出现OH^-的振动峰，在1412、1456、877cm^-1处出现CO₃ ^2-的振动峰，其峰形与自然牙釉质粉末的峰形相似；其中箭头所指处表示氨基酸已引入HA晶相中，并随氨基酸浓度的增大，峰强度逐渐增加；在1400-1500cm^-1处的C-O非对称伸缩振动吸收带分裂为双峰，表明部分CO₃ ^2-进入HA晶格内部，取代了部分PO₄ ^3-，形成B型HA，其峰形较自然釉质尖锐，这是由于官能团间的相互作用增强所致。在谷氨酸和天门冬氨酸浓度逐渐增加，1560-1600cm^-1处代表羧基的峰强度递增。这表明，天冬氨酸和谷氨酸被包含在所获得的HA-Asp和HA-Glu中。也从侧面证实了氨基酸在本工艺条件下的诱导作用。

图6是牙釉质表面产物的XRD谱图，a–c:酸蚀牙釉质表面、牙釉质-10mmol/L Asp、牙釉质-10mmol/L Glu。从图中可以看出不同的X射线衍射峰强度的比值可在宏观水平用于估计晶体的特定生长方位。更具体地，磷灰石的尖锐和密集(002)和(004)晶面表明晶体倾向于沿晶体c轴方向上对齐有序。相比空白对照组，(002)峰形和强度都更加尖锐和增强。说明，碳酸根成功的进入到HA晶格中，另一方面，磷灰石结晶与天然釉质棒共享沿c轴相类似的取向。

为了使牙釉质的生长规律要点更加清楚，图7显示酸蚀时间延长至90s扫面电镜图片。图中可见人工层大规模的保留了与自然牙釉质相似的鱼鳞状结构，即再矿化层与自然牙釉质相似的晶体结构。酸蚀的自然牙釉质(图7A)可见脱矿后单个釉质束的棒状结构变成粗糙、钝、平头末端，高度下降。但是，当20mmol/L的谷氨酸加入之后，见图7B，釉质状人工层的HA结构形貌类似于一个圆锥体的形状，并具有光滑的表面和圆形末端。修复后的晶体结构紧凑。与图4一致。人工层生长方向同原自然牙釉质相同。

图8是一步法通过先在牙釉质表面吸附羟基磷灰石晶体，然后引用谷氨酸作为有机模板诱导羟基磷灰石晶体排列(Li Li,Caiyun Mao,Jianming Wang,Xurong Xu,Haihua Pan,Yan Deng,Xinhua Gu,and Ruikang Tang*，Bio-Inspired EnamelRepair via Glu-Directed Assembly of Apatite Nanoparticles:an Approach toBiomaterials with Optimal Characteristics,Adv.Mater.2011,23,4695–4701)，图中可见磷灰石晶体延续釉质表面生长，虽然总体趋势向外，但晶体束与束间方向不一致，正如白色箭头所指，而通过两步法，先在牙釉质表面形成碳酸钙薄层，然后以此基础进一步沉积羟基磷灰石，呈现出有序的人工釉柱排列方式，参考图3，在釉柱间质和釉柱表面都呈现出有规律的延续生长性，相比一步法，反应排列更容易受到良好的调控。

具体实施方式

对比案例1

(1)人类釉质标本的制备和处理

①将去净软垢、牙石和软组织的牙釉质切割为0.5×0.5×0.2cm³大小的牙釉质片，用360目、400目、600目、800目、1000目、1200目、2000目的磨砂纸按序打磨抛光。

②将牙釉质片放于放入小烧杯中，加入75wt％无水乙醇，液面没过牙釉质片，晃动烧杯使牙釉质片与乙醇充分接触，然后放入超声清洗机超声清洗15min；取出烧杯将无水乙醇倒出，用去离子水反复冲洗牙釉质片；再加入去离子水，液面没过牙釉质片，超声清洗震荡15min，取出牙釉质片，干燥。

③牙釉质片用质量分数为37％的磷酸溶液浸泡60s。然后用去离子水反复冲洗后自然干燥备用。

(2)碳酸钙衔接层的制备

①称取0.222g CaCl₂溶于25mL溶液中，经超声处理至混合液均匀透明。

②将上述步骤(1)处理的牙釉质片放入上述混合溶液中。

③溶液上方悬挂装有0.300g NH₄HCO₃粉末的小烧杯作为CO₂扩散源，反应完全密闭。

④80℃恒温水浴反应1h。

(3)羟基磷灰石晶体的制备

①配制0.03mol/L的Na₂HPO₄·12H₂O溶液：准确称取2.686g Na₂HPO₄·12H₂O固体溶于250mL蒸馏水中。

②以物质量的比Ca/P＝1.68，取上述0.030mol/L的Na₂HPO₄·12H₂O溶液40mL。

③将上述②混合溶液以2mL/min的速率滴加至上述(2)步骤反应体系中。

④将上述(2)反应体系置于60℃恒温磁力搅拌器中。

⑤用质量分数为20％的NaOH溶液调节pH＝10。

⑥反应时间为2h。

⑦取出牙釉质基质片，自然条件下待测。

酸蚀处理后的牙釉质表面的XRD谱图见图6(a)，通过反应得到的空白组碳酸钙涂层见图1，图1显示了两步法中牙釉质表面均匀的且薄片状的薄层碳酸钙层形成，自然牙釉质基底的鱼鳞状结构变得模糊，但外形和趋势仍可识别出来。该方法制备出的CaCO₃粒子晶体均一，分布均匀，层薄。得到的羟基磷灰石晶体呈现放射性排列，但晶体形貌、大小均一。

实施例1

(1)人类釉质标本的制备和处理

①将去净软垢、牙石和软组织的牙釉质切割为0.5×0.5×0.2cm³大小的牙釉质片，用360目、400目、600目、800目、1000目、1200目、2000目的磨砂纸按序打磨抛光。

②将牙釉质片放于放入小烧杯中，加入75wt％无水乙醇，液面没过牙釉质片，晃动烧杯使牙釉质片与乙醇充分接触，然后放入超声清洗机超声清洗15min；取出烧杯将无水乙醇倒出，用去离子水反复冲洗牙釉质片；再加入去离子水，液面没过牙釉质片，超声清洗震荡15min，取出牙釉质片，干燥。

③将牙釉质片用质量分数为37％的磷酸溶液浸泡60s。然后用去离子水反复冲洗后自然干燥备用。

(2)氨基酸溶液配置

由于在每次称量粉末时会带来一定的误差，所以我们一般先配置较大浓度的氨基酸溶液，例如分别配制天门冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)浓度为0.02～0.03mol/L的水溶液，然后再分别稀释成所需浓度梯度1～20mmol/L的水溶液备用。

①准确秤取0.166g天门冬氨酸固体溶于50mL蒸馏水中，配置0.025mol/L的天门冬氨酸溶液。

②准确秤取0.184g谷氨酸固体溶于50mL蒸馏水中，配置0.025mol/L的谷氨酸溶液。

(3)碳酸钙衔接层的制备

①取上述(2)中天门冬氨酸溶液1mL，配置成1mmol/L的天门冬氨酸溶液。称取0.222g CaCl₂溶于上述配置的氨基酸溶液中，经超声处理至混合液均匀透明。

②将上述步骤(1)处理的牙釉质片放入上述混合溶液中。

③溶液上方悬挂装有0.300g NH₄HCO₃粉末的小烧杯作为CO₂扩散源，反应完全密闭。

④80℃恒温水浴反应1h。

(4)羟基磷灰石晶体的制备

①配制0.03mol/L的Na₂HPO₄·12H₂O溶液：准确称取2.686g Na₂HPO₄·12H₂O固体溶于250mL蒸馏水中。

②以物质量的比Ca/P＝1.68，取上述0.03mol/L的Na₂HPO₄·12H₂O溶液40mL。将0.0053g天门冬氨酸粉末加入此40mL溶液中配成含量为1mmol/L天门冬氨酸的混合溶液。

③将上述②混合溶液以2mL/min的速率滴加至上述(3)步骤反应体系中。

④将上述(3)反应体系置于60℃恒温磁力搅拌器中。

⑤用质量分数为20％的NaOH溶液调节pH＝10。

⑥反应时间为2h。

⑦取出牙釉质基质片，自然条件下待测。

牙釉质表面得到相对疏松的羟基磷灰石涂层，排列偏向于花状。得到的羟基磷灰石产物的红外光谱见图5A(a)。

实施例2

碳酸钙衔接层的制备过程中，①取(2-①)中天门冬氨酸溶液体积为5mL，配置成5mmol/L的天门冬氨酸溶液。

羟基磷灰石晶体的制备过程中，②将0.0265g天门冬氨酸粉末加入此Na₂HPO₄·12H₂O40mL溶液中配成含量为5mmol/L的天门冬氨酸混合溶液。

其它条件如实施例1，牙釉质表面得到的晶体类似于实施例1。得到的羟基磷灰石产物的红外光谱见图5A(b)。

实施例3

碳酸钙衔接层的制备过程中，①取(2-①)中天门冬氨酸溶液体积为10mL，配置成10mmol/L的天门冬氨酸溶液。

羟基磷灰石晶体的制备过程中，②将0.053g天门冬氨酸粉末加入Na₂HPO₄·12H₂O40mL溶液中配成含量为10mmol/L的天门冬氨酸混合溶液。

其它条件如实施例1，牙釉质表面得到羟基磷灰石涂层逐渐出现有序的规律性。得到的羟基磷灰石产物的红外光谱见图5A(c)，XRD衍射图谱见图6(b)。

实施例4

碳酸钙衔接层的制备过程中，①取(2-①)中天门冬氨酸溶液体积为20mL，配置成20mmol/L的天门冬氨酸溶液。

羟基磷灰石晶体的制备过程中，②将0.106g天门冬氨酸粉末加入Na₂HPO₄·12H₂O40mL溶液中配成含量为20mmol/L的天门冬氨酸混合溶液。

其它条件如实施例1，牙釉质表面得到相对疏松的羟基磷灰石涂层。得到的晶体形貌为长棒状，排列紧密，走向趋势也一致，隐约仍能见到牙釉质表面鱼鳞状结构。晶体束间距减小，晶体在釉柱间质间排列有序紧密，见图2。得到的羟基磷灰石产物的红外光谱见图5A(d)。

实施例5

碳酸钙衔接层的制备过程中，①取(2-②)中谷氨酸溶液体积为1mL，配置成1mmol/L的谷氨酸溶液。

羟基磷灰石晶体的制备过程中，②将0.0059g谷氨酸粉末加入Na₂HPO₄·12H₂O40mL溶液中配成含量为1mmol/L谷氨酸的混合溶液。其它条件如实施例1。

牙釉质表面得到相对较为紧密的羟基磷灰石涂层。相比天门冬氨酸在低浓度的时候已经呈现出良好的晶体排列方式。得到的羟基磷灰石产物的红外光谱见图5B(a)。

实施例6

碳酸钙衔接层的制备过程中，①取(2-②)中谷氨酸溶液体积为5mL，配置成5mmol/L的谷氨酸溶液。

羟基磷灰石晶体的制备过程中，②将0.0294g谷氨酸粉末加入Na₂HPO₄·12H₂O40mL溶液中配成含量为5mmol/L谷氨酸的混合溶液。其它条件如实施例1。

牙釉质表面得到相对疏松的羟基磷灰石涂层，釉柱间质之间也见有明显的羟基磷灰石有序沉积。得到的羟基磷灰石产物的红外光谱见图5B(b)。

实施例7

碳酸钙衔接层的制备过程中，①取(2-②)中谷氨酸溶液体积为10mL，配置成10mmol/L的谷氨酸溶液。

羟基磷灰石晶体的制备过程中，②将0.0589g谷氨酸粉末加入Na₂HPO₄·12H₂O40mL溶液中配成含量为10mmol/L谷氨酸的混合溶液。其它条件如实施例1。

牙釉质表面得到相对紧密的羟基磷灰石涂层，排列方向一致，紧密有序，沿自然牙釉质表面“断端”“延伸”。得到的羟基磷灰石产物的红外光谱见图5B(c)，XRD衍射图谱见图6(c)。

实施例8

碳酸钙衔接层的制备过程中，①取(2-②)中谷氨酸溶液体积为20mL，配置成20mmol/L的谷氨酸溶液。

羟基磷灰石晶体的制备过程中，②将0.118g谷氨酸粉末加入Na₂HPO₄·12H₂O40mL溶液中配成含量为20mmol/L谷氨酸的混合溶液。其它条件如实施例1。

得到的晶体呈棒状，沉积在牙釉质表面，这些晶体的宽约60nm，长为300-400nm之间。产物晶体排列方向基本一致，此外，晶体长轴方向与自然牙釉质的方向还相互延续，排列紧密有序。再生层沿着自然牙釉质釉柱方向延续生长。横截面见釉质状人工层的HA结构形貌类似于一个圆锥体的形状，并具有光滑的表面和圆形末端。修复后的晶体结构紧凑，修复层的厚度是5.0-7.0μm。见图3、图4和图7。得到的羟基磷灰石产物的红外光谱见图5B(d)。

Claims (7)

1.一种牙科修复材料的酸性氨基酸诱导脱矿牙釉质体外釉柱原位再生制备方法，其步骤如下：

(1)牙釉质片的处理

将去净软垢、牙石和软组织的牙釉质切割成牙釉质片，依次用360目～2000目的磨砂纸打磨抛光，然后将牙釉质片浸入到75wt％的无水乙醇中，超声清洗10～20min；再用去离子水反复冲洗牙釉质片，之后将牙釉质片浸入到去离子水，超声清洗震荡10～20min；最后将牙釉质片浸入到质量分数为35～37％的磷酸溶液中浸泡40～60s，再用去离子水反复冲洗后自然干燥；

(2)氨基酸溶液的配制

配制浓度范围为1～20mmol/L的天门冬氨酸Asp或谷氨酸Glu的水溶液；

(3)在密闭的反应条件下，将步骤(1)的牙釉质片置于含有钙离子和步骤(2)的氨基酸溶液的混合溶液中，60～80℃恒温水浴反应1～3h，反应过程中利用碳酸盐粉末作为CO₂扩散源，稳定釉质表面钙离子，在酸性氨基酸模板诱导下在牙釉质片表面形成有序碳酸钙薄层；

(4)羟基磷灰石晶体的制备

在40～60℃恒温磁力搅拌下，将磷酸根溶液与氨基酸溶液混合后缓慢滴加到步骤(3)的反应体系中，氨基酸溶液的种类、浓度与步骤(2)相同，然后用碱性溶液调节反应液的pH＝9～11，反应1.5～2.5h，实现以酸性氨基酸作为有机软模板诱导脱矿牙釉质的体外再生。

2.如权利要求1所述的一种牙科修复材料的氨基酸诱导脱矿牙釉质体外釉柱原位再生制备方法，其特征在于：氨基酸溶液的浓度为10～20mmol/L。

3.如权利要求1所述的一种牙科修复材料的酸性氨基酸诱导脱矿牙釉质体外釉柱原位再生制备方法，其特征在于：含钙离子的溶液为氯化钙溶液，浓度为0.05～0.15mol/L。

4.如权利要求1所述的一种牙科修复材料的酸性氨基酸诱导脱矿牙釉质体外釉柱原位再生制备方法，其特征在于：碳酸盐为NH₄HCO₃，NH₄HCO₃与钙离子的摩尔比为1.2～1.5：1。

5.如权利要求1所述的一种牙科修复材料的酸性氨基酸诱导脱矿牙釉质体外釉柱原位再生制备方法，其特征在于：磷酸根溶液是Na₂HPO₄·12H₂O的水溶液，Ca与P的摩尔比为1.60～1.70：1，滴加速度为1～3mL/min。

6.如权利要求1所述的一种牙科修复材料的酸性氨基酸诱导脱矿牙釉质体外釉柱原位再生制备方法，其特征在于：碱性溶液是NaOH溶液，其质量分数为20％～25％。

7.一种牙科修复材料，其特征在于：由权利要求1～6任何一项所述的方法制备得到。