CN109195590A - 聚合纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包括药物结合物的聚合纳米颗粒，包括其的药物组合物和通过向需要的患者给药这些聚合纳米颗粒治疗某些疾病的方法。

Description

聚合纳米颗粒
相关申请
本申请要求于2015年11月3日递交的美国临时申请号为62/250,137和于2016年7月5日递交的美国临时申请号为62/358,373的优先权，上述申请的全部内容在此通过引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及纳米技术领域，尤其是利用可生物降解的聚合纳米颗粒进行治疗剂传递的纳米技术领域。
背景技术
癌症是最具毁灭性的疾病之一，其包括多种遗传变异和细胞异常。这些复杂性和异质性促进癌细胞侵略性的生长，导致病人出现显著的发病曲线和死亡率(Das,M.et al.(2009)Ligand-based targeted therapy for cancer tissue(癌症组织的基于配体的靶向治疗).Expert Opin.Drug Deliv.6,285–304；Mohanty,C.et al.(2011)Receptormediated tumor targeting:an emerging approach for cancer therapy(受体介导的肿瘤靶向：一种癌症治疗的整合疗法).Curr.Drug Deliv.8,45–58).乳腺癌是发病率最高的癌症之一并且是导致妇女死亡的第二主要原因。紫杉醇(“PTX”)是一种在治疗乳腺癌及其他固体肿瘤时广泛使用的化疗药物(Holmes F.,et al.Phase II trial of taxol,anactive drug in the treatment of metastatic breast cancer.(紫杉酚的第二阶段试验，一种治疗转移性乳腺癌的活性药物)J.Natl.Cancer Inst.1991,83(24):1797–1805；Brown T.,et al.A phase I trial of taxol given by a 6-hour intravenousinfusion(6小时腹腔注射后紫衫酚的第一阶段试验).J.Clin.Oncol.1991,9(7):1261–1267；McGuire W.,et al.:Taxol:a unique antineoplastic agent with significantactivity in advanced ovarian epithelial neoplasms(紫杉酚：对晚期卵巢上皮性肿瘤具有显著活性的抗肿瘤剂).Ann.Intern.Med.1989,111(4):273–279).当与组装的微观蛋白结合时抑制微管蛋白扩散，将微管蛋白锁定在聚合状态(Jordan M.,Kamath K.:How domicrotubule-targeted drugs work？An overview(综述：靶向微管蛋白的药物如何工作？).Curr.Cancer Drug Targets 2007,7(8):730–742)导致细胞周期停止(Fuchs D.,Johnson R.:Cytologic evidence that taxol,an antineoplastic agent from Taxusbrevifolia,acts as a mitotic spindle poison.(来自短叶紫杉的抗肿瘤剂紫杉酚可以毒死有丝分裂纺锤体的细胞学证据)Cancer Treat..Rep.1978,62(8):1219–1222；SchiffP.,Horwitz SB:Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells.(在老鼠纤维母细胞中紫杉酚能够使微管蛋白稳定)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1980,77(3):1561–1565；Schiff P.,Horwitz S.:Taxol assembles tubulin in the absence of exogenousguanosine 5′-triphosphate or microtubule-associated proteins(在没有外源鸟嘌呤核苷5′-三磷酸盐或者微管相关蛋白质的情况下紫杉酚组装微管蛋白).Biochemistry1981,20(11):3247–3252；Schiff P.,et al.:Promotion of microtubule assembly invitro by taxol.(紫杉酚体外促进微管蛋白的组装)Nature 1979,277(5698):665–667).紫杉醇还抑制抗凋亡蛋白质BCL-2，从而诱导癌细胞凋亡(Haldar S.,et al.:Inactivation of BCL-2by phosphorylation.(磷酸化作用导致的BCL-2失活)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995,92(10):4507–4511).紫杉醇是一种非常有效的抗肿瘤剂，但是他的使用剂量很大并且需要重复治疗，这会产生很高的细胞毒性和耐药性，限制病人长期使用(Brown T.,et al.J.Clin.Oncol.1991,9(7):1261–1267；Wiernik P.,et al.:Phase I clinical and pharmacokinetic study of taxol.(紫杉酚的第一阶段临床和药代动力学研究)Cancer Res 1987,47(9):2486–2493；Wiernik P.,et al.:Phase I trialof taxol given as a 24-hour infusion every 21 days:responses observed inmetastatic melanoma.(每隔21天进行24小时输液后的紫杉酚第一阶段试验：在转移性黑素瘤中观察到的反应)J.Clin.Oncol.1987,5(8):1232–1239).
紫杉醇(PTX)最初为了治疗乳腺癌而被研发，研发成一种基于溶剂的制剂，由聚氧乙烯蓖麻油组成，聚氧乙烯蓖麻油在临床上与严重的过敏性反应有关。Nab-紫杉醇(Abraxane)是第二代制剂，其中紫杉醇(PTX)被封装在无溶剂的白蛋白纳米颗粒中(Yardley DA,et al.(2013)Randomized phase II,double-blind,placebo-controlledstudy of exemestane with or without entinostat in postmenopausal women withlocally recurrent or metastatic estrogen receptor-positive breast cancerprogressing on treatment with a nonsteroidal aromatase inhibitor.(在患有局部循环性或者转移性雌激素受体-阳性乳腺癌的绝经后妇女中进行的依西美坦(与entinostat同用或者不同用)随机第二阶段、双盲、安慰剂参照实验研究，与一种非类固醇芳香酶抑制剂一起进行治疗)J.Clin Oncol 31(17):2128-2135).Nab-紫杉醇可以比紫杉醇(PTX)更高的剂量给药，并且部分的解决过敏性反应(Ibrahim NK,et al.(2005)Multicenter phase II trial of ABI-007,an albumin-bound paclitaxel,in womenwith metastatic breast cancer.(在患有转移性乳腺癌的妇女中进行的ABI-007(一种白蛋白结合的紫杉醇)的多通道第二阶段试验)J.Clin.Oncol 23(25):6019-6026；YardleyDA et al.(2013),J.Clin.Oncol 31(17):2128-2135).另外，据发现，Nab-紫杉醇在治疗患有乳腺癌的病人时，比紫杉醇(PTX)更有效(Gradishar WJ,et al.(2005)Phase III trialof nanoparticle albumin-bound paclitaxel compared with polyethylated castoroil-based paclitaxel in women with breast cancer.(纳米颗粒白蛋白结合的紫杉醇与多乙基取代的蓖麻油基紫杉醇相比在患有乳腺癌的妇女中进行的第三阶段试验)J.Clin.Oncol 23(31):7794-7803；Blum JL,et al.(2007)Phase II study of weeklyalbumin-bound paclitaxel for patients with metastatic breast cancer heavilypretreated with taxanes.(对患有转移性乳腺癌并用紫杉类药物预先治疗过的病人进行一周一次的白蛋白结合的紫杉醇的第二阶段研究)Clin Breast Cancer 7(11):850-856；30；Gradishar WJ,et al.(2012)Phase II trial of nab-paclitaxel compared withdocetaxel as first-line chemotherapy in patients with metastatic breastcancer:final analysis of overall survival.(患有转移性乳腺癌病人的Nab-紫杉醇的第二阶段试验，与多昔紫彬作为第一线化疗剂相比：对所有幸存者的最终分析)ClinBreast Cancer12(5):313-321).因此，批准将Nab-紫杉醇用于治疗乳腺癌、NSCLC和胰腺癌的治疗证明了纳米颗粒制剂传递紫杉醇(PTX)的有效性。然而，紫杉醇(PTX)和Nab-紫杉醇作为一线治疗剂治疗局部循环的或者转移性乳腺癌的存活期分别为11个月和9.3个月(Rugo HS,et al.(2015)Randomized Phase III Trial of Paclitaxel Once Per WeekCompared With Nanoparticle Albumin-Bound Nab-Paclitaxel Once Per Week orIxabepilone With Bevacizumab As First-Line Chemotherapy for Locally Recurrentor Metastatic Breast Cancer:CALGB 40502/NCCTG N063H(Alliance).(每周一次紫杉醇与每周一次纳米颗粒白蛋白-结合的Nab-紫杉醇或者伊沙匹隆与贝伐珠单抗作为第一线化疗剂治疗局部循环的或者转移性乳腺癌相比的随机第三阶段试验：CALGB 40502/NCCTGN063H(联合))J.Clin Oncol.33(21):2361-2369),说明对更有效的解决耐药性发展的治疗剂存在强烈的需要。
紫杉醇(PTX)在很大程度上通过过表达ABC族转运蛋白诱导多重耐药性(MDR)表型(Barbuti AM&Chen ZS(2015)Paclitaxel Through the Ages of Anticancer Therapy:Exploring Its Role in Chemoresistance and Radiation Therapy.(长久以来紫杉醇的抗癌治疗：探索它在化学抵抗性和放射疗法中的作用)Cancers(Basel)7(4):2360-2371；Zhao Y,Mu X,&Du G(2015)Microtubule-stabilizing agents:New drug discovery andcancer therapy.(微管稳定剂：新药发现和癌症治疗)Pharmacol Ther.).在这些ABC转运蛋白亚类中，Pgp1(ABCB1，MDR1)的过表达代表了紫杉醇(PTX)抵抗性的主要机制(BarbutiAM&Chen ZS(2015)Cancers(Basel)7(4):2360-2371；Zhao Y,Mu X,&Du G(2015)PharmacolTher.).然而，经过经过多年研究，在能够增加紫杉醇(PTX)有效性并不产生不可接受的毒性的P-gp抑制剂方面所取得的进展是非常有限的(Gottesman MM,Fojo T,&Bates SE(2002)Multidrug resistance in cancer:role of ATP-dependent transporters.(癌症的多重耐药性：三磷酸腺苷-依赖型转运蛋白的作用)Nat Rev Cancer 2(1):48-58).
在临床上已经使用联合疗法解决与紫杉醇癌症治疗有关的问题。通过将紫杉醇与一种或者一种以上例如顺式铂氨、5-氟尿嘧啶(5-FU)或者吉西他滨之类的试剂一起联合使用，可以实验不同生物信号传导途径的协同作用降低每种化合物的剂量，从而克服与高剂量有关的化学疗法的抵抗性和副作用。使用靶向不同分子的多重药物可以引起遗传阻碍，癌细胞突变需要克服此遗传阻碍，因此使用靶向不同分子的多重药物可以延迟癌症进程。这还说明使用靶向相同细胞途径的多重药物可以产生协同效果，实现更好的治疗效果和更高的靶点选择性(Lehar J.,et al.Synergistic drug combinations tend to improvetherapeutically relevant selectivity.(协同药物联合使用能够改善治疗相关选择性)Nat.Biotechnol.27(7),659–666(2009)).纳米技术可以提供更智能的药物传递系统，从而在癌症治疗领域带来显著进展。
但是，由于低的生物利用率和在靶点位置药物的最佳生物分布不佳，传统的联合治疗没有能够成功的用于癌症治疗。Wang et al.显示使用硬脂酸盐-接枝壳聚糖低聚糖(CSO-SA)共同给药紫杉醇(PTX)和阿霉素(Zhao,M.et al.Coadministration ofglycolipid-like micelles loading cytotoxic drug with different action sitefor efficient cancer chemotherapy.(共同给药装载有不同作用位点的细胞毒素药物的药醣脂类胶束进行有效的癌症化疗)Nanotechnology 2009,20,055102).另一个研究使用聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)的纳米颗粒同时传递长春新碱(VCR)和异搏定(VRP)(Song,X.et al.PLGA nanoparticles simultaneously loaded with vincristine sulfate andverapamil hydrochloride:Systematic study of particle size and drug entrapmentefficiency.聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)纳米颗粒同时装载硫酸醛基长春碱和异搏定盐酸盐：颗粒尺寸和药物滞留效力的系统性研究J.Pharm.2008,35,320-329).还研发了脂质体传递制剂，用于传递槲皮黄素和长春新碱(VCR)(Wong,M.-Y.；Chiu,G.N.C.Simultaneousliposomal delivery of quercetin and vincristine for enhanced estrogen-receptor-negative breast cancer treatment.(槲皮黄素和长春新碱的同时脂质体传递用于加强的雌性激素-受体-阴性乳腺癌治疗)Anti-Cancer Drugs 2010,21,401-410).然而由于化疗药物的联合使用，这些制剂依旧显示高毒性。
在研究中，生物分子与化疗药物一起使用用于降低毒性并实现更好的治疗效果。Kwon et al.报道了聚(乙二醇)-嵌段-聚(D,L-乳酸)(PEG-b-PLA)胶束可以传递多重药物，包括紫杉醇(PTX)/17-烯丙基胺-17-二甲氧基格尔德霉素(17-AAG)(Kwon,G.S.etal.Multi-drug loaded polymeric micelles for simultaneous delivery of poorlysoluble anticancer drugs.(装载多重药物的聚合胶束用于同时传递可溶性差的抗癌药)J.Controlled Release 2009,140,294-300).已经有报道将紫杉醇(PTX)与BCL-2靶向的siRNA一起使用阳离子核心和纳米颗粒外壳用于治疗乳腺癌。Sugahara et al.显示了iRGD(肿瘤穿透肽)和不同类型的癌症治疗药物共同给药能够有效的抑制肿瘤生长和肿瘤累积(Sugahara KN,et al.Co-administration of a Tumor-Penetrating Peptide Enhancesthe Efficacy of Cancer Drugs.(共同给药肿瘤穿透性肽增强癌症药物的效力)Science.2010；328:1031–1035).在这些联合给药中，化疗药物的细胞毒性有效剂量被显著降低，同时减少副作用的发生，因此这种策略是利用单一化疗药物和生物分子的高级方法(Wang S.Z.,et al.TRAIL and Doxorubicin Combination Induces Proapoptotic andAntiangiogenic Effects in Soft Tissue Sarcoma in vivo.(TRAIL和阿霉素联合诱导体内软组织肉瘤中的凋亡作用和抗血管增生作用)Clin.Cancer Res.2010；16:2591–2604；Hossain MA,et al.Aspirin enhances doxorubicin-induced apoptosis and reducestumor growth in human hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo.(体外和体内人肝细胞癌细胞中阿斯匹林加强阿霉素诱导的凋亡并减少肿瘤生长)Int.J.Oncol.2012；40:1636–1642；Jin C.,et al.Combination chemotherapy ofdoxorubicin and paclitaxel for hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo.(阿霉素和紫杉醇的联合化学疗法用于体内和体外治疗肝细胞癌)J.CancerRes.Clin.2010；136:267–274).
进一步的，分子靶向治疗已经显现出是一种有前途的方法，可以克服传统化疗剂在癌症治疗中缺少专一性的问题。合成肽药物在癌症治疗中显示高度专一性、稳定性，并且比传统的蛋白质更易合成。然而，由于类似酶促降解、免疫原性和在血液中代谢时间短等因素，这些抗癌肽向目标区域的传递存在巨大问题。如果传递系统能够通过穿透身体阻断到达理想的肿瘤组织并且其自身体积或者在血液循环中的活性损失最小，则抗癌药的靶向传递将更为有效，可以选择性的杀死肿瘤细胞。这会改善患者存活率和生活品质，增加药物的细胞内浓度并同时减少剂量限制性毒性。传递肽药物的一个策略包括将携带细胞穿透肽(CPP)的共轭肽直接传递到细胞液中。然而，结合CPP会增加成本并降低肽药物的效力及稳定性，并且在某些情况下会增加毒性。一些肽治疗剂，例如NuBCP-9和Bax-BH3，选择性的结合癌细胞并引发凋亡。不幸的是，肽治疗剂的游离药物制剂要求使用大量的肽并频繁给药，因此增加成本并不便于治疗。
迫切需要一种能够有效的传递治疗剂的传递系统，例如将治疗肽单独或者与其他例如化疗剂的治疗剂一同传递进入癌细胞。并且，迫切需要能够治疗对传统化疗剂，例如紫杉醇或者Nab-紫杉醇具有耐受性的癌症的传递系统。
发明内容
在一个方面，这里提供了一种组合物，包括
a)聚合纳米颗粒，包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物；
b)一个或者一个以上化疗剂或者抗癌症靶向试剂；和
c)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)或者一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
在所述组合物的一个实施方案中，所述组合物包括一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID No：1)。
在所述组合物的另一个实施方案中，所述组合物包括另一个种肽，所述肽包括MUC1(SEQ ID No：2)。
在所述组合物的一个实施方案中，PLA的分子量在大约2,000和大约80,000道尔顿之间。
在所述组合物的一个实施方案中，所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物由PEG-PPG-PEG三嵌段共聚物和PLA化学共轭组成，其中，所述PEG-PPG-PEG三嵌段共聚物可以具有不同的分子量。
在所述组合物的一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有
a)化疗剂或者靶向抗癌症试剂；和
c)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)或者一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
在所述组合物的进一步的实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有
a)化疗剂或者靶向抗癌症试剂；和
b)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)。
在所述组合物的另一个进一步的实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有
a)化疗剂或者靶向抗癌症试剂；和
b)一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
在所述组合物的进一步的实施方案中，所述化疗剂是紫杉醇。
在所述组合物的依旧进一步的实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有紫杉醇和一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)，装载比例大约为9:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:9。
在所述组合物的另一个的实施方案中，所述化疗剂是吉西他滨。在所述组合物进一步的实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有吉西他滨和一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQID NO:1)，装载比例大约为9:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:9。
在所述组合物另一个实施方案中，所述化疗剂或者靶向抗癌症剂选自由阿霉素、道诺红菌素、地西他滨、依立替康、SN-38、阿糖胞苷、多昔紫彬、雷公藤内酯、格尔德霉素、17-AAG、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、卡铂、泰索帝(taxotere)、氨甲蝶呤，和硼替佐米所组成的组中。
在另一个方面，这里提供了一种药物组合物，包括
a)聚合纳米颗粒，包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物；
b)一个或者一个以上治疗剂；和
c)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)或者一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)，
所述药物组合物用于治疗选自由癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、新陈代谢功能紊乱、发育异常、心血管疾病、肝病、肠病、传染性疾病、内分泌病和神经系统紊乱所组成的组中的疾病。
在所述药物组合物的一个实施方案中，所述药物组合物包括一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID No：1)。
在所述药物组合物的另一个实施方案中，所述药物组合物包括另一个种肽，所述肽包括MUC1(SEQ ID No：2)。
在这里提供的任一药物组合物的一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成。
在这里提供的任一组合物的一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒进一步包括附着在所述聚合纳米颗粒外部的靶向部分，所述靶向部分是一种抗体、肽或者适体。
在另一个方面，这里提供了一种聚合纳米颗粒，所述聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成，其中，所述聚合纳米颗粒装载有紫杉醇和一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)。
在另一个方面，这里提供了一种聚合纳米颗粒，所述聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成，其中，所述聚合纳米颗粒装载有紫杉醇和一种肽，所述肽包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
在另一个方面，这里提供了一种治疗需要的患者所患癌症的方法，该方法包括对所述患者给药治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括
a)聚合纳米颗粒，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物；
b)化疗剂和/或抗癌症靶向试剂；和
c)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)或者一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
在所述方法的一个实施方案中，所述药物组合物包括一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID No：1)。
在所述方法的另一个实施方案中，所述药物组合物包括一种肽，所述肽包括MUC1(SEQ ID No：2)。
在所述方法的一个实施方案中，所述化疗剂是紫杉醇。在所述方法进一步的实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有紫杉醇和一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)，装载比例大约为9:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:9。
在所述方法的另一个的实施方案中，所述化疗剂是吉西他滨。在所述方法进一步的实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有吉西他滨和一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ IDNO:1)，装载比例大约为9:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:9。
在所述方法另一个实施方案中，所述化疗剂或者靶向抗癌症剂选自由阿霉素、道诺红菌素、地西他滨、依立替康、SN-38、阿糖胞苷、多昔紫彬、雷公藤内酯、格尔德霉素、17-AAG、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、卡铂、泰索帝(taxotere)、氨甲蝶呤，和硼替佐米所组成的组中。
在所述方法的一个实施方案中，所述癌症是乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、转移性的结肠癌、胰腺癌或者血液恶性肿瘤。
在所述方法的一个实施方案中，所述患者对紫杉醇或者Nab-紫杉醇治疗具有耐受性。
在所述方法的一个实施方案中，所述患者用紫杉醇或者Nab-紫杉醇难以治疗。
在所述方法的另一个实施方案中，所述患者用紫杉醇或者Nab-紫杉醇治疗后复发。
在另一个方面，这里提供了用于抑制细胞中紫杉醇消逝的方法，包括将该细胞与有效量的聚合纳米颗粒相接触，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物。
在所述方法的一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载着紫杉醇。
在依旧另一个方面，这里提供了用于阻断细胞中P-糖蛋白表达的方法，包括将该细胞与有效量的聚合纳米颗粒相接触，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物。
在依旧另一个方面，这里提供了用于阻断细胞中反向P-糖蛋白调节的耐药性的方法，包括将该细胞与有效量的聚合纳米颗粒相接触，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四逆转的共聚物。
在这里提供的任一方法的一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成。
在另一个方面，这里提供了用于产生对第一化疗剂具有耐受性的癌细胞的方法，所述方法包括将所述癌细胞与聚合纳米颗粒相接触，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物，其中所述聚合纳米颗粒装载有第二化疗剂，并且其中，所述癌细胞对第一化疗剂的耐受性是由于P-糖蛋白上调造成的。
在一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成。
在一个实施方案中，所述癌细胞是乳腺癌细胞。
在一个实施方案中，第一化疗剂的是紫杉醇。
在一个实施方案中，第二化疗剂的是紫杉醇。
在一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQID No：1)。
在另一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有一种肽，所述肽包括MUC1(SEQ IDNo：2)。
附图说明
下图构成本发明说明书的一部分，并且被包括来进一步解释本发明的各个方面。通过参照这些附图，并结合这里提供的具体实施方案的详细说明，本发明可以更好的被理解。
图1提供了聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物的聚合纳米颗粒的示意图。
图2提供了PLA、PEG-PPG-PEG和聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的FTIR光谱。
图3A显示了由1,100克/摩尔的PEG-PPG-PEG嵌段共聚物合成的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的核磁共振(NMR)光谱。
图3B显示了由4,400克/摩尔的PEG-PPG-PEG嵌段共聚物合成的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的核磁共振(NMR)光谱。
图3C显示了由8,400克/摩尔的PEG-PPG-PEG嵌段共聚物合成的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的核磁共振(NMR)光谱。
图4A和图4B显示了聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)聚合纳米颗粒的透射式电子显微镜(TEM)照片。
图5A、图5B和图5C显示了MCF-7细胞中，包含荧光染料、若丹明B的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的细胞内化作用。
图6A显示了25℃下，被包含的L-NuBCP-9从使用不同共聚物合成的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒中随时间变化的体内释放。
图6B显示了使用装载有L-NuBCP-9的不同的合成聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒在正常人脐静脉(HUVEC)细胞中的效力缺失，作为阴性对照。
图7A显示了抗癌肽、L-NuBCP-9-装载的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒在另一个主要人脐静脉(HUVEC)细胞系中的效力缺失。
图7B显示了装载有抗癌肽、L-NuBCP-9的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒与使用细胞穿透肽(CPP)进行药物传递相比，对MCF-7细胞增殖作用的传递效力。
图8A显示了用聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒治疗的BALB/c小鼠体内的血红蛋白水平，通过进行血液化学作用定义一般毒性，剂量为150毫克/千克体重。
图8B显示了用聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒治疗的BALB/c小鼠体内的嗜中性白细胞水平和淋巴细胞数量，通过进行血液化学作用定义一般毒性，剂量为150毫克/千克体重。
图8C显示了用聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒治疗的BALB/c小鼠体内的红细胞压积、MCV(平均红血球容积)、MCH(红细胞平均血红蛋白)和MCHC(平均红血球血色素浓度)，通过进行血液化学作用定义一般毒性，剂量为150毫克/千克体重。
图9A显示了用聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒治疗的BALB/c小鼠体内的天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平，通过进行血液化学作用定义一般毒性，剂量为150毫克/千克体重。
图9B显示用聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒治疗的BALB/c小鼠体内的碱性磷酸酶水平，通过进行血液化学作用定义一般毒性，剂量为150毫克/千克体重。
图9C显示用聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒治疗的BALB/c小鼠体内尿素和血液尿素氮(BUN)水平，通过进行血液化学作用定义一般毒性，剂量为150毫克/千克体重。
图10显示了注射了聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的BALB/c小鼠的脑、心脏、肝、脾、肾和肺的组织解刨图，通过对不同器官进行组织病例学研究定义任意常规毒性。
图11A和图11B显示了用包含LNuBCP-9的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒(8,800克/摩尔)治疗的小鼠体内欧利希腹水肿瘤(EAT)的肿瘤退化。
图12A显示了第一天在BALB-c小鼠体内的欧利希腹水肿瘤。
图12B显示了第21天，用包含L-NuBCP-9的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒(8,800克/摩尔)治疗的小鼠体内欧利希腹水肿瘤(EAT)的肿瘤生长抑制作用。
图12C显示了第21天未处理的、参照小鼠。
图13显示了装载胰岛素的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒在患有糖尿病的兔子体内控制血糖水平的效力。
图14显示了与聚精氨酸序列(RRRRRRRRRCQCRRKN)相连的MUC1细胞质结构域肽从聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒中释放的数据。
图15A显示了PLA72K-PEG-PPG-PEG12K纳米颗粒的扫描电镜照片。
图15B显示了PLA72K-PEG-PPG-PEG12K纳米颗粒的透射电子显微镜照片。
图16显示了装载有若丹明B的PLA72K-PEG-PPG-PEG12K纳米颗粒的细胞内化作用。
图17A显示了紫杉醇(在这里也叫做“PTX”)从聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒中的释放。
图17B显示了L-NuBCP-9从聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒中的释放。
图17C显示了紫杉醇(PTX)和L-NuBCP-9从在同一纳米颗粒中包含两种药物的二重/杂合聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的释放。
图18A显示了MCF-7细胞(左栏)和MDA-MB-231(右栏)细胞在暴露于包含有不同比例PTX:NuBCP-9(3:1、1:1和1:3)的纳米颗粒中的治疗。72小时之后，进行XTT实验分析细胞，结果表示为存活率百分比(三个独立实验的平均值±标准差)。
图18B显示了二重装载的纳米颗粒(即，包含紫杉醇(PTX)和NuBCP-9的聚合纳米颗粒)与单独装载的纳米颗粒时间-依赖型研究，其中，时间点是0小时(1)；治疗后12小时(2)；治疗后24小时(3)；治疗后48小时(4)和治疗后72小时(5)，使用激素依赖性乳腺癌细胞系MCF-7
图18C显示了使用不同药物浓度的单一制剂与游离或者单一装载的纳米颗粒相比对MCF-7细胞增值作用的抑制。
图18D显示了使用不同药物浓度的单一制剂与游离或者单一装载的纳米颗粒相比对MDA-MB231细胞增值作用的抑制。
图18E显示了紫杉醇和L-NuBCP-9分析在协同抑制MCF-7细胞方面的CI(复合指数)。所述CI小于1.0显示协同作用。本分析中实现的CI值在不同剂量下为0.1-0.3，显示在杀死MCF-7细胞方面具有很高的协同作用。
图18F显示了紫杉醇和L-NuBCP-9分析在协同抑制MDA-MB-231细胞方面的CI(复合指数)。本分析中实现的CI值在不同剂量下为0.1-1.0，显示在杀死MCF-7细胞方面具有相当高的协同作用。
图18G显示了用不同浓度的空纳米颗粒(圆圈)、紫杉醇(PTX)/纳米颗粒(三角)或者NuBCP-9/纳米颗粒(方块)治疗72小时后的MCF-7细胞。通过XTT试验确定细胞存活率。左边栏的结果代表了存活率百分比(三个独立实验的平均值±标准差)。注明的细胞被不同浓度的空纳米颗粒(圆圈)、紫杉醇(PTX)/纳米颗粒+NuBCP-9/纳米颗粒(方块)或者紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒(三角)治疗72小时。通过XTT试验确定细胞存活率。右边栏的结果代表了存活率百分比(三个独立实验的平均值+标准差)。
图18H显示了用不同浓度的空纳米颗粒(圆圈)、紫杉醇(PTX)/纳米颗粒(三角)或者NuBCP-9/纳米颗粒(方块)治疗72小时后的MDA-MB-231细胞。通过XTT试验确定细胞存活率。左边栏的结果代表了存活率百分比(三个独立实验的平均值±标准差)。注明的细胞被不同浓度的空纳米颗粒(圆圈)、紫杉醇(PTX)/纳米颗粒+NuBCP-9/纳米颗粒(方块)或者紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒(三角)治疗72小时。通过XTT试验确定细胞存活率。右边栏的结果代表了存活率百分比(三个独立实验的平均值+标准差)。
图18I显示了使用指定浓度的紫杉醇(PTX)/纳米颗粒单独治疗、使用指定浓度的NuBCP-9/纳米颗粒单独治疗和使用指定浓度的紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒治疗72小时后的MCF-7细胞的复合指数。通过XTT试验一式三份评价平均细胞存活率。图(左图)中数字1到7代表联合记载在表(右表)中。Fa表示受影响的百分率，CI代表复合指数。
图18J显示了使用指定浓度的紫杉醇(PTX)/纳米颗粒单独治疗、使用指定浓度的NuBCP-9/纳米颗粒单独治疗和使用指定浓度的紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒治疗72小时后的MDA-MB-231细胞的复合指数。通过XTT试验一式三份评价平均细胞存活率。图(左图)中数字1到7代表联合记载在表(右表)中。Fa表示受影响的百分率，CI代表复合指数。
图19A显示了紫杉醇(PTX)和NuBCP-9(单/二重)装载的纳米颗粒(NPs)在引导细胞死亡方面的作用。在指定时间内，未被治疗的MCF-7细胞(参照；顶部)、用NuBCP-9装载的PLA72K-PEG-PPG-PEG纳米颗粒治疗的MCF-7细胞(中间第二个)、紫杉醇(PTX)装载的PLA72K-PEG-PPG-PEG纳米颗粒治疗的MCF-7细胞(中间第三个)、只用游离紫杉醇(PTX)治疗的作为参照的MCF-7细胞(下面第二个)和紫杉醇(PTX)-NuBCP-9装载的PLA72K-PEG-PPG-PEG纳米颗粒治疗的MCF-7细胞(底部)的Annexin V/PI双染后共焦激光扫描微观纤维照片。
图19B显示了与L-NuBCP-9/紫杉醇(PTX)联合纳米颗粒、NuBCP-9纳米颗粒、紫杉醇(PTX)纳米颗粒、紫杉醇(PTX)和纳米颗粒相接触后，在凋亡早期、凋亡晚期或者已经死亡的阳性细胞百分比。
图19C显示了用于确定MCF-7细胞中BCL-2、微管蛋白、半胱天冬酶3的裂解形式和PARP蛋白质的裂解形式水平的蛋白质印迹实验数据。
图19D显示了通过图19C的蛋白质印迹实验数据确定的乳腺癌细胞系中BCL-2、微管蛋白、半胱天冬酶3的裂解形式和PARP蛋白质的裂解形式水平。
图20A显示了每周、每两周腹腔注射L-NuBCP-9肽和紫杉醇(PTX)装载的纳米颗粒所产生的肿瘤成长曲线(欧利希腹水肿瘤(EAT)同源肿瘤模型)。肿瘤生长曲线显示，与未被治疗的或者每周一次剂量治疗的结果相比，每两周腹腔注射L-NuBCP-9肽和紫杉醇(PTX)装载的纳米颗粒能够有效的控制欧利希腹水肿瘤(EAT)肿瘤生长。每个点代表所有EAT小鼠的平均肿瘤体积±标准差。*P<0.01,与参照PBS基团显著不同；**P<0.001,与参照PBS基团显著不同；P<0.001,与单独使用肽或者紫杉醇显著不同。.
图20B显示了每两周腹腔注射紫杉醇(PTX)装载的纳米颗粒所产生的肿瘤成长曲线(欧利希腹水肿瘤(EAT)同源肿瘤模型)。肿瘤生长曲线显示，与未被治疗的或者每周一次剂量治疗的结果相比，每两周腹腔注射L-NuBCP-9肽和紫杉醇(PTX)装载的纳米颗粒能够有效的控制欧利希腹水肿瘤(EAT)肿瘤生长。
图20C显示了每两周腹腔注射装载有NuBCP-9肽的纳米颗粒所产生的肿瘤生长曲线。肿瘤生长曲线显示，与未被治疗的或者每周一次剂量治疗的结果相比，每两周腹腔注射L-NuBCP-9肽装载的纳米颗粒能够有效的控制欧利希腹水肿瘤(EAT)肿瘤生长。
图21显示了从用参照、紫杉醇(PTX)参照、紫杉醇(PTX)装载的纳米颗粒、L-NuBCP-9装载的纳米颗粒和二重药物装载的纳米颗粒治疗21天小鼠中获得的肿瘤组织并用苏木精和曙红色染料(X400)染色的组织解刨图(从右到左)。在结合实验中只观察到非常低的Ki67表达；在L-NuBCP-9装载的纳米颗粒和紫杉醇(PTX)装载的纳米颗粒中观察到减少的ki67表达，而在载体参照和紫杉醇(PTX)参照中观察到高表达(P<0.05)。在联合药物装载的纳米颗粒中观察到最大量的TUNEL-阳性细胞；在L-NuBCP-9装载的纳米颗粒和紫杉醇(PTX)装载的纳米颗粒中观察到一些TUNEL-阳性细胞，而在载体参照中没有观察到TUNEL-阳性细胞(P<0.05)。
图22显示紫杉醇(PTX)和L-NuBCP-9(单/二重)装载的纳米颗粒的抗肿瘤活性。用空纳米颗粒(腹腔注射、方块、每周两次)、10毫克/千克L-NuBCP-9装载的纳米颗粒(腹腔注射、三角形、每周两次)、10毫克/千克紫杉醇(PTX)装载的纳米颗粒(腹腔注射、菱形、每周两次)、或者10毫克/千克紫杉醇(PTX)-NuBCP-9装载的纳米颗粒(腹腔注射、圆圈、每周两次)治疗患有欧利希肿瘤的小鼠进行21天循环。在指定的天数测量肿瘤。结果表示为肿瘤体积(平均值±标准差)。
图23显示了图22所描述的实验结果，结果表示为存活率百分比，所述存活率通过Kaplan-Meier分析空纳米颗粒(方块)、L-NuBCP-9装载的纳米颗粒(三角)、紫杉醇(PTX)装载的纳米颗粒(圆圈)和紫杉醇(PTX)-NuBCP-9装载的纳米颗粒(空方块)。对载体参照和紫杉醇(PTX)-NuBCP-9装载的纳米颗粒基团进行统计分析(P<0.001)。
图24显示了紫杉醇(PTX)和L-NuBCP-9(单/二重)装载的纳米颗粒在30毫克/千克剂量下的抗癌活性。在同源欧利希腹水肿瘤(EAT)模型中比较紫杉醇/纳米颗粒、L-NuBCP-9/纳米颗粒和紫杉醇+NuBCP-9二重/纳米颗粒以30毫克/千克的剂量每周腹内注射一次，一式三份。
图25显示了用FITC-标记的L-NuBCP-9纳米颗粒治疗12小时的MCF-7细胞的共定位研究结果。在洗涤后，固定细胞并用共焦显微镜观察。用线粒体选择性Mitotracker染料对线粒体进行染色(上图)。此外，用包含L-NuBCP-9-Rho B和绿色氟代染料标记(FITC)的紫杉醇的纳米颗粒治疗MCF-7细胞12小时。在洗涤后，固定细胞并用共焦显微镜观察。在线粒体中观察到L-NuBCP-9和紫杉醇(PTX)的共定位(下图)。
图26显示了一种示意图，代表了紫杉醇(PTX)-NuBCP-9双装载的纳米颗粒，作用于多重靶点，显示协同效果。
图27A显示了来自野生型MCF-7(MCF-7)和紫杉醇(PTX)-耐受性MCF-7(MCF-7/紫杉醇(PTX)-R)的全细胞溶解产物分析，用抗-P gp1、抗BCL-2和抗肌动蛋白抗体进行免疫印迹(参见实施例9)。
图27B显示了用100nM紫杉醇(PTX)或者100nM紫杉醇(PTX)/纳米颗粒处理12小时后的MCF-7或者MCF-7/紫杉醇(PTX)-R细胞。在洗涤后，固定细胞并用共焦显微镜观察(参见实施例9)。
图27C显示了MCF-7细胞(上面2图)和MCF-7/紫杉醇(PTX)-R细胞(下面2图)的共焦激光扫描显微镜照片，所述细胞用100nM紫杉醇(PTX)或者100nM紫杉醇(PTX)/纳米颗粒处理48小时，然后用AnnexinV/PI染色(参见实施例9)。
图27D显示了用100nM紫杉醇(PTX)和100nM紫杉醇(PTX)/纳米颗粒处理48小时后的MCF-7和MCF-7/紫杉醇(PTX)-R细胞。然后用Annexin V/PI染色细胞并用荧光激活细胞分类术分析。图中显示了PI+和/或annexin V+细胞百分比(参见实施例9)。
图27E显示了用100nM紫杉醇(PTX)、100nM Nab-紫杉醇(nab-PTX；Abraxane)或者100nM紫杉醇(PTX)/纳米颗粒治疗48小时的MCF-7和MCF-7/紫杉醇(PTX)-R的全细胞溶解产物。用抗-半胱天冬酶-3-CF、抗-PARP CF和抗肌动蛋白抗体进行免疫印迹分析(参见实施例9)。
图27F显示了用100nM紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒处理72小时后的MCF-7/紫杉醇(PTX)-R细胞的全细胞溶解产物分析。用抗-P-gp、抗-BCL-2、和抗肌动蛋白抗体进行免疫印迹分析(参见实施例9)。
具体实施方式
NuBCP-9是一种非常有前途的抗癌肽，她能够通过暴露BCL-2BH3结构物并阻断BCL-xL存活百分比选择性的诱导癌细胞凋亡(Kolluri SK,et al.A short Nur77-derivedpeptide converts Bcl-2 from a protector to a killer.Cancer Cell 2008；14:285–98).NuBCP-9与D-精氨酸八聚物r8结合用于细胞内传递，这种修饰作用已经被报道可以通过诱导BCL-2-独立细胞致死(包括膜破裂)减少选择性。通过新型的聚合聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒腹膜内注射给药L-NuBCP-9肽的持续传递能够有效诱导欧利希肿瘤的完全退化(参见，例如，图11和图12，以及实施例7)。制备这类纳米颗粒的特点和过程公开在WO 2013/160773中，其全部内容通过引证在此并入本文。
纳米颗粒(在这里也叫做“NPs”)可以制成纳米胶囊或者纳米球。可以通过吸附或者密封过程将蛋白质装载到所述纳米颗粒中(Spada et al.,2011；Protein delivery ofpolymeric nanoparticles；World Academy of Science,Engineering and Technology:76).通过使用被动和主动靶向策略，纳米颗粒可以增加药物在癌细胞中的细胞内浓度同时避免在正常细胞中的毒性。当纳米颗粒与特异性受体结合并进入细胞中时，他们通常被内涵体通过受体-调节的胞吞作用包裹，从而省略P-糖蛋白的识别(这是主要的耐药性机理)(Cho et al.,2008,Therapeutic Nanoparticles for Drug Delivery in Cancer,Clin.Cancer Res.,2008,14:1310-1316).通过调理作用和吞噬作用从体内除去纳米颗粒(Sosnik et al.,2008；Polymeric Nanocarriers:New Endeavors for the Optimizationof the Technological Aspects of Drugs；Recent Patents on BiomedicalEngineering,1:43-59).基于纳米载体的系统可以被用于有效的药物传递，其优势在于能够改善细胞内渗透、定位传递、防止药物早熟降解、控制药代动力学和药物组织分布曲线，降低所需剂量和效力成本(Farokhzad OC,et al.；Targeted nanoparticle-aptamerbioconjugates for cancer chemotherapy in vivo.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2006,103(16):6315–20；Fonseca C,et al.,Paclitaxel-loaded PLGA nanoparticles:preparation,physicochemical characterization and in vitro anti-tumoralactivity.J.Controlled Release 2002；83(2):273–86；Hood et al.,Nanomedicine,2011,6(7):1257-1272).
纳米颗粒的吸收与其小尺寸间接成比例。由于其小尺寸，已经发现所述聚合纳米可以避开网状-内皮系统(RES)的识别和吸收，并因此在血液中传播更长的时间(Borchardet al.,1996,Pharm.Res.7:1055-1058).纳米可以还能够在病变位点(例如实性肿瘤能透过的脉管系统)溢出，产生消极靶向机理。由于高表面积会产生更快的溶解速率，纳米结构通常显示更高的血液浓度和曲线下面积(AUC)值。减少的颗粒尺寸帮助避开宿主防御机理并且增加血液循环时间。纳米颗粒尺寸影响药物释放。较大的颗粒使药物更慢扩散入系统。较小颗粒提供大的表面积但是会使药物更快释放。更小的颗粒在纳米颗粒分散体系储存和运输期间有凝聚趋势。从而，需要在纳米颗粒小尺寸和最大稳定性方面寻找平衡。用于药物传递系统的纳米颗粒尺寸应该足够大从而防止其快速渗入血液毛细血管中，但是也应该足够小从而不被固定的巨噬细胞，也就是存在于网状内皮系统(例如肝脏和脾)中的巨噬细胞所捕获。
除了其尺寸之外，纳米颗粒的表面性质也是确定其在循环过程中存在时间和历程的一个重要因素。理想的情况是纳米颗粒具有亲水表面来逃避巨噬细胞捕获。嵌段共聚物产生的纳米颗粒具有亲水和疏水结构域，可以满足这一标准。控制的聚合物降解还可以增加传递到患病状态的试剂水平。聚合物降解还可以被颗粒尺寸影响。在体外，随着颗粒尺寸增加降解速率也增加(Biopolymeric nanoparticles；Sundar et al.,2010,Science andTechnology of Advanced Materials；doi:10.1088/1468-6996/11/1/014104).
聚(乳酸)(PLA)已经被美国美国食品与药物管理局批准可以用于组织工程医用材料和药物载体，并且聚乳酸-聚乙二醇PLA-PEG基药物传递系统是本领域内已知的。US2006/0165987A1描述了一种暗中聚合的生物可降解纳米球，包括聚酯-聚乙烯基多块共聚物和任选的适用于改善纳米球刚性的组分和增和的药物化合物。US2008/0081075A1公开了一种新型混合胶束结构，具有功能性内核和亲水性外壳，由接枝共聚物和一个或者一个以上嵌段共聚物自组装而成。US2010/0004398A1描述了一种聚合纳米颗粒和其生产过程，该聚合纳米颗粒具有壳/心构造和一个界面区域。
但是，这些聚合纳米颗粒基本上要求使用大约1％到2％的乳化剂保持纳米颗粒的稳定性。乳化剂在介质中稳定分散的粒子。PVA、PEG、吐温80和吐温20是常用的乳化剂。但是，使用乳化剂用于体内应用需要谨慎考虑，这是因为乳化剂的渗出对患者具有毒性(Safety Assessment on polyethylene glycols(PEGS)and their derivatives as usedin cosmetic products,Toxicology,2005 Oct.15；214(1-2):1-38).使用乳化剂还会增加纳米颗粒的质量从而减少药物装载，导致更高的剂量要求。纳米颗粒药物传递系统其他常见的不利因素还包括较差的口服生物利用率、在循环中不稳定、不充分的组织分布和毒性。可以有效的传递治疗剂的传递系统包括将治疗性肽(例如，NuBCP-9)传递进入患病细胞(例如，癌细胞)的细胞液中但不引起上面所描述的不利因素。
本领域普通技术人员知道这里所描述的发明可以经历不同的变化和修饰，而不仅仅包括这里所具体描述的。应当被理解的是这里所描述的发明包括所有这些变化和修饰。本发明还包括本说明书所涉及或者指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，单独地或者作为一个整体，并且包括所述步骤或者特征的任意两个或者更多个的结合或者全部结合。
定义
为了方便起见，在进一步地描述的所述本发明之前，本发明说明书、实施例和所附权利要求书所使用的某些术语在此整理。这些定义应该依据本发明所公开的其他部分进行阅读并可以被本发明所属技术领域的普通技术人员所理解。除非另有定义，这里使用的所有科技用语与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。除非在具体的情况下明确限定，本发明说明书中所使用的术语如下定义。
“一个”、“一种”、“所述”物品指的是一个或者一个以上(即，至少一个)语法对象所述的物品。
这里所使用的术语“包含”、“包括”、“含有”、“具有”、“其特征在于”及其在语法上相等的词语指的是开放式包含，指可能包括其他元素。其不应被理解为“只由此组成”。
如这里所使用的，术语“由。。。组成”及其语法上相等的术语不包括任何在权利要求中没有特别指出的成分、步骤或者组分。
如这里所使用的，术语“大约”或者“大概”通常指在给定数值或者范围的20％范围内，更优选地在10％范围内，并且最优选的在5％范围内。
如这里所使用的术语“可生物降解的”指的是聚合结构的酶解或者非酶裂解或者降解作用。
如这里所使用的，术语“纳米颗粒”指的是直径范围在10纳米到1000纳米范围内的颗粒，其中，所述直径指的是与该颗粒具有相同体积的完美球形所具有的直径。术语“纳米颗粒”可以与“纳米颗粒们”互换使用。在一些情况下，该颗粒的直径范围在大约1-1000纳米，10-500纳米，30-270纳米，30-200纳米，或者30-120纳米范围内。
在一些情况下，可能存在一群颗粒。如这里所使用的，所述纳米颗粒的直径是该群颗粒的平均分布。
如这里所使用的，术语“聚合物”与本领域的常规含义相同，即，包括一个或者一个异常重复单位(单体)并通过共价键相连的分子结构。所述重复单位可以全部是相同的，或者在一些情况下，所述聚合物内部存在超过一种类型的重复单位。
术语“核酸”指的是多聚核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、及其变体和衍生物。
如这里所使用的，术语“治疗剂”和“药物”可以互换使用，并且不仅仅包括本身具有药学上或者生物学活性的化合物或者种类，还包括含有一种或者一种以上这些活性化合物或者种类的材料，及其结合、修饰和药理学上的活性片段及其抗体衍生物。
“靶向部分”或者“靶向剂”指的是与靶细胞表面选择性结合的分子。例如，所述靶向部分可以是能够与特定种类的细胞中发现的细胞表面受体相结合的配体，或者能够与相对其他细胞，在靶细胞上以更高频率表达的细胞表面受体相结合的配体。
所述靶向剂或者治疗剂可以是一种肽或者蛋白质。“蛋白质”和“肽”是本领域内已知的术语，并且，如这里所使用的，这些术语具有本领域常规含义。一般来说，肽是长度小于大约100个氨基酸的氨基酸序列，但是也可以包括高达300个氨基酸。蛋白质通常被认为到是至少具有100个氨基酸的分子。所述氨基酸可以是D-构型或者L-构型。蛋白质可以是，例如，蛋白质药物、抗体、重组抗体、重组蛋白、酶等等。在一些情况下，肽或者蛋白质的一个或者一个以上氨基酸可以被修饰，例如，通过添加化学部分进行修饰，例如，碳水化合物基团、磷酸基、法呢基基团、异法尼基基团、脂肪酸基团、适于结合或者功能化的连接体，或者进行其他修饰，例如，环化作用、次生-环化作用和其他大量的能够赋予所述肽和蛋白质更有利的性质的其他修饰。在其他情况下，所述肽或者蛋白质的一个或者一个以上氨基酸可以被一个或者一个以上非自然存在的氨基酸所取代。所述肽或者蛋白质可以选自组合文库，例如噬菌体文库、酵母文库、或者体外组合文库。
如这里所使用的，术语“抗体”指的是任意结合给定抗原氨基酸序列的分子，或通过二级或者三级结构相似性而对给定抗原具有结合亲和性的分子，所述抗原与来自任意物种的包含免疫球蛋白可变区的分子显示相似或者更大的结合亲和性。术语“抗体”包括，但不局限于有两个重链和两个轻链组成的天然抗体；来源于轻链、重链或者二者之中的片段的结合分子、可变区片段、只有重链或者轻链的抗体、或者这些结构域的任意工程学结合，无论是单特异性或者双特异性的，无论是否与第二诊断剂或者治疗剂部分(例如显象剂或者化学治疗分子)相结合。该术语包括但不局限于免疫球蛋白可变区衍生的结合部分，无论来源于鼠、大鼠、兔、山羊、羊驼、骆驼、人或者其他任何脊椎动物。本术语涉及任意这种免疫球蛋白可变区结合部分，无论其发现方法是什么(杂交衍生、人源化产生、噬菌体衍生、酵母衍生、组合显示衍生、或者其他任意本领域内已知的类似的衍生方法)、或者生产方法是什么(细菌、酵母、哺乳动物细胞培养、或者转基因动物、或者本领域内已知的其他任意类似的方法)。
如这里所使用的术语“结合”、“治疗结合”或者“药学上结合”指的是两个或者更多治疗剂的联合给药(例如，共同传递)。
如这里所使用的术语“药学上可接受的”指的是实体医学判断范围中适合于与热血动物(例如，哺乳动物或者人)组织相接触，而不产生过度毒性、刺激性过敏反应及其他复杂问题，具有合理的利益/风险比例的化合物、材料、组合物和/或剂量形式。
包括一个或者一个以上治疗剂的聚合纳米颗粒的“治疗有效量”是指在联合治疗疾病之后足够提供所述疾病临床可见的现象或者症状可见的或者临床显著改善的量。
如这里所使用的术语“患者”或者“病人”指的是患有癌症或者直接或者间接与癌相关的异常的动物，或者为癌症所困的动物。患者的实施例包括哺乳动物，例如，人、猿、猴子、家犬、牛、马、猪、羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人类动物。在一个实施方案中，患者是人，例如，患有、或者有风险患有或者由潜在的可能患有癌症的人。
如这里所使用的术语“治疗”或者“疗法”包括能够缓解、减少或者减轻患者至少一个症状，或者延缓疾病进程的治疗方法。例如，治疗可以是使疾病的一个或者一些症状消失或者完全根除疾病，例如，癌。在本发明所公开的内容中，所述术语“治疗”还表示防止和/或减少疾病恶化风险。如这里所使用的术语“预防”、“防止”或者“避免”包括预防至少一个与被预防的状态、疾病或者异常有关的、或者由其引起的症状。
聚合纳米颗粒
这里提供了一种无毒的、安全的、可生物降解的聚合纳米颗粒，由嵌段共聚物组成，适用于传递一种或者一种以上治疗剂。本发明的可生物降解的聚合纳米颗粒由嵌段共聚物形成，所述嵌段共聚物基本上由亲水-疏水性嵌段共聚物化学修饰的聚(乳酸)(PLA)组成，其中，所述亲水-疏水性嵌段共聚物选自聚(甲基丙烯酸甲酯)-聚(异丁烯酸)(PMMA-PMAA)、聚(苯乙烯)-聚(丙烯酸)(PS-PAA)、聚(丙烯酸)-聚(乙烯吡淀)(PAA-PVP)、聚(丙烯酸)-聚(N,N-甲基丙烯酸二甲氨基乙酯)(PAA-PDMAEMA)、聚(乙二醇)-聚(丁二醇)(PEG-PBG)和聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PEG-PPG-PEG)。
如这里所使用的，本发明的“聚合纳米颗粒”指的是由嵌段共聚物形成的聚合纳米颗粒，所述嵌段共聚物包括被亲水-疏水性嵌段共聚物化学修饰的聚(乳酸)(PLA)，其中，所述亲水-疏水性嵌段共聚物选自聚(甲基丙烯酸甲酯)-聚(异丁烯酸)(PMMA-PMAA)、聚(苯乙烯)-聚(丙烯酸)(PS-PAA)、聚(丙烯酸)-聚(乙烯吡淀)(PAA-PVP)、聚(丙烯酸)-聚(N,N-甲基丙烯酸二甲氨基乙酯)(PAA-PDMAEMA)、聚(乙二醇)-聚(丁二醇)(PEG-PBG)和聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PEG-PPG-PEG)。因此，本发明的“聚合纳米颗粒”包括由嵌段共聚物形成的聚合纳米颗粒，所述嵌段共聚物包括、或者基本上由聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PEG-PPG-PEG)化学修饰的聚(乳酸)(PLA)组成。
本发明提供了一种制备可生物降解的聚合纳米颗粒的方法，所述可生物降解的聚合纳米颗粒包括一种或者一种以上的治疗剂。所产生的纳米颗粒不仅仅是无毒、安全且可生物降解的，还在体内稳定，具有高储藏稳定性，并且可以安全的被用于药物领域的纳米载体系统或者药物传递系统。事实上，本发明的纳米颗粒增加了被传递药物或者治疗剂在体内的半衰期。
本发明还提供了一种用于在可生物降解的聚合纳米颗粒上装载有效药物，形成一种有效的靶向药物传递系统的方法，所述药物靶向传递系统可以防止活性试剂过早降解，并在治疗癌症方面具有很强的应用前景。
这里还提供了一种组合物，所述组合物包括在医药领域或者使用载体系统或者纳米颗粒储蓄器或者贮存所的其他领域中使用的可生物降解的聚合纳米颗粒。本发明的纳米颗粒可以广泛的应用于预后、治疗、诊断或者治疗诊断组合物。相应的，本发明的纳米颗粒可以用于药物传递和试剂传递，以及用于人和动物的疾病诊断和医学成像中。因此，本发明提供了使用所述纳米颗粒治疗疾病的方法，所述纳米颗粒进一步包括这里所描述的治疗剂。本发明的纳米颗粒还可以用于其他应用中，例如需要储蓄器或者贮存所的化学或者生物反应中，例如作为生物传感器，或者用于固定化酶等等。
根据这里所描述的方法，在产生可生物降解的聚合纳米颗粒期间可以不使用任何乳化剂或者稳定剂就获得意料之外的惊喜结果。通过本方法所获得的可生物降解的聚合纳米颗粒是安全、稳定且无毒的。在一个实施方案中，嵌段共聚物PEG-PPG-PEG共价附着于聚-乳酸(PLA)基质上，使该嵌段共聚物变成基质的一部分，即，纳米颗粒传递系统。相反，在现有技术中，乳化剂(例如，PEG-PPG-PEG)不是所述纳米颗粒基质的一部分，因此被滤出(图1)。与现有技术的纳米颗粒相反，这里所提供的纳米颗粒不需要将乳化剂滤出到介质中。
由于不使用可能体内滤出的乳化剂，通过这里的方法所获得的纳米颗粒是无毒且安全的。不使用乳化剂或者减少乳化剂的用量还增加了药物与聚合物的比例。这些纳米颗粒与现有技术中存在的聚合纳米颗粒相比具有更高的稳定性和更长的储存时间。本发明的聚合纳米颗粒被制备成可生物降解的，从而降解产物可以容易的被分泌出体外。降解作用还使包含在所述纳米颗粒中的内容物在体内定点释放。
聚(乳酸)(PLA)是一种疏水性聚合物，适用于合成本发明聚合纳米颗粒的优选聚合物。当然，也可以使用聚(羟基乙酸)(PGA)和聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)嵌段共聚物。所述疏水性聚合物还可以是生物衍生的或者是生物聚合物。
使用的PLA的分子量在大约2,000克/摩尔到80,000克/摩尔范围内。因此，在一个实施方案中，使用的PLA在大约2,000克/摩尔到80,000克/摩尔范围内。PLA的平均分子量还可以是大约72,000克/摩尔。如这里所使用的一克/摩尔等于一个“道尔顿”(即，在指聚合物分子量时道尔顿和克/摩尔可互换使用)。
嵌段共聚物，例如聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PEG-PPG-PEG)、聚(甲基丙烯酸甲酯)-聚(异丁烯酸)(PMMA-PMAA)、聚(苯乙烯)-聚(丙烯酸)(PS-PAA)、聚(丙烯酸)-聚(乙烯吡淀)(PAA-PVP)、聚(丙烯酸)-聚(N,N-甲基丙烯酸二甲氨基乙酯)(PAA-PDMAEMA)、聚(乙二醇)-聚(丁二醇)(PEG-PBG)和PG-PR(聚甘油(PG)及其与聚酯(PR)的共聚物，其中聚酯包括己二酸、庚二酸和sebecic acid)是亲水性或者亲水-疏水性共聚物，可被用于本发明，并且包括ABA型嵌段共聚物，例如，PEG-PPG-PEG，BAB嵌段共聚物，例如PPG-PEG-PPG，(AB)n型交替多嵌段共聚物和随机多嵌段共聚物。嵌段共聚物具有两个、三个或者更多个不同的嵌段。PEG由于能够赋予亲水性、抗巨噬细胞吞噬作用和免疫识别抵抗性而是优选的组分。
在一些实施方案中，所述亲水-疏水性嵌段共聚物的平均分子量(Mn)通常在1,000到20,000克/摩尔范围内。在进一步地实施方案中，所述亲水-疏水性嵌段共聚物的平均分子量(Mn)通常在大约4,000到大约15,000克/摩尔范围内。在一些情况下，所述亲水-疏水性嵌段共聚物的平均分子量(Mn)通常是4,400克/摩尔、8,400克/摩尔或者14,600克/摩尔。
本发明的“嵌段共聚物”包括聚(乳酸)(PLA)片段和聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PEG-PPG-PEG)片段。
本发明具体的可生物降解的聚合纳米颗粒由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物组成。
本发明另一个具体的可生物降解的聚合纳米颗粒由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)-聚(乳酸)(PLA-PEG-PPG-PEG-PLA)嵌段共聚物组成。
本发明可生物降解的聚合物由亲水-疏水性嵌段共聚物共价化学修饰的PLA形成。
本发明可生物降解的聚合纳米颗粒的尺寸在大约30-300纳米范围内。在进一步的实施方案中，可生物降解的聚合纳米颗粒的尺寸在大约30-120纳米范围内。
在一个实施方案中，本发明的可生物降解的聚合物是基本上不含乳化剂的，或者可以包括按重量计算大约0.5％到5％的外部乳化剂。
在一个实施方案中，本发明可生物降解的聚合纳米颗粒是聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)，并且聚(乳酸)嵌段的平均分子量是大约60,000克/摩尔，PEG-PPG-PEG嵌段的平均分子量大约是8,400或者大约14,600克/摩尔，并且外部乳化剂按重量计算占0.5％到5％。
在另一个实施方案中，本发明可生物降解的聚合纳米颗粒是聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)，并且聚(乳酸)嵌段的平均分子量是小于或等于大约16,000克/摩尔，PEG-PPG-PEG嵌段的平均分子量大约是8,400或者大约14,600克/摩尔，并且所述组合物基本上不含有乳化剂。
聚合纳米颗粒的制备
本发明用于制备可生物降解的聚合纳米颗粒的方法包括将聚(乳酸)(PLA)和一种亲水-疏水性嵌段共聚物溶解在有机溶剂中得到一种溶液；向所述溶液中加入碳化二亚胺偶合剂和一种碱，得到反应混合物；搅拌所述反应混合物获得用所述亲水-疏水性嵌段共聚物化学修饰的PLA嵌段共聚物；将前述步骤中获得的嵌段共聚物溶解在有机溶剂中，并且搅拌均匀得到均质化混合物；向该均质化混合物中加入水相得到乳化剂，搅拌所得乳化剂获得聚合纳米颗粒。<0}
碳化二亚胺偶合剂在本领域内是已知的。<0}合适的碳化二亚胺偶合剂包括，但是不局限于，N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-(3-二乙氨基丙基)-N-乙基碳化二亚胺(EDC)和N,N-二异丙基碳化二亚胺。<0}
耦合反应通常在催化剂和/或辅助碱基(例如，三烷基胺、吡啶或者4-三甲胺吡啶(DMAP))存在的情况下进行。
所述耦合反应还可以与羟基衍生物，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)一起进行。其他的羟基衍生物包括但是不局限于1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)、6-氯-1-羟基苯并三唑(Cl-HOBt)。
在制备本发明纳米颗粒时有用的有机溶剂是合适的乙腈(C2H3N)、二甲基甲酰胺(DMF；C3H7NO)、丙酮((CH3)2CO)和二氯甲烷(CH2Cl2)。
如上所述的方法可以选择性的包括额外的步骤，用水洗涤可生物降解的聚合纳米颗粒，并干燥所得聚合可生物降解的聚合纳米颗粒。该方法还可以选择性的包括加入乳化剂的第一步骤。本方法产生的纳米颗粒的尺寸在大约30-300纳米范围内，或者大约30-120纳米范围内。
在一个具体的方法中，所述PLA和所述共聚物、PEG-PPG-PEG溶于有机溶剂中，获得聚合溶液。向该溶液中加入N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，随后在-4℃到0℃下加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。在-4℃到0℃的低温下以250-300转/分的速度搅拌溶液20-28小时。聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒中的PLA与PEG-PPG-PEG共价相连，形成聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)基质。用有机溶剂(例如二乙醚、甲醇或者乙醇)沉淀纳米颗粒并使用本领域常规方法(包括过滤、超速离心法或者超滤作用)使之与溶液分离。在2℃到8℃下储存纳米颗粒。
本发明方法的优势在于不需要额外的冷冻步骤，或者在此方法中不使用假目标蛋白、或者使用最小量的乳化剂。本发明可以在25℃-30℃的室温条件下方便的进行，不需要过度搅拌获得理想的小颗粒尺寸。
图2显示了本发明一个纳米颗粒实施例的FTIR光谱。图3A、3B和3C显示了该纳米颗粒的NMR光谱。如图4A和图4B的TEM图像所示，所述纳米颗粒的结构基本上是球形的，但是在膨胀或者收缩过程中也可以呈现非-球形结构。所述纳米颗粒具有两亲性。表2显示了所述纳米颗粒和ζ电位和PDI(多分散指数)。本发明纳米颗粒的储藏稳定性比传统的基于乳化剂的系统要好，这是由于本发明方法中不含有游离的乳化剂，并且包括PEG部分的嵌段共聚物以共价键连接在聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)基质整体中。本发明纳米颗粒的储存时间在6-8个月范围内。
使用透射电子显微镜测量显示本发明的纳米颗粒尺寸在30-120纳米范围内(图4)。在适当的实施方案中，本发明纳米颗粒的直径小于500纳米，小于300纳米或者小于200纳米。在某些实施方案中，本发明的纳米颗粒直径在大约10至500纳米之间、大约10到300纳米之间、大约10到200纳米之间、在大约20至150纳米之间、或者在大约30至20纳米之间。
这里提供了形成纳米颗粒的具体过程及其在药物组合物中的应用，这里的介绍仅起到参考目的。所述方法和应用还可以通过本发明所属领域普通技术人员显而易见的其他多种方法来进行。
在本发明的一个实施方案中提供了一种制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法，其中，所述方法包括(a)将PEG-PPG-PEG共聚物和聚(乳酸)(PLA)溶解在有机溶剂中获得溶液，(b)在-4℃到0℃温度范围内向该溶液中加入N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-(二甲胺)吡啶(DMAP)，获得反应混合物，(c)在-4℃到0℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌反应混合物20-28小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物，(d)将所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物溶解在有机溶剂中并以250-400转/分的速度使其均质化，获得均质化混合物，(e)向所得均质化混合物中加入水相获得乳化液，和(f)在25℃到30℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌所得乳化液10-12小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物的纳米颗粒。
在本发明的另一个实施方案中提供了一种制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法，其中，所述方法包括(a)将PEG-PPG-PEG共聚物和聚(乳酸)(PLA)溶解在有机溶剂中获得溶液，(b)在-4℃到0℃温度范围内向该溶液中加入N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-(二甲胺)吡啶(DMAP)，获得反应混合物，(c)在-4℃到0℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌反应混合物20-28小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物，(d)将所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物溶解在有机溶剂中并以250-400转/分的速度使其均质化，获得均质化混合物，(e)向所得均质化混合物中加入水相获得乳化液，和(f)在25℃到30℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌所得乳化液10-12小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物的纳米颗粒，其中，所述方法选择性的包括用水洗涤所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物纳米颗粒并用常规方法干燥所述纳米颗粒的步骤。
在本发明的另一个实施方案中提供了一种制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法，其中，所述方法包括(a)将PEG-PPG-PEG共聚物和聚(乳酸)(PLA)溶解在有机溶剂中获得溶液，(b)在-4℃到0℃温度范围内向该溶液中加入N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-(二甲胺)吡啶(DMAP)，获得反应混合物，(c)在-4℃到0℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌反应混合物20-28小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物，(d)将所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物溶解在有机溶剂中并以250-400转/分的速度使其均质化，获得均质化混合物，(e)向所得均质化混合物中加入水相获得乳化液，和(f)在25℃到30℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌所得乳化液10-12小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的尺寸在大约30-300纳米或者30-120纳米范围之内。
在本发明的依旧另一个实施方案中提供了一种制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法，其中，所述方法包括(a)将PEG-PPG-PEG共聚物和聚(乳酸)(PLA)溶解在有机溶剂中获得溶液，(b)在-4℃到0℃温度范围内向该溶液中加入N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-(二甲胺)吡啶(DMAP)，获得反应混合物，(c)在-4℃到0℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌反应混合物20-28小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物，(d)将所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物溶解在有机溶剂中并以250-400转/分的速度使其均质化，获得均质化混合物，(e)向所得均质化混合物中加入水相获得乳化液，和(f)在25℃到30℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌所得乳化液10-12小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物的纳米颗粒，其中所述PEG-PPG-PEG共聚物的分子量在1,000克/摩尔到10,000克/摩尔范围之内。
在本发明进一步的实施方案中提供了一种制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法，其中，所述方法包括(a)将PEG-PPG-PEG共聚物和聚(乳酸)(PLA)溶解在有机溶剂中获得溶液，(b)在-4℃到0℃温度范围内向该溶液中加入N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-(二甲胺)吡啶(DMAP)，获得反应混合物，(c)在-4℃到0℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌反应混合物20-28小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物，(d)将所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物溶解在有机溶剂中并以250-400转/分的速度使其均质化，获得均质化混合物，(e)向所得均质化混合物中加入水相获得乳化液，和(f)在25℃到30℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌所得乳化液10-12小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物的纳米颗粒，其中，PLA的分子量在10,000克/摩尔到60,000克/摩尔范围之内。
在本发明进一步的实施方案中提供了一种制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法，其中，所述方法包括(a)将PEG-PPG-PEG共聚物和聚(乳酸)(PLA)溶解在有机溶剂中获得溶液，(b)在-4℃到0℃温度范围内向该溶液中加入N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-(二甲胺)吡啶(DMAP)，获得反应混合物，(c)在-4℃到0℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌反应混合物20-28小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物，(d)将所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物溶解在有机溶剂中并以250-400转/分的速度使其均质化，获得均质化混合物，(e)向所得均质化混合物中加入水相获得乳化液，和(f)在25℃到30℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌所得乳化液10-12小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物的纳米颗粒，其中，步骤(a)选择性的包括添加剂，例如乳化剂。
在本发明另一个实施方案中提供了聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒所述纳米颗粒通过制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法获得，其中，所述方法包括(a)将PEG-PPG-PEG共聚物和聚(乳酸)(PLA)溶解在有机溶剂中获得溶液，(b)在-4℃到0℃温度范围内向该溶液中加入N.N-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-(二甲胺)吡啶(DMAP)，获得反应混合物，(c)在-4℃到0℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌反应混合物20-28小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物，(d)将所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物溶解在有机溶剂中并以250-400转/分的速度使其均质化，获得均质化混合物，(e)向所得均质化混合物中加入水相获得乳化液，和(f)在25℃到30℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌所得乳化液10-12小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物的纳米颗粒，
在本发明另一个实施方案中提供了一种组合物，所述组合物包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒，所述纳米颗粒通过制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法获得，其中，所述方法包括(a)将PEG-PPG-PEG共聚物和聚(乳酸)(PLA)溶解在有机溶剂中获得溶液，(b)在-4℃到0℃温度范围内向该溶液中加入N.N-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-(二甲胺)吡啶(DMAP)，获得反应混合物，(c)在-4℃到0℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌反应混合物20-28小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物，(d)将所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物溶解在有机溶剂中并以250-400转/分的速度使其均质化，获得均质化混合物，(e)向所得均质化混合物中加入水相获得乳化液，和(f)在25℃到30℃温度范围内以250-400转/分的速度搅拌所得乳化液10-12小时获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物的纳米颗粒。
包括治疗剂的聚合纳米颗粒
本发明的纳米颗粒能够传递活性试剂或者实物到特定位点(图5)。可以通过改变聚合物基体中PLA或者PEG-PPG-PEG的分子量控制本发明聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的颗粒尺寸和释放性质。可以控制活性试剂或者物质释放12小时到60天，这比现有技术存在的传统PLA-PEG系统大有改善(图6A)。还可以通过改变纳米颗粒聚合物基质中嵌段共聚物的平均分子量来控制纳米颗粒的药物装载量。随着PEG-PPG-PEG嵌段共聚物的嵌段长度增加，纳米颗粒的药物装载量也有所增加(表3)。
由于聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物组成的聚合纳米颗粒本质上是两亲性的，疏水性和亲水性药物都可以装载在纳米颗粒上。由于不使用乳化剂或者仅使用最小量的乳化剂，本发明的纳米颗粒具有高的药物装载量，因此可以减少治疗剂的使用剂量和频率。与使用乳化剂的传统系统相比，本发明纳米颗粒中活性试剂或物质与纳米颗粒的比例更高，这是由于乳化剂的重量占总制剂重量的高达50％(International Journal of Pharmaceutics,15 June 2011,Volume 411,Issues 1–2,Pages 178-187；International Journal of Pharmaceutics,2010,387:253–262).所述纳米颗粒可以协助实现单剂量或者低剂量药物传递，同时伴随减少的毒性。聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米载体系统中活性试剂的重量百分比占所述纳米颗粒的2-20％。纳米颗粒中装载更多的药物可以减少所需的药物剂量，这是由于有效剂量的药物可以以减少的剂量水平传递。聚合纳米颗粒中更高的内部装载量能够延长装载物质的活性，不阻碍纳米颗粒总装载容量，从而实现有潜力治疗剂的有效传递。图7B显示了被装载入纳米颗粒制剂的抗癌肽、L-NuBCP-9(在这里也叫做“NuBCP-9”(氨基酸序列FSRSLHSLL的L-构象))与游离肽药物制剂和常规细胞-穿透肽共轭的药物制剂相比，对主要人脐静脉(HUVEC)细胞系的效力。
通过体外细胞系研究和体内小鼠模型研究证实本发明的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒是无毒。对用150毫克/千克体重聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒治疗的小鼠进行血液学参数评价显示与参照组相比，治疗组在全血细胞计数、红细胞计数、白细胞计数、嗜中性白细胞和淋巴细胞水平方面无显著变化(图8)。对肝和肾功能进行生物化学参数评价显示在总蛋白、白蛋白和球蛋白水平方面，参照组与纳米颗粒治疗组之间无显著差异。如图9A和9B显示，在聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒治疗组与参照组相比，肝脏酶、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)水平没有显著增加。与参照相比，用聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒治疗的小鼠体内尿素和血液尿素氮(BUN)水平无显著变化(图9C)。图10显示了注射有聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的小鼠的器官、脑、心脏、肝、脾、肾和肺的病理解剖学。
本发明纳米颗粒可以包含和/或吸附一个或者一个以上物质。所述物质还可以直接与所述可生物降解的纳米颗粒的嵌段共聚物共轭。本发明的物质包括但是不局限于小有机分子、核酸、多聚核苷酸、低聚核苷酸、核苷、DNA、RNA、SiRNA、氨基酸、肽、蛋白质、胺类、抗体及其变体、抗生素、低分子量分子、化学治疗剂、药物或者治疗剂、金属离子、染料、放射性同位素、造影剂、和/或显象剂。
可以包含的适当的分子是治疗剂。被包括的治疗剂是蛋白质或者肽或者其片段、胰岛素，等等，疏水性药物，例如亚德里亚霉素、紫杉醇、吉西他滨、多昔紫彬等等；抗生素，例如两性霉素B、异烟肼(INH)等等和核酸。治疗剂还包括化学治疗剂，比如紫杉醇，阿霉素派迷清，乙嘧啶，茚并异喹啉，或者NOR-茚并异喹啉。
所述治疗剂包括天然的或者非天然(合成的)氨基酸。非限制性实施例包括二环化合物和肽模拟物，例如环状肽模拟物。
已知L-形式或者L-构型的治疗肽在经济上更为便宜，更易制备，但是在药物应用中与其D-型相比会在体内快速降级因此是不利的。但是，本发明的纳米颗粒可以将L-肽密封，在体内研究中确认由于被密封在纳米颗粒核心中，所述L-肽避免在循环中降解(图11、12和13)。
与现有技术中流行的游离药物制剂相比，装载抗癌药的纳米颗粒可以实现靶向传递。本发明的纳米颗粒可以与一种或者一种以上包括纳米颗粒表面上靶向部分的物质表面共轭、生物共轭或者吸附。靶向部分使纳米颗粒定位在肿瘤或者疾病位点上，并释放治疗剂。所述靶向部分可以结合或者与连接体分子相连。靶向分子包括但是不局限于抗体分子、生长受体配位体、维生素、肽、半抗原、适体、及本领域普通技术人员已知的其他靶向分子。药物分子和成像分子也可以直接或者通过连接体分子附着在纳米颗粒表面的靶向部分上。
靶向部分具体的、非限制性实施例包括维生素、配位体、胺类、肽片段、抗体、适体、转铁蛋白、抗体或者其片段、唾液酸化Lewis X抗原、透明质酸、甘露糖衍生物、葡萄糖衍生物、细胞特异性外源凝集素、galaptin、galectin、lactosylceramide、类固醇衍生物、RGD序列、表皮生长因子、表皮生长因子结合肽、尿激酶受体结合肽、凝血栓蛋白衍生肽、白蛋白衍生物和/或来源于组合化学作用的分子。
进一步的，本发明的纳米颗粒可以进行表面功能化和/或与其他所关心的分子共轭。小低分子量分子(例如叶酸、前列腺膜特异性抗原(PSMA)、抗体、适体、结合细胞表面受体或者抗原的分子等等)可以与嵌段共聚物PEG-PPG-PEG或者所述聚合物制剂的PEG组分共价相连。在本发明适当的实施方案中，所述制剂包括聚合物和一种物质。在一些情况下，所述物质或者目标成分可以与聚合物基质表面共价相连。治疗剂可以与聚合物基质表面相连或者被包含在纳米颗粒聚合物基质中。共轭的纳米颗粒的细胞内吸收比单纯纳米颗粒的吸收更高。
本发明纳米颗粒可以包括一个或者一个以上通过本领域已知方法附着在纳米颗粒表面的试剂，还可以包含一个或者一个以上试剂从而用作多功能纳米颗粒。本发明的纳米颗粒可以作为一种多功能性纳米颗粒，从而连接肿瘤靶点，在多合一系统中进行肿瘤治疗和肿瘤成像，从而提供一种多模式方法与癌症战斗。所述多功能的纳米颗粒可以含有一个或者一个以上具有类似的或者不同作用机理的活性试剂、具有相似或者不同作用位点的活性试剂或者具有相似或者不同功能的活性试剂。
使用乳化沉淀法制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的物质胶囊。使用本发明方法制备的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)聚合纳米颗粒被溶解在包括有机溶剂的有机溶液中。向聚合溶液中加入物质，加入量占所述聚合物重量的10-20％。然后逐滴将聚合溶液加入到水相中，在室温条件下搅拌10-12小时，使溶剂蒸发，纳米颗粒稳定。通过离心作用收集装载物质的纳米颗粒，干燥并在2℃-8℃条件下存贮等待进一步使用。在制备本发明装载物质的聚合纳米颗粒的方法中可以将其他添加剂，例如糖、氨基酸、甲基纤维素等等加入到水相中。
本发明纳米颗粒的物质装载量较高，几乎达到70-90％，如表3所示。本发明基于聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)的纳米载体系统防止过早开始的降解作用，并且有效地将抗癌肽靶向传递到癌细胞中。表面呈片状的可生物降解的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒在核心处包含治疗性肽，例如NuBCP-9、Bax BH3等等，可以不使用任何细胞穿透性肽就有效的传递到癌细胞的细胞液中。用NuBCP-9装载的纳米颗粒感染MCF-7细胞系进行体外研究显示在48-72小时之间完全杀死细胞，使用XTT实验进行评价(图7B)，并进行体内研究(图11和图12)。图7B还显示了用于持续释放的纳米颗粒的效力，以及与游离药物制剂相比，纳米颗粒在MCF-7细胞系中有效的药物传递。
在适当的实施方案中，将活性试剂与低分子量的PLA相连可以实现聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒中更高的物质装载量。所述物质通过碳化二亚胺耦合剂反应，结合羟基衍生物与低分子量PLA共价相连。举例来说，所述碳化二亚胺偶合剂是乙基二甲基氨丙基碳化二亚胺，并且所述羟基衍生物是N-羟基-琥珀酰亚胺(EDC/NHS)化学品。PLA的平均分子量在大约2,000-10,000克/摩尔范围内。聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒可以实现更高的疏水性药物和亲水性药物装载量(实施例5，表4和表5)。包覆PLA-药物的纳米颗粒不需要使用细胞穿透肽(CPPs)就能被传递到细胞液中。
因此，这里提供了用于制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包括一个或者一个以上物质(例如，一个或者一个以上治疗剂)。
在一个实施方案中，这里提供了用于制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包括一个或者一个以上物质(例如，一个或者一个以上治疗剂)，其中，所述方法包括(a)将所述物质与溶解在有机溶剂中的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物聚合纳米颗粒一起在250-400转/分的条件下搅匀获得一种初级乳化液，(b)在水相中以250-400转/分乳化初级乳化液获得二级乳化液，并且(c)在25℃-30℃条件下以250-400转/分的速度搅拌二级乳化液10-12分获得包括该物质的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒。
在本发明的另一个实施方案中，提供了制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包括至少一个物质，其中，所述方法包括(a)将所述物质与溶解在有机溶剂中的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物聚合纳米颗粒一起在250-400转/分的条件下搅匀获得一种初级乳化液，(b)在水相中以250-400转/分乳化初级乳化液获得二级乳化液，并且(c)在25℃-30℃条件下以250-400转/分的速度搅拌二级乳化液10-12分获得包括该物质的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒，其中，所述方法选择性的包括用水洗涤包括所述物质的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物纳米颗粒的步骤，并用常规方法干燥所得纳米颗粒。
在本发明的另一个实施方案中，提供了制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包括至少一个物质，其中，所述方法包括(a)将所述物质与溶解在有机溶剂中的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物聚合纳米颗粒一起在250-400转/分的条件下搅匀获得一种初级乳化液，(b)在水相中以250-400转/分乳化初级乳化液获得二级乳化液，并且(c)在25℃-30℃条件下以250-400转/分的速度搅拌二级乳化液10-12分获得包括该物质的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒，其中所述物质包括但是不局限于小有机分子、核酸、多聚核苷酸、低聚核苷酸、核苷、DNA、RNA、SiRNA、氨基酸、肽、蛋白质、抗生素、低分子量分子、药理学活性分子、金属离子、染料、放射性同位素、造影剂、显象剂和目标部分。
在本发明的另一个实施方案中，提供了制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包括至少一个物质，其中，所述方法包括(a)将所述物质与溶解在有机溶剂中的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物聚合纳米颗粒一起在250-400转/分的条件下搅匀获得一种初级乳化液，(b)在水相中以250-400转/分乳化初级乳化液获得二级乳化液，和(c)在25℃-30℃条件下以250-400转/分的速度搅拌二级乳化液10-12分获得包括该物质的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒，所述物质是一种靶向部分，选自由维生素、配位体、胺类、肽片段、抗体和适体所组成的组中。
在本发明的另一个实施方案中，提供了制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包括至少一个物质，其中，所述方法包括(a)将所述物质与溶解在有机溶剂中的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物聚合纳米颗粒一起在250-400转/分的条件下搅匀获得一种初级乳化液，(b)在水相中以250-400转/分乳化初级乳化液获得二级乳化液，和(c)在25℃-30℃条件下以250-400转/分的速度搅拌二级乳化液10-12分获得包括该物质的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒，其中，所述物质与PLA相连。
在本发明的另一个实施方案中，提供了制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包括至少一个物质，其中，所述方法包括(a)将所述物质与溶解在有机溶剂中的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物聚合纳米颗粒一起在250-400转/分的条件下搅匀获得一种初级乳化液，(b)在水相中以250-400转/分乳化初级乳化液获得二级乳化液，和(c)在25℃-30℃条件下以250-400转/分的速度搅拌二级乳化液10-12分获得包括该物质的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒，其中，所述物质与分子量在2,000克/摩尔到10,000克/摩尔范围内的PLA相连。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒，所述纳米颗粒包括至少一个物质，所述药物组合物由以下方法制备(a)将所述物质与溶解在有机溶剂中的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物聚合纳米颗粒一起在250-400转/分的条件下搅匀获得一种初级乳化液，(b)在水相中以250-400转/分乳化初级乳化液获得二级乳化液，并且(c)在25℃-30℃条件下以250-400转/分的速度搅拌二级乳化液10-12分获得包括该物质的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒包括至少一个物质，所述药物组合物由以下方法制备(a)将所述物质与溶解在有机溶剂中的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物聚合纳米颗粒一起在250-400转/分的条件下搅匀获得一种初级乳化液，(b)在水相中以250-400转/分乳化初级乳化液获得二级乳化液，并且(c)在25℃-30℃条件下以250-400转/分的速度搅拌二级乳化液10-12分获得包括该物质的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物可生物降解的聚合纳米颗粒，所述纳米颗粒包括至少一个物质，所述组合物由以下方法制成(a)将所述物质与溶解在有机溶剂中的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物聚合纳米颗粒一起在250-400转/分的条件下搅匀获得一种初级乳化液，(b)在水相中以250-400转/分乳化初级乳化液获得二级乳化液，和(c)在25℃-30℃条件下以250-400转/分的速度搅拌二级乳化液10-12分获得包括该物质的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒，其中，所述组合物选择性的包括至少一种药物赋形剂，所述药物赋形剂选自由防腐剂、抗氧化剂、增稠剂、螯合剂、等渗剂、调味剂、甜味剂、着色剂、增溶剂、染料、香料、粘合剂、润滑剂、填充剂、润滑剂和防腐剂所组成的组中。
包括药物化合物的聚合纳米颗粒
这里所描述的可生物降解的聚合纳米颗粒可用于传递药物化合物。例如，可以被这里所公开的纳米颗粒传递的药物化合物包括化学治疗药物，例如，紫杉醇；和抗癌肽，例如包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)的肽或者包括MUC1(SEQ ID NO:2)的肽。当通过纳米颗粒传递时，紫杉醇和NuBCP-9抗乳腺癌细胞系的体外生物活性协同增加，在balb/c小鼠欧利希腹水肿瘤(EAT)模型中的活性也一样(参见，例如，实施例8)。结果显示，与单独使用一种药物相比，当与NuBCP-9共同传递时，紫杉醇的IC50下降大约40倍(参见，例如，实施例8和表8)。紫杉醇(PTX)/NuBCP-9结合物的机理包括加强凋亡作用，所述凋亡作用是半胱天冬酶-依赖性并且本质上是MCF7细胞中半胱天冬酶级联的一部分。在欧利希腹水肿瘤(EAT)肿瘤模型Balb/c小鼠中，NuBCP-9和紫杉醇(PTX)在低浓度下的结合使用比单独使用一种药物明显更为有效。因此紫杉醇与NuBCP-9抗癌肽的共同传递可以用来有效的治疗癌症，例如，乳腺癌。
在一个方面，这里提供了一种包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物的聚合纳米颗粒，其中，所述聚合纳米颗粒装载有
a)一个或者一个以上化疗剂；和
b)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)或者一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
在一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQID No：1)。
在另一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有一种肽，所述肽包括MUC1(SEQ IDNo：2)。
在所述组合物的一个实施方案中，PLA的分子量在大约2,000和大约80,000道尔顿之间。
在所述组合物的另一个实施方案中，所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物由PEG-PPG-PEG三嵌段共聚物和PLA化学共轭组成，其中，所述PEG-PPG-PEG三嵌段共聚物可以具有不同的分子量。
在一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有
a)化疗剂或者靶向抗癌症试剂；和
b)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)或者一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
在一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQID No：1)。
在另一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有一种肽，所述肽包括MUC1(SEQ IDNo：2)。
在一个实施方案中，所述化疗剂的是紫杉醇。在进一步的实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有紫杉醇和一种肽，所述肽包括NuBCP-9，装载比例大约为9:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:9。
在另一个的实施方案中，所述化疗剂是吉西他滨。在进一步的实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有吉西他滨和一种肽，所述肽包括NuBCP-9，装载比例大约为9:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:9。
在其他实施方案中，所述化疗剂或者靶向抗癌剂选自由阿霉素、道诺红菌素、地西他滨、依立替康、SN-38、阿糖胞苷、多昔紫彬、雷公藤内酯(一种diterpinoid环氧化物)、格尔德霉素(一种HSP90抑制剂)、17-AAG、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、卡铂、泰索帝(taxotere)、氨甲蝶呤，和硼替佐米所组成的组中。
在一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成。
在另一个方面，这里提供了一种聚合纳米颗粒，包括
a)聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物；
b)一个或者一个以上治疗剂；和
c)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)或者一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)，
所述聚合纳米颗粒用于治疗选自由自身免疫性疾病、炎性疾病、新陈代谢功能紊乱、发育异常、心血管疾病、肝病、肠病、传染性疾病、内分泌病和神经系统紊乱所组成的组中的疾病。
在一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成。
组合物
在一个方面，这里提供的本发明的聚合纳米颗粒包括药物结合物，用于制备可以治疗或者预防疾病(例如癌症)的药物。在一个实施方案中，包括药物结合物的聚合纳米颗粒可以用于制备治疗癌症的药物。
在另一个方面，本发明提供了可生物降解的聚合纳米颗粒的应用，所述可生物降解的聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物组成，并且包括一种药物结合物，用于制备药物。
这里还提供了一种组合物，所述组合物包括本发明的聚合纳米颗粒，其中，所述聚合纳米颗粒包括治疗剂(例如，包括NuBCP-9的肽和化疗剂或者靶向抗癌剂)的药物结合物和药学上可接受的载体。
在一个方面，这里提供的包括药物结合物的聚合纳米颗粒的应用包括用于制造可以治疗或者预防疾病(例如癌症)的药物。在一个实施方案中，包括药物结合物的聚合纳米颗粒的应用是用于制备治疗疾病(例如，癌症)的药物。
在这里提供的组合物的一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒进一步包括附着在所述聚合纳米颗粒外部的靶向部分，所述靶向部分是一种抗体、肽或者适体。
在一个方面，这里提供了一种组合物，包括
a)聚合纳米颗粒，包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物；
b)一个或者一个以上化疗剂或者抗癌症靶向试剂；和
c)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)或者一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
在所述组合物的一个实施方案中，所述组合物包括一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID No：1)。
在所述组合物的另一个实施方案中，所述组合物包括另一个种肽，所述肽包括MUC1(SEQ ID No：2)。
在所述组合物的一个实施方案中，PLA的分子量在大约2,000和大约80,000道尔顿之间。
在所述组合物的一个实施方案中，所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物由PEG-PPG-PEG三嵌段共聚物和PLA化学共轭组成，其中，所述PEG-PPG-PEG三嵌段共聚物可以具有不同的分子量。
在所述组合物的一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有
a)化疗剂或者靶向抗癌症试剂；和
b)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)或者一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
在一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQID No：1)。
在另一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有一种肽，所述肽包括MUC1(SEQ IDNo：2)。
在所述组合物的进一步的实施方案中，所述化疗剂是紫杉醇。
在所述组合物的依旧进一步的实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有紫杉醇和一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)，装载比例大约为9:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:9。
在所述组合物的另一个的实施方案中，所述化疗剂是吉西他滨。在所述组合物的依旧进一步的实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有吉西他滨和一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)，装载比例大约为9:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:9。
在所述组合物另一个实施方案中，所述化疗剂或者靶向抗癌症剂选自由阿霉素、道诺红菌素、地西他滨、依立替康、SN-38、阿糖胞苷、多昔紫彬、雷公藤内酯、格尔德霉素、17-AAG、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、卡铂、泰索帝(taxotere)、氨甲蝶呤，和硼替佐米所组成的组中。
在另一个方面，这里提供了一种药物组合物，包括
a)聚合纳米颗粒，包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物；
b)一个或者一个以上治疗剂；和
c)包括NuBCP-9(SEQ ID No：1)的肽，
所述药物组合物用于治疗选自由癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、新陈代谢功能紊乱、发育异常、心血管疾病、肝病、肠病、传染性疾病、内分泌病和神经系统紊乱所组成的组中的疾病。
在一个实施方案中，所述组合物用于治疗癌症。在进一步的实施方案中，所述癌症是乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、转移性的结肠癌、胰腺癌或者血液恶性肿瘤。在进一步的实施方案中，所述癌症是乳腺癌。
在另一个方面，这里提供了一种药物组合物，包括
a)聚合纳米颗粒，包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物；
b)一个或者一个以上治疗剂；和
c)包括MUC1(SEQ ID No：2)的肽，
所述药物组合物用于治疗选自由癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、新陈代谢功能紊乱、发育异常、心血管疾病、肝病、肠病、传染性疾病、内分泌病和神经系统紊乱所组成的组中的疾病。
在一个实施方案中，所述组合物用于治疗癌症。在进一步的实施方案中，所述癌症是乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、转移性的结肠癌、胰腺癌或者血液恶性肿瘤。在进一步的实施方案中，所述癌症是乳腺癌。
在这里提供的任一药物组合物的一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成。
在这里提供的组合物的一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒进一步包括附着在所述聚合纳米颗粒外部的靶向部分，所述靶向部分是一种抗体、肽或者适体。
适当的药物组合物或者制剂可以包含，例如，大约0.1％到大约99.9％，优选大约1％到大约60％的活性成分。适合于肠道或者肠胃外给药的药物制剂是，例如，以单位剂量形式存在的制剂，例如，糖衣片剂、片剂、胶囊剂或者栓剂或者安瓿剂。如果不另外指明，这些都是以本领域已知的方法制备的，例如，通过传统的混合、造粒、糖衣包覆、溶解或者冷冻干燥过程制备。可以理解的是，在每种剂量形式的单一剂量中存在的结合组分的单位含量不需要是其自身的有效量，这是由于可通过给药多个剂量单位实现必须的有效剂量。
作为活性成分，所述药物组合物可以包含与一个或者一个以上药学上可接受的载体(赋形剂)结合的一个或多个本发明的纳米颗粒。在制备本发明组合物时，所述活性成分通常与赋形剂相混合，被赋形剂稀释或者包裹在载体内部，所述载体以，例如，胶囊、粉末、纸或者其他容器的形式存在。当所述赋形剂作为稀释剂时，其可以是固体材料、半固体材料或者液体材料，作为活性成分的媒介物、载体或者介质。因此，所述组合物可以以片剂、药丸、粉末、锭剂、香囊、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳化液、溶液、糖浆、烟雾剂(固体或者液体介质)、软膏剂的形式存在，包含，例如，按重量计高达10％的活性化合物、软胶囊和硬胶囊、栓剂、无菌可注射溶液和无菌程序包
适当的赋形剂的实施例包括乳糖(例如乳糖一水化物)、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉(例如，淀粉羟基乙酸钠)、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、胶体二氧化硅、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(例如聚烯吡酮)、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素，并且羟基丙基纤维素。所述制剂可以另外包括：润滑剂，比如滑石、硬脂酸镁，和矿物油；润湿剂；乳化剂和助悬剂；防腐剂，比如甲基和羟丙基苯甲酸盐；甜味剂；和调味剂。
本发明的化合物和组合物可以被整合到液态形式中用于口服给药，或者被注射给药，所述液态形式包括水溶液、合适调味糖浆、水或油悬浮液、和含有可食用油(例如棉花子油、芝麻油、椰子油或者花生油)的调味乳化液，以及酏剂和类似药物媒介物。
治疗方法
在依旧另一个方面，本发明提供了一种用于治疗疾病的方法，包括向需要的患者给药本发明的可生物降解的聚合纳米颗粒(例如，基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)组成)，所述聚合纳米颗粒中包括药物结合物。
在一个实施方案中，所述疾病选自由癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、新陈代谢功能紊乱、发育异常、心血管疾病、肝病、肠病、传染性疾病、内分泌病和神经系统紊乱所组成的组中。
这里还提供了一种治疗需要的患者所患癌症的方法，该方法包括向需要的患者给药治疗有效量的聚合纳米颗粒，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物并装载有
a)化疗剂和/或靶向抗癌症试剂；和
b)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)或者一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
在一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQID No：1)。
在另一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有一种肽，所述肽包括MUC1(SEQ IDNo：2)。
在一个实施方案中，所述化疗剂的是紫杉醇。在进一步的实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有紫杉醇和一种肽，所述肽包括NuBCP-9，装载比例大约为9:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:9。
在另一个的实施方案中，所述化疗剂是吉西他滨。在进一步的实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有吉西他滨和一种肽，所述肽包括NuBCP-9，装载比例大约为9:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:9。
在其他实施方案中，所述化疗剂或者靶向抗癌症剂选自由阿霉素、道诺红菌素、地西他滨、依立替康、SN-38、阿糖胞苷、多昔紫彬、雷公藤内酯、格尔德霉素、17-AAG、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、卡铂、泰索帝(taxotere)、氨甲蝶呤，和硼替佐米所组成的组中。在进一步地实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有化疗剂的或者目标抗癌剂(例如，阿霉素，道诺红菌素，地西他滨，依立替康，锡38，阿糖胞苷，多昔紫彬，雷公藤内酯，格尔德霉素，17美国地理学家协会，5-氟尿嘧啶，奥沙利铂，卡铂，泰索帝(taxotere)，氨甲蝶呤，否则硼替佐米)和包括NuBCP-9的肽，装载比例为大约9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，或者1:9。
在一个实施方案中，所述癌症是乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、转移性的结肠癌、胰腺癌或者血液恶性肿瘤。在具体的实施方案中，所述癌症是乳腺癌。
在一个方面，这里还提供了一种治疗需要的患者所患癌症的方法，该方法在于向需要的患者给药治疗有效量的聚合纳米颗粒，所述聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成，并且所述聚合纳米颗粒装载有
a)一个或者一个以上治疗剂；和
b)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)或者一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
在一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQID No：1)。
在另一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有一种肽，所述肽包括MUC1(SEQ IDNo：2)。
在一个实施方案中，所述疾病选自由癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、新陈代谢功能紊乱、发育异常、心血管疾病、肝病、肠病、传染性疾病、内分泌病和神经系统紊乱所组成的组中。
在另一个方面，这里提供了一种治疗需要的患者所患癌症的方法，该方法包括对所述患者给药治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括
a)聚合纳米颗粒，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物；
b)化疗剂和/或抗癌症靶向试剂；和
c)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)或者一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
在所述方法的一个实施方案中，所述药物组合物包括一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID No：1)。
在所述方法的另一个实施方案中，所述药物组合物包括一种肽，所述肽包括MUC1(SEQ ID No：2)。
在所述方法的一个实施方案中，所述化疗剂是紫杉醇。在所述方法的依旧进一步的实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有紫杉醇和一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ IDNO:1)，装载比例大约为9:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:9。
在所述方法的另一个的实施方案中，所述化疗剂是吉西他滨。在所述方法的依旧进一步的实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有吉西他滨和一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)，装载比例大约为9:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:9。
在所述方法另一个实施方案中，所述化疗剂或者靶向抗癌症剂选自由阿霉素、道诺红菌素、地西他滨、依立替康、SN-38、阿糖胞苷、多昔紫彬、雷公藤内酯、格尔德霉素、17-AAG、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、卡铂、泰索帝(taxotere)、氨甲蝶呤，和硼替佐米所组成的组中。
在所述方法的一个实施方案中，所述癌症是乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、转移性的结肠癌、胰腺癌或者血液恶性肿瘤。
与使用本发明药物结合物中的一个药学治疗剂进行单治疗剂给药(或者使用聚合纳米颗粒传递系统进行单治疗剂治疗，或者使用传统方法进行单治疗剂治疗)相比，给药包括药物结合物的聚合纳米颗粒不仅仅能够得到有益结果(例如，协同治疗作用，例如减轻、缓解疾病进展或者抑制症状)，还可以进一步的获得额外的有益效果(例如，较少的副作用、更持久的药效、改善患者生活质量或者减少死亡率)。
通过建立实验模型已经显示，包括药物结合物的聚合纳米颗粒能够实现这里描述的有益效果。本领域普通技术人员完全可以选择相应的实验模型来证实这种有益效果。包括药物结合物的聚合纳米颗粒的药理学活性可以，例如，在临床研究或者动物模型中予以说明。
在确定各个或者多个组分之间协同相互作用时，每个组分实现其作用的最适范围和绝对剂量范围可以通过调节不同的重量比范围和对需要的患者给药的剂量来明确确定。对人来讲，对病人进行临床研究的复杂性和成本使其不适合作为协同作用的初级模型。但是，在某些实验中所观察到的协同作用(参见，例如，实施例8)可以预计在其他种类中的作用，并且动物模型的存在可以进一步用于测定协同效果。这些研究结果还可以用来预计有效剂量比例范围、绝对剂量和血液浓度。
在一个实施方案中，这里提供的包括药物结合物的聚合纳米颗粒，或者包括所述药物结合物的聚合纳米颗粒的药物组合物，或者二者的结合均显示出协同效果。如这里所使用的术语“协同作用”指的是两个试剂的作用，例如，比方说，紫杉醇和包括NuBCP-9的肽产生的作用，所述作用例如减缓癌症发展症状或者癌症症状，并且所述作用大于每个药物在单独给药后所产生作用的简单加和(使用聚合纳米颗粒传递系统单独给药或者通过传统方法单独传递试剂)。可以使用适当的方法计算协同效应，例如Sigmoid-Emax公式(Holford,N.H.G.and Scheiner,L.B.,Clin.Pharmacokinet.6:429-453(1981))，Loewe加成性方程式(Loewe,S.and Muischnek,H.,Arch.Exp.Pathol Pharmacol.114:313-326(1926))和中位数-作用方程式(Chou,T.C.and Talalay,P.,Adv.Enzyme Regul.22:27-55(1984)).上面涉及的每个方程及公式都可以代入实验数据产生相应的图表，从而评价药物结合物的作用。通过上述方程式得到的相应的图表分别是浓度-作用曲线，等效线图和复合指数曲线。
在进一步实施方案中，这里提供了包括协同药物结合物的聚合纳米颗粒，适用于对患者给药，其中，在适当的肿瘤模型或者临床研究中给出了每个组分实现所述协同效果建议的剂量范围。
这里所提供的聚合纳米颗粒中药物结合物中各个结合物成分的有效剂量可以根据具体使用的化合物或者药物组合物、给药方式、被治疗的疾病、和被治疗的疾病的严重程度而变化。因此，包括药物结合物的聚合纳米颗粒的给药方案可以根据不同因素选择，包括给药途径、病人的肝肾功能。
虽然这里公开了药物结合物的某些比例，但是用于形成这里所提供的聚合纳米颗粒的结合物成分(例如，包括NuBCP-9的肽和紫杉醇)的最适比例和浓度，能够产生效力但不产生毒性的最适比例和浓度取决于所述治疗剂在靶向位点的有效性动力学，并可以通过本领域已知的方法来确定。
这里公开的治疗方法尤其适合于已经被诊断患有至少一种癌症的患者，这种患者可以利用这里所描述的聚合纳米颗粒进行治疗。例如，可生物降解的四嵌段聚合纳米颗粒可用于细胞内传递紫杉醇(PTX)(紫杉醇(PTX)/纳米颗粒)并且在抑制紫杉醇(PTX)漏泄方面非常有效。如实施例9所述，紫杉醇(PTX)/纳米颗粒具有抗P-gp-表达乳腺癌细胞活性，所述乳腺癌细胞对紫杉醇(PTX)和Nab-紫杉醇由耐受性。
在一些实施方案中，所述患者已经被诊断患有这里所提及的癌症，并且一般被证明使用至少一种传统的化疗剂(例如，紫杉醇，Nab-紫杉醇(ABRAXANE)、多昔紫彬、长春新碱、长春花碱、紫杉酚)难以治疗。因此，在一个实施方案中，本发明的治疗指的是接受一个或者一个以上传统化疗剂治疗的患者或者病人仍需要进行更有效的治疗。在一个具体的实施方案中，本发明的治疗指的是接受紫杉醇或者Nab-紫杉醇治疗的患者或者病人仍需要进行更有效的治疗。
在这里所提供任意方法的一个实施方案中，所述患者对紫杉醇或者Nab-紫杉醇治疗具有耐受性。
在这里所提供任意方法的一个实施方案中，所述患者使用紫杉醇或者Nab-紫杉醇难以治疗。
在这里提供任意方法的另一个实施方案中，所述患者用紫杉醇或者Nab-紫杉醇治疗后复发。
在另一个方面，这里提供了用于抑制细胞中紫杉醇消逝的方法，包括将该细胞与有效量的聚合纳米颗粒相接触，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物。
在这些方法的一个实施方案中，这些聚合纳米颗粒装载着紫杉醇。
在依旧另一个方面，这里提供了用于阻断细胞中P-糖蛋白表达的方法，包括将该细胞与有效量的聚合纳米颗粒相接触，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物。
在另一个方面，这里提供了用于阻断细胞中反向P-糖蛋白调节的耐药性的方法，包括将该细胞与有效量的聚合纳米颗粒相接触，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四逆转的共聚物。
在这里提供的任一方法的一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成。
在另一个方面，这里提供了用于产生对第一化疗剂具有耐受性的癌细胞的方法，所述方法包括将所述癌细胞与聚合纳米颗粒相接触，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物，其中所述聚合纳米颗粒装载有第二化疗剂，并且其中，所述癌细胞对第一化疗剂的耐受性是由于P-糖蛋白上调造成的。
在该方法的一个实施方案中，这些聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成。
在该方法的一个实施方案中，所述癌细胞是乳腺癌细胞。
在这些方法的一个实施方案中，第一化疗剂是紫杉醇。
在这些方法的一个实施方案中，第二化疗剂是紫杉醇。
在该方法的一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID No：1)。
在该方法的另一个实施方案中，所述聚合纳米颗粒装载有一种肽，所述肽包括MUC1(SEQ ID No：2)。
尽管主体内容已经参考其优选的实施方案进行了详细的描述，但也可以存在其他的实施方案。因此，所述权利要求书的精髓和范围不局限于这里所描述的优选的实施方案。
实施例
通过下述实施例来说明这里公开的内容，所述实施例仅仅起到解释这里所公开的内容的作用，并不作为对本发明内容范围的限制。除非另有定义，这里使用的所有科技用语与本揭发所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。虽然与这里描述的方法和材料相似的任何方法和材料都可以被用于实施或者检测本发明，但是下面描述的是示范性的方法、装置和材料。
实施例1：聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物的聚合纳米颗粒的制备
聚(乳酸)(分子量为45,000-72,000克/摩尔)、PEG-PPG-PEG(表1)和组织培养试剂购自Sigma-Aldrich公司(美国密苏里州，圣路易斯)。除非另有说明，所有试剂都是分析级或以上的，并以其收到的形式被使用。细胞系购自印度NCCS Pune公司。NuBCP-9肽是常规合成的，具有95％的纯度。
聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物 的制备
在250毫升圆底烧瓶中，将平均分子量为60,000克/摩尔的5克聚乳酸(PLA)溶于100毫升CH2Cl2(二氯甲烷)中。向此溶液中加入0.7克PEG-PPG-PEG聚合物(分子量范围为1100-12,500Mn)。在0℃下搅拌溶液10-12小时。向该反应混合物中加入5毫升的1％的N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)溶液，随后在-4℃到0℃温度下缓慢加入5毫升的0.1％的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。搅拌反应混合物24小时，随后用二乙醚沉淀聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物，并用华特曼纸No.1过滤。从而获得聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物沉淀，低度真空下干燥沉淀物并在2℃到8℃下储备直到进一步使用。
聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的 制备
通过乳化沉淀滴定法制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒。通过上述步骤获得的100毫克聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)共聚物被分别溶于有机溶剂，例如，乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)或者二氯甲烷中，得到聚合溶液。
将所得聚合溶液逐滴加入到20毫升蒸馏水构成的水相中制备纳米颗粒。在室温下磁力搅拌所述溶液10-12小时，使剩余溶剂蒸发并使纳米颗粒稳定。然后通过在25,000转/分下离心10分钟收集纳米颗粒，并用蒸馏水洗涤三次。进一步冷冻干燥纳米颗粒并在2℃到8℃下存储直到进一步使用。
聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物 聚合纳米颗粒的特性鉴定
按照如上所述步骤获得的纳米颗粒的形状基本上是球形的，如图4A-4B中显示的透射电子显微照片所示。透射电子显微镜照片确定了粒度范围在30-120纳米范围内。使用动态光散射(DLS)仪测量纳米颗粒的流体动力学半径在110-120纳米范围内(图2)。
表2显示了使用大分子量范围嵌段共聚物(PEG-PPG-PEG)合成的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的特征。
图2A显示了PLA、PLA-PEG、嵌段共聚物PEG-PPG-PEG和聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)聚合纳米颗粒的FTIR光谱。所述FTIR被证明在物种间差异不敏感。因此，使用核磁共振进一步进行特征鉴定。
图3A-C显示了使用大分子量范围嵌段共聚物(PEG-PPG-PEG)获得的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的核磁共振光谱。在这些图中，化学位移大约为5.1的质子代表PLA的酯质子，化学位移大约为3.5的质子代表PEG-PPG-PEG的醚质子。这两种质子同时存在于光谱中证实PLA与PEG-PPG-PEG结合。
实施例2：包含物质的纳米颗粒的制备
封装药物的聚合纳米颗粒的制备
本发明的纳米颗粒本质上是两亲性的，并且能够装载疏水性药物(例如阿霉素)和亲水性药物(例如抗癌剂九基肽(L-NuBCP-9、FSRSLHSLL的L-构型)、16-基BH3结构域等等)。
100克使用实施例1的方法制备的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒被溶解在5毫升有机溶剂(例如乙腈(CH3CN)、二甲基甲酰胺(DMF；C3H7NO)、丙酮或者二氯甲烷(CH2Cl2))中。
1-5毫克的药物物质、NuBCP-9(FSRSLHSLL的L-构型)被溶解于水溶液中并加入上述聚合溶液中。所述物质通常占聚合物重量的10-20％。所述溶液在250-400转/分下被简单的超声处理10-15秒，产生精细的初级乳化液。
使用注射器/微量吸液管将所述精细初级乳化液逐滴加入到20毫升蒸馏水的水溶液中，并在25℃到30℃下以250-400转/分的速度磁力搅拌10-12小时，使溶剂蒸发并使纳米颗粒稳定。所述水溶液进一步包括糖添加剂。所得纳米颗粒悬浮液被搅拌整夜，在开口、裸露的环境下蒸发残余有机溶剂。在10,000转每分下离心10分钟收集所述NuBCP-9封装的聚合纳米颗粒，或者在3000g下超滤15分收集(Amicon Ultra,Ultracel membrane with 100,000NMWL,Millipore,USA).所述纳米颗粒再悬浮在蒸馏水中，洗涤三次并冷冻干燥。他们在2℃到8℃下存储直到进一步使用。所述聚合纳米颗粒高度稳定且没有秘密特性。
使用不同重量的共聚物制备的聚合纳米颗粒装载效力的比较
按照上述方法，使用不同分子量的PEG-PPG-PEG聚合物制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)聚合纳米颗粒。使用不同分子量的PEG-PPG-PEG聚合物合成聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)共聚物，在使用此共聚物制备嵌二萘装载的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)聚合纳米颗粒。嵌二萘占聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物重量的2-20％，并且制备装载荧光染料的纳米颗粒。纳米颗粒的物质装载量根据用来合成所述纳米颗粒的PEG-PPG-PEG聚合物的分子量变化而变化。表3显示了使用不同分子量的嵌段共聚物产生的聚合纳米颗粒中封装的成像分子的百分比。
荧光染料若丹明的细胞内化作用
按照如上所述的方法制备装载若丹明的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)聚合纳米颗粒。若丹明占聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物重量的2-20％，并且制备装载荧光染料的纳米颗粒。
1×105MCF-7被制板并在含盖烧瓶中生长至60％汇合。然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，在10毫升包含10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养24小时。然后吸出生长培养基并用PBS洗涤细胞两次。向盖玻片上的细胞中加入装载若丹明的纳米颗粒并在37℃下培养12小时。培养后，洗涤细胞，除去盖玻片。用PBS溶液洗涤，最后在室温下用4％的多聚甲醛固定20分钟。之后，除去固定剂，洗涤细胞并用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色(荧光染料-染色核细胞)5分钟，然后在旋转台上用水洗涤1分钟。然后用共焦荧光显微镜(奥林帕斯，Fluoview FV1000显微镜，日本)分析盖玻片。使用装载荧光染料(若丹明B)的纳米颗粒和共焦激光扫描显微镜(CLSM)确定纳米颗粒在MCF-7细胞中的细胞内化作用(图5)。
实施例3：具有靶向部分的药物封装聚合纳米颗粒的制备
许多小分子，例如分别能够提供-COOH或者-NH2功能性的胺类或者氨基酸，可以被用作本发明聚合纳米颗粒靶向部分与生物分子结合。
聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)-赖氨酸的制 备
聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)共聚物与氨基酸(赖氨酸)相连，从而具有-NH2基团。在250毫升烧瓶中，将5克的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)和0.05克的赖氨酸溶于100ml乙腈/二氯甲烷(1:1)中，并在-4℃-0℃下搅拌。向此溶液中加入1％的N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)溶液，随后在0℃下缓慢加入0.1％的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。将反应混合物搅拌24小时，然后用二乙醚沉淀聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)-赖氨酸，并用华特曼1号纸过滤。在低度真空下干燥沉淀并在2-8℃下放置直到进一步使用。
聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)-赖氨酸纳米 颗粒的制备
为了制备纳米颗粒制备，将聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)-赖氨酸共聚物(100mg)溶于乙腈(或者二甲基甲酰胺(DMF)或者二氯甲烷)中。然后向溶液中加入药物(大约占聚合物重量的10-20％)，并短暂超声15秒，产生初级乳化剂。然后逐滴将产生初级乳化剂加入到蒸馏水(20毫升)水相中，在室温条件下磁力搅拌10-12小时，使溶剂蒸发，纳米颗粒稳定。在25,000转/分下离心收集形成的纳米颗粒10分钟，然后用蒸馏水洗涤三次，随后冷冻干燥，并在2-8℃下储存进一步使用
纳米颗粒与叶酸(FA)的生物结合物
20毫克冷冻干燥的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒被溶于milliQ水中并用N-(3-二乙胺基丙基)-N-乙基碳化二亚胺(EDC)(50微升，100mM)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(50微升，100mM)处理，并轻轻摇动所得混合物20分。之后，加入10mM的叶酸溶液并轻摇溶液30分钟，随后使用amikon过滤器过滤，除去滤液中残留的未发生作用的FA。冷冻干燥结合叶酸的纳米颗粒，随后在-20℃下储存。
实施例4：评价聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)聚合纳米颗粒的传递能力
通过聚合纳米颗粒聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG- PPG-PEG)体外释放被包覆的药物
10毫升磷酸盐缓冲液盐水和10毫克包覆若丹明B-结合NuBCP-9(药物)的PLA-PEG-PPG-PEG纳米颗粒组成混合物，在37℃下以200转每分的速度搅拌所述混合物。在不同的时间间隔，以25,000转/分的速度离心收集混合物上清液样品6天。每次离心作用之后将纳米颗粒在悬浮在新鲜的缓冲液中。使用BCA试剂盒(Pierce公司，美国)在562纳米下用分光光度计评价药物释放的量，对2毫升上清液进行蛋白质评价。根据标准曲线计算药物释放。据观察，通过聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)聚合纳米颗粒完成的药物释放比使用传统PLA纳米颗粒完成的药物释放更好控制(图6A)。
XTT(2,3，-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯胺基)-羰基]-2H-四唑内钠 盐)试验
使用XTT(2,3，-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯胺基)-羰基]-2H-四唑内钠盐)试验在主要人脐静脉(HUVEC)细胞系和MCF-7细胞系中进行细胞生存能力实验(图6B、7A和7B)。
在96孔板的每个小孔中接种1×104个MCF-7细胞，培养24小时。24小时后，在每个平板中用包含5微摩NuBCP-9肽的本发明聚合纳米颗粒或者不含有任何肽的参照纳米颗粒处理细胞。还分别用相同浓度的NuBCP-9肽在不含有任何细胞穿透肽(CPP)的情况下处理细胞。将细胞与纳米颗粒一起培养不同的时间范围，包括16小时、24小时、48小时、72小时和96小时。在培养之后，用新鲜的培养基与包含装载抗癌肽-NuBCP-9的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的培养基互换，向每个孔中加入10微升重新组成的XTT混合物试剂盒试剂。培养4小时后，使用微量滴定板阅读器(Bio-Rad公司，加州、美国)在450纳米下测定样品的吸光度。确定细胞的增殖作用，作为与未被处理的参照活细胞的百分比，一式三份进行分析。图6显示了装载NuBCP-9的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒对MCF-7细胞系细胞生存能力随时间变化的作用图7A显示了装载药物NuBCP-9的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒对主要人脐静脉(HUVEC)细胞系细胞生存能力随时间变化的作用。
实施例5：为了实现纳米颗粒中更高的治疗剂装载量而进行的肽药物的修饰作用
通过用低分子量的PLA共价修饰药物部分实现更高的疏水性和亲水性治疗剂的装载量。使用低分子量的PLA和乙基二甲基氨丙基碳化二亚胺和N-羟基-琥珀酰亚胺(EDC/NHS)化学品对肽药物进行修饰。用于连接物质的PLA的平均分子量在大约2,000-10,000克/摩尔范围内。
将1克分子量为5,000克/摩尔的PLA溶于10毫升乙腈中。向溶液中加入500微升在二氯甲烷中的N-(3-二乙氨基丙基)-N-乙基碳化二亚胺(EDC；400mM)和500微升在二氯甲烷中的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS；100mM)。将混合物轻轻摇晃2小时，随后用二乙醚沉淀PLA。这种PLA也叫“活化的”PLA。1毫摩尔活化的PLA溶于乙腈中，并向此溶液中加入1毫摩尔的肽药物NuBCP-9，并且在此轻轻摇晃反应混合物30分钟。然后用二乙醚沉淀混合物并在低度真空下干燥，随后储存在-20℃下直到进一步使用。
聚合纳米颗粒的药物装载量会随着用于制备所述纳米颗粒的嵌段共聚物的重量增加而增加。纳米颗粒的药物装载量还可以通过在将药物装载入所述聚合纳米颗粒之前将低分子量的PLA和治疗剂(即NuBCP-9)结合而显著增加，如表4和表5中所示。本发明纳米颗粒的药物装载量可增加5％-10％。
实施例6：评价纳米颗粒安全性和毒性的体内试验
在BALB/c小鼠中进行研究评价使用实施例1中描述的方法制备的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)聚合纳米颗粒的毒性和安全性。
血液学参数
对动物组以150毫克/千克体重的单一剂量静脉注射聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒，每隔7天在参照和纳米颗粒治疗的组中评价血液学参数进行21天。参照组没有接受纳米颗粒。
如图8所示，在参照组合纳米颗粒治疗组之间的全血细胞计数(CBC)，红血球(RBC)计数，白细胞(WBC)计数，嗜中性白细胞，淋巴细胞，红细胞压积，MCV(平均红血球容积)，MCH(红细胞平均血红蛋白)和MCHC(平均红血球血色素浓度)没有显著变化。
肝肾功能的生化血液实验
对动物组以150毫克/千克体重的单一剂量静脉注射聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒，每隔7天在参照和纳米颗粒治疗的组中评价血液学参数进行21天。
在参照组和治疗组之间，总蛋白质、白蛋白和球蛋白水平没有显著变化。如图9所示，在聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒治疗组中，肝脏酶、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)水平没有显著增加。尿素和血液尿素氮(BUN)是肾功能良好的指标。如图9所示，治疗组小鼠与参照组相比，尿素和BUN水平没有显著变化。
用聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒 治疗的小鼠的病理解剖
用单一剂量为150毫克/千克体重的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒治疗的BALB/c小鼠。21天后，杀死动物并对其组织器官进行组织学评价，评价其由于聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒或者其降解产物造成的毒性引起的组织损伤、发炎或者病变。如图10所示，在纳米颗粒治疗动物的脑、心脏、肝、脾、肺和肾中没有观察到组织病理学反常或者病变。
实施例7：聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒作为体内纳米载体系统的效力
菌株BALB/c类转基因小鼠的欧利希腹水肿瘤(EAT)模型被用作评价纳米颗粒用作纳米载体系统的效力。使用体重为20克的动物进行此研究(图12A)。
抗癌剂肽药物(NuBCP-9)被装载入所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)聚合纳米颗粒。将实施例2制备的聚合纳米颗粒的腹膜内制剂经腹膜内给药小鼠，所述聚合纳米颗粒包括抗癌剂肽、NuBCP-9，包裹在聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)中的剂量为200-100微克肽。对动物给药的抗癌剂肽的总重量是300微克-600微克/小鼠。制剂的给药频率是每两周给药一次，进行21天，然后观察动物60天。
对小鼠给药装载有NuBCP-9的纳米颗粒60天之后，在小鼠体内可以观察到肿瘤生长抑制作用(图11)。据发现，与参照组相比(图12c)，用装载NuBCP-9纳米颗粒治疗的小鼠所患肿瘤完全被治愈(图12b)。参照组只接受简单的不含治疗剂的纳米颗粒。
在患有糖尿病的兔子中评价作为肠胃外补给站的装载胰岛素的聚(乳酸)-聚(乙 二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒
胰岛素在聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳 米颗粒中的胶囊化作用
通过双乳化液溶剂蒸发方法制备包覆胰岛素的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒。为了制备纳米颗粒，1克的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)共聚物溶于乙腈。向溶液中加入胰岛素(500I.U)并短暂的超声15秒，产生初级乳化液。所得初级乳化液逐滴加入到30毫升水相中并在室温下磁力搅拌6-8小时，从而使溶剂蒸发，纳米颗粒稳定。然后通过在21,000转/分下离心10分钟收集纳米颗粒，并用蒸馏水洗涤三次。进一步冷冻干燥装载胰岛素的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒并在4℃下存储至进一步使用。
体内研究研究
对患有糖尿病小鼠皮下给药单一剂量为50I.U./千克体重的装载胰岛素的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒，并且监控10天。
在给药50I.U./千克体重胰岛素的动物中，可以观察到，在逐渐增加血糖水平之后，血糖水平会维持在120-150毫克/dl，维持8天。装载药物的聚合纳米颗粒在注射位点形成补给站并通过缓慢降解和扩散的方式持续释放捕获的胰岛素。在长达8天的时间里，葡萄糖水平不会回复到原始糖尿病水平(500mg/dl)，说明聚合纳米颗粒能够以持续的方式保持并释放具有生物活性的胰岛素长达一个星期的时间(图13)。
装载MUC1的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG) 纳米颗粒的评价：
通过聚合纳米颗粒聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG- PPG-PEG)体外释放被包覆的MUC1
10毫升磷酸盐缓冲液盐水并且10毫克包裹若丹明B-连接的MUC1细胞质结构域肽(与聚精氨酸蛋白质转导结构域(Ac-RRRRRRRRRCQCRRKN-NH2)相连)的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒形成混合物，在37℃下以200转每分的速度搅拌混合物。在不同的时间间隔，以25,000转/分的速度离心收集混合物上清液样品6天。每次离心作用之后将纳米颗粒在悬浮在新鲜的缓冲液中。使用BCA试剂盒(Pierce公司，美国)在562纳米下用分光光度计评价药物释放的量，对2毫升上清液进行蛋白质评价。根据标准曲线计算药物释放。据观察，通过聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)聚合纳米颗粒完成的药物释放可以被控制到长达60天(图14)。
XTT(2,3，-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯胺基)-羰基]-2H-四唑内钠 盐)试验
使用XTT(2,3，-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯胺基)-羰基]-2H-四唑内钠盐)试验在主要人脐静脉(HUVEC)细胞系和MCF-7细胞系中进行细胞生存能力实验(表6)。
在96孔板的每个小孔中接种1×104个MCF-7细胞，培养24小时。24小时后，用包含20或者30微摩与聚精氨酸序列(RRRRRRRRRCQCRRKN)相连的MUC1-细胞质结构域肽的本发明聚合纳米颗粒或者不含有任何肽的参照颗粒处理每个平板中的细胞。将细胞与纳米颗粒一起培养不同的时间范围，包括16小时、24小时、48小时、72小时和96小时。在培养之后，用新鲜的培养基与包含装载MUC1-细胞质结构域肽的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的培养基互换，向每个孔中加入10微升重新组成的XTT混合物试剂盒试剂。培养4小时后，使用微量滴定板阅读器(Bio-Rad公司，加州、美国)在450纳米下测定样品的吸光度。确定细胞的增殖作用，作为与未被处理的参照活细胞的百分比，一式三份进行分析。表6显示了装载MUC1-细胞质结构域肽的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒对激素依赖性乳腺癌细胞系MCF-7的细胞生存能力的作用。
本领域普通技术人员可以识别或者能够仅仅使用常规实验确定许多与这里描述的本发明具体实施方案的等价物。这些等价物包括在随后的权利要求书中。
实施例8：紫杉醇(PTX)和L-NuBCP-9肽通过聚合纳米颗粒共同传递的协同效应
将紫杉醇和L-NuBCP-9包裹入聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段聚合纳米颗粒中评价其在体内和体外对恶性细胞的协同效应。
I.材料和方法
A.聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)共聚物的 合成和特性鉴定：
使用70-KDa PLA(NatureWorks公司，美国)或者12-kDa PLA(Purac Chemicals公司，欧洲)和泊洛沙姆-F127(12.5KDa)和泊洛沙姆F68(6KDa)(Sigma-Aldrich公司，美国)合成聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物。通过DCC-DMAP(Sigma-Aldrich公司)方法合成四嵌段共聚物。
B.装载L-NuBCP 9和紫杉醇(PTX)药物的纳米颗粒的制备：如文献(Kumar M,GuptaD,Singh G,Sharma S,Bhat M,Prashant CK,Dinda AK,Kharbanda S,Kufe D,and SinghH.Cancer Research 74(12):3271-3281,2014)的报道，使用L-NuBCP-9肽(Bioconcept公司常规合成，印度)-装载的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒进行双乳化液溶剂蒸发法。使用乳化液-溶剂蒸发方法产生装载紫杉醇(PTX)的纳米颗粒。简单的说，将50毫克在5毫升乙腈(ACN)中的共聚物和5毫克紫杉醇(PTX)(LC实验室，波士顿，麻省，美国)溶于100微升ACN中，加入到溶于5毫升ACN的50毫克聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)溶液中。然后将所得混合物加入20毫升水溶液(由在蒸馏水中F127组成)中并在室温下搅拌6-8小时促进溶剂蒸发和纳米颗粒稳定。使用双乳化液法制备装载紫杉醇(PTX)和NuBCP-9肽的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)(50mg)纳米颗粒。将紫杉醇加入所述溶解的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)共聚物中，随后立即加入轻微超声处理的肽。然后将混合物全部加入20毫升包含poloxomer F127的水溶液中。若丹明(RhB)作为亲水染料，香豆素6作为疏水染料，使用相同的过程制备装载有上述亲水染料和疏水染料的纳米颗粒，进行聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的细胞吸收研究。
用Amikon 30-KDa超滤器(Millipore公司，美国)过滤纳米颗粒并用MQ水洗涤两次除去游离药物/染料。进一步冷冻干燥纳米颗粒并在-20℃下存储直到进一步使用。收集滤液并用Micro-BCA试剂盒(Pierce化学品公司，美国)分析游离NuBCP-9肽，并在590纳米下在EPOCH微板阅读器(BioTek公司，美国)上测量。同样，使用高效液相色谱法HPLC(PerkinElmer公司，美国)测定法测量单体的紫杉醇，用C18柱，乙腈、水、甲醇(60:35:5体积比)作为流动相。按照下式确定NuBCP-9肽/紫杉醇(PTX)的胶囊化效力(EE％)：
EE％＝[总药物(肽/PTX)–滤出物]X 100
总(原始肽/PTX)
使用扫描电子显微镜法(SEM，蔡斯EVO 50系列)和透射电子显微镜(TEM，菲利普CM12型)确定所得纳米颗粒的形态学和颗粒尺寸。通过纳米颗粒轨迹分析(Malvernnanosight公司，英国)评价纳米颗粒的ζ电势。
C.肽和紫杉醇从纳米颗粒中释放的评价：使用超滤方法确定NuBCP-9和紫杉醇从 纳米颗粒中体外释放的动力学。简单的将，将冷冻干燥的纳米颗粒样品(10毫克)悬浮在PBS中并在150-160转/分条件下37℃摇瓶培养。在长达60天的时间内按照预定的时间点从培养器中除去样品并用30-kDa Amikon滤纸(微孔)超滤。收集滤液并分析，向各自试管中加入新鲜缓冲液。使用微-BCA实验试剂盒确定滤液中肽浓度并使用HPLC测定紫杉醇(PTX)。
D.体外细胞毒性分析：在两个癌细胞系中评价聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二 醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的体外细胞毒性。人ER+MCF-7和ER-MDA-MB231乳腺癌细胞在包含10％FBS、100单位/毫升青霉素和100克/毫升链霉素的DMEM中生长。在整个实验过程中，细胞维持在37℃和5％二氧化碳环境中。将指数生长期的癌细胞放入96-孔板中，接种密度为每孔3000个细胞并培养24小时。在每个小孔中分别加入处于二甲亚砜中的游离紫杉醇(PTX)、装载紫杉醇(PTX)-和NuBCP-9(单/二重装载)的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒，使最终药物浓度为.001、0.01、0.1、1、5、10和20微摩。用细胞培养基稀释，稀释后培养平板小孔中二甲亚砜的最终浓度<0.1％。在72小时后，使用基于XTT的体外细胞增殖实验试剂盒(Cayman公司，美国)按照使用说明书评价游离药物、装载单一药物或者二重药物的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的肿瘤细胞增殖抑制作用。使用Graph Padprism进行中位数作用方程计算最大半抑制药物浓度(IC50)，数据表示为平均值±标准差(n＝3)。
为了评价纳米颗粒的吸收，将MCF-7细胞接种在盖玻片上，生长24小时，然后与若丹明B和香豆素6装载的纳米颗粒一起培养，去掉盖玻片，用PBS洗涤，并用4％的多聚甲醛固定。然后用4,6二脒基2苯基吲哚(4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI))(Invitrogen公司，美国)对细胞染色，并在共焦激光扫描显微镜(CLSM；奥林帕斯，Fluoview FV1000显微镜)下观察。
E.结合指数(CI)分析:根据Chou-Talalay方法，使用compusyn软件(1.0版本，combosyn公司，美国)对紫杉醇(PTX)和NuBCP-9肽结合物进行CI分析，确定其对MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞协同的、加成的或者拮抗的细胞毒素作用。
CI>1代表拮抗作用；CI＝1代表加成作用；CI<1代表协同作用。药物结合比例，使用GraphPad prism软件(5.0版本；美国)将药物结合物的fa(部分影响)对CI制图(例如，图18E、18F、18I、18J)。
F.凋亡评价:用AnnexinV-AlexaFluor488/PI凋亡检测试剂盒(Invitrogen公司，美国)对细胞染色。使用CLSM显微镜对细胞成像进行定性分析。使用FACS(Aria LLC)进行凋亡/坏死定量分析。
G.蛋白质印迹实验分析：用M-PER试剂(Pierce化学品公司，美国)制备细胞溶解产物并用抗Bcl-2、抗-β微管蛋白、抗半胱天冬酶-3(Biosepses公司，中国)、抗PARP和抗-β-肌动蛋白(圣克鲁斯生物技术公司，美国)进行免疫印迹分析。用chemiliuminesence软件(Li-Cor印迹扫描仪，美国)计算谱带强度的相对倍数变化。
H.抗癌活性分析:将小鼠欧利希肿瘤细胞皮下注射入同基因系Balb/c小鼠(17-22克)的下肢。患上肿瘤的小鼠(大约150立方毫米)被分成9组(6小鼠/组)并每周一次或者每两周一次腹腔给药(i.p.)不同的制剂，进行21天。使用游标卡尺测量并使用式(A X B2)X0.5计算肿瘤体积，其中，A和B分别是最长和最短肿瘤直径。在第7、14和21天从每个组中杀死一只小鼠，收获肿瘤进行组织解剖实验。将肿瘤固定在10％福尔马林/盐水中，并迁入石蜡。用苏木精和曙红色染料染色5微米切片进行进一步免疫组织化学分析、TUNNEL和Ki67试验。使用Graph pad prism进行单向ANOVA对肿瘤体积进行统计分析。用Prism 4.0软件(Graph Pad软件)，使用Kaplan–Meier方法确定小鼠的存活率。
I.数据/统计分析:所有的结果均显示为平均值±标准差，并且用学生T检验测定参照组和实验组之间的差异。至少分析三个样品。当P<0.05时认为参照组和实验治疗组之间具有统计学显著差异。
II.结论
A.装载NuBCP-9的聚合纳米颗粒的制备和特性鉴定：
使用DCC DMAP，按照之前的描述，使用12kDa或者72kDa的PLA和6KDa或者12.5KDa的PEG-PPG-PEG嵌段制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)嵌段共聚物。正如前面提到的那样使用1H NMR确定出PLA12K PEG-PPG-PEG和PLA72KPEG-PPG-PEG所合成的嵌段共聚物的分子量分别为15.6KDa和83KDa。
使用扫描电镜和透射电子显微镜分析聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物的形态和尺寸。SEM显示聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒是球形的，而TEM显示多层构造，其中，PLA作为疏水核，PEG作为亲水壳，在两个层之间含有疏水性PPG夹层。颗粒尺寸的直径在45-90纳米范围内(图15A和图15B)。
将MCF-7乳腺癌细胞与装载若丹明B(亲水性药物模型)和香豆素6(疏水性药物模型)染料的PLA72K-PEG-PPG-PEG12.5K纳米颗粒一起培养，用荧光共焦激光扫描显微镜检查在3小时后显示出纳米颗粒的吸收(图16)。结果显示细胞液内布满装载若丹明B和香豆素6的纳米颗粒的细胞内荧光。据观察，基于PLA的纳米颗粒的吸收可以穿过胞吞作用，并且在内溶酶体的酸性pH值条件下与表面电荷逆转(阴离子型到阳离子性)有关。所述电荷逆转促进纳米颗粒与液胞膜之间的相互作用，导致短暂的和定向的细胞膜不稳定，从而使纳米颗粒进入细胞液(Kumar M,et al.(2014)Novel polymeric nanoparticles forintracellular delivery of peptide cargos:antitumor efficacy of the BCL-2conversion peptide NuBCP-9.Cancer Res 74(12):1-11；Hasegawa M,et al.(2015)Intracellular targeting of the oncogenic MUC1-C protein with a novel GO-203nanoparticle formulation.Clin Cancer Res 21(10):2338-2347).
NuBCP-9靶向BCL-2，并将其从细胞保护体转变为细胞致死体(Kolluri SK,et al.(2008)A short Nur77-derived peptide converts Bcl-2 from a protector to akiller.Cancer Cell 14(4):285-298).因此，当用FITC-NuBCP-9/纳米颗粒治疗MCF-7细胞时，研究NuBCP-9的细胞内定位。通过用Mitotracker染色证实FITC-NuBCP-9定位到细胞质和线粒体上(图25)。光亲和性交联研究说明在微管中与微管蛋白结合的紫杉醇(PTX)的定位作用(Rao S,et al.(1995)Characterization of the taxol binding site on themicrotubule.2-(m-Azidobenzoyl)taxol photolabels a peptide(amino acids 217231)of beta-tubulin.J.Biol.Chem.270(35):20235-20238；Rao S,et al.(1999)Characterization of the Taxol binding site on the microtubule.Identificationof Arg(282)in beta-tubulin as the site of photoincorporation of a 7-benzophenone analogue of Taxol.J.Biol.Chem.274(53):37990-37994)和在线粒体中(Carre M,et al.(2002)Tubulin is an inherent component of mitochondrialmembranes that interacts with the voltage-dependent anionchannel.J.Biol.Chem.277(37):33664-33669).与上述研究一致，用FITC-紫杉醇(PTX)/纳米颗粒和RhoB-NuBCP-9/纳米颗粒治疗的MCF-7细胞的共焦分析说明紫杉醇(PTX)和NuBCP-9共定位在细胞液和线粒体中(图25)。
B.药物装载效率和体外释放研究
表7下显示了不同分子量的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒对NuBCP-9和紫杉醇(PTX)包覆作用的百分比。由于其高PLA含量(84％)，聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物是高疏水性的，因此该共聚物对亲水性肽NuBCP-9的包裹作用较低，只有64.5％，相对的对紫杉醇的包覆作用则为87％。
制备不同配比的紫杉醇(PTX)-NuBCP-9肽在聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒中的结合物制剂，实现以最小的紫杉醇(PTX)和NuBCP-9肽浓度实现最大的细胞增殖抑制作用。然后观察这些制剂的尺寸和ζ电势，如表7中所示。紫杉醇(PTX)的包裹效率在所有制剂中都>90％，而对于NuBCP-9肽，装载量随着肽数量的增加而增加。在所有制剂中，当紫杉醇(PTX)和NuBCP-9肽的比例为1:4时可以观察到最大装载量，随后，比例越大会导致微颗粒的形成。
据观察，纳米颗粒的ζ电势随着肽的包裹作用的增加而更趋阴性(表7)。ζ电势下降的准确原因至今不明，但可能的原因是由于带正电吸附的肽与带负电荷的PLA的相互作用，使肽的羧基具有负电荷。装载紫杉醇(PTX)和NuBCP-9的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒(单/双)的尺寸分布在100-170纳米范围内变化，这一结果在几乎所有制剂中都相似。
图17A和图17B显示了紫杉醇(PTX)和NuBCP-9从PLA72K/12K-PEG-PPG-PEG12.5k纳米颗粒中体外释放的曲线。在生理pH下，紫杉醇(PTX)和NuBCP-9肽从PLA72K-PEG-PPG-PEG12.5K和PLA12K-PEG-PPG-PEG6K中的共同释放显示出缓慢的和持续性特点，分别在7天内释放30％和40％的药物，而当单独装载在纳米颗粒中时，紫杉醇(PTX)释放47％，肽释放58％(图17C)。但是，在低分子量PLA12K-PEG-PPG-PEG6K中(单/双)装载的紫杉醇(PTX)和NuBCP-9完全体外释放曲线只不过分别持续7天和10天，而在高分子量PLA72K-PEGPPG-PEG12.5K，则能持续60天，这大概是与低分子量PLA降解速度更快和生物溶解性更好有关。
这些发现说明(i)紫杉醇(PTX)和NuBCP-9的包覆作用可以在相同的纳米颗粒内完成，并且(ii)紫杉醇(PTX)和NuBCP-9可以从紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒中持续释放。
根据这些结果，NuBCP-9和紫杉醇(PTX)-包覆(单和双)的PLA72K-PEG-PPG-PEG12.5K纳米颗粒被用于进一步控制药物持续释放，与低分子量PLA四嵌段纳米颗粒相比可以释放更长的时间，适合进一步研究体外和体内生物活性。
C.体外细胞毒性和组合分析
为了确定共-传递系统的协同作用，以剂量依赖方式研究不同制剂的体外细胞生存作用，在MCF7和MDA-MB231细胞中分别对游离药物和单药物装载/双药物装载的纳米颗粒进行研究。如图18所示，可以看出与其他各种药物制剂相比，紫杉醇(PTX)-NuBCP-9按1:1联合装载的纳米颗粒对MCF7和MDA-MB231乳腺癌细胞显示最高细胞增殖抑制作用。因此，1:1装载的紫杉醇(PTX)-L-NuBCP-9纳米颗粒用于进一步体外和体内试验。
进行时间依赖性研究直到96小时，比较1微摩游离药物和(单/双)装载药物的纳米颗粒的效力。在图18B中，装载1:1结合的紫杉醇(PTX)-NuBCP-9肽的纳米颗粒在48小时内显示>80％的细胞抑制作用。装载紫杉醇和装载L-NuBCP-9的混合物显示大约70％的抑制作用，这与游离紫杉醇(PTX)类似。但是，单装载紫杉醇(PTX)和NuBCP-9的只分别显示40％和20％的细胞增殖抑制作用。因此，可以确认联合装载1:1紫杉醇(PTX)-NuBCP-9肽的纳米颗粒在48小时具有细胞增殖抑制的协同效应。还以不同的浓度(直到115微摩)检测简单的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的细胞生存能力，结果显示其生存能力大于85％，这说明聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒无毒性且具有生物相容性(图18C和图18D)。
装载单药物紫杉醇(PTX)和NuBCP-9肽的纳米颗粒以1:1的比例混合，与双装载紫杉醇(PTX)-NuBCP-9肽的纳米颗粒相比较进行研究，评价其细胞增值作用的抑制能力。混合纳米颗粒只显示70％抑制作用，而双装载紫杉醇(PTX)-NuBCP-9肽的纳米颗粒在第48小时仍显示90％的抑制作用。在1微摩下，当单药物装载纳米颗粒以相同比例混合时几乎是无效的，而两种药物装载在同一纳米颗粒中时，显示最大的协同作用，其远远好于单紫杉醇(PTX)或者NuBCP-9装载的纳米颗粒。因此证实了双装载纳米颗粒具有协同效应。
根据上述结果可知，紫杉醇(PTX)-NuBCP-9纳米颗粒向细胞中最佳的共同传递是很重要的，可以强化体外抗癌效果。
在较宽浓度范围内分析不同的纳米颗粒对MCF-7和MDA-MB细胞的结合指数。结合指数(CI)值小于、等于或者大于1分别指具有协同效果、加成效果或者拮抗作用。可以看出，与游离或者装载单药物的纳米颗粒相比，装载1：1紫杉醇(PTX)-NuBCP-9肽的纳米颗粒具有高协同效果的最佳拟合水平(图18E和18F)。为了进一步验证这些发现，用不同浓度的紫杉醇(PTX)/纳米颗粒、NuBCP-9/纳米颗粒或者紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒处理MCF-7细胞。根据Chou and Talalay方法使用Compusyn软件进行CI分析。结果证明所有不同的结合物都具有协同作用，CI值<0.2(图18I)。MDA-MB-231细胞也可以得到类似的结果(图18J)说明紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒对抑制乳腺癌细胞的生长和存活具有协同作用。
D.装载NuBCP-9-紫杉醇(PTX)组合物的纳米颗粒对乳腺癌细胞细胞凋亡的作用:
为了评价紫杉醇(PTX)-NuBCP-9纳米颗粒对细胞凋亡的作用，用单或者双药物装载的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒治疗MCF-7细胞并检测细胞膜上磷脂酰丝氨酸的表面化作用。用Annexin V-Alexa flour 488/PI染色的MCF-7细胞的共焦显微照片说明，在48小时，用紫杉醇(PTX)-NuBCP-9联合治疗的和用装载但药物纳米颗粒治疗的细胞具有更高的细胞凋亡，这与凋亡反应的诱导有关。相反，用空白纳米颗粒的治疗没有观察到作用。
通过荧光激活细胞分类术(Aria BD falcon)进行Annexin V和PI染色定量分析进一步证实紫杉醇(PTX)-NuBCP-9PLA72K-PEG-PPG-PEG12.5K纳米颗粒比单装载纳米颗粒更有效，能在24小时内诱导MCF-7细胞凋亡(图19A/19B)。
通过蛋白质印迹实验分析检验乳腺癌细胞系中BCL-2、微管蛋白、半胱天冬酶3裂解片段和PARP蛋白质裂解片段的水平。(图19C)紫杉醇(PTX)-NuBCP-9纳米制剂具有减少的BCL-2和微管蛋白表达水平和增加的半胱天冬酶3裂解片段和PARP表达裂解片段表达，超过任意一种单独药物装载的纳米颗粒(图19D)。这些发现支持前述结论，即紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒在诱导MCF-7细胞凋亡方面比紫杉醇(PTX)/纳米颗粒或者NuBCP-9/纳米颗粒更有活性。
E.体内协同抗癌效果的评价:
在欧利希腹水肿瘤(EAT)模型Balb/c小鼠中评价装载双药物和装载单药物的纳米颗粒的体内抗癌效果和系统毒性。通过狭窄的尾部静脉很难精确给药粘稠的装在药物的纳米颗粒悬浮液，因此，使用腹膜内途径给药，并使纳米颗粒通过肠系膜血管和门静脉进入体循环。用不同的药物制剂(分别装载的和结合装载的)处理小鼠，每两周给药一次或者每周给药一次，持续21天，与盐水参照相比，纳米颗粒治疗对肿瘤生长显示出显著作用。
单独使用NuBCP-9肽和装载NuBCP-9的PLA72K-PEG-PPG-PEG12.5k纳米颗粒进行上述研究，每两周腹膜内注射20毫克/千克，结果显示肿瘤体积退化90％。与此相比，NuBCP-9-紫杉醇(PTX)结合显示更好的效果，并且在整个治疗期间完全抑制肿瘤生长并没有明显的肿瘤复发。在三个组(装载双药物、单独装载紫杉醇、单独装载NuBCP-9肽的纳米颗粒)中还观察到，每两周腹膜内给药比每周给药具有更好的效力(图20A、20B、和20C)。重要的是，在任何紫杉醇(PTX)/NuBCP-9纳米颗粒(单/双)治疗的小鼠中都没有观察到重量减轻或者其他明显的毒性作用。
患有欧利希肿瘤的小鼠每周两次腹膜内治疗进行三周。与用空白纳米颗粒治疗的小鼠相比，用10毫克/千克紫杉醇(PTX)/纳米颗粒治疗的小鼠的肿瘤出现部分退化(图22)。而且重要地的是，用10毫克/千克紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒治疗的小鼠出现完全的和延长的肿瘤退化(图22)。使用Kaplan-Meier制图确定存活率，结果进一步说明用紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒治疗的小鼠比用空白纳米颗粒、紫杉醇(PTX)/纳米颗粒或者NuBCP-9/纳米颗粒治疗的小鼠活的更长(图23)。由于具有更高的抗癌作用和更低的药物毒性，装载双药物的系统在治疗癌症方面更有前景。药物结合的原则是以较低的药物剂量实现有效的抗癌作用，并获得最大的治疗作用同时减少副作用。
F.组织学和免疫组织化学分析:
为了进一步调查共-纳米颗粒的抗癌活性，在治疗后(21天)杀死患有肿瘤的Balb/C小鼠，解刨肿瘤并用H&E和TUNEL染色进行病理学分析。图21显示了PBS治疗组、NuBCP-纳米颗粒治疗组、紫杉醇(PTX)-纳米颗粒治疗组和共-纳米颗粒治疗组的数据。
对于H&E染色，正常的肿瘤细胞具有球形或者纺锤型的大核以及染色质。而坏死细胞不具有清晰的细胞形态，并且所述染色质变黑变小，或者缺少细胞外表面。如图7所示，在PBS治疗组可以观察到具有正常形状和更多染色质的肿瘤细胞，这说明肿瘤生长依然旺盛。然而，在单独装载紫杉醇(PTX)或者NuBCP-9的纳米颗粒治疗组中可以观察到广泛的组织坏死。然而，与NuBCP-9-纳米颗粒和紫杉醇(PTX)-纳米颗粒治疗组相比，共-纳米颗粒治疗组不显示正常的肌肉组织，这说明肿瘤完全退化，这些结果显示在共-纳米颗粒治疗组中有最多的肿瘤细胞坏死。
TUNEL试验可以检测肿瘤细胞核中的DNA片段。在PBS治疗的肿瘤组织中可以检测到小凋亡。而在NuBCP-9-纳米颗粒、紫杉醇(PTX)-纳米颗粒和共纳米颗粒治疗组中，可以观察到明显的细胞凋亡面积。与信号药物-装载的纳米颗粒相比，共-纳米颗粒治疗显著的增加了细胞凋亡水平，这与H&E分析结果一致。
III.讨论
紫杉醇是用于治疗乳腺癌和各种实体肿瘤的主要化疗剂。紫杉醇临床应用的主要限制是长时间治疗后的神经毒性和细胞耐受性。NuBCP-9肽是一种新型的次生试剂，具有BCL-2介导的细胞凋亡的双重作用Cancer Cell 2008；14:285-298。实施例8说明当通过纳米颗粒传递时，紫杉醇和NuBCP-9对两种不同乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231的生长具有深远的协同抑制作用。当两种试剂结合使用时，NuBCP-9和紫杉醇(PTX)的IC50显著降低。这些结果说明通过将两种药物联合使用可以显著的减少紫杉醇(PTX)的副作用同时维持或增强临床效果。
为了定性装载双药物的PLA-PEG-PPG纳米颗粒，确定不同分子量的PLA72KDa/12KDa与PEG-PPG-PEG12.5K/6K纳米颗粒对紫杉醇、NuBCP-9、和紫杉醇(PTX)-NuBCP-9的装载程度，并调查其体外释放性质。表7下显示了不同的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒对NuBCP-9和紫杉醇(PTX)的平均装载程度。如表7所示，无论装载什么药物，高分子量的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的装载程度往往高于其相应的低分子量聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒。而且，在装载双药物(PLA12K-PEG-PPG-PEG-PTX-PEP和PLA72K-PEG-PPG-PTX-PEP)的纳米颗粒中每个药物分子的装载程度要低于装载单药物的纳米颗粒(PLA10KPEG-PPG-PEG-PTX/PLA10KPEG-PPG-PEG-PEP和PLA72K-PEG-PPG-PTX/PLA72K-PEG-PPG-PEP)的装载程度。因此，装载程度的差异可以归于其不同强度的静电引力和有效装载之间的疏水性力。
在装载双药物过程中，可以通过后装载NuBCP-9肽来实现更高的紫杉醇(PTX)装载程度，这会使NuBCP-9从纳米颗粒中轻微释放。基于类似的溶解理论，由于紫杉醇(PTX)的疏水性能够比肽捕获更多的PLA疏水核，并且紫杉醇(PTX)还会产生一些空间位阻，导致与装载单药物相比装载程度下降。另一方面，装载双药物的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的整体装载程度大于装载但药物的纳米颗粒。这大概是由于装载紫杉醇(PTX)后聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的孔没有完全被装满的缘故。另外，即使所有孔都被装满或者与紫杉醇(PTX)嵌段，肽还可以通过肽的疏水性部分和颗粒表面之间的疏水性相互作用吸附在装载紫杉醇(PTX)的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的外表面上。静电引力还有一种貌似合理的解释。NuBCP-9的等电点大约是7.2，这说明在装载过程中所述肽在水中带有正电荷。即使紫杉醇(PTX)先装载，由于装载紫杉醇(PTX)的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)(-3.21±1.5mV)带负电，所述肽可以通过静电引力吸附在聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)颗粒表面并且防止所述肽扩散到孔中。
图3显示了pH值为7.4时高和低分子量的PLA-PEG-PPG-PEGS纳米颗粒中紫杉醇(PTX)和NuBCP-9肽的释放曲线。肽和紫杉醇(PTX)(单或者二重的)可以慢慢从高分子量聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒中释放60天，而由于药物沉淀或者共聚物较快的降解作用，低分子量聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)颗粒不能显示所述稳定性。
据报道，协同效果可以是每个药物单独的抗癌机制的结合产生的。如上所述，NuBCP-9结合BCL-2级联，从而将蛋白质从预凋亡状态转化为抗凋亡状态，而紫杉醇(PTX)可以抑制微观蛋白破裂，从而阻断微管网络正常的动态结构变换，而这一结构变换是有丝分裂和细胞增殖所必须的，并因此造成细胞凋亡。据报道：紫杉醇(PTX)直接结合BCL-2并在功能上模拟Nur77的活性。据报道，多种药物具有相同的细胞途径，可以起到协同作用实现更好的治疗效果和更高的靶向选择性。
用NuBCP-9和紫杉醇(PTX)纳米颗粒混合物治疗的MCF-7细胞与紫杉醇(PTX)起到相似的作用，但是当两种治疗剂在同一媒介物中共同传递时，可以实现最好的协同效果(图18G和18H，右栏)。根据体外研究，当使用其他药物比例时，不能有效的显示协同效果，并且两种药物平衡的剂量共同产生最好的肿瘤效果。
据显示，在MCF-7细胞和MDA-MB 231三重阴性细胞中，紫杉醇(PTX)-NuBCP-9纳米颗粒的IC50显著降低，与正常紫杉醇相比差40和4倍(表8)。因此，共同治疗能够强化紫杉醇的细胞毒性，并且提供更广泛的临床应用潜力。
为了研究可能的机理，体外实验说明两种药物在相同的媒介物中的共同传递可以产生协同效果。与只装载单一药物相比，结合装载NuBCP-9-紫杉醇(PTX)的纳米颗粒显著降低了凋亡BCL-2和微管蛋白的表达。这些生物化学数据提供了上述两种试剂对细胞凋亡和细胞周期终止协同作用的基础。
为了进一步探索可能的细胞凋亡途径，进一步分析一些关键凋亡-相关蛋白质，包括半胱天冬酶-3和PARP的表达。在这些研究中，与装载单药物治疗组相比，装载双药物的纳米颗粒治疗组中半胱天冬酶-3的水平和PARP蛋白质的水平显著提高。裂解的PARP是内在凋亡作用必不可少的因素，并被认为是凋亡作用的标记物。
上述通过腹膜内给药NuBCP-9纳米颗粒治疗癌症的研究显示延长的肿瘤退化。体内，与用装载单药物纳米颗粒/盐水治疗的小鼠相比，注射装载双药物纳米颗粒的小鼠的肿瘤体积几乎消失，而盐水治疗的小鼠体内肿瘤体积无变化(图20A-C)。这些结果说明装载双药物的纳米颗粒显示更显著的抗癌活性。进一步的，可以推断双/单药物装载的纳米颗粒能够以持续和控制的方式将药物有效的传递入肿瘤细胞中，长达60天。更重要的是，给药单/双药物纳米颗粒具有很好的耐受性，没有任何证据证明会引起体重降低或者明显的毒性。这些结果支持减少剂量的可能性，并且通过双装载的纳米制剂可以加速肿瘤组织减少。
IV.结论
总之，已经研发出用于共同传递NuBCP-9(抗癌肽)和PTX的聚乳酸(PLA)与PEG-PPG-PEG的四嵌合共聚物。高分子量聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)有效的结构稳定性、有效的传递能力、很好的生物相容性和合适的粒径分布说明其在传递抗癌药方面有巨大的应用潜力，可以通过腹膜内注射治疗癌症。共-纳米颗粒在抑制MCF-7和三重阴性MDA-MB231乳腺癌细胞生长方面具有协同效应。共-纳米颗粒显示出高肿瘤累积、优秀的抗癌效率和更低的体内毒性。这里的研究表明共传递系统提供了有前途的平台，使用联合治疗剂治疗乳腺癌或者其他可能的癌症种类。
实施例9：紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒对紫杉醇(PTX)和Nab-紫杉醇有耐受性的MCF-7细胞有活性。
紫杉醇(“PTX”)是一种在治疗乳腺癌及其他固体肿瘤时广泛使用的微管药物紫杉醇(PTX)还在白蛋白-结合纳米颗粒制剂(Nab-紫杉醇；Abraxane)中被给药。然而，紫杉醇(PTX)的效力被药物射流泵上调节的耐受性机制所限制，例如P-糖蛋白(P-gp)、和所述抗凋亡BCL-2蛋白质。这里所描述的可生物降解的四嵌段聚合纳米颗粒可用于细胞内传递紫杉醇(PTX)(紫杉醇(PTX)/纳米颗粒)并且在抑制紫杉醇(PTX)流出方面非常有效。具体地说，紫杉醇(PTX)/纳米颗粒具有抗P-gp-表达乳腺癌细胞活性，所述乳腺癌细胞对紫杉醇(PTX)和Nab-紫杉醇有耐受性。这些纳米颗粒已经被用于系统性传递NuBCP-9肽(NuBCP-9/纳米颗粒)，其将抗凋亡BCL-2蛋白质从细胞保护体转变为细胞致死体。用包含紫杉醇(PTX)和NuBCP-9的纳米颗粒(紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒)进行的乳腺癌细胞的治疗实现了显著的体外抗乳腺癌细胞协同作用，有证据显示紫杉醇(PTX)的IC50下降40倍，并且具有增强的凋亡反应。在小鼠同基因欧利希乳腺癌模型中用紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒进行治疗比用紫杉醇(PTX)/纳米颗粒和/或NuBCP-9/纳米颗粒所得结果明显更为有效(参见实施例8)。这些结果说明紫杉醇(PTX)/纳米颗粒在Nab-紫杉醇耐受性组中是有活性的，并且当与NuBCP-9在紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒中共同传递时，紫杉醇(PTX)的活性被协同增加。这些发现还支持了一个概念，即该平台可以广泛的用于增强其他细胞毒素(p-gp底物和/或被BCL-2过表达抑制的细胞毒素)的活性。
紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒可协同诱导细胞凋亡，这一发现引发一种可能性，即这些纳米颗粒可以有效用于对紫杉醇有耐受性的细胞。因此，将MCF-7细胞与增加浓度的紫杉醇(PTX)相接触，产生对紫杉醇(PTX)由抵抗力的MCF-7细胞(表9)。值得注意的是，MCF-7/紫杉醇(PTX)-R细胞对Nab-紫杉醇也具有耐受性，但是对紫杉醇(PTX)/纳米颗粒不具有耐受性(表9)。为了定义MCF-7/紫杉醇(PTX)-R细胞对紫杉醇(PTX)/纳米颗粒敏感性的理论基础，分析野生型和紫杉醇(PTX)-耐受性MCF-7细胞的P-gp表达，并发现，根据上述报道(Brown T,et al.(1991)J.Clin.Oncol.9(7):1261-1267；Wiernik PH,et al.(1987)Cancer Res 47(9):2486-2493；Wiernik PH,et al.(1987).J.Clin.Oncol.5(8):1232-1239),耐受性与P-gp的上调节有关(图27A)。与P-gp过表达一致，与野生型MCF-7细胞相比，MCF-7/紫杉醇(PTX)-R细胞中细胞内FITC-紫杉醇(PTX)显著下降(图27B)。而且，令人惊奇的是，用FITC-紫杉醇(PTX)/纳米颗粒治疗MCF-7/紫杉醇(PTX)-R细胞的结果与细胞内FITC-紫杉醇(PTX)的保持力有关(图27B)，支持了一种概念，即聚合纳米颗粒抑制紫杉醇(PTX)流出。用紫杉醇(PTX)/纳米颗粒而不是紫杉醇(PTX)或者Nab-紫杉醇治疗MCF-7/紫杉醇(PTX)-R细胞的治疗结果还与诱导的凋亡有关，这可以通过(i)Annexin V/PI染色(图27C)、(ii)FLOW定量分析(图27D)和(iii)半胱天冬酶-3和PARP裂解(图27E)证实。在MCF-7/紫杉醇(PTX)-R细胞中可以观察到P-gp和BCL-2被上调节，说明为了增强紫杉醇活性可能需要靶向紫杉醇(PTX)耐受性的潜在机理。因此，用紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒处理MCF-7/紫杉醇(PTX)-R细胞，发现IC50为10.3nM，这比使用紫杉醇(PTX)/纳米颗粒所得到的IC50低5倍(表9)。另外，用紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒治疗MCF-7/紫杉醇(PTX)-R细胞的结果与P-gp和BCL-2水平的显著抑制作用有关(图27F)。
这些发现为一种模型提供了支持，在此模型中，紫杉醇(PTX)-NuBCP-9/纳米颗粒通过嵌合Pgp1和靶向BCL-2有效的抵抗紫杉醇耐受性，增加紫杉醇(PTX)的细胞内水平。
表列
表1提供了用于制备聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)共聚物的PEG-PPG-PEG嵌段共聚物的细节
Sl.No. Mol.wt. 化学名称 组成
1 1100 PEG-PPG-PEG 1100 PEG 10％wt.
2 4400 PEG-PPG-PEG 4400 PEG 30％wt.
3 8400 PEG-PPG-PEG 8400 PEG 80％wt.
表2显示了PLA-PEG-PPG-PEG纳米颗粒的特点
表3显示了使用不同分子量的PEG-PPG-PEG聚合物合成聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒的装载效力.
表4提供了未修饰的抗癌肽药物在PLA-PEG-PPG-PEG纳米颗粒中的装载百分比
样品 总肽(μg) 包覆的肽(μg) 装载％
2242.49 998.27 44.52
PEG-PPG-PEG 1100 2242.49 1125.34 50.18
PEG-PPG-PEG 4400 2242.49 1457.99 65.02
PEG-PPG-PEG 8400 2242.49 1459.77 65.10
表5提供了修饰的抗癌肽药物在PLA-PEG-PPG-PEG纳米颗粒中的装载百分比
样品 总肽(μg) 包裹的肽(μg) ％装载
2112.23 1434.23 67.90
PEG-PPG-PEG 1100 2112.23 1498.76 70.96
PEG-PPG-PEG 4400 2112.23 1545.14 73.15
PEG-PPG-PEG 8400 2112.23 1578.23 74.72
表6提供了装载与聚精氨酸蛋白质转导结构域相连的MUC1细胞质结构域肽的聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒进行的增殖研究数据(*代表1毫克/孔的浓度)
表7提供了单或双装载PLA72K-PEG-PPG-PEG12.5K纳米颗粒的尺寸，ζ电势、％EEod
表8显示了与图18A-F有关的数据：这些结果说明将紫杉醇(PTX)与L-NuBCP-9在纳米颗粒中联合基本上减少了紫杉醇(PTX)的有效剂量38倍(从38nM到1nM)。NuBCP-9剂量从3600nM减少到12nM(大约降低300倍)。
表9显示了MCF-7和MCF-7/PTX-R细胞系中PTX、nab-紫杉醇、PTX/纳米颗粒和PTX-NuBCP-9/纳米颗粒的IC50值

Claims (44)

1.一种组合物，包括
a)聚合纳米颗粒，包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物；
b)一个或者一个以上化疗剂或者抗癌症靶向试剂；和
c)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)或者一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包括一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID No：1)。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包括一种肽，所述肽包括MUC1(SEQID No：2)。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，PLA的分子量在大约2,000和大约80,000道尔顿之间。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物由PEG-PPG-PEG三嵌段共聚物和PLA化学共轭组成，并且其中，所述PEG-PPG-PEG三嵌段共聚物可以具有不同的分子量。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述聚合纳米颗粒装载：
a)化疗剂或者靶向抗癌症试剂；和
b)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)或者一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述聚合纳米颗粒装载：
a)化疗剂或者靶向抗癌症试剂；和
b)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)。
8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述聚合纳米颗粒装载：
a)化疗剂或者靶向抗癌症试剂；和
b)一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
9.根据权利要求6所述的组合物，其中所述化疗剂是紫杉醇。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述聚合纳米颗粒装载有紫杉醇和一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)，装载比例大约为9:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:9。
11.根据权利要求6所述的组合物，其中所述化疗剂是吉西他滨。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述聚合纳米颗粒装载有吉西他滨和一种肽，所述肽包括NuBCP-11(SEQ ID NO:1)，装载比例大约为11:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:11。
13.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述化疗剂或者靶向抗癌症剂选自由阿霉素、道诺红菌素、地西他滨、依立替康、SN-38、阿糖胞苷、多昔紫彬、雷公藤内酯、格尔德霉素、17-AAG、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、卡铂、泰索帝(taxotere)、氨甲蝶呤，和硼替佐米所组成的组中。
14.一种药物组合物，包括
a)聚合纳米颗粒，包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物；
b)一个或者一个以上治疗剂；和
所述药物组合物用于治疗选自由癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病、新陈代谢功能紊乱、发育异常、心血管疾病、肝病、肠病、传染性疾病、内分泌病和神经系统紊乱所组成的组中的疾病。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述药物组合物包括一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID No：14)。
16.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述药物组合物包括一种肽，所述肽包括MUC1(SEQ ID No：2)。
17.根据权利要求1到16中任意一项所述的组合物，其中，所述聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成。
18.根据权利要求1-17中任意一项所述的组合物，其中，所述聚合纳米颗粒进一步包括附着在所述聚合纳米颗粒外部的靶向部分，并且其中，所述靶向部分是一种抗体、肽或者适体。
19.一种聚合纳米颗粒，所述聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成，其中，所述聚合纳米颗粒装载有紫杉醇和一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)。
20.一种聚合纳米颗粒，所述聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成，其中，所述聚合纳米颗粒装载有紫杉醇和一种肽，所述肽包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
21.一种治疗需要的患者所患癌症的方法，该方法包括对所述患者给药治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括
a)聚合纳米颗粒，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物；
b)化疗剂和/或抗癌症靶向试剂；和
c)一种肽，包括NuBCP-9(SEQ ID NO:1)或者一种肽，包括MUC1(SEQ ID NO:2)。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述药物组合物包括一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID No：1)。
23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述药物组合物包括一种肽，所述肽包括MUC1(SEQ ID No：2)。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述化疗剂是紫杉醇。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述聚合纳米颗粒装载有紫杉醇和一种肽，所述肽包括NuBCP-24(SEQ ID NO:1)，装载比例大约为24:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:24。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述化疗剂是吉西他滨。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述聚合纳米颗粒装载有吉西他滨和一种肽，所述肽包括NuBCP-26(SEQ ID NO:1)，装载比例大约为26:1，8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8或者1:26。
28.根据权利要求21所述的方法，其中，所述化疗剂或者靶向抗癌症剂选自由阿霉素、道诺红菌素、地西他滨、依立替康、SN-38、阿糖胞苷、多昔紫彬、雷公藤内酯、格尔德霉素、17-AAG、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、卡铂、泰索帝(taxotere)、氨甲蝶呤，和硼替佐米所组成的组中。
29.根据权利要求21所述的方法，其中，所述癌症是乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、转移性的结肠癌、胰腺癌或者血液恶性肿瘤。
30.根据权利要求21所述的方法，其中，所述患者对紫杉醇或者Nab-紫杉醇治疗具有耐受性。
31.根据权利要求21所述的方法，其中，所述患者用紫杉醇或者Nab-紫杉醇难以治疗。
32.根据权利要求21所述的方法，其中，所述患者用紫杉醇或者Nab-紫杉醇治疗后复发。
33.用于抑制细胞中紫杉醇消逝的方法，包括将该细胞与有效量的聚合纳米颗粒相接触，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述聚合纳米颗粒装着紫杉醇。
35.用于阻断细胞中P-糖蛋白表达的方法，包括将该细胞与有效量的聚合纳米颗粒相接触，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物。
36.用于阻断细胞中反向P-糖蛋白调节的耐药性的方法，包括将该细胞与有效量的聚合纳米颗粒相接触，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四逆转的共聚物。
37.根据权利要求21-36中任意一项所述的方法，其中，所述聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成。
38.用于产生对第一化疗剂具有耐受性的癌细胞的方法，所述方法包括将所述癌细胞与聚合纳米颗粒相接触，所述聚合纳米颗粒包括聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物，其中所述聚合纳米颗粒装载有第二化疗剂，并且其中，所述癌细胞对第一化疗剂的耐受性是由于P-糖蛋白上调造成的。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述聚合纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成。
40.根据权利要求38所述的方法，其中，癌细胞是乳腺癌细胞。
41.根据权利要求38所述的方法，其中第一化疗剂是紫杉醇。
42.根据权利要求38所述的方法，其中第二化疗剂是紫杉醇。
43.根据权利要求38所述的方法，其中，所述聚合纳米颗粒装着一种肽，所述肽包括NuBCP-9(SEQ ID No：1)。
44.根据权利要求38所述的方法，其中，所述聚合纳米颗粒装着一种肽，所述肽包括MUC1(SEQ ID No：2)。
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