CN102639159B - 离子取代的磷酸钙颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于形成离子取代的磷酸钙的球形颗粒的方法。所述方法基于在静态、搅拌或水热条件下来自缓冲溶液的颗粒的沉淀物。本发明还涉及所形成的材料和颗粒本身的用途。

Description

离子取代的磷酸钙颗粒
技术领域
本发明涉及用于制造离子取代的磷酸钙纳米颗粒、特别是具有形态和结构可控的磷酸钙纳米颗粒的方法。本发明还涉及用于医学应用的此类材料组合物。 
背景技术
磷酸钙(CaP)和特别地羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2，HA)由于其与骨和牙齿的矿物组分的相似性及其生物相容性而作为广泛用于医学应用的矿物质。此外，羟基磷灰石为无毒性、生物相容性和生物活性的。这就意味着羟基磷灰石是无害的并且不会被识别为异物，另一方面其可对骨再造具有积极作用。因此，羟基磷灰石已被广泛用于骨修复并作为药物/基因运载载体、催化剂、离子吸附/交换剂、光电试剂等。对于许多应用如骨空隙(void)填充物、药物运载载体、牙本质小管(dentin tubuli)的脱敏等，可吸收(resorbable)的纳米颗粒(即，可在体内溶解的颗粒)具有特殊影响。 
骨中的羟基磷灰石为多取代的磷酸钙，包括痕量CO3 2-、F-、Cl-、Mg2+、Sr2+、Si4+、Zn2+、Ba2+、Fe3+等。这些离子取代担负骨形成和正常功能如材料的溶解性、晶体结构和表面化学的重要作用。 
氟化物(fluoride)存在于脊椎动物体的骨骼和牙齿中。据报道，氟化物对于OH位的取代和氟取代(fluoride-substituted)的羟基磷灰石的形成增强了羟基磷灰石生物陶瓷的耐酸性和机械性能(Gross等人，Biomaterials 2004；25：1375-1384)，并诱导更好的生物应答(Robinson等人，Crit Rev Oral Biol Med 2000； 11：481-495)。 
已发现硅对正常的骨和软骨的生长和发育是必需的。与化学计量磷酸钙相比，在其结构中包括痕量水平Si的合成磷酸钙显示显著增加的生物学性能(Pietak等人，Biomaterials 2007；28：4023-4032)。生物学性能的改进可归因于材料性质中Si诱导的改变以及归因于在骨和结缔组织系统的生理过程中Si的直接影响。通过增加材料的溶解性、产生更多负电性表面以及产生更精细的微结构来将材料表面转化为生物学相当的磷酸钙，Si的取代促进生物学活性。Si复合体释放到细胞外基质和Si在材料表面的存在可诱导对在骨和软骨组织系统的细胞的另外的剂量依赖性刺激效应。 
由于锶在化学和物理上与钙密切相关，所以易于将其引入作为磷酸钙中钙的天然取代。已证明锶具有增加骨形成和减少骨吸收的效果，导致在正常动物和人类中骨质增加和骨的机械性改进。Sr取代的羟基磷灰石陶瓷已显示比纯羟基磷灰石更好的机械性，以及增强体外研究中成骨细胞的增殖和分化(Landi等人，Acta Biomaterials 2007；3：961-969)。锶离子的积极作用被用于药物，应用于骨质疏松症人群的所谓的雷奈酸锶(strontium ranelate)。 
生产纯CaP颗粒、球形颗粒和输送材料的方法已在现有技术中描述，并包括以下所记载的湿法化学沉淀、溶胶凝胶法或水热合成法：例如US 5858318、US 7326464、US 5702677和HuiGang Zhang，Qingshan Zhu，Yong Wang，Chem.Mater.2005，17，5824-5830。 
在其他方法中，磷酸钙的合成模仿生物矿化，其为天然自组装(self-assembly)过程，通过该过程在生物体中形成该种矿物质。此外，来自溶液的具有特定形态和结构的矿物质纳米材料 的合成，由于其独特的物理、化学和生物性质和在高级功能材料中的潜在应用而吸引更多的注意。 
目前，模仿生物矿化过程的具有如球形、纤维和棒状的不同形态、核-壳结构和中孔结构的矿物质纳米材料的合成集中于使用表面活性剂和生物分子的自组装(Xu等人，J Mater Chem2007；17：415-449)。例如，磷酸钙的成核和生长受控于某些特定的表面活性剂或生物分子，该表面活性剂或生物分子指导生长的纳米材料的生长并因而控制生长的纳米材料的形态。在无表面活性剂的情况下，所述形态固有地受控于优先在在溶液中具有最低表面张力的特定晶面上生长的晶体。例如，在过饱和溶液中(通常包括钙和磷酸根离子)磷酸钙自发地生长成沿晶体的c轴定向的鳞片(flake)或纤维/棒。 
并不是所有的形态都便于用作运载颗粒、催化剂支持体、离子吸附/交换剂等，直到现在已研究了例如棒、管、片或球状纳米颗粒时为止。举例来说，为了使药物运载过程有效，高表面积和多孔结构对于吸附尽可能多的活性物质是有利的，并且当然也存在生物相容性和载体与物质间的结合的需要。 
制备CaP颗粒的一个问题是控制颗粒的粒度分布和形状。通常粒度分布很广，并由CaP的六角对称和晶格参数所引起。最可能产生沿c轴的定向并由此产生针状形状(pin-like shape)。 
发明内容
鉴于前述，本发明的一个目的为提供形态可控的纳米至微米范围内的磷酸钙(CaP)颗粒，并且其不使用表面活性剂或模板。 
因此，如在独立权利要求中所定义的，本发明提供经由无表面活性剂的生物矿化过程制造形态和结构可控的离子取代的 CaP颗粒的方法、CaP颗粒及其在生物医药应用和作为药物载体的用途。 
在根据本发明的方法中，在无表面活性剂的仿生过程中制备形态和结构可控的CaP颗粒。 
对于根据本发明的形态和形态可控的CaP颗粒的制备，旨在使用含类似于它们天然存在的组合物的前体，并且不使用未用于天然过程中的并且也不应包括在产物中的化学制品，即，在本发明的制造方法中，表面活性剂不必用于颗粒合成。在现有技术方法中，使用有机表面活性剂或模板如尿素、胶原蛋白、单糖或Na2EDTA来通过限定的反应空间实现球形结构。生产中，表面活性剂的使用引起许多步骤和另外的步骤，例如热处理，对于从CaP中除去有机组分可能是必要的。此外，体内使用时残基可能引起问题。本发明的一个优势为由于仿生制造方法，这些另外的步骤是不必要的，从而简化了该过程。此外，使用离子取代来控制形态的一个优势为使通过表面活性剂控制过程不能易于形成其他形状和多孔性成为可能。 
在本发明的方法中用矿化和沉淀法来合成颗粒，所述方法包括制备盐溶液和从盐溶液中沉淀CaP颗粒的基本步骤。 
更详细地，所述方法包括以下步骤： 
-提供水溶液，其包括钙离子、钠离子、钾离子、氯离子、和/或磷酸根离子中的一种或多种， 
-所述溶液具有2.0至10.0范围内的初始pH、优选6.0和8.0之间的pH，以及20℃至150℃的温度， 
-所述溶液进一步包括镁、锶、硅、氟、钡、铁和锌、碳酸根离子和硫酸根离子或其组合中的一种或多种，和 
-提供在足以形成期望的纳米颗粒的时间中以静态工艺、搅拌工艺和/或水热工艺的形式的自组装过程。 
在本发明的优选实施方案中，所述溶液包括钙和磷酸根离子以及镁、钠、钾、氯、碳酸根或硫酸根离子的一种或多种，并且其中所述离子的浓度为： 
钙离子的浓度可在0.01×10-3M至25×10-3M的范围， 
镁离子的浓度可在0.01×10-3M至15×10-3M的范围， 
钠离子的浓度可在0.01×10-3M至1420×10-3M的范围， 
钾离子的浓度可在0.01×10-3M至1420×10-3M的范围， 
氯离子的浓度可在0.01×10-3M至1030×10-3M的范围， 
磷酸根离子的浓度可在0.01×10-3M至10×10-3M的范围， 
碳酸根离子的浓度可在0.01×10-3M至270×10-3M的范围， 
硫酸根离子的浓度可在0.01×10-3M至5×10-3M的范围， 
取代离子的浓度可为Sr2+在0.01×10-3M至1.0×10-3M的范围、Si4+在0.01×10-3M至10×10-3M的范围和F-在0.01×10-3M至0.5×10-3M的范围。 
在一个实施方案中，制造方法利用包括至少钙离子和取代离子，例如Sr2+、Si4+、F-、Mg2+、Zn2+、Ba2+或Fe3+或其组合的过饱和磷酸盐缓冲溶液。在缓冲溶液中发生无表面活性剂的自组装过程，并可通过温度、pH、组合物和离子浓度控制动态形成率。自组织过程(self-organized process)可为静态工艺、搅拌工艺和水热工艺。形成时间典型地在1h至4周以内，例如大于2小时或大于5小时或大于10小时或大于1天，但小于4周或小于2周或小于1周，但更长或更短的形成时间也可形成颗粒。 
在本发明的一个实施方案中，至少一种取代离子为Sr2+。 
在本发明的另一实施方案中，至少一种取代离子为Mg2+。 
在本发明的另一实施方案中，至少一种取代离子为Si4+。 
在本发明的另一实施方案中，至少一种取代离子为F-。 
在本发明的另一实施方案中，至少两种取代离子为Sr2+和 Mg2+。 
在本发明的另一实施方案中，至少两种取代离子为Sr2+和F-。 
在本发明的另一实施方案中，至少两种取代离子为Mg2+和F-。 
在另一实施方案中，溶液的温度为30℃至70℃。 
在另一实施方案中，在所形成的颗粒中，镁浓度为0至10重量％之间，例如大于1％或大于3％或大于5％或10％或小于8％或小于5％。 
在一个实施方案中，所述方法包括在溶液中生长和自组装颗粒的步骤，从而由于在所述溶液中取代离子的浓度的调整而形成具中空核和致密壳、或中空核和多孔壳、或多孔核和致密壳或颗粒为多孔的离子取代的颗粒。 
还在另一实施方案中，离子取代的颗粒为球形。 
还在另一实施方案中，溶液中的Sr2+的浓度为小于0.15mM，优选约0.06mM，从而形成直径约1μm的无规球形多孔Sr取代的纳米颗粒。 
还在另一实施方案中，溶液中的Sr2+的浓度大于0.06mM并小于0.3mM，优选约0.15mM，从而形成直径100至300nm的球形多孔Sr取代的纳米颗粒，各纳米颗粒具有中空核和多孔壳。 
还在另一实施方案中，溶液中的Sr2+的浓度大于0.15mM并小于0.6mM，优选约0.3mM，从而形成直径200至500nm的规则球形Sr取代的纳米颗粒，各纳米颗粒具有中空核和多孔壳。 
还在另一实施方案中，溶液中的Sr2+的浓度大于0.3mM并小于0.67mM，优选约0.6mM，从而形成直径100至500nm的Sr取代的球形纳米颗粒，各纳米颗粒具有致密壳和多孔核。 
还在另一实施方案中，Sr2+的浓度为0.01至0.7mM，例如 0.01或大于0.05或大于0.1或大于0.3或0.7以下或小于0.5mM；和Mg2+的浓度为0.1至0.5mM，例如0.1或大于0.2或大于0.3或0.5或小于0.4mM。 
还在另一实施方案中，溶液中的F-的浓度约0.04至0.2mM，从而形成直径300至500nm的球形多孔的F-取代的纳米颗粒。 
还在另一实施方案中，Si4+的浓度约6mM，从而形成200至500nm大小的多孔的Si取代的纳米颗粒。 
在本发明的第一方面，提供形态可控的颗粒，如中空或多孔CaP颗粒或其组合。例如，所述颗粒可具有中空核和致密壳，或中空核和多孔壳，或多孔核和致密壳，或者所述颗粒为多孔的。本发明的CaP颗粒的形态可通过调整取代离子在生长溶液中的浓度来控制。本发明的球形颗粒的直径优选10至1000nm，例如大于30nm或大于50nm或大于100nm但小于1000nm或小于500nm或小于300nm。所形成的颗粒不是离子取代的CaP的单晶体，而是由离子取代的CaP的几个较小单元、完全或部分或非晶体组成。颗粒的最小单元可以是例如共同形成为较大颗粒的鳞片状纳米颗粒和针状纳米颗粒。 
在一个实施方案中，在例如超过30℃或超过50℃或超过100℃来加热处理形成的颗粒。 
在另一实施方案中，在所形成的颗粒中的锶浓度为0至35重量％之间，例如大于5或大于15％或大于25％或35％或小于30％或小于20％或小于10％。 
还在另一实施方案中，颗粒为中空的(hollow)和/或多孔的(porous)。 
还在另一实施方案中，颗粒具有含致密壳的多孔核。 
在另一实施方案中，颗粒包括作为取代离子的Sr2+、Si4+和F-中的一种或多种。 
利用各种各样的设计来控制使用根据本发明的方法制备的颗粒的形态。可形成直径100nm至1μm的固体、多孔、中空或绳状(rope-like)结构的球体。除锶以外，单独或组合的镁、氟(fluor)、硅和液态前体(缓冲溶液)可强烈地影响形态。 
在本发明的一个实施方案中，提供多孔和/或中空、锶掺杂的球形磷酸钙颗粒。 
在另一实施方案中，提供氟和/或硅掺杂的球形磷酸钙颗粒。 
在本发明的第二方面，提供用于在人类或模拟躯体环境中控制从所制备的颗粒的离子释放(如锶释放)的颗粒。 
通过使用根据本发明的颗粒的锶释放研究，显示出离子释放量对pH值的依赖性。发现浸液的pH值从8.0降至6.8使锶释放量加倍，在不改变溶液的情况下，在13天后释放了总计为20％的引入的锶。此外，浸液中无机离子的存在使溶液中的锶含量降低，分别诱导颗粒上的CaP的结晶作用，这显示出颗粒为生物活性的(Hench L L.J Am Ceram Soc 1991；74：1487-1510)。该性质对于再矿化性质具有重要意义的应用如牙科和矫形应用特别重要。 
由于可通过将生物相容的、生物可降解的、人工制备的离子取代的CaP嵌入躯体中来刺激例如受损骨骼的再生，并因而增大骨的强度，所以CaP形成形态可控的非化学计量晶体的能力能够使材料适用于特定应用。然而不限定于此，可用本发明产生的广泛范围的颗粒形态和组成开启了多种应用： 
-具有持续和控释行为的药物运载。药物的非限制性实例包括抗生素、抗炎剂、蛋白质、癌症治疗剂和用于治疗疼痛的药物。可使用任何本领域技术人员已知的方法进行载药。非限制性实例包括颗粒制造期间的浸透和装载或二者的组合。例如， 本发明的CaP颗粒可通过具有大表面积和多孔结构使有效的药物运载成为可能，其能够在满足生物相容性和载体与物质之间的强烈结合的需求的同时吸附大量活性物质。 
-颗粒可用于骨修复和再生。可使用本领域技术人员已知的方法将颗粒运载至骨缺损处。两个非限制性实例包括在血浆中浸透颗粒并将其添加至缺损处，或者使用载体液体或凝胶经注射器运载颗粒。所述凝胶可为多糖如透明质酸或壳聚糖或其任意衍生物。其他实例包括甘油、聚乙二醇或其他水混溶性液体。此外，可将颗粒添加到可注射的自硬化材料系统，其非限制性实例包括可注射的生物陶瓷(磷酸钙水泥(cement)、硫酸钙水泥和硅酸钙水泥等)，以及添加到非可吸收(non resorbable)的可注射聚合物如聚丙烯酸甲酯(poly-methyl-meta-acrylate，PMMA)。为了进一步改进再生，颗粒和/或液体或凝胶可另外包括生物学物质如生长因子。 
-颗粒可用于牙齿修复和再生。可使用本领域技术人员已知的方法将颗粒运载至骨缺损处。两个非限制性实例包括在血浆中浸透颗粒并将其添加至缺损处，或者使用载体液体或凝胶经注射器运载颗粒。所述凝胶可为多糖如透明质酸或壳聚糖或其任意衍生物。其他实例包括甘油、聚乙二醇或其他水混溶性液体。此外，可将颗粒添加到可注射的自硬化材料系统，其非限制性实例包括可注射的生物陶瓷(磷酸钙水泥、硫酸钙水泥和硅酸钙水泥等)，以及添加到非可吸收的可注射聚合物如聚丙烯酸甲酯(PMMA)。为了进一步改进再生，颗粒和/或液体或凝胶可另外包括生物学物质如生长因子。 
-牙科微创和预防性治疗如清洁、抛光、增白、漂白和喷砂牙齿(blasting teeth)，嵌缝添料(sealant)，龋洞(cavity)预防，牙齿保存及修复，以及改善漂白后牙釉质的表面。 
-使用载体凝胶或液体用于牙周炎的治疗，或作为龋洞修复(cavity restoration)或作为龋洞填充修复的一部分。 
-用于种植体周围炎(peri-implantatis)的治疗(填充并再生由于种植体周围炎形成的牙种植体周围的骨空隙)。此处，CaP颗粒可使用可注射制剂用运载机制运载至位点，或与血液等混合并包装进缺损中。 
-用于治疗敏感牙根的牙膏中的填料颗粒，为了使开口小管(open tubulis)脱敏和治疗早期龋齿。优选地使用球形CaP颗粒，甚至更优选包含F离子的球形CaP颗粒。 
-重金属离子的吸附剂。 
基因、生长因子、对照物、放射性标记颗粒或物质或药物的运载。 
-牙本质小管的脱敏。中空和/或多孔颗粒适用于填充开口牙本质小管。 
-用于治疗牙釉质的洁牙带(dental tape)、洁齿漂白带或膏。 
-牙膏、洗口液(mouth water)、漱口水、口气清新剂、牙科用乳霜(tooth cream)、漂白和增白膏。 
-食品补充剂和口香糖。对于口香糖，添加大约10重量％以下的CaP颗粒以实现再矿化性质。 
本发明的颗粒可与其他材料组合以改进例如可注射生物材料中的填料颗粒的性质。非限制性实例包括PMMA骨水泥、生物陶瓷(如，磷酸钙、硫酸钙)、玻璃离聚物水泥。 
对于药物运载，本发明的上述第一和第二方面分别产生使颗粒形态适应于能够在颗粒的孔(pores)或空腔(hollows)中装载药物的第一方法，和包括控制离子释放的第二方法。在第一方法中，药物可在生长后和/或生长期间装载。 
类似于图9的F取代的颗粒，图10的Si取代的颗粒的表面相对粗糙并包括从表面突出的鳞片。然而，F取代的颗粒具有更规则的球形形状。这两种取代颗粒将适用于药物运载、基因运载、蛋白质吸附和色谱柱中的填料材料。 
在独立的权利要求中定义本发明的实施方案。当与附图和权利要求一起考虑时，本发明的其他目的、优势和新特征从本发明的以下详细描述中将变得明显。 
附图说明
现在将参考附图描述本发明的优选实施方案，其中 
图1说明在60℃下使用0.06mM Sr掺杂的PBS处理1周后的SrCaP的形态， 
图2说明在60℃下使用0.15mM Sr掺杂的PBS处理1周后的SrCaP的形态， 
图3说明在60℃下使用0.3mM Sr掺杂的PBS处理1周后的SrCaP的形态。图中的箭头说明中空颗粒。 
图4说明在60℃下使用0.6mM Sr掺杂的PBS处理1周后的SrCaP的形态， 
图5说明在60℃下使用0.6mM Sr掺杂的PBS处理2周后的SrCaP的形态， 
图6说明通过在60℃下使用0.6mM Sr掺杂的PBS处理1周所获得的SrCaP颗粒的TEM图像， 
图7说明在60℃下使用0.6mM Sr掺杂的PBS搅拌1天后的SrCaP的形态， 
图8说明在100℃下使用0.6mM Sr掺杂的PBS水热化1小时后的SrCaP的形态， 
图9说明在100℃下使用(a)0.04mM和(b)0.2mM F掺杂的 PBS水热化24小时后的FCaP的形态， 
图10说明在100℃下使用6mM Si掺杂的PBS水热化24小时后的SiCaP的形态， 
图11说明在100℃下使用纯PBS老化24小时后CaP的形态， 
图9′示出根据本发明的具有增加的Ca/P比的Sr掺杂的CaP颗粒， 
图10′示出根据本发明的F掺杂和Si掺杂颗粒， 
图1′(a)-(c)示出根据本发明分别使用M1、M2和M3-Sr所获得的形态， 
图2′(a)-(d)示出根据本发明来自M2-H2O(无缓冲溶液)的颗粒的形态， 
图3′示出Mg和Sr对使用M2制造的颗粒形态的影响， 
图4′示出根据本发明使用不同Mg和Sr浓度的M2制造的颗粒的XRD图谱， 
图5′示出根据本发明使用M3制造的颗粒的形态， 
图6′示出根据本发明使用M3-Sr制造的颗粒的XRD图谱， 
图7′示出根据本发明使用M1制造的100mg颗粒的累积的锶释放，和 
图8′示出根据本发明在37℃的水溶液中老化13天后的来自M1的颗粒的形态。 
图9′示出在100℃下老化24小时具有增加的Ca/P比的0.6mM Sr掺杂的多孔CaP球体的SEM图像。Ca/P比为(A)0.1、(B)0.1、(C)和(D)2.5、(E)和(F)5.0。 
图10′示出氟取代的磷酸钙纳米颗粒的SEM图像，所述氟取代的磷酸钙纳米颗粒通过在100℃下处理包含0.2mM氟离子(fluoride ion)的磷酸盐缓冲溶液(A)12小时和(B)24小时，和0.15mM硅酸盐离子的磷酸盐缓冲液(C)12小时和(D)24小时而 制备。 
图11示出利用在(A)至(E)中从0增加至0.6mM的锶浓度在60℃下老化1周的磷酸钙的形态。Ca/P比为0.1。(D)中的箭头表示颗粒的中空性质。 
图12示出在100℃下处理不同反应时间的锶掺杂的磷酸钙球体的SEM图像。 
图13示出使用含0.6mM Sr离子的溶液的Sr-CaP球形颗粒的XRD图谱。 
具体实施方式
在本申请中，措辞“掺杂的”可与“取代的”互换使用。 
为了应用目的，生物材料为与生物系统连接(interface)以评价、处理、增加或替换任何躯体组织、器官或功能的材料。 
化学计量的羟基磷灰石(HA)的化学式为Ca10(PO4)6(OH)2，但为了该申请的目的可使用多种变体。本发明主要用磷酸钙(CaP)来描述，其包括但不限于磷酸二钙二水合物(DCPD)、磷酸八钙(OCP)、磷酸三钙(TCP)和无定形磷酸钙(ACP)或其任意衍生物。可将不同的离子引入三种亚晶格，并由此可改变材料的性质，例如溶解性、晶体结构、结晶度、晶粒大小或多孔性。可能地，阳离子取代离子为Sr2+、Mg2+、Si4+、Zn2+、Ba2+、Fe3+或Ti4+以及阴离子取代离子为Cl-、F-、HCO3 -或CO3 2-。离子取代的来源可为包含待取代离子的可溶性盐和微溶性盐，例如但不限于SrCl2、SrCO3、Sr(NO3)2、Na2SiO3、硅酸钙如(CaOSiO2、CaO(SiO2)2、CaO(SiO2)3)；ZnCl2、ZnSO4、BaCl2、FeCl3、Fe(NO3)3、Na2CO3、NaF、Na2FPO4、NaHCO3或NaTiO3。 
在根据本发明的方法中，在无表面活性剂的仿生过程中制备形态可控的离子取代的CaP颗粒。仿生学，由Otto Schmidt在 20世纪50年代创造的术语，是指研究天然过程并将所获得的知识从生物学转化为科技，因而，模仿自然发生的过程，在该情况下所述自然发生的过程为生物矿化。 
以下为本发明和各种形态中的某些、它们如何受到不同因子的影响以及如何通过本发明而获得它们的一般的、非限制性综述： 
本发明涉及为了控制形态和结构的离子取代的CaP的较小单元的聚集体，优选球体， 
单元/晶体的形态受离子浓度的影响， 
优选地，颗粒的直径小于1000nm，更优选小于100nm，优选直径大于10nm。 
当使用锶作为取代离子时，Sr2+∶Ca2+∶HPO4 2-的比优选x∶1∶10，其中x优选0＜x≤0.67，例如x为0以上，或大于0.10或大于0.20或大于0.30或0.67以下，或小于0.50或小于0.40。 
-0.01至0.09mM以形成直径约700nm至2μm的无规球形多孔颗粒 
-0.01至0.1mM以形成直径约100至300nm的球形多孔颗粒 
-0.2至0.4mM以形成直径约200至500nm的具有中空核和多孔壳的规则球形颗粒 
-0.5至0.7mM以形成直径100至500nm的具有致密壳和多孔核的球形颗粒。 
图9′示出在(A)至(E)中用从0增加至0.6mM的锶浓度在60℃下老化1小时的磷酸钙的多孔形态。Ca/P比为0.1。(D)中的箭头表示颗粒的中空性质。此外，图10′、11和12说明锶掺杂的CaP。 
当使用氟作为取代离子时，F-∶Ca2+∶HOP4 2-的比优选为X∶1∶10，其中x优选0＜x≤0.22，例如x大于0.05或大于0.10或0.22以下或小于0.15 
-以形成直径约300至500nm的球形多孔颗粒。 
当使用硅作为取代离子时，SiO3 2-∶Ca2+∶HPO4 2-可为X∶1∶10，优选0＜x≤10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10， 
-以形成直径约200至500nm的球形多孔颗粒。 
在以下实施例中，将更详细地描述具有不同形态的离子取代C aP颗粒的形成。由于许多例举的过程的目的在于CaP颗粒的球形形状，所以颗粒可互换地称作纳米球(nanosphere)。 
实施例1 
在静态工艺中，由包含Ca2+、HPO4 2-、Na+、K+、Cl-、Mg2+(浓度参见表1)的Sr掺杂的过饱和磷酸盐缓冲溶液合成锶取代的多孔CaP纳米球。为了模仿体液，将Sr掺杂的磷酸盐缓冲盐水的pH值控制为7.4。Sr2+∶Ca2+∶HPO4 2-的初始比为x∶1∶10(其中x为0至0.67)。锶取代的CaP在过饱和溶液中结晶、生长并自组装。为了增加晶体生长和自组装的进程，在静态工艺期间，在37℃或60℃下在炉中进行处理。 
该过程产生具外壳结构和多孔内部以及颗粒大小约100至1000nm的Sr取代的CaP纳米球。 
用磷酸盐缓冲溶液中的锶离子浓度改变Sr取代的CaP纳米球的形态。当PBS溶液中Sr的初始浓度为0.06mM时纳米球变成直径约1微米的无规球形多孔颗粒(图1)。当PBS溶液中Sr的初始浓度增加到0.15mM时，球的大小降低至100至300nm，颗粒变成具中空核和多孔壳的球形(图2)。当Sr离子浓度增加到0.3mM时，颗粒变成具有中空核和多孔壳，以及直径约200至500nm的规则球(图3)。然而，在将PBS溶液中Sr的初始浓度增加到0.6mM时，颗粒转变为具有致密壳和多孔核，以及直径约100至500nm的球(图4、图6)。当处理时间增加到2周时，形态未改变，颗粒未生长，大小变得与1周的结果相同(图5)。 
实施例2 
与实施例1相同的实验步骤，只是溶液在37℃或60℃下的水浴中磁力搅拌。 
该过程产生具有中空核和比静态工艺的壳更粗糙的壳，以及颗粒大小约200至400nm的Sr取代的CaP纳米球。 
在图7的形态中，示出了此Sr取代的CaP纳米球的球体，其具有粗糙外层和中空核。反应在0.6mM Sr掺杂的PBS中在60℃下搅拌1天。 
实施例3 
与实施例1相同的实验步骤，只是溶液置于60℃、80℃或100℃下的高压灭菌锅中以获得水热工艺。 
该过程产生具有致密壳和多孔内部，以及颗粒大小约200至500nm的Sr取代的CaP纳米球。经水热工艺，合成时间从1周大大缩短至1小时。 
在图8的形态中，说明了此Sr取代的CaP纳米球的具有光滑表面的球体。反应在0.6mM Sr掺杂的PBS中在100℃下水热化1小时。 
因此，实施例1至3和相应的图1至8示出磷酸盐缓冲溶液中Sr离子浓度可用于控制Sr取代的颗粒的形态。Sr浓度对羟基磷灰石纳米晶体的形态的作用之前已由Bigi等人(Inorganica Chaemica Acta 2007；360：1009-1016)观察到。在他们的研究中，当降低Sr含量时，Sr取代的纳米晶体的形态从板状变化成具不清晰边缘的更混乱的形状。之前的研究未揭示任何球体或球形颗粒的产生，并且他们未提出任何关于浓度如何影响形态的结果。在较高Sr含量下，晶体的尺寸随Sr含量的增加而增加。这些较大的纳米晶体，即0.5×0.1μm，具有沿平行于结晶c轴的方向伸长的轮廓非常清晰的形状。与此相反，本发明的Sr取代的 颗粒基本上为球形聚集体，称作多态纳米晶体的10至1000nm的纳米球和微米球。此外，除了当改变Sr离子浓度时的形态变化之外，当Sr离子浓度增加时纳米球的大小降低。实施例1至3产生四种类型的形态，如下所示：图1，直径约1μm的无规球形多孔颗粒；图2：具有中空核和多孔壳及直径约100至300nm的球形颗粒；图3，具有中空核和多孔壳及直径约200至500nm的规则球形颗粒；和图4至6，具有致密壳和多孔核及直径约100至500nm的球形颗粒。 
本发明不限定于借助Sr浓度控制形态。以下实例说明使用氟取代和硅取代所形成的颗粒形态的控制，后者可例举为硅酸盐类如二氧化硅。这些实例示出通过选择不同的取代离子或结合不同的取代离子，并通过改变取代离子浓度，可获得广泛范围的形状、大小和形态。 
实施例4 
在水热工艺中，由包含Ca2+、HPO4 2-、Na+、K+、Cl-、Mg2+的F掺杂的过饱和磷酸盐溶液合成氟取代的多孔CaP纳米球。为了模仿体液，将F掺杂的磷酸盐缓冲盐水的pH值控制为7.4。F-∶Ca2+∶HPO4 2-的初始比为x∶1∶10(其中x为0至0.22)。氟取代的CaP在过饱和溶液中结晶、生长并自组装。该合成为在60℃、80℃或100℃下在炉中进行的水热化过程。 
该过程产生直径约300至500nm的球形多孔的F取代的颗粒。 
图9中说明了使用0.04mM(图9a)和0.2mM(图9b)F掺杂的PBS在100℃下水热化24小时后此F取代的CaP颗粒的形态。当与例如图4至6中的Sr取代的颗粒的图像比较时，可认识到F取代的颗粒表面形态不同于Sr取代的颗粒的表面形态，即，Sr取代的颗粒具有比具有从表面突出的薄片的粗糙平面的F取代的颗粒 更光滑的表面。 
对氟取代的磷灰石的晶体形态的一种影响已示于Jha等人的Journal of Materials Science：Materials in Medicine 1997；8：185-191中。在他们的工作中，沉淀出类似球体或更加针状的晶体。发现沉淀温度的降低和氟离子浓度的增加趋于降低所产生的晶体纵横比。在本发明中，氟化物浓度用于获得其中聚集体具有可控的形态的氟取代的磷酸钙晶体的球形聚集体。在许多上述应用中，聚集体形态的控制是最重要的，然而，晶体形态的影响有限。 
实施例5 
由包含Ca2+、HPO4 2-、Na+、K+、Cl-、Mg2+的Si掺杂的过饱和磷酸盐溶液合成硅酸盐取代的多孔磷酸钙纳米球。为了模仿体液，将硅酸盐掺杂的磷酸盐缓冲盐水的pH值控制为7.4。SiO3 2-∶Ca2+∶HPO4 2-的初始比为x∶1∶10(其中x为0至10)。用硅酸盐取代的磷酸钙在过饱和溶液中结晶、生长并自组装。为了增加晶体生长和自组装的进程，将溶液置于80℃或100℃下的高压灭菌锅中。 
该过程产生直径约200至500nm的球形多孔的Si取代的CaP颗粒。 
图10中说明了使用6mM Si掺杂的PBS在100℃下水热化24小时后此Si取代的CaP颗粒的形态。类似于图9的F取代的颗粒，图10的Si取代的颗粒的表面相当粗糙并包括从表面突出的鳞片。然而，F取代的颗粒具有更规则的球形形状。 
实施例6 
由包含Ca2+、HPO4 2-、Na+、K+、Cl-、Mg2+(浓度参见表1)的过饱和磷酸盐溶液合成多孔磷酸钙纳米球。为了模仿体液(body fluid sounding)，在接下来的处理之前将该磷酸盐缓冲盐 水的pH值控制为7.4。Ca2+∶HPO4 2-的初始比为1∶10。磷酸钙在过饱和溶液中结晶、生长并自组装。为了增加晶体生长和自组装的进程，将溶液置于80℃或100℃下的高压灭菌锅中。 
该过程产生直径约300至500nm的多孔颗粒。 
图11中说明使用纯PBS在100℃下水热化24小时后此类颗粒的形态。 
实施例7 
在另一实施例中，缓冲溶液的Ca/P比为0.1至1.0mM内变化的钙和10mM的磷酸根离子，而Sr在0至0.6mM内变化，并在60℃下老化颗粒1周。磷酸钙颗粒在没有锶离子时沉淀为纳米鳞片的随机簇(random cluster)。在将锶添加到磷酸盐缓冲盐水中后，注意到了颗粒形态的变化。随着Sr浓度增加到0.06mM，鳞片状CaP颗粒聚集体比由无锶离子的溶液获得的聚集体更规则。Sr离子进一步增加到0.15mM导致颗粒聚集成为具更小直径的球形。单个的CaP颗粒仍与鳞片状纳米磷酸钙组装。Sr增加到0.3mM后CaP颗粒的形态为在球体周围有鳞片状翼的球形。这些CaP颗粒的平均直径约为500nm。特别有趣的是这些CaP球体为中空的。当Sr离子的浓度增加到0.6mM时，CaP颗粒似乎完全为球形，并且直径为200nm至1μm。该样品的XRD分析表明具有(002)、(211)和(203)的磷酸钙的特定峰，证实这些球体为磷酸钙晶体。 
通过高角度环形暗视野(CaPADF)扫描透射电子显微镜(STEM)进一步分析了由0.6mM锶溶液所获得的CaP颗粒的结构。很明显CaP球体具有中空核和约100nm厚度的壳，图6。来自EDXS的元素分布图证实球体包含Ca、P、O和Sr，并贯穿样品均匀分布。元素分布图还证实球体的确是中空的，因为Ca、P、O和Sr信号仅沿壳分布。 
很明显在该矿化过程中，锶离子的添加是关键因素，其不仅改变组成，还改变磷酸钙的形态和结构。磷酸钙的形态从鳞片状颗粒的随机簇变化为鳞片状颗粒的规则簇，变化为具有粗糙表面的球形颗粒，变化为具有粗糙壳的中空球体，和最终变化为具有光滑壳的中空球体。该现象说明仅借助无机离子改变CaP的形态和结构的可能性，这与结构导向(structure directing)表面活性剂截然相反。本发明提供确保最终材料为掺杂CaP而并无其他残留物或其他晶体如磷酸锶的方案。 
锶掺杂的磷酸钙的形态不仅取决于Sr离子浓度，还受钙与磷酸根之比的影响。在该系统中，Sr浓度和钙与磷酸根之比越高，形状变得越呈球形。 
举例来说，当Ca/P比为0.1时，对于0.6mM锶浓度，获得直径20至40nm的CaP颗粒，然而当增加Ca/P比至1.0时，CaP生长成纳米鳞片，具有与花样形态一起聚集的趋势。当Ca/P比进一步增加到2.5时，鳞片状颗粒自组装成直径0.6至1μm的球形颗粒。此外，当Ca/P比增加到5.0时，CaP颗粒显示具有多孔结构的完整的球状形态，并且直径增加到约1至5μm。图9′示出具有比例增加的离子掺杂CaP颗粒：(A)0.1、(B)1.0、(C)和(D)2.5、(E)和(F)5.0。 
溶液处理的温度也对所得颗粒的形态具有较大的影响。当在60℃下处理1周后，包含1.0mM钙离子、10mM磷酸根离子和0.6mM锶离子的溶液产生完整的中空CaP球体。当增加温度至100℃时，在1小时处理后形成球状CaP纳米颗粒。这些颗粒具有直径200至500nm，并被纳米鳞片所覆盖。12小时的反应后，CaP球体似乎更光滑，球体的直径增加至500至800nm。24小时的反应后CaP球体的直径进一步增加到600nm至1μm，表面变得比12小时反应后所获得的球体表面更粗糙。长且鳞片状颗粒从CaP 球体的内部呈放射状生长。由0.06mM Sr2+浓度制备的CaP球体在60℃下不产生CaP球体，但随着温度增加到100℃，易于形成球状颗粒。 
除了锶，可向磷酸盐缓冲溶液添加其他离子如氟和硅酸根离子例如SiO3 2-，如在上述实施例中所示，其类似于Sr，为骨矿化中的天然取代。 
在向磷酸盐缓冲溶液添加这些离子并在100℃下处理12和24小时后，形成形态可控的氟和硅掺杂的CaP(F-CaP和Si-CaP)颗粒。F-CaP颗粒在仅12h后就形成球体(图6A)。针状颗粒从球形内核呈放射状生长以产生完整的球体。处理24小时后，氟掺杂的CaP颗粒变成球形。然而，硅掺杂的CaP颗粒显现为球形。反应温度在Si/F-CaP系统中的球形颗粒形成中起重要作用，优选温度应为高于60℃。图10′示出在100℃下处理包含0.2mM氟离子的磷酸盐缓冲溶液(A)12小时和(B)24小时，以及处理包含0.15mM硅酸根离子的磷酸盐缓冲液(C)12小时和(D)24小时所制备的磷酸钙球体的SEM图像。 
静态工艺中增加反应温度的作用类似于水热法的作用。高温不仅增加锶掺杂的CaP球体的形成速率，而且还能够制备在低温下不能制备的氟和硅掺杂的CaP球体。 
如前所述，额外的热处理不是必须的，也可热处理使用根据本发明的方法制造的颗粒以改变晶体的形态或结晶度。为此，选择在高温炉中煅烧或在水基质中熟成。 
实施例8 
根据实施例1用0.15mM Sr溶液制造包含球形Sr取代CaP颗粒的牙膏，球体的大小为100至300nm，颗粒为具中空核和多孔壳的球形。将7重量％CaP颗粒添加到商购可得的牙膏中(ACTA，Cederbloms， Sweden)。该研究的目的为评价含CaP颗粒的 牙本质小管的闭合。 
方法：使用来自拔掉的牙齿的人牙本质的标准化板(standardized slab)进行体外实验。从拔掉的牙齿切割并且通过磨削和抛光来标准化试验表面，从而制备盘(disc)。将其蚀刻以除去任意污点层(smear layer)从而提供良好的观察，将板切成两半以提供相匹配的试验和对照样品。以圆周运动轻柔擦拭牙本质块的抛光表面分别处理30秒。使处理材料置于牙本质块上三十几秒，然后用自来水使劲地冲洗约60秒以除去牙膏残留。然后干燥样品并置于37℃的仿唾液浴中5分钟。5分钟后，再次处理样品，随后进行相同的过程直至处理各样品总计10次。为了可视化效果，装载所有样品以用于扫描电子显微镜(SEM)。 
结果：在SEM评价下注意到对照样品具有丰富的开口牙本质小管，而处理的样品具有非常少的开口小管。小管均被残留的CaP颗粒封闭。 
实施例9 
以下，将参考三种不同的方法详细描述在人体或躯体模拟环境中形态可控和控制从制备的颗粒释放离子如释放锶的离子取代的CaP颗粒的形成，所述三种不同方法利用1)基于杜氏磷酸盐缓冲溶液D8862(D-PBS)的盐溶液，2)自制的Tris-HCl和3)蒸馏水，下文中分别称作M1、M2和M3。这些盐溶液的实例示于表1。可改变盐溶液的一种或多种组成的浓度。 
表1. 
对于医学应用，必须了解并控制释放离子的速率和量，为此，通常进行释放研究。因此，相对于取代离子，特别是Sr离子的释放，评价本发明的CaP颗粒。为了模拟躯体条件，通常在模拟体液中进行体外释放试验，该模拟体液为含有类似于人血浆的那些的组成并且pH值约7.4的溶液。各种溶液是已知的，某些仅包含无机组分，其他也试图模拟有机物质。 
其中随时间测量液体中的锶浓度的此类释放研究之前已对于不同类型的生物材料如，例如生物玻璃、骨水泥或多层纳米颗粒进行，常见的有两种不同方法。在连续模式下，测定累积释放，并且一直在相同液体中保持材料，然而在动态模式中，每次取样后更换液体，因此液体的初始组成在各时间都是相同 的并仅测量两次取样之间的释放量。为了获得关于释放离子的有效的、相对毒素浓度的信息，需要进行细胞研究，其可在体外或体内进行。 
在M1中，将1升D-PBS和0.6mM硝酸锶(Sr(NO3)2)填入玻璃容器中，紧密密封并在100℃下在炉中放置24小时。液态前体也可基于模拟体液(SBF)。D-PBS和SBF的组成可与下表中血浆的组成相比。 
表2 
M2基于自制的PBS，称为Tris-HCl。用500ml 0.1M三(羟甲基)甲胺(Tris)、420ml 0.1M HCl和5.844g NaCl，然后用蒸馏水填至1升溶液来制备1升该溶液。pH值调至7.4。 
M2的基础版本为尝试用自制的PBS模拟D-PBS并尝试研究缓冲溶液的影响。以与它们在用于M1的D-PBS中相同的浓度将所有期望的离子(Ca、P、Mg)添加到Tris-HCl。将0.6mM硝酸锶添加到溶液中，然后填入玻璃容器中并保持在100℃下24h(比较M1)。 
研究的一个目的为示出镁对形态的影响。因此在四个相同的步骤中，降低溶液中的Mg浓度，为0.5mM初始Mg浓度的0.75、0.5、0.25和0倍。这些方法分别命名为M2-0.38Mg、M2-0.25Mg、M2-0.13Mg、M2-0Mg。此外，研究各自老化的时间依赖性，因而制备反应时间为1小时和24小时二者择一的所有变体。 
另一目的为示出锶对形态的影响，因而在无锶的情况下制 备0.5mM Mg和无Mg 24-h变体(M2-0Sr、M2-0Mg-0Sr)并且在M2-H2O中使用与M2中相同的离子浓度，但蒸馏水为液态前体，其导致初始pH为7.2至7.3。上述表格示出所有变体的组成。 
M3中，蒸馏水用作液态前体。将两种单独制备的溶液(在第一种中P和HCO3，在第二种中Ca)室温下磁力搅拌下添加到烧杯中。5分钟的反应时间后取出样品。 
在M3-Sr中，加入0.6mM锶，并在5分钟和1小时后取出样品。在M3-Sr-0HCO3 -中，不添加碳酸盐并在M3-Sr-2x和M3-Sr-5x中制备溶液，因此在尝试增加每升溶液球体的量时，离子浓度分别通过因子2和5而增加。用扫描电子显微镜(SEM)研究所制备的颗粒的形态。 
X射线衍射用于测定颗粒的晶体结构。为此，用乙醇-颗粒-溶液覆盖硅晶片，蒸发乙醇，并使用Cu Kα射线(λ＝1.5418)用X射线衍射仪检测样品。借助计算机(DIFFRACplus EVA，Bruker)分析所得图谱。 
为了从取代的离子获益，必须在体内降解CaP颗粒。降解依赖于许多因素，如，例如pH值，对于人血液其在7.35和7.45之间不等，以及材料的结晶度和向CaP结构引入晶格畸变的掺杂或取代基团或离子。例如通过降低pH值、镁和锶的掺入以及通过降低的结晶度或增加的表面积使降解更快发生。通常CaP的溶解性如下：ACP＞TTCP＞＞αTCP＞＞β-TCP＞＞CaP，这意味着无定形磷酸钙比磷酸三钙降解更快，磷酸钙为最稳定的CaP。 
为了说明根据本发明制造的锶掺杂的CaP颗粒向浸透液中的锶释放及其对周围pH值的依赖性，制备四种不同的溶液，并且将100mg来自M1的球体置于含各100ml四种溶液之一的瓶中。密封瓶并在37℃轻柔震荡(沿水平方向25rev/min)以模拟躯体环境。所使用的溶剂为Tris-HCl，分别将其pH值调为6.8、7.4和8.0， 因而在人血液pH值左右，以及简易D-PBS(P4417，含P、K、Na、Cl)，pH值也为7.4。 
在15分钟和13天之间的反应时间后取出12个样品。每次用移液管取出瓶中溶液上部的2ml并装入管中。然后，用2ml特定溶剂重新装入瓶中。然后，离心样品，如果观察到沉淀，则将液体倾倒入新管中，在2ml特定溶剂中分散沉淀。在接下来的取样后，在该情况下，用该2ml溶液代替2ml新鲜溶剂重新装入瓶中。此外，将20mg颗粒溶于5ml 1摩尔HCl以测定颗粒的全部组成。 
用电感耦合等离子体-光学发射光谱测定法(ICP-OES)测定样品中的离子浓度。 
在四种不同溶液中老化13天后，离心颗粒，在乙醇中洗涤并干燥。SEM用于检测形态变化。 
图1′中的SEM照片示出来自三种不同基本方法的颗粒，各包含锶。所有颗粒类型显示球形形状，但各具有均一形态。示于图1a′的来自M1的颗粒具有多孔表面，直径在1和2μm之间，示于图1b′的M2颗粒显示绳状结构并且大小为300nm至2μm，示于图1c′的用M3-Sr产生的球体仅为100至200nm小，并具有不能在图像中分辨的光滑表面结构。X射线衍射确定来自M3的球体为无定形，而来自M1和M2的那些球体具有CaP晶体结构。 
在实验M2-H2O中，用水置换Tris-HCl缓冲溶液，所得颗粒的形态显示高的多样性，宽的粒度分布。然而，大多数颗粒为球形形状，某些是中空的，其他是多孔或毛皮样。几个代表性实例可见于图2′。 
在图3′中，组合了含变化的锶和镁浓度的M2的实验结果。Mg浓度沿垂直方向从图第一行的0.5mM下降到最后一行的无Mg，然而前两列显示出1h和24h的反应时间之间的差异，列2和 3分别比较含0.6mM和0mM的Sr浓度的颗粒。很明显，镁具有对球体表面结构的影响。而含0.5mM Mg的24h颗粒具有毛球外观(图3b)，无Mg颗粒高度多孔，呈现花样(图3k)。形态变化的边界为Mg浓度0.38mM左右。该组成的照片上的颗粒(图3e)示出花和绳状外观之间的形状，但表示两种状态的颗粒显示在样品中。在图3′的第一列中，可看到1h反应时间后颗粒的状态。花样颗粒的核仁已经具有相同的结构，但还不是完整的球形(图3f、h、j)，然而0.5mM和0.38mM Mg球体的核仁为含毛皮样表面并且比24小时颗粒更小的颗粒(图3a、3d)。在这些实验中Mg的作用为主导而Sr的作用很小，但明显地当Sr存在时无Mg的花更小(图3k、3l)。在包含球体的Mg的照片中(图3b、3c)，未能发现Sr的显著影响。 
含变化的Mg浓度的颗粒的XRD图谱(反应时间24h)示于图4′。对于所有样品，可检测到典型的磷酸钙峰。 
用M3的变体制备的颗粒示于图5′。使用M3制造颗粒(a)，显示与M3-Sr即，含0.6mM锶的版本无差异(图1c)。来自含双倍离子浓度的溶液的(b)中的颗粒，即M3-Sr-2x，仍显示球形颗粒，然而五倍浓度，即M3-Sr-5x，产生不规则形状的颗粒(c)。用M3-Sr-0HCO3 -生产的无碳酸根的颗粒(d)更小(＜100nm)。XRD-分析产生随机图谱，其意味着所有M3的颗粒是无定形的。XRD图谱的一个实例显示图6′。 
M1的使用产生约130mg颗粒/升D-PBS。使用M2产生180mg颗粒/升缓冲溶液，而M3产生190mg/升溶液。如果考虑到每质量所用盐的颗粒的质量，生产率的差异变得甚至更加明显。这些生产率分别约为13.3、24.0和55.9mg/g。 
在图7′中，显示锶释放研究曲线。所有曲线的级数是对数形。开始时释放进行得非常快，以致于在约15min后的第一测量 点，锶浓度已经在终浓度的20至45％之间，而2天的释放后，变化是极微的。 
锶的释放量取决于溶液。从而当Tris-HCl溶液的pH值越低时释放越高。如下表所示，13天后溶液中锶的释放总量示出pH增加1.2使释放降低至几乎50％。令人惊讶地是，D-PBS中的释放速率比Tris-HCl中的那些更低，最终的锶浓度为8.20mg/g·l，因此小于具有相同pH值的Tris-HCl的锶浓度的四分之一。 
表3.13天后Sr的累积释放 
此外，颗粒中总量锶的释放百分比通过使用如下表所示的颗粒组成的数据来计算，通过在HCl溶解的颗粒中的ICP测量实现。13天后在pH6.8的Tris-HCl中溶解20.3％锶，而在D-PBS中，仅在溶液中检测到球体的3.5％锶含量(比较上表)。 
表4.来自M1的粉末的组成 
37℃下分别在Tris-HCl和D-PBS中老化后，来自M1的颗粒的形态稍微变化，可见降解迹象，但颗粒形状仍为球形。然而，如分别相应于Tris-HCl pH6.8、Tris-HCl pH7.4和Tris-HCl pH8.0的图9a-c所示，在Tris-HCl实验的SEM照片之间无可见的显著差异。所有颗粒示出多孔表面，某些甚至获得深的裂纹，在图9a中尤其可见。图9d所示在D-PBS pH7.4中老化的颗粒在与原始颗粒的照片(图1a)相比较时变化最大。许多颗粒在表面获得鳞片或 薄片，意味着不仅发生降解，还发生材料的重形成和再造。13天后溶液的pH值测量为6.75、7.15、7.75和7.45，因而，Tri-HCl溶液的pH值降低，D-PBS的稍微增加，但是所有这些变化是可以忽略的，pH值可被认为是恒定的。 
贯穿实验M2-H2O，其中Tris-HCl缓冲溶液被水置换，可研究pH值对颗粒形状的影响。这是由于pH值在无缓冲液的整个反应时间中不保持恒定。该变化参数可产生不同过程的优势，并导致不同形态。因此，来自该方法的颗粒显示形态和大小的高度多样性。从该结果来看，可总结为颗粒的形态可通过调节反应溶液的pH值，并还可能通过在整个反应期间保持其恒定或安排pH值特定的变化来控制。在关于镁对来自M2的球体形态的影响的研究中，可检测到两种不同结构类型，这两者之间转变的关键浓度似乎为约0.38mM Mg的组成，其中照片示出具有为两种典型形状的混合物的形态的颗粒(图3′e)。或许，形成花样颗粒的核类似于含较少镁的球体来形成，其后鳞片在表面上生长。然而，该假设不能与1h实验的结果相容，而1h实验揭示了颗粒的成核是不同的。但是，虽然如此，鳞片在绳状结构的球体表面生长是可能的，因而由混乱的核产生一种花形态。此外，发现所有颗粒，无论含有Mg的量多少，都具有CaP结构。 
如果比较所有方法的结果，很明显液态前体影响材料的形成。锶是D-PBS中形成球体的关键因素，但在M3中，锶的添加不具有可见的影响，尽管碳酸根是有影响的，但在M2中无锶的颗粒仍为球形形状，而镁比锶对形态具有更大的影响。此外，用含有相同盐组成、只是不同的缓冲液(M1、M2)的溶液制备的颗粒的形态相当不同(图1b、1c)，这是由于Tris-HCl颗粒的表面是有结构的，但PBS颗粒具有平坦的、仅稍微凹陷(dimpled)的表面，此外后者显示为中空，但来自M2的球体是实心的。 
在本申请所描述的方法中，观察形态的变化，但颗粒的形状基本上总是球形。 
由于来自M3的颗粒为无定形的，该颗粒的降解会发生得比M1和M2的更快。因此，例如在炉中可选地热处理由M3形成的颗粒以获得晶体材料。用于热处理的方法为在分散有颗粒的溶液中熟成，因此凝聚的风险更小。 
所制备的颗粒用于医学应用的特殊性能(qualities)可分成两组。第一组为所掺入的锶的释放，可用于刺激骨再生，可想象的为局部注射，而第二组为小尺寸的，和球形形状的颗粒显示用于作为生物相容载体颗粒而应用的良好条件。其生物相容性使其适合于在躯体中循环，并可当行使功能时，运载所吸附的对象物到达在躯体中需要它们的准确位置。这意味着试剂的损失更小，活性组分的总剂量可降低。为了良好的有效性，具有大的比表面积的高度多孔或平坦中空颗粒，分别大的体积是具有优势的，因此该性质为来自M1和M2的颗粒提供的性质。可想象的应用为药物和基因运载或作为标记物的用途。 
对于离子取代CaP颗粒的一个应用在于牙科治疗用产品。已知氟在该应用领域中具有有利的性质。锶具有抗牙齿超敏性的作用，并且颗粒的球形形状进一步配合良好以封闭牙本质管，从而防止液体从中流过，这将降低超敏性和感觉过敏。 
由于颗粒可具有各种横截面形状，对于本申请的目的，术语直径意指有效直径。 
虽然与目前认为最实用和优选的实施方案一起描述了本发明，但应理解本发明不受限于所公开的实施方案，相反，其意于覆盖各种修改和所附权利要求内的等同的更改。 
实施例10 
已在骨腔(cavital bone)缺损模型中使用含0.6mM Sr溶液的实施例1进行动物研究来调查球形Sr取代的CaP(Sr-CaP)颗粒对骨再生的作用，球体的大小为100至1000nm，颗粒为具有中空核和光滑壳的球形。 
方法：在材料植入物预操作之前12周将动物预操作。用2L/min O2、400cm3/min N2O、200cm3/min氟烷(halothan)麻醉重500至600g的雄性威斯塔大鼠(Wistar rat)。用碘伏洗涤尾巴三次，并在尾根处结扎以防止出血。用外科手术方法除去尾尖，用具有包括塞的特殊钻头(driller tip)由尾椎骨的远端侧钻孔出缺陷。尺寸为直径2mm和3.5mm深，以便标准化缺陷的深度。为了阻止椎骨的自再生，将柯氏线(kirschen wire)植入孔中。使用非可吸收的聚丙烯单丝4/0Premilene 45cm缝合线缝合创口。通过X射线追踪柯氏线的位置。12周后麻醉动物，通过如上所述的相同步骤洗涤。除去柯氏线植入物。 
使用前在灭菌条件下预混合球形Sr-CaP粉末和2滴自体血液。缺陷用Sr-CP(n＝5)、骨芯片(n＝5)或留空(n＝7)作为阴性对照填充，通过如上所述的相同步骤封闭创口。所有手术步骤均在无菌条件下。在它们的耳朵和耳标中用切口标记动物。为了追踪骨向内生长和骨Sr-CP再生，通过单一同位素nanoSPECT-CT分析骨芯片和空缺陷。nanoSPECT-CT一周进行一次，共六周，在第12周进行最终的分析。12周后，过度麻醉动物，并通过放血对动物进行生理安乐死，外科手术除去操作的椎骨和下一健康椎骨，置于15ml 4％福尔马林中，并通过微CT分析。 
结果：12周后，使用Sr-CP在所填充的孔缺陷中形成小梁骨(trabecular bone)。骨整合(Bony consolidation)被增强，约总缺陷体积的80％被新形成的骨填充。然而，在固定有骨芯片的孔中没有骨整合。结果显示这些球形CaP颗粒作为骨空隙填料材料的良好的潜在应用。 

Claims (17)

1.一种用于形成基本上为球形的离子取代的磷酸钙化合物颗粒的方法，其包括以下步骤：
-提供水溶液，所述水溶液包括钙离子和磷酸根离子，其中所述溶液具有2.0至10.0范围内的初始pH，和其中所述溶液进一步包括取代离子Sr2+、F-或Si4+之一；和
-根据a、b、c、d或e在溶液中通过自组织过程来沉淀所述颗粒，其中：
a.为静态工艺，其中所述溶液以0.15mM至0.3mM的浓度包括Sr2+，和其中所述溶液具有37至60℃范围内的温度，以产生具有中空核和多孔壳的球形；
b.为搅拌工艺，其中所述溶液以0.15mM至0.6mM的浓度包括Sr2+，和其中所述溶液具有37至60℃范围内的温度，以产生具有粗糙外层和中空核的颗粒；
c.为水热工艺，其中所述溶液以0.15至0.6mM的浓度包括Sr2+，和其中所述工艺在60至100℃范围内的温度下进行，以产生具有致密壳和多孔核的球形颗粒；
d.为水热工艺，其中所述溶液以0.04至0.2mM的浓度包括F-，和其中所述工艺在80℃和100℃之间进行，以产生球形多孔的F取代的颗粒；
e.为水热工艺，其中所述溶液以6mM至10mM的浓度包括Si4+，和其中所述工艺在80℃和100℃之间进行，以产生球形多孔颗粒，和
f.为静态工艺，其中所述溶液以0.6mM的浓度包括Sr2+，和其中所述溶液具有37至60℃范围内的温度，以产生具有致密壳和多孔核的球形。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液包括钙、镁和磷酸根离子以及选自钠、钾、氯、碳酸根或硫酸根离子的一种或多种，并且所述离子的浓度为：
钙离子在0.01×10-3M至25×10-3M的范围，
镁离子在0.01×10-3M至15×10-3M的范围，
钠离子在0.01×10-3M至1420×10-3M的范围，
钾离子在0.01×10-3M至1420×10-3M的范围，
氯离子在0.01×10-3M至1030×10-3M的范围，
磷酸根离子在0.01×10-3M至10×10-3M的范围，
碳酸根离子在0.01×10-3M至270×10-3M的范围，或
硫酸根离子在0.01×10-3M至5×10-3M的范围。
3.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述Ca/P比为0.1，1.0，2.5和5.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液进一步以0.38至0.5mM的浓度包括Mg2+。
5.一种颗粒，其通过用于形成基本上为球形的离子取代的磷酸钙化合物颗粒的方法获得，其中所述方法包括以下步骤：
-提供水溶液，所述水溶液包括钙离子和磷酸根离子，其中所述溶液具有2.0至10.0范围内的初始pH，和其中所述溶液进一步包括取代离子Sr2+、F-或Si4+之一；和
-根据a、b、c、d或e在溶液中通过自组织过程来沉淀所述颗粒，其中：
a.为静态工艺，其中所述溶液以0.15mM至0.3mM的浓度包括Sr2+，和其中所述溶液具有37至60℃范围内的温度以产生具有中空核和多孔壳的球形；
b.为搅拌工艺，其中所述溶液以0.15mM至0.6mM的浓度包括Sr2+，和其中所述溶液具有37至60℃范围内的温度以产生具有粗糙外层和中空核的颗粒；
c.为水热工艺，其中所述溶液以0.15至0.6mM的浓度包括Sr2+，和其中所述工艺在60至100℃范围内的温度下进行以产生具致密壳和多孔核的球形颗粒；
d.为水热工艺，其中所述溶液以0.04至0.2mM的浓度包括F-，和其中所述工艺在80℃和100℃之间进行以产生球形多孔的F取代的颗粒；
e.为水热工艺，其中所述溶液以6mM至10mM的浓度包括Si4+，和其中所述工艺在80℃和100℃之间进行以产生球形多孔颗粒，和
f.为静态工艺，其中所述溶液以0.6mM的浓度包括Sr2+，和其中所述溶液具有37至60℃范围内的温度，以产生具有致密壳和多孔核的球形。
6.一种由结晶的、无定形的或二者的多个较小单元的聚集体所组成的磷酸钙化合物的颗粒，磷酸钙材料的特征在于，所述磷酸钙颗粒包括浓度大于5重量％且不大于35重量％的取代离子锶，并且所述颗粒具有中空核和多孔壳。
7.根据权利要求6所述的颗粒，其中所述锶浓度为大于5％小于30％。
8.根据权利要求6所述的颗粒，其中所述锶浓度为大于15％小于20％。
9.根据权利要求6所述的颗粒，其中所述锶浓度为大于5％小于10％。
10.根据权利要求6所述的颗粒，其中所述颗粒进一步包括镁，并且其中所述镁浓度为0和10重量％之间。
11.根据权利要求10所述的颗粒，其中所述镁浓度为大于1％小于10％。
12.根据权利要求10所述的颗粒，其中所述镁浓度为大于3％小于8％。
13.根据权利要求10所述的颗粒，其中所述镁浓度为大于3％小于5％。
14.根据权利要求5至13任一项所述的颗粒的用途，所述用途为在药物运载应用中的用途，所述用途为通过用药物、对照物、放射性标记颗粒填充所述空腔和/或孔，或者将所述药物、对照物、放射性标记颗粒吸附至或附着于所述颗粒表面来药物运载；或者所述用途为用于运载基因或生长因子的用途，所述用途为通过用所述基因和/或生长因子填充所述空腔和/或孔，或者将所述基因和/或生长因子吸附至所述颗粒表面来运载所述基因或生长因子；所述用途为用于控制离子释放的用途。
15.根据权利要求5至13任一项所述的颗粒的用途，所述用途为制备用于牙科微创和预防性治疗的组合物的用途；或制备用于牙周炎的治疗的组合物的用途；或制备作为龋洞填充材料或作为植入材料或作为重金属离子吸附剂的用途；或制备作为用于治疗敏感牙根的牙膏中的填料颗粒的用途；或制备作为用于牙釉质治疗的洁牙带或膏、牙膏、洗口液、漱口水、口气清新剂、牙科用乳霜、漂白和增白膏的用途；或作为食品补充剂和口香糖的用途。
16.一种组合物，其包括根据权利要求5至13任一项所述的颗粒，其中所述组合物包括对照物和放射性标记颗粒，所述组合物用于药物运载应用；或者所述组合物用于运载基因或生长因子，通过用所述基因和/或生长因子填充所述颗粒的空腔和/或孔，或者将所述基因和/或生长因子吸附至所述颗粒表面来运载所述基因或生长因子；或者所述组合物用于控制离子释放。
17.一种组合物，其包括根据权利要求5至13任一项所述的颗粒，所述组合物用于牙科微创和预防性治疗、牙周炎的治疗，或作为龋洞填充材料或作为植入材料或作为重金属离子吸附剂；或用于治疗敏感牙根的牙膏中的填料颗粒，以改善敏感性和治疗早期龋齿；或作为用于治疗牙釉质的洁牙带或膏、牙膏、洗口液、漱口水、口气清新剂、牙科用乳霜、漂白和增白膏；或作为食品补充剂和口香糖；或作为骨填料或用于骨生长刺激手术，其中所述颗粒包括Sr2+作为取代离子，所述Sr2用于离子释放；或用于骨修复和再生，或用于牙齿修复和再生。
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