JP2021088603A - ポリマーナノ粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年11月3日に出願された米国仮出願番号第62/250,137
号、および2016年7月5日に出願された米国仮出願番号第62/358,373号に
基づく優先権を主張しており、これら仮出願の内容は、それら全体が本明細書中に参考と
して援用される。
発明の分野
本発明は、ナノテクノロジーの分野、特に治療剤を送達するための生分解性ポリマーナ
ノ粒子の使用に関する。
癌は最も壊滅的な疾患の1つであり、それは様々な遺伝子変化および細胞異常を伴う。
この複雑性および不均質性は、癌細胞の侵襲的な成長を促進して、患者の顕著な罹患率お
よび死亡率をもたらす(Das,M.ら、(2009)Ligand−based ta
rgeted therapy for cancer tissue.Expert
Opin.Drug Deliv.6,285−304;Mohanty,C.ら、(2
011)Receptor mediated tumor targeting:an
emerging approach for cancer therapy.Cu
rr.Drug Deliv.8,45−58)。乳癌は、最も多く診断される癌の1つ
であり、女性の第2位の死亡原因である。パクリタキセル(「PTX」)は、乳癌および
他の固形腫瘍の処置において広く使用される化学療法薬である(Holmes F.ら、
Phase II trial of taxol,an active drug i
n the treatment of metastatic breast can
cer.J.Natl.Cancer Inst.1991,83(24):1797−
1805;Brown T.ら、A phase I trial of taxol
given by a 6−hour intravenous infusion.J
.Clin.Oncol.1991,9(7):1261−1267;McGuire
W.ら、Taxol:a unique antineoplastic agent
with significant activity in advanced ov
arian epithelial neoplasms.Ann.Intern.Me
d.1989,111(4):273−279)。それは、集合チューブリンに結合する
と微小管の分解を阻害し、微小管を重合状態に固定して(Jordan M.,Kama
th K.:How do microtubule−targeted drugs
work? An overview.Curr.Cancer Drug Targe
ts 2007,7(8):730−742)、細胞周期の停止をもたらす(Fuchs
D.,Johnson R.:Cytologic evidence that t
axol,an antineoplastic agent from Taxus
brevifolia,acts as a mitotic spindle poi
son.Cancer Treat..Rep.1978,62(8):1219−12
22;Schiff P.,Horwitz SB:Taxol stabilizes
microtubules in mouse fibroblast cells.
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1980,77(3):1561−1
565;Schiff P.,Horwitz S.:Taxol assembles
tubulin in the absence of exogenous gua
nosine 5’−triphosphate or microtubule−as
sociated proteins.Biochemistry 1981,20(1
1):3247−3252;Schiff P.ら、Promotion of mic
rotubule assembly in vitro by taxol.Natu
re 1979,277(5698):665−667)。パクリタキセルはまた、抗ア
ポトーシスタンパク質BCL−2を阻害し、癌細胞のアポトーシスを誘導する(Hald
ar S.ら、Inactivation of BCL−2 by phosphor
ylation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995,92(1
0):4507−4511)。パクリタキセルは非常に有効な抗腫瘍剤であるが、その高
用量および反復処置は高い細胞毒性および薬剤耐性をもたらし得、患者における長期使用
を制限する(Brown T.ら、J.Clin.Oncol.1991,9(7):1
261−1267;Wiernik P.ら、Phase I clinical an
d pharmacokinetic study of taxol.Cancer
Res 1987,47(9):2486−2493;Wiernik P.ら、Pha
se I trial of taxol given as a 24−hour i
nfusion every 21 days:responses observed
in metastatic melanoma.J.Clin.Oncol.198
7,5(8):1232−1239)。
顕著な過敏性反応に関連していた)で、乳癌処置のために開発された。nab−パクリタ
キセル(アブラキサン)は、PTXが無溶媒アルブミンNPに封入された第2世代製剤で
ある(Yardley DAら、(2013)Randomized phase II
,double−blind,placebo−controlled study o
f exemestane with or without entinostat
in postmenopausal women with locally rec
urrent or metastatic estrogen receptor−p
ositive breast cancer progressing on tre
atment with a nonsteroidal aromatase inh
ibitor.J.Clin Oncol 31(17):2128−2135)。na
b−パクリタキセルは、過敏性反応を部分的に回避することによって、PTXよりも高用
量で送達され得る(Ibrahim NKら、(2005)Multicenter p
hase II trial of ABI−007,an albumin−boun
d paclitaxel,in women with metastatic br
east cancer.J.Clin.Oncol 23(25):6019−602
6;Yardley DAら、(2013),J.Clin.Oncol 31(17)
:2128−2135)。加えて、nab−パクリタキセルは、乳癌を有する患者の処置
においてPTXよりも有効であることが見出された(Gradishar WJら、(2
005)Phase III trial of nanoparticle albu
min−bound paclitaxel compared with polye
thylated castor oil−based paclitaxel in
women with breast cancer.J.Clin.Oncol 23
(31):7794−7803;Blum JLら、(2007)Phase II s
tudy of weekly albumin−bound paclitaxel
for patients with metastatic breast canc
er heavily pretreated with taxanes.Clin
Breast Cancer 7(11):850−856;30;Gradishar
WJら、(2012)Phase II trial of nab−paclita
xel compared with docetaxel as first−lin
e chemotherapy in patients with metastat
ic breast cancer:final analysis of overa
ll survival.Clin Breast Cancer 12(5):313
−321)。したがって、乳癌ならびにNSCLCおよび膵臓癌の処置に関するnab−
パクリタキセルの承認は、NP製剤でPTXを送達することの有効性によって裏付けられ
た。しかしながら、局所再発性または転移性乳癌の第1選択処置としてのPTXおよびn
ab−パクリタキセルの無増悪生存は、それぞれ11カ月間および9.3カ月間であり(
Rugo HSら、(2015)Randomized Phase III Tria
l of Paclitaxel Once Per Week Compared W
ith Nanoparticle Albumin−Bound Nab−Pacli
taxel Once Per Week or Ixabepilone With
Bevacizumab As First−Line Chemotherapy f
or Locally Recurrent or Metastatic Breas
t Cancer:CALGB 40502/NCCTG N063H(Allianc
e).J.Clin Oncol.33(21):2361−2369)、耐性の発現を
回避するより有効な治療の必要性を強調している。
MDR)表現型を誘導する(Barbuti AM&Chen ZS(2015)Pac
litaxel Through the Ages of Anticancer T
herapy:Exploring Its Role in Chemoresist
ance and Radiation Therapy.Cancers(Basel
)7(4):2360−2371;Zhao Y,Mu X,&Du G(2015)M
icrotubule−stabilizing agents:New drug d
iscovery and cancer therapy.Pharmacol Th
er.)。ABCトランスポーターのサブクラスの中でも、Pgp1(ABCB1、MD
R1)の過剰発現は、PTX耐性の主要機構に相当する(Barbuti AM&Che
n ZS(2015)Cancers(Basel)7(4):2360−2371;Z
hao Y,Mu X,&Du G(2015)Pharmacol Ther.)。し
かしながら、長年の研究にもかかわらず、許容され得ない毒性を伴わずにPTXの有効性
を増加させるP−gp阻害剤の開発における進歩は限定的であった(Gottesman
MM,Fojo T,&Bates SE(2002)Multidrug resi
stance in cancer:role of ATP−dependent t
ransporters.Nat Rev Cancer 2(1):48−58)。
れている。パクリタキセルと、シスプラチン、5−フルオロウラシル(5−FU)または
ゲムシタビンのような1つまたはそれを超える薬剤とを組み合わせることによって、高用
量に関連する化学療法耐性および副作用は、異なる生物学的シグナル伝達経路を相乗的に
相殺して、各化合物の低投与量を可能にすることによって克服され得る。異なる分子標的
を有する複数の薬物の適用は、癌細胞突然変異の克服に必要な遺伝的バリアを作り、それ
により、癌の適合プロセスを遅延させ得る。同じ細胞経路をターゲティングする複数の薬
物は、より高い治療有効性およびより高い標的選択性のために相乗的に機能し得ることも
実証されている(Lehar J.ら、Synergistic drug combi
nations tend to improve therapeutically
relevant selectivity.Nat.Biotechnol.27(7
),659−666(2009))。ナノテクノロジーは、スマート薬物送達系を提供す
ることによって、癌治療における大幅な進歩をもたらし得る。
内分布のために、従来の併用療法は、癌について成功が証明されていない。Wangらは
、ステアレートをグラフトしたキトサンオリゴ糖(CSO−SA)のミセルを使用して、
パクリタキセル(PTX)およびドキソルビシンの同時投与を示した(Zhao,M.ら
、Coadministration of glycolipid−like mic
elles loading cytotoxic drug with differ
ent action site for efficient cancer che
motherapy.Nanotechnology 2009,20,055102)
。別の研究では、ビンクリスチン(VCR)およびベラパミル(VRP)の同時送達のた
めに、ポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド酸)(PLGA)のナノ粒子が用いられ
た(Song,X.ら、PLGA nanoparticles simultaneo
usly loaded with vincristine sulfate and
verapamil hydrochloride:Systematic stud
y of particle size and drug entrapment e
fficiency.Int.J.Pharm.2008,35,320−329)。ケ
ルセチンおよびVCRのためのリポソーム送達製剤も開発された(Wong,M.−Y.
;Chiu,G.N.C.Simultaneous liposomal deliv
ery of quercetin and vincristine for enh
anced estrogen−receptor−negative breast
cancer treatment.Anti−Cancer Drugs 2010,
21,401−410)。しかしながら、化学療法薬の組み合わせにより、これらの製剤
は依然として高い毒性を示した。
研究で採用されている。Kwonらは、ポリ(エチレングリコール)−ブロック−ポリ(
D,L−乳酸)(PEG−b−PLA)ミセルが、PTX/17−アリルアミノ−17−
デメトキシゲルダナマイシン(17−AAG)の組み合わせを含む複数の薬物を送達し得
ることを報告した(Kwon,G.S.ら、Multi−drug loaded po
lymeric micelles for simultaneous delive
ry of poorly soluble anticancer drugs.J.
Controlled Release 2009,140,294−300)。BCL
−2標的siRNAと共にカチオン性コアシェルナノ粒子を使用したPTXが、乳癌処置
について報告されている。Sugaharaらは、iRGD(腫瘍透過性ペプチド)と異
なる種類の抗癌薬との同時投与が、腫瘍成長および腫瘍蓄積の阻害において有効であるこ
とを示した(Sugahara KNら、Co−administration of
a Tumor−Penetrating Peptide Enhances the
Efficacy of Cancer Drugs.Science.2010;3
28:1031−1035)。このような組み合わせでは、化学療法薬の有効細胞毒性用
量は劇的に減少し、同時に有害事象も減少するので、この戦略は、生体分子と共に単一化
学療法薬を使用する優れたアプローチである(Wang S.Z.ら、TRAIL an
d Doxorubicin Combination Induces Proapo
ptotic and Antiangiogenic Effects in Sof
t Tissue Sarcoma in vivo.Clin.Cancer Res
.2010;16:2591−2604;Hossain MAら、Aspirin e
nhances doxorubicin−induced apoptosis an
d reduces tumor growth in human hepatoce
llular carcinoma cells in vitro and in v
ivo.Int.J.Oncol.2012;40:1636−1642;Jin C.
ら、Combination chemotherapy of doxorubici
n and paclitaxel for hepatocellular carc
inoma in vitro and in vivo.J.Cancer Res.
Clin.2010;136:267−274)。
有望な手段として登場した。癌治療における合成ペプチド薬は、従来のタンパク質と比較
して高い特異性、安定性および合成容易性を示す。しかしながら、標的部位へのこれらの
抗癌ペプチドの送達は、酵素分解、免疫原性および血液中での短い寿命などの要因による
大きな問題を引き起こす。送達系が、血液循環中におけるその体積または活性の損失を最
小化して体内の障壁の透過によって所望の腫瘍組織に達し、腫瘍細胞を選択的に死滅させ
ることができる場合、抗癌薬の標的送達はより有効であろう。これは、薬物の細胞内濃度
を増加させ、それと同時に用量制限毒性を減少させることによって、患者の生存および生
活の質を改善するであろう。ペプチド薬の送達戦略の1つは、薬物を細胞質ゾルに直接送
達するために、ペプチドを細胞透過性ペプチド(CPP)にコンジュゲートすることを伴
う。しかしながら、CPPとのコンジュゲーションはペプチド薬の費用を増加させ、ペプ
チド薬の有効性および安定性を減少させ、いくつかの場合では毒性を増加させ得る。Nu
BCP−9およびBax−BH3のようないくつかのペプチド治療剤は、癌性細胞に対す
る選択的結合を示し、アポトーシスを開始させる。残念ながら、ペプチド治療剤の遊離薬
物製剤は、ペプチドの大量使用および頻繁な投与を必要とし、それにより、治療の費用お
よび不便さを増加させる。
治療用ペプチドなどの治療剤を単独で、または化学療法剤などの他の治療剤と組み合わ
せて癌性細胞に有効に送達し得る送達系に対する緊急の必要性が存在する。さらに、伝統
的な化学療法薬、例えばパクリタキセルまたはnab−パクリタキセルに対して耐性の癌
を処置することができる送達系に対する必要性が存在する。
一態様では、
a)ポリ(乳酸)−ポリ(エチレングリコール)−ポリ(プロピレングリコール)−ポリ
(エチレングリコール)(PLA−PEG−PPG−PEG)テトラブロックコポリマー
を含むポリマーナノ粒子;
b)1つまたはそれを超える化学療法剤または抗癌標的薬剤;および
c)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含む
ペプチド
を含む組成物が本明細書で提供される。
含む。
。
ンである。
は、PEG−PPG−PEGトリブロックコポリマーとPLAとの化学的コンジュゲーシ
ョンから形成され、PEG−PPG−PEGトリブロックコポリマーは、異なる分子量で
あり得る。
a)化学療法剤または標的抗癌剤;および
b)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含む
ペプチド
がロードされている。
a)化学療法剤または標的抗癌剤;および
b)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチド
がロードされている。
a)化学療法剤または標的抗癌剤;および
b)MUC1(配列番号2)を含むペプチド
がロードされている。
:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8または1:9の比で、パクリタキセルと
、NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドとがロードされている。
施形態では、前記ポリマーナノ粒子に、約9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4
:6、3:7、2:8または1:9の比で、ゲムシタビンと、NuBCP−9(配列番号
1)を含むペプチドとがロードされている。
ノルビシン、デシタビン、イリノテカン、SN−38、シタラビン、ドセタキセル、トリ
プトライド、ゲルダナマイシン、17−AAG、5−FU、オキサリプラチン、カルボプ
ラチン、タキソテール、メトトレキセートおよびボルテゾミブからなる群より選択される
。
肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経学的障害からなる群より選択される
疾患の処置に使用するための医薬組成物であって、
a)ポリ(乳酸)−ポリ(エチレングリコール)−ポリ(プロピレングリコール)−ポリ
(エチレングリコール)(PLA−PEG−PPG−PEG)テトラブロックコポリマー
を含むポリマーナノ粒子;
b)1つまたはそれを超える治療剤;および
c)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含む
ペプチド
を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
ドを含む。
含む。
リ(乳酸)−ポリ(エチレングリコール)−ポリ(プロピレングリコール)−ポリ(エチ
レングリコール)(PLA−PEG−PPG−PEG)テトラブロックコポリマーから本
質的になる。
ーナノ粒子の外側に結合したターゲティング部分をさらに含み、ターゲティング部分は、
抗体、ペプチドまたはアプタマーである。
になるポリマーナノ粒子であって、パクリタキセルと、NuBCP−9(配列番号1)を
含むペプチドとがロードされているポリマーナノ粒子が本明細書で提供される。
なるポリマーナノ粒子であって、パクリタキセルと、MUC1(配列番号2)を含むペプ
チドとがロードされているポリマーナノ粒子が本明細書で提供される。
、
a)PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子
;
b)化学療法剤および/または抗癌標的薬剤;ならびに
b)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含む
ペプチド
を含む治療有効量の医薬組成物を前記被験体に投与することを含む方法が本明細書で提供
される。
チドを含む。
を含む。
施形態では、前記ポリマーナノ粒子に、約9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4
:6、3:7、2:8または1:9の比で、パクリタキセルと、NuBCP−9(配列番
号1)を含むペプチドとがロードされている。
施形態では、前記ポリマーナノ粒子に、約9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4
:6、3:7、2:8または1:9の比で、ゲムシタビンと、NuBCP−9(配列番号
1)を含むペプチドとがロードされている。
ノルビシン、デシタビン、イリノテカン、SN−38、シタラビン、ドセタキセル、トリ
プトライド、ゲルダナマイシン、17−AAG、5−FU、オキサリプラチン、カルボプ
ラチン、タキソテール、メトトレキセートおよびボルテゾミブからなる群より選択される
。
臓癌または血液学的悪性腫瘍である。
て耐性である。
て不応性である。
に再発状態にある。
と、PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含む有効量のポリマー
ナノ粒子とを接触させることを含む、方法が本明細書に提供される。
前記細胞と、PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含む有効量の
ポリマーナノ粒子とを接触させることを含む、方法が本明細書に提供される。
って、前記細胞と、PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含む有
効量のポリマーナノ粒子とを接触させることを含む、方法が本明細書に提供される。
−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーから本質的になる。
あって、前記癌細胞と、PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含
むポリマーナノ粒子とを接触させることを含み、前記ポリマーナノ粒子に第2の化学療法
薬がロードされており、P−糖タンパク質のアップレギュレーションによって、前記第1
の化学療法薬に対する前記癌細胞の前記耐性を生じさせる、方法が本明細書に提供される
。
ブロックコポリマーから本質的になる。
ペプチドがロードされている。
チドがロードされている。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
a)ポリ(乳酸)−ポリ(エチレングリコール)−ポリ(プロピレングリコール)−ポ
リ(エチレングリコール)(PLA−PEG−PPG−PEG)テトラブロックコポリマ
ーを含むポリマーナノ粒子;
b)1つまたはそれを超える化学療法剤または抗癌標的薬剤;および
c)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含
むペプチド
を含む、組成物。
(項目2)
前記組成物がNuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドを含む、項目1に記載の組
成物。
(項目3)
前記組成物がMUC1(配列番号2)を含むペプチドを含む、項目1に記載の組成物。
(項目4)
前記PLAの分子量が約2,000〜約80,000ダルトンである、項目1に記載の
組成物。
(項目5)
前記PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーが、PEG−PPG−
PEGトリブロックコポリマーとPLAとの化学的コンジュゲーションから形成され、前
記PEG−PPG−PEGトリブロックコポリマーが異なる分子量であり得る、項目1に
記載の組成物。
(項目6)
前記ポリマーナノ粒子に、
a)化学療法剤または標的抗癌剤;および
b)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含む
ペプチド
がロードされている、項目1に記載の組成物。
(項目7)
前記ポリマーナノ粒子に、
a)化学療法剤または標的抗癌剤;および
b)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチド
がロードされている、項目6に記載の組成物。
(項目8)
前記ポリマーナノ粒子に、
a)化学療法剤または標的抗癌剤;および
b)MUC1(配列番号2)を含むペプチド
がロードされている、項目6に記載の組成物。
(項目9)
前記化学療法剤がパクリタキセルである、項目6に記載の組成物。
(項目10)
前記ポリマーナノ粒子に、約9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:
7、2:8または1:9の比で、パクリタキセルと、NuBCP−9(配列番号1)を含
むペプチドとがロードされている、項目9に記載の組成物。
(項目11)
前記化学療法剤がゲムシタビンである、項目6に記載の組成物。
(項目12)
前記ポリマーナノ粒子に、約9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:
7、2:8または1:9の比で、ゲムシタビンと、NuBCP−9(配列番号1)を含む
ペプチドとがロードされている、項目11に記載の組成物。
(項目13)
前記化学療法剤または標的抗癌剤が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、
イリノテカン、SN−38、シタラビン、ドセタキセル、トリプトライド、ゲルダナマイ
シン、17−AAG、5−FU、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メ
トトレキセートおよびボルテゾミブからなる群より選択される、項目6に記載の組成物。
(項目14)
癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心臓血管疾患、肝疾患、腸疾患
、感染性疾患、内分泌疾患および神経学的障害からなる群より選択される疾患の処置に使
用するための医薬組成物であって、
a)ポリ(乳酸)−ポリ(エチレングリコール)−ポリ(プロピレングリコール)−ポリ
(エチレングリコール)(PLA−PEG−PPG−PEG)テトラブロックコポリマー
を含むポリマーナノ粒子;
b)1つまたはそれを超える治療剤;および
c)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含む
ペプチド
を含む、医薬組成物。
(項目15)
前記組成物がNuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドを含む、項目14に記載の
医薬組成物。
(項目16)
前記組成物がMUC1(配列番号2)を含むペプチドを含む、項目14に記載の医薬組
成物。
(項目17)
前記ポリマーナノ粒子が、ポリ(乳酸)−ポリ(エチレングリコール)−ポリ(プロピ
レングリコール)−ポリ(エチレングリコール)(PLA−PEG−PPG−PEG)テ
トラブロックコポリマーから本質的になる、項目1〜16のいずれか一項に記載の組成物
。
(項目18)
前記ポリマーナノ粒子が、前記ポリマーナノ粒子の外側に結合したターゲティング部分
をさらに含み、前記ターゲティング部分が抗体、ペプチドまたはアプタマーである、項目
1〜17のいずれか一項に記載の組成物。
(項目19)
PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーから本質的になるポリマー
ナノ粒子であって、パクリタキセルと、NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドと
がロードされている、ポリマーナノ粒子。
(項目20)
PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーから本質的になるポリマー
ナノ粒子であって、パクリタキセルと、MUC1(配列番号2)を含むペプチドとがロー
ドされている、ポリマーナノ粒子。
(項目21)
癌の処置を必要とする被験体における癌を処置するための方法であって、
a)PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒
子;
b)化学療法剤および/または抗癌標的薬剤;ならびに
c)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含
むペプチド
を含む治療有効量の医薬組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
(項目22)
前記医薬組成物が、NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドを含む、項目21に
記載の方法。
(項目23)
前記医薬組成物が、MUC1(配列番号2)を含むペプチドを含む、項目21に記載の
方法。
(項目24)
前記化学療法剤がパクリタキセルである、項目21に記載の方法。
(項目25)
前記ポリマーナノ粒子に、約9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:
7、2:8または1:9の比で、パクリタキセルと、NuBCP−9(配列番号1)を含
むペプチドとがロードされている、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記化学療法剤がゲムシタビンである、項目21に記載の方法。
(項目27)
前記ポリマーナノ粒子に、約9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:
7、2:8または1:9の比で、ゲムシタビンと、NuBCP−9(配列番号1)を含む
ペプチドとがロードされている、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記化学療法剤または標的抗癌剤が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、
イリノテカン、SN−38、シタラビン、ドセタキセル、トリプトライド、ゲルダナマイ
シン、17−AAG、5−FU、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メ
トトレキセートおよびボルテゾミブからなる群より選択される、項目21に記載の方法。
(項目29)
前記癌が、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、転移性結腸癌、膵臓癌または血液学的悪性
腫瘍である、項目21に記載の方法。
(項目30)
前記被験体が、パクリタキセルまたはnab−パクリタキセルによる処置に対して耐性
である、項目21に記載の方法。
(項目31)
前記被験体が、パクリタキセルまたはnab−パクリタキセルによる処置に対して不応
性である、項目21に記載の方法。
(項目32)
前記被験体が、パクリタキセルまたはnab−パクリタキセルによる処置後に再発状態
にある、項目21に記載の方法。
(項目33)
細胞におけるパクリタキセル流出を阻害するため方法であって、前記細胞と、PLA−
PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含む有効量のポリマーナノ粒子とを
接触させることを含む、方法。
(項目34)
前記ポリマーナノ粒子にパクリタキセルがロードされている、項目33に記載の方法。
(項目35)
細胞におけるP−糖タンパク質発現を遮断するため方法であって、前記細胞と、PLA
−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含む有効量のポリマーナノ粒子と
を接触させることを含む、方法。
(項目36)
細胞におけるP−糖タンパク質媒介性薬剤耐性を打ち消すための方法であって、前記細
胞と、PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含む有効量のポリマ
ーナノ粒子とを接触させることを含む、方法。
(項目37)
前記ポリマーナノ粒子がPLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーから
本質的になる、項目21〜36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
第1の化学療法薬に対する耐性を有する癌細胞を生じさせるための方法であって、前記
癌細胞と、PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含むポリマーナ
ノ粒子とを接触させることを含み、前記ポリマーナノ粒子に第2の化学療法薬がロードさ
れており、P−糖タンパク質のアップレギュレーションによって、前記第1の化学療法薬
に対する前記癌細胞の前記耐性を生じさせる、方法。
(項目39)
前記ポリマーナノ粒子がPLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーか
ら本質的になる、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記癌細胞が乳癌細胞である、項目38に記載の方法。
(項目41)
前記第1の化学療法薬がパクリタキセルである、項目38に記載の方法。
(項目42)
前記第2の化学療法薬がパクリタキセルである、項目38に記載の方法。
(項目43)
前記ポリマーナノ粒子に、NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドがロードされ
ている、項目38に記載の方法。
(項目44)
前記ポリマーナノ粒子に、MUC1(配列番号2)を含むペプチドがロードされている
、項目38に記載の方法。
本発明は、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて図を参照する
ことによってより良く理解され得る。
NuBCP−9は、BCL−2BH3ドメインを露出させてBCL−xL生存機能を遮
断することによって、癌細胞のアポトーシスを選択的に誘導する非常に有望な抗癌ペプチ
ドである(Kolluri SKら、A short Nur77−derived p
eptide converts Bcl−2 from a protector t
o a killer.Cancer Cell 2008;14:285−98)。N
uBCP−9は、細胞内送達のためにD−Argオクタマーr8(膜破壊を伴うBCL−
2非依存性細胞死滅を誘導することによって、選択性を減少させると報告されている改変
)に連結された。新規ポリマーPLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子の腹腔内投与に
よるL−NuBCP−9ペプチドの持続送達は、エールリッヒ腫瘍の完全退縮の誘導にお
いて有効であった(例えば、図11および図12ならびに実施例7を参照のこと)。この
種類のナノ粒子を調製するための特徴およびプロセスは、国際公開第2013/1607
73号に開示されている(この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)
。
として生成され得る。ナノ粒子へのタンパク質ロードは、吸着プロセスまたは封入プロセ
スのいずれかによって行われ得る(Spadaら、2011;Protein deli
very of polymeric nanoparticles;World Ac
ademy of Science,Engineering and Technol
ogy:76)。受動的および能動的なターゲティング戦略の両方を使用することによっ
て、正常細胞における毒性を回避しながら、ナノ粒子は、癌細胞における薬物の細胞内濃
度を増強し得る。ナノ粒子が特定の受容体に結合して細胞に進入すると、それらは、通常
、受容体媒介性エンドサイトーシスを介してエンドソームで覆われ、それにより、主要な
薬剤耐性機構の1つであるP−糖タンパク質の認識を回避する(Choら、2008,T
herapeutic Nanoparticles for Drug Delive
ry in Cancer,Clin.Cancer Res.,2008,14:13
10−1316)。ナノ粒子は、オプソニン作用および食作用によって身体から除去され
る(Sosnikら、2008;Polymeric Nanocarriers:Ne
w Endeavors for the Optimization of the
Technological Aspects of Drugs;Recent Pa
tents on Biomedical Engineering,1:43−59)
。ナノ担体ベースの系は、細胞内透過性の改善、局所送達、早期分解からの薬物の保護、
薬物動態および薬物組織分布プロファイルの制御、より低い用量必要性および費用対効果
の利点を有する有効な薬物送達のために使用され得る(Farokhzad OCら、T
argeted nanoparticle−aptamer bioconjugat
es for cancer chemotherapy in vivo.Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 2006,103(16):6315−20;F
onseca Cら、Paclitaxel−loaded PLGA nanopar
ticles:preparation,physicochemical chara
cterization and in vitro anti−tumoral ac
tivity.J.Controlled Release 2002;83(2):2
73−86;Hoodら、Nanomedicine,2011,6(7):1257−
1272)。
、ポリマーナノ粒子は、細網内皮系(RES)による認識および取り込みを逃れることが
見出されているので、血液中で長時間循環し得る(Borchardら、1996,Ph
arm.Res.7:1055−1058)。ナノ粒子はまた、固形腫瘍の漏出性脈管構
造のような病的部位で浸出することができ、受動的なターゲティング機構を提供する。よ
り速い可溶化速度をもたらすより大きな表面積により、ナノサイズの構造は、通常、より
高い血漿濃度および曲線下面積(AUC)値を示す。小さい粒径は、宿主防御機構を逃れ
るのに役立ち、血液循環時間を増加させる。ナノ粒子のサイズは、薬物放出に影響する。
より大きな粒子は、系への薬物のより緩徐な拡散を有する。より小さい粒子は、より大き
い表面積を提供するが、速い薬物放出をもたらす。より小さい粒子は、ナノ粒子分散液の
保存および輸送の間に凝集する傾向がある。よって、ナノ粒子の小さいサイズと最大安定
性との折衷が望ましい。薬物送達系において使用されるナノ粒子のサイズは、その毛細血
管への急速な漏出を防ぐ程度には十分大きいが、肝臓および脾臓などの細網内皮系中に留
まっている固定マクロファージによる捕捉を逃れる程度には十分小さいものとするべきで
ある。
ける重要な要因である。ナノ粒子は、理想的には、マクロファージ捕捉を逃れるために親
水性表面を有するべきである。親水性ドメインおよび疎水性ドメインを有するブロックコ
ポリマーから形成されたナノ粒子は、これらの基準を満たす。制御されたポリマー分解も
また、疾患状態への薬剤送達のレベルの増加を可能にする。ポリマー分解はまた、粒径の
影響を受け得る。分解速度は、インビトロの粒径の増加と共に増加する(Biopoly
meric nanoparticles;Sundarら、2010,Science
and Technology of Advanced Materials;do
i:10.1088/1468−6996/11/1/014104)。
US FDAによって承認されており、ポリ(乳酸)−ポリ(エチレングリコール)PL
A−PEGベースの薬物送達系は、当技術分野で公知である。米国特許出願公開第200
6/0165987号には、ポリ(エステル)−ポリ(エチレン)マルチブロックコポリ
マーおよびナノ球体に強剛性を与える任意の成分を含み、医薬化合物を組み込む、ステル
ス性のポリマー生分解性ナノ球体が記載されている。米国特許出願公開第2008/00
81075号には、グラフト高分子および1つまたはそれを超えるブロックコポリマーか
ら自己組織化した、機能的内部コアおよび親水性外部シェルを有する新規の混合ミセル構
造が記載されている。米国特許出願公開第2010/0004398号には、相間領域を
有するシェル/コア立体配置のポリマーナノ粒子およびそれを生成するためのプロセスが
記載されている。
%〜2%の乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、媒質中の分散粒子を安定化させる。P
VA、PEG、Tween 80およびTween 20は、一般的な乳化剤の一部であ
る。しかしながら、乳化剤の使用は、乳化剤の浸出が被験体に対して毒性であり得るので
、インビボ用途の懸念理由である(Safety Assessment on pol
yethylene glycols(PEGS)and their derivat
ives as used in cosmetic products,Toxico
logy,2005 Oct.15;214(1−2):1−38)。乳化剤の使用はま
た、ナノ粒子の質量を増加させ、それにより薬物ロードを減少させ、より多い投与量必要
性をもたらす。ナノ粒子薬物担体系において依然として広く存在する他の不利益は、不十
分な経口バイオアベイラビリティ、循環中の不安定性、不適切な組織分布および毒性であ
る。上記不利益を伴わずにNuBCP−9などの治療用ペプチドを含む治療剤を罹患(例
、癌性)細胞の細胞質ゾルに有効に送達し得る送達系が本明細書に記載される。
バリエーションおよび改変に供されることを認識するであろう。本明細書に記載される本
発明は、すべてのこのようなバリエーションおよび改変を含むことを理解すべきである。
本発明はまた、個々にもしくは集合的に本明細書で言及されもしくは示されているすべて
のこのような工程、特徴、組成物および化合物、ならびに任意の2つもしくはそれを超え
る前記工程もしくは特徴のありとあらゆる組み合わせを含む。
定義
で用いられる特定の用語をここにまとめる。これらの定義は、残りの開示を考慮して解釈
し、当業者によって理解されるように理解すべきである。他に定義がない限り、本明細書
で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるもの
と同じ意味を有する。本明細書全体を通して使用される用語は、特定の場合で他に制限が
ない限り、以下のように定義される。
1つを超えるもの(すなわち、少なくとも1つ)を指すために使用される。
(including)」、「含有すること」、「を特徴とする」およびそれらの文法的
同等物は、包括的な非限定的意味で使用され、さらなる要素が含まれ得ることを意味する
。それは、「のみからなる」と解釈されることを意図しない。
されていないいかなる要素、工程または成分も除外する。
囲の20%以内、より好ましくは10%以内、最も好ましくはさらに5%以内を意味する
。
的の両方の場合の破壊または分解を指す。
内の粒子を指し、直径は、粒子と同じ容積を有する完全な球体の直径を指す。「ナノ粒子
」という用語は、「ナノ粒子(単数または複数)」と互換的に使用される。いくつかの場
合では、粒子の直径は、約1〜1000nm、10〜500nm、30〜270nm、3
0〜200nmまたは30〜120nmの範囲内である。
の直径は、特定の集団における分布の平均である。
意味が与えられる(すなわち、共有結合によって接続された1つまたはそれを超える反復
単位(モノマー)を含む分子構造)。反復単位はすべてが同一のものであり得るか、また
はいくつかの場合では、1種類を超える反復単位がポリマー内に存在し得る。
体およびその誘導体などのポリヌクレオチドを指す。
的に薬学的もしくは生物学的に活性な化合物または種だけではなく、それらの活性化合物
または種の1つまたはそれよりも多くを含む材料、ならびにそれらのコンジュゲーション
、改変体および薬理学的に活性な断片ならびに抗体誘導体を包含することも意図する。
択的に結合し得る分子である。例えば、ターゲティング部分は、特定の種類の細胞上に見
られるか、または標的細胞上で他の細胞よりも高頻度で発現される細胞表面受容体に結合
するリガンドであり得る。
び「ペプチド」は当技術分野で周知の用語であり、本明細書に使用される場合、これらの
用語は、当技術分野におけるその通常の意味が与えられる。一般に、ペプチドは、約10
0個未満のアミノ酸長であるが、最大300個までのアミノ酸を含み得るアミノ酸配列で
ある。タンパク質は、一般に、少なくとも100個のアミノ酸の分子であると考えられる
。アミノ酸は、D−またはL−立体配置であり得る。タンパク質は、例えば、タンパク質
薬、抗体、組換え抗体、組換えタンパク質、酵素などであり得る。いくつかの場合では、
ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸の1つまたはそれよりも多くは、例えば、炭水化物
基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーションの
ためのリンカーなどの化学的実体の添加、機能化または他の改変、例えば環化、副次的環
化、ならびにペプチドおよびタンパク質により有利な特性を付与することを目的とする多
数の他の改変のいずれかによって改変され得る。他の場合では、ペプチドまたはタンパク
質のアミノ酸の1つまたはそれよりも多くは、1つまたはそれを超える天然に存在しない
アミノ酸による置換によって改変され得る。ペプチドまたはタンパク質は、ファージライ
ブラリー、酵母ライブラリーまたはインビトロコンビナトリアルライブラリーなどのコン
ビナトリアルライブラリーから選択され得る。
ブリン可変領域によって示される結合親和性と同様またはそれよりも大きい結合親和性を
所定の抗原に付与する二次または三次構造類似性を有するアミノ酸配列または分子を組み
込んだ任意の分子を指す。抗体という用語は、限定されないが、単一特異性または二重特
異性かにかかわらず、およびイメージング剤または化学療法薬分子などの二次診断用また
は治療用部分とコンジュゲーションされるかにかかわらず、2つの重鎖および2つの軽鎖
からなるネイティブな抗体;軽鎖、重鎖もしくはその両方の断片、可変ドメイン断片、重
鎖もしくは軽鎖のみの抗体、またはこれらのドメインの任意の操作された組み合わせに由
来する結合分子を含む。この用語は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、
ラマ、ラクダ、ヒトまたは任意の他の脊椎動物種に由来するかにかかわらず、免疫グロブ
リン可変領域由来結合部分を含む。この用語は、発見方法(ハイブリドーマ由来、ヒト化
、ファージ由来、酵母由来、コンビナトリアルディスプレイ由来、または当技術分野で公
知の任意の類似の誘導方法)または生産方法(細菌、酵母、哺乳類細胞培養または遺伝子
導入動物または当技術分野で公知の任意の類似の生産方法)にかかわらず、任意のこのよ
うな免疫グロブリン可変領域結合部分を指す。
せ」という用語は、2つまたはそれを超える治療剤の併用投与(例えば、同時送達)を指
す。
レルギー反応および他の問題の合併症を伴わずに、健全な医学的判断の範囲内で温血動物
、例えば哺乳類またはヒトの組織との接触に適切であり、合理的な利益/リスク比に見合
った化合物、材料、組成物および/または剤形を指す。
せで処置された障害のベースラインの臨床的に観察可能な兆候および症候に対する観察可
能なまたは臨床的に顕著な改善を提供するために十分な量である。
しくは間接的に関与する任意の障害を患うかまたはそれに罹患する可能性がある動物を含
むことを意図する。被験体の例としては、哺乳類、例えばヒト、類人猿、サル、イヌ、ウ
シ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラットおよびトランスジェニッ
ク非ヒト動物が挙げられる。一実施形態では、被験体は、ヒト、例えば、癌を患っている
ヒト、癌を患うリスクがあるヒト、または潜在的に癌を患う可能性があるヒトである。
少なくとも1つの症候を軽減、低減もしくは緩和し、または疾患進行の遅延をもたらす処
置を含む。例えば、処置は、癌などの障害の1つもしくは複数の症候の縮小または障害の
完全な根絶であり得る。本開示の意味の範囲内では、「処置する」という用語はまた、疾
患の悪化を停止し、および/またはそのリスクを減少させることを示す。本明細書で使用
される「予防する」、「予防すること」または「予防」という用語は、予防される状態、
疾患または障害に関連するか、またはそれによって引き起こされる少なくとも1つの症候
の予防を含む。
ポリマーナノ粒子
毒性かつ安全な生分解性ポリマーナノ粒子が本明細書で提供される。本発明の生分解性ポ
リマーナノ粒子は、親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に改変されたポリ(乳酸
)(PLA)から本質的になるブロックコポリマーから形成され、前記親水性−疎水性ブ
ロックコポリマーは、ポリ(メチルメタクリレート)−ポリ(メタクリル酸)(PMMA
−PMAA)、ポリ(スチレン)−ポリ(アクリル酸)(PS−PAA)、ポリ(アクリ
ル酸)−ポリ(ビニルピリジン)(PAA−PVP)、ポリ(アクリル酸)−ポリ(N,
N−ジメチルアミノエチルメタクリレート)(PAA−PDMAEMA)、ポリ(エチレ
ングリコール)−ポリ(ブチレングリコール)(PEG−PBG)およびポリ(エチレン
グリコール)−ポリ(プロピレングリコール)−ポリ(エチレングリコール)(PEG−
PPG−PEG)から選択される。
リマーで化学的に改変されたポリ(乳酸)(PLA)を含むブロックコポリマーから形成
されたポリマーナノ粒子を指し、前記親水性−疎水性ブロックコポリマーは、ポリ(メチ
ルメタクリレート)−ポリ(メタクリル酸)(PMMA−PMAA)、ポリ(スチレン)
−ポリ(アクリル酸)(PS−PAA)、ポリ(アクリル酸)−ポリ(ビニルピリジン)
(PAA−PVP)、ポリ(アクリル酸)−ポリ(N,N−ジメチルアミノエチルメタク
リレート)(PAA−PDMAEMA)、ポリ(エチレングリコール)−ポリ(ブチレン
グリコール)(PEG−PBG)およびポリ(エチレングリコール)−ポリ(プロピレン
グリコール)−ポリ(エチレングリコール)(PEG−PPG−PEG)から選択される
。したがって、「本発明のポリマーナノ粒子」は、ポリ(エチレングリコール)−ポリ(
プロピレングリコール)−ポリ(エチレングリコール)(PEG−PPG−PEG)で化
学的に改変されたポリ(乳酸)(PLA)を含むかまたはそれから本質的になるブロック
コポリマーから形成されたポリマーナノ粒子を包含する。
ためのプロセスを提供する。得られたナノ粒子は、非毒性、安全および生分解性であるだ
けではなく、インビボで安定しており、高い保存安定性を有し、医療分野におけるナノ担
体系または薬物送達系で安全に使用され得る。実際、本発明のナノ粒子は、送達可能薬物
または治療剤のインビボ半減期を増加させる。
る有効な標的薬物送達ナノ担体系を形成するために、薬物(例えば、単一薬剤としてNu
BCP−9を含むペプチド、またはNuBCP−9および化学療法剤または標的抗癌剤)
を生分解性ポリマーナノ粒子に効率的にロードするためのプロセスを提供する。
あって、ナノ粒子の担体系またはリザーバーもしくはデポーを用いる組成物も提供される
。本発明のナノ粒子は、予後用組成物、治療用組成物、診断用組成物またはセラノスティ
クス組成物において広く使用され得る。適切には、本発明のナノ粒子は、薬物および薬剤
送達のために、ならびにヒトまたは動物における疾患診断および医用画像のために使用さ
れる。したがって、本発明は、本明細書に記載される治療剤をさらに含むナノ粒子を使用
して疾患を処置するための方法を提供する。本発明のナノ粒子はまた、リザーバーもしく
はデポーが必要とされる場合、バイオセンサーとして、固定化酵素のための薬剤としてな
ど、化学反応または生体反応などの他の用途において使用され得る。
解性ポリマーナノ粒子の生産中に、予想外の驚くべき結果が得られた。前記プロセスによ
って得られた生分解性ポリマーナノ粒子は、安全、安定および非毒性である。一実施形態
では、ブロックコポリマーPEG−PPG−PEGは、ポリ−乳酸(PLA)マトリック
スと共有結合されており、その結果、ブロックコポリマーはマトリックスの一部となる(
すなわち、ナノ粒子送達系)。対照的に、先行技術では、乳化剤(例えば、PEG−PP
G−PEG)は、ナノ粒子マトリックスの一部ではないので浸出する(図1)。先行技術
のナノ粒子とは対照的に、本明細書で提供されるナノ粒子から媒質への乳化剤の浸出はな
い。
で、非毒性および安全である。乳化剤の欠如またはその量の減少はまた、より高い薬物対
ポリマー比を有するナノ粒子をもたらす。これらのナノ粒子は、当技術分野に存在するポ
リマーナノ粒子と比較して、より高い安定性および増加した保存期間を有する。本発明の
ポリマーナノ粒子は、分解産物が体から容易に排泄され得るような生分解性であるように
調製される。分解はまた、ナノ粒子中の封入内容物が体内のある部位で放出され得る方法
を提供する。
好ましいポリマーである。しかしながら、ポリ(グリコール酸)(PGA)およびポリ乳
酸−コ−グリコール酸(PLGA)のブロックコポリマーも使用され得る。疎水性ポリマ
ーはまた生物学的に誘導され得るか、またはバイオポリマーであり得る。
olの範囲内である。したがって、一実施形態では、使用されるPLAは、約2,000
g/mol〜80,000g/molの範囲内である。PLAの平均分子量はまた、約7
2,000g/molであり得る。本明細書で使用される場合、1g/モルは、1「ダル
トン」と同等である(すなわち、ポリマーの分子量について言及する場合、ダルトンおよ
びg/molは互換的である。
ール)(PEG−PPG−PEG)、ポリ(メチルメタクリレート)−ポリ(メタクリル
酸)(PMMA−PMAA)、ポリ(スチレン)−ポリ(アクリル酸)(PS−PAA)
、ポリ(アクリル酸)−ポリ(ビニルピリジン)(PAA−PVP)、ポリ(アクリル酸
)−ポリ(N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート)(PAA−PDMAEMA)
、ポリ(エチレングリコール)−ポリ(ブチレングリコール)(PEG−PBG)、なら
びにPG−PR(ポリグリセロール(PG)およびアジピン酸、ピメリン酸およびセベシ
ン酸を含むポリエステル(PR)とのそのコポリマー)のようなブロックコポリマーは、
本発明において使用され得る親水性または親水性−疎水性コポリマーであり、PEG−P
PG−PEGなどのABA型ブロックコポリマー、PPG−PEG−PPGなどのBAB
ブロックコポリマー、(AB)n型交互マルチブロックコポリマーおよびランダムマルチ
ブロックコポリマーを含む。ブロックコポリマーは、2つ、3つまたはそれを超える数の
異なるブロックを有し得る。PEGは、親水性、マクロファージに対する抗食作用および
免疫認識への耐性を与えるため、好ましい成分である。
一般に、1,000〜20,000g/molの範囲内である。さらなる実施形態では、
親水性−疎水性ブロックコポリマーの平均分子量(Mn)は、約4,000g/mol〜
15,000g/molである。いくつかの場合では、親水性−疎水性ブロックコポリマ
ーの平均分子量(Mn)は、4,400g/mol、8,400g/molまたは14,
600g/molである。
チレングリコール)−ポリ(プロピレングリコール)−ポリ(エチレングリコール)(P
EG−PPG−PEG)のセグメントから本質的になり得る。
(エチレングリコール)−ポリ(プロピレングリコール)−ポリ(エチレングリコール)
(PLA−PEG−PPG−PEG)から形成される。
ポリ(エチレングリコール)−ポリ(プロピレングリコール)−ポリ(エチレングリコー
ル)−ポリ(乳酸)(PLA−PEG−PPG−PEG−PLA)から形成される。
ポリマーで化学的に改変することによって形成可能である。
る。さらなる実施形態では、本発明の生分解性ポリマーナノ粒子は、約30〜120nm
の範囲内のサイズを有する。
約0.5重量%〜5重量%の量の外部乳化剤を含み得る。
EGであり、ポリ(乳酸)ブロックの平均分子量は約60,000g/molであり、P
EG−PPG−PEGブロックの平均重量は約8,400または約14,600g/mo
lであり、外部乳化剤は約0.5重量%〜5重量%である。
EGであり、ポリ(乳酸)ブロックの平均分子量はおよそ16,000g/molまたは
それ未満であり、PEG−PPG−PEGブロックの平均重量は約8,400g/mol
または約14,600g/molであり、その組成物は、乳化剤を実質的に含まない。
ポリマーナノ粒子の調製
A)および親水性−疎水性ブロックコポリマーを有機溶媒に溶解して、溶液を得ること;
、カルボジイミドカップリング剤および塩基を前記溶液に添加して、反応混合物を得るこ
と;前記反応混合物を撹拌して、前記親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に改変
されたPLAのブロックコポリマーを得ること;前工程のブロックコポリマーを有機溶媒
に溶解し、ホモジナイズして、均一化混合物を得ること;前記均一化混合物を水相に添加
して、エマルジョンを得ること;前記エマルジョンを撹拌して、ポリマーナノ粒子を得る
ことを含む。
ップリング剤としては、限定されないが、N,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド(D
CC)、N−(3−ジエチルアミノプロピル)−N−エチルカルボジイミド(EDC)お
よびN,N−ジイソプロピルカルボジイミドが挙げられる。
ピリジン(DMAP)などの触媒および/または補助塩基の存在下で行われる。
誘導体と組み合わせて行われ得る。他のヒドロキシ誘導体としては、限定されないが、1
−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリア
ゾール(HOAt)、6−クロロ−1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(Cl−HOBt
)が挙げられる。
トリル(C2H3N)、ジメチルホルムアミド(DMF;C3H7NO)、アセトン((
CH3)2CO)およびジクロロメタン(CH2Cl2)である。
解性ポリマーナノ粒子を乾燥させるさらなる工程を含み得る。前記プロセスはまた、場合
により、乳化剤を添加する最初の工程を含み得る。このプロセスから得られたナノ粒子は
、約30〜300nmまたは約30〜120nmの範囲内のサイズを有し得る。
解し、ポリマー溶液を得る。この溶液にN,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DC
C)を−4℃〜0℃で添加し、続いて、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)を添加
する。この溶液を250〜300rpm、−40℃〜0℃の範囲の低温で20〜28時間
撹拌し得る。PLA−PEG−PPG−PEGのナノ粒子は、PEG−PPG−PEGに
共有結合するPLAを有し、PLA−PEG−PPG−PEGマトリックスを形成する。
ジエチルエーテル、メタノールまたはエタノールのような有機溶媒によってナノ粒子を沈
殿させ、ろ過、超遠心分離または限外ろ過を含む当技術分野における従来の方法によって
溶液から分離する。ナノ粒子を2℃〜8℃の範囲の温度で保存する。
で、本発明のプロセスは、さらなる凍結工程またはデコイタンパク質の使用を必要としな
いさらなる利点を提供する。本発明は、25℃〜30℃の環境室温条件下で容易に行われ
、所望の小粒径を得るために過剰なせん断を必要としない。
NMRスペクトルは、図3A、3Bおよび3Cに提供されている。図4Aおよび4BのT
EM画像に示されているように、ナノ粒子は立体配置で実質的に球状であるが、しかしな
がら、ナノ粒子は、膨張または収縮により非球状立体配置をとり得る。ナノ粒子は、本質
的に両親媒性である。ナノ粒子のゼータ電位およびPDI(多分散指数)は、表2に提供
されている。いかなる遊離乳化剤もプロセスに添加せず、PEG部分を含むブロックコポ
リマーは、PLA−PEG−PPG−PEGマトリックス全体と共有結合により連結され
ているので、本発明のナノ粒子の保存安定性は、従来の乳化剤ベースの系と比較して優れ
ている。ナノ粒子の保存可能期間は、6〜18カ月間の範囲である。
範囲の寸法を有し得る(図4)。適切な実施形態では、本発明のナノ粒子の直径は、直径
500nm未満、直径300nm未満または直径200nm未満である。特定のこのよう
な実施形態では、本発明のナノ粒子は、直径約10〜500nm、約10〜300nm、
約10〜200nmの範囲内、約20〜150nmの範囲内または約30〜120nmの
範囲内となる。
用が本明細書で提供される。これらのプロセスおよび使用は、当業者に明らかな様々な方
法によって行われ得る。
性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、(a)PEG−PPG−PEG
コポリマーおよびポリ(乳酸)(PLA)を有機溶媒に溶解して、溶液を得ること、(b
)N,N,−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)および4−(ジメチルアミノ)
ピリジン(DMAP)を前記溶液に−4℃〜0℃の範囲内の温度で添加して、反応混合物
を得ること、(c)前記反応混合物を250〜400rpm、−4℃〜0℃の範囲の温度
で20〜28時間撹拌して、PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーを得る
こと、(d)前記PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーを有機溶媒に溶解
し、250〜400rpmでホモジナイズして、均一化混合物を得ること、(e)前記均
一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること、ならびに(f)前記エマルジョ
ンを250〜400rpm、25℃〜30℃で10〜12時間撹拌して、PLA−PEG
−PPG−PEGブロックコポリマーの前記ナノ粒子を得ることを含むプロセスが本明細
書で提供される。
分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、(a)PEG−PPG−P
EGコポリマーおよびポリ(乳酸)(PLA)を有機溶媒に溶解して、溶液を得ること、
(b)N,N,−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)および4−(ジメチルアミ
ノ)ピリジン(DMAP)を前記溶液に−4℃〜0℃の範囲内の温度で添加して、反応混
合物を得ること、(c)前記反応混合物を250〜400rpm、−4℃〜0℃の範囲の
温度で20〜28時間撹拌して、PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーを
得ること、(d)前記PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーを有機溶媒に
溶解し、250〜400rpmでホモジナイズして、均一化混合物を得ること、(e)前
記均一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること、ならびに(f)前記エマル
ジョンを250〜400rpm、25℃〜30℃で10〜12時間撹拌して、PLA−P
EG−PPG−PEGブロックコポリマーの前記ナノ粒子を得ることを含み、場合により
、PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーの前記ナノ粒子を水で洗浄し、従
来の方法によって前記ナノ粒子を乾燥させる工程を含むプロセスが提供される。
分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、(a)PEG−PPG−P
EGコポリマーおよびポリ−乳酸(PLA)を有機溶媒に溶解して、溶液を得ること、(
b)N,N,−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)および4−(ジメチルアミノ
)ピリジン(DMAP)を前記溶液に−4℃〜0℃の範囲内の温度で添加して、反応混合
物を得ること、(c)前記反応混合物を250〜400rpm、−4℃〜0℃の範囲の温
度で20〜28時間撹拌して、PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーを得
ること、(d)前記PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーを有機溶媒に溶
解し、250〜400rpmでホモジナイズして、均一化混合物を得ること、(e)前記
均一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること、ならびに(f)前記エマルジ
ョンを250〜400rpm、25℃〜30℃で10〜12時間撹拌して、PLA−PE
G−PPG−PEGブロックコポリマーの前記ナノ粒子を得ることを含み、前記ナノ粒子
のサイズが、約30〜300nmまたは約30〜120nmの範囲内であるプロセスが提
供される。
の生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、(a)PEG−PPG
−PEGコポリマーおよびポリ−乳酸(PLA)を有機溶媒に溶解して、溶液を得ること
、(b)N,N,−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)および4−(ジメチルア
ミノ)ピリジン(DMAP)を前記溶液に−4℃〜0℃の範囲内の温度で添加して、反応
混合物を得ること、(c)前記反応混合物を250〜400rpm、−4℃〜0℃の範囲
の温度で20〜28時間撹拌して、PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマー
を得ること、(d)前記PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーを有機溶媒
に溶解し、250〜400rpmでホモジナイズして、均一化混合物を得ること、(e)
前記均一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること、ならびに(f)前記エマ
ルジョンを250〜400rpm、25℃〜30℃で10〜12時間撹拌して、PLA−
PEG−PPG−PEGブロックコポリマーの前記ナノ粒子を得ることを含み、前記PE
G−PPG−PEGコポリマーの分子量が、1,000g/mol〜10,000g/m
olの範囲内であるプロセスが提供される。
の生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、(a)PEG−PPG
−PEGコポリマーおよびポリ(乳酸)(PLA)を有機溶媒に溶解して、溶液を得るこ
と、(b)N,N,−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)および4−(ジメチル
アミノ)ピリジン(DMAP)を前記溶液に−4℃〜0℃の範囲内の温度で添加して、反
応混合物を得ること、(c)前記反応混合物を250〜400rpm、−4℃〜0℃の範
囲の温度で20〜28時間撹拌して、PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマ
ーを得ること、(d)前記PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーを有機溶
媒に溶解し、250〜400rpmでホモジナイズして、均一化混合物を得ること、(e
)前記均一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること、ならびに(f)前記エ
マルジョンを250〜400rpm、25℃〜30℃で10〜12時間撹拌して、PLA
−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーの前記ナノ粒子を得ることを含み、PLA
の分子量が、10,000g/mol〜60,000g/molの範囲内であるプロセス
が提供される。
の生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、(a)PEG−PPG
−PEGコポリマーおよびポリ(乳酸)(PLA)を有機溶媒に溶解して、溶液を得るこ
と、(b)N,N,−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)および4−(ジメチル
アミノ)ピリジン(DMAP)を前記溶液に−4℃〜0℃の範囲内の温度で添加して、反
応混合物を得ること、(c)前記反応混合物を250〜400rpm、−4℃〜0℃の範
囲の温度で20〜28時間撹拌して、PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマ
ーを得ること、(d)前記PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーを有機溶
媒に溶解し、250〜400rpmでホモジナイズして、均一化混合物を得ること、(e
)前記均一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること、ならびに(f)前記エ
マルジョンを250〜400rpm、25℃〜30℃で10〜12時間撹拌して、PLA
−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーの前記ナノ粒子を得ることを含み、工程(
a)の溶液が、場合により、乳化剤などの添加剤を含むことがあるプロセスが提供される
。
解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスによって得られるPLA−PEG−PP
G−PEGブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子であって、前記プロセスが、
(a)PEG−PPG−PEGコポリマーおよびポリ(乳酸)(PLA)を有機溶媒に溶
解して、溶液を得ること、(b)N,N,−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)
および4−(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)を前記溶液に−4℃〜0℃の範囲内
の温度で添加して、反応混合物を得ること、(c)前記反応混合物を250〜400rp
m、−4℃〜0℃の範囲の温度で20〜28時間撹拌して、PLA−PEG−PPG−P
EGブロックコポリマーを得ること、(d)前記PLA−PEG−PPG−PEGブロッ
クコポリマーを有機溶媒に溶解し、250〜400rpmでホモジナイズして、均一化混
合物を得ること、(e)前記均一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること、
ならびに(f)前記エマルジョンを250〜400rpm、25℃〜30℃で10〜12
時間撹拌して、PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーの前記ナノ粒子を得
ることを含む、PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーの生分解性ポリマー
ナノ粒子を提供する。
解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスによって得られるPLA−PEG−PP
G−PEGブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を含む組成物であって、前記
プロセスが、(a)PEG−PPG−PEGコポリマーおよびポリ(乳酸)(PLA)を
有機溶媒に溶解して、溶液を得ること、(b)N,N,−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド(DCC)および4−(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)を前記溶液に−4℃〜
0℃の範囲内の温度で添加して、反応混合物を得ること、(c)前記反応混合物を250
〜400rpm、−4℃〜0℃の範囲の温度で20〜28時間撹拌して、PLA−PEG
−PPG−PEGブロックコポリマーを得ること、(d)前記PLA−PEG−PPG−
PEGブロックコポリマーを有機溶媒に溶解し、250〜400rpmでホモジナイズし
て、均一化混合物を得ること、(e)前記均一化混合物を水相に添加して、エマルジョン
を得ること、ならびに(f)前記エマルジョンを250〜400rpm、25℃〜30℃
で10〜12時間撹拌して、PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーの前記
ナノ粒子を得ることを含む、組成物を提供する。
治療薬を含むポリマーナノ粒子
。本発明のPLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子の粒径および放出特性は、ポリマー
マトリックス中のPLAまたはPEG−PPG−PEGの分子量を変化させることによっ
て制御され得る。活性剤または実体の放出は12時間〜60日間制御され得るが、これは
、当技術分野で利用可能な従来のPLA−PEG系に対する改善である(図6A)。ナノ
粒子の薬物ロード容量もまた、ナノ粒子のポリマーマトリックス中のブロックコポリマー
の平均分子量を変化させることによって制御され得る。ナノ粒子の薬物ロード容量は、P
EG−PPG−PEGブロックコポリマーのブロック長の増加と共に増加する(表3)。
は本質的に両親媒性であるので、疎水性薬物および親水性薬物は両方ともナノ粒子にロー
ドされ得る。乳化剤を使用しないかまたは乳化剤の使用が最小限であるので、本発明のナ
ノ粒子は、高い薬物ロード容量を有し、その結果、ロード用量および治療頻度が減少する
。乳化剤の重量は総製剤重量の50%になり得るので、ナノ粒子に対する活性剤または実
体の比は、本発明のナノ粒子では、乳化剤を用いる従来の系と比較して高い(Inter
national Journal of Pharmaceutics,15 Jun
e 2011,Volume 411,Issues 1−2,Pages 178−1
87;International Journal of Pharmaceutic
s,2010,387:253−262)。ナノ粒子は、毒性の減少を伴う単回低用量薬
物送達の達成を支援する。PLA−PEG−PPG−PEGのナノ担体系に対する活性剤
の重量割合は、ナノ粒子に対して2〜20%の範囲である。低い投与量レベルで有効量が
投与され得るので、ナノ粒子へのより高い薬物ロードは、薬物用量の必要性を減少させる
。ナノ粒子の総ロード容量を損なわずに、ポリマーナノ粒子への長期活性のロード実体の
内部ロードの増強は、非常に将来性のある治療薬の有効な送達をもたらす。図7Bは、一
次HUVEC細胞株における、ナノ粒子製剤にロードした抗癌ペプチドL−NuBCP−
9(本明細書では、「NuBCP−9」(アミノ酸配列FSRSLHSLLのL−立体配
置)とも称される)の有効性を、遊離ペプチド薬製剤および従来の細胞透過性ペプチドコ
ンジュゲート薬物製剤と比較して示す。
発明のPLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子は非毒性である。150mg/体重kg
の用量のPLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子で処置したマウスにおいて評価した血
液学的パラメータにより、対照群と比べて全血球数、赤血球数、白血球数、好中球および
リンパ球レベルの有意な変化はないことが示された(図8)。肝機能および腎機能につい
て評価した生化学的パラメータにより、対照群とナノ粒子処置群との間で、総タンパク質
、アルブミンおよびグロブリンレベルの有意な変化はないことが示された。図9Aおよび
9Bに示されているように、肝臓酵素(アラニントランスアミナーゼ(ALT)、アスパ
ラギン酸トランスアミナーゼ(AST)およびアルカリホスファターゼ(ALP))のレ
ベルは、PLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子処置群では、対照群と比較して非有意
に増加した。PLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子で処置したマウスでは、対照と比
較して、尿素および血中尿素窒素(BUN)のレベルの有意な変化はない(図9C)。P
LA−PEG−PPG−PEGナノ粒子を注射したマウスの器官(脳、心臓、肝臓、脾臓
、腎臓および肺)の組織病理学は、図10に示されている。
実体はまた、生分解性ナノ粒子のブロックコポリマーに直接コンジュゲートされ得る。本
発明の実体としては、限定されないが、有機小分子、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチド、ヌクレオシド、DNA、RNA、SiRNA、アミノ酸、ペプチド、タンパ
ク質、アミン、抗体およびその変異体、抗生物質、低分子量分子、化学療法薬、薬物もし
くは治療剤、金属イオン、色素、放射性同位体、造影剤ならびに/またはイメージング剤
が挙げられる。
の断片、インスリンなど、ドキソルビシン(doxorubcin)、パクリタキセル(
paclitaxil)、ゲムシタビン(gemcetabin)、ドセタキセルなどの
疎水性薬物、アンホテリシンB、イソニアジド(INH)などの抗生物質および核酸が治
療剤に含まれる。治療剤としては、パクリタキセル、ドキソルビシンピモジド、ペリメタ
ミン、インデノイソキノリンまたはノル−インデノイソキノリンなどの化学療法薬も挙げ
られる。
環式化合物および環状ペプチド模倣薬などのペプチド模倣薬が挙げられる。
らは、それらのD形態と比較してインビボ系において急速に分解することが公知であるの
で、薬物適用における不利益を有することが公知である。しかしながら、インビボ研究で
確認されたように、本発明のナノ粒子によるこのようなL−ペプチドの封入は、ナノ粒子
のコアへの封入により、循環中の分解をもたらさない(図11、12および13)。
的送達が達成され得る。本発明のナノ粒子はまた、ナノ粒子の表面上にターゲティング部
分を含む1つまたはそれを超える実体と表面コンジュゲート、バイオコンジュゲートまた
は吸着され得る。ターゲティング部分は、ナノ粒子を腫瘍または疾患部位に局在化させ、
治療剤を放出させる。ターゲティング部分は、リンカー分子と結合または会合し得る。タ
ーゲティング分子としては、限定されないが、抗体分子、成長受容体リガンド、ビタミン
、ペプチド、ハプテン、アプタマーおよび当業者に公知の他のターゲティング分子が挙げ
られる。薬物分子およびイメージング分子はまた直接的に、またはリンカー分子を介して
ナノ粒子の表面上のターゲティング部分に結合され得る。
チド断片、抗体、アプタマー、トランスフェリン、抗体もしくはその断片、シアリルルイ
スX抗原、ヒアルロン酸、マンノース誘導体、グルコース誘導体、細胞特異的レクチン、
ガラプチン、ガレクチン、ラクトシルセラミド、ステロイド誘導体、RGD配列、EGF
、EGF結合ペプチド、ウロキナーゼ受容体結合ペプチド、トロンボスポンジン由来ペプ
チド、アルブミン誘導体および/またはコンビナトリアルケミストリーに由来する分子が
挙げられる。
コンジュゲートされ得る。葉酸のような低分子量小分子、前立腺膜特異的抗原(PSMA
)、抗体、アプタマー、細胞表面の受容体もしくは抗原に結合する分子などは、ブロック
コポリマーPEG−PPG−PEGまたはポリマーマトリックスのPEG成分に共有結合
され得る。本発明の適切な実施形態では、マトリックスは、ポリマーおよび実体を含む。
いくつかの場合では、実体またはターゲティング部分は、ポリマーマトリックスの表面と
共有結合され得る。治療剤は、ポリマーマトリックスの表面と会合され得るか、またはナ
ノ粒子のポリマーマトリックス全体に封入され得る。コンジュゲートナノ粒子の細胞取り
込みは、単純ナノ粒子と比較して高い。
つまたはそれを超える薬剤を含み得、さらに、多機能ナノ粒子として機能するように1つ
またはそれを超える薬剤を封入し得る。本発明のナノ粒子は、オールインワンシステムで
腫瘍ターゲティング、腫瘍治療および腫瘍イメージングを併せ持ち得る多機能ナノ粒子と
して機能して、癌との闘いにおいて有用な集学的アプローチを提供し得る。多機能ナノ粒
子は、類似のもしくは異なる作用機構、類似のもしくは異なる作用部位;または類似のお
よび異なる機能を有する1つまたはそれを超える活性剤を有し得る。
って調製される。本発明のプロセスを使用して調製されたPLA−PEG−PPG−PE
Gポリマーナノ粒子を、有機溶媒を含む有機溶媒に溶解する。ポリマーの10〜20重量
%の重量範囲で、実体をポリマー溶液に添加する。次いで、ポリマー溶液を水相に滴下し
、溶媒を蒸発させ、ナノ粒子を安定化させるために室温で10〜12時間撹拌する。遠心
分離によって実体ロードナノ粒子を収集し、乾燥させ、さらなる使用まで2℃〜8℃で保
存する。実体ロードポリマーナノ粒子の調製のためのプロセスでは、糖、アミノ酸、メチ
ルセルロースなどのような他の添加剤を水相に添加し得る。
90%に達する。本発明のPLA−PEG−PPG−PEGベースのナノ担体系は早期分
解を防止し、抗癌ペプチドを癌細胞に有効に標的送達する。NuBCP−9、Bax B
H3などの治療用ペプチドをコアに封入した表面葉状生分解性PLA−PEG−PPG−
PEGナノ粒子は、いかなる細胞透過性ペプチドも使用せずに、癌細胞の細胞質ゾル中に
有効に送達され得る。NuBCP−9ロードナノ粒子をチャレンジしたMCF−7細胞株
を用いたインビトロ研究では、XTTアッセイ(図7B)およびインビボ研究(図11お
よび12)によって評価したように、48〜72時間で細胞の完全な死滅が示された。図
7Bはまた、MCF−7細胞株における、薬物の持続放出および効率的な送達に関するナ
ノ粒子の有効性を、遊離薬物製剤と比較して示す。
ードは、活性剤を低分子量PLAと結合させることによって達成される。実体は、ヒドロ
キシ誘導体と組み合わせたカルボジイミドカップリング試薬との反応によって、低分子量
PLAと共有結合により連結される。一例として、カルボジイミドカップリング剤はエチ
ル−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドであり、ヒドロキシ誘導体はN−ヒドロキシ
−スクシンイミド(EDC/NHS)化学である。PLAの分子量は、約2,000〜1
0,000g/molの範囲内である。PLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子への疎
水性薬物および親水性薬物の両方のより高いロードが達成される(実施例5、表4および
5)。細胞透過性ペプチド(CPP)の助けを用いずに、封入PLA−薬物を有するナノ
粒子を細胞質ゾルに送達した。
を含むPLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子
を調製するためのプロセスが本明細書で提供される。
剤)を含むPLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ
粒子を調製するためのプロセスであって、(a)有機溶媒に溶解されたPLA−PEG−
PPG−PEGブロックコポリマーのポリマーナノ粒子と共に前記実体を250〜400
rpmでホモジナイズして、一次エマルジョンを得ること、(b)水相中の前記一次エマ
ルジョンを250〜400rpmで乳化して、二次エマルジョンを得ること、および(c
)前記二次エマルジョンを250〜400rpm、25℃〜30℃で10〜12時間撹拌
して、前記実体を含むPLA−PEG−PPG−PEGの前記ナノ粒子を得ることを含む
プロセスが本明細書で提供される。
EGブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって
、(a)有機溶媒に溶解されたPLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーのポ
リマーナノ粒子と共に前記実体を250〜400rpmでホモジナイズして、一次エマル
ジョンを得ること、(b)水相中の前記一次エマルジョンを250〜400rpmで乳化
して、二次エマルジョンを得ること、および(c)前記二次エマルジョンを250〜40
0rpm、25℃〜30℃で10〜12時間撹拌して、前記実体を含むPLA−PEG−
PPG−PEGの前記ナノ粒子を得ることを含み、場合により、前記実体を含むPLA−
PEG−PPG−PEGブロックコポリマーの前記ナノ粒子を水で洗浄し、従来の方法に
よって前記ナノ粒子を乾燥させる工程を含むことがあるプロセスが提供される。
EGブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって
、(a)有機溶媒に溶解されたPLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーのポ
リマーナノ粒子と共に前記実体を250〜400rpmでホモジナイズして、一次エマル
ジョンを得ること、(b)水相中の前記一次エマルジョンを250〜400rpmで乳化
して、二次エマルジョンを得ること、および(c)前記二次エマルジョンを250〜40
0rpm、25℃〜30℃で10〜12時間撹拌して、前記実体を含むPLA−PEG−
PPG−PEGの前記ナノ粒子を得ることを含み、前記実体が、有機小分子、核酸、ポリ
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、DNA、RNA、アミノ酸、ペプチ
ド、タンパク質、抗生物質、低分子量分子、薬理学的に活性な分子、薬物、金属イオン、
色素、放射性同位体、造影剤、イメージング剤およびターゲティング部分からなる群より
選択される、プロセスが提供される。
EGブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって
、(a)有機溶媒に溶解されたPLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーのポ
リマーナノ粒子と共に前記実体を250〜400rpmでホモジナイズして、一次エマル
ジョンを得ること、(b)水相中の前記一次エマルジョンを250〜400rpmで乳化
して、二次エマルジョンを得ること、および(c)前記二次エマルジョンを250〜40
0rpm、25℃〜30℃で10〜12時間撹拌して、前記実体を含むPLA−PEG−
PPG−PEGの前記ナノ粒子を得ることを含み、前記実体が、ビタミン、リガンド、ア
ミン、ペプチド断片、抗体およびアプタマーからなる群より選択される、プロセスが提供
される。
EGブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって
、(a)有機溶媒に溶解されたPLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーのポ
リマーナノ粒子と共に前記実体を250〜400rpmでホモジナイズして、一次エマル
ジョンを得ること、(b)水相中の前記一次エマルジョンを250〜400rpmで乳化
して、二次エマルジョンを得ること、および(c)前記二次エマルジョンを250〜40
0rpm、25℃〜30℃で10〜12時間撹拌して、前記実体を含むPLA−PEG−
PPG−PEGの前記ナノ粒子を得ることを含み、前記実体がPLAに連結されているプ
ロセスが提供される。
EGブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって
、(a)有機溶媒に溶解されたPLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーのポ
リマーナノ粒子と共に前記実体を250〜400rpmでホモジナイズして、一次エマル
ジョンを得ること、(b)水相中の前記一次エマルジョンを250〜400rpmで乳化
して、二次エマルジョンを得ること、および(c)前記二次エマルジョンを250〜40
0rpm、25℃〜30℃で10〜12時間撹拌して、前記実体を含むPLA−PEG−
PPG−PEGの前記ナノ粒子を得ることを含み、前記実体が、2,000g/mol〜
10,000g/molの範囲内の分子量のPLAに連結されているプロセスが提供され
る。
Gブロックコポリマーのポリマーナノ粒子と共に前記実体を250〜400rpmでホモ
ジナイズして、一次エマルジョンを得ること、(b)水相中の前記一次エマルジョンを2
50〜400rpmで乳化して、二次エマルジョンを得ること、および(c)前記二次エ
マルジョンを250〜400rpm、25℃〜30℃で10〜12時間撹拌して、前記実
体を含むPLA−PEG−PPG−PEGの前記ナノ粒子を得ることを含むプロセスによ
って得られた少なくとも1つの実体を含むPLA−PEG−PPG−PEGの生分解性ポ
リマーナノ粒子を提供する。
Gブロックコポリマーのポリマーナノ粒子と共に前記実体を250〜400rpmでホモ
ジナイズして、一次エマルジョンを得ること、(b)水相中の前記一次エマルジョンを2
50〜400rpmで乳化して、二次エマルジョンを得ること、および(c)前記二次エ
マルジョンを250〜400rpm、25℃〜30℃で10〜12時間撹拌して、前記実
体を含むPLA−PEG−PPG−PEGの前記ナノ粒子を得ることを含むプロセスによ
って得られた少なくとも1つの実体を含むPLA−PEG−PPG−PEGの生分解性ポ
リマーナノ粒子を含む組成物を提供する。
EGブロックコポリマーのポリマーナノ粒子と共に前記実体を250〜400rpmでホ
モジナイズして、一次エマルジョンを得ること、(b)水相中の前記一次エマルジョンを
250〜400rpmで乳化して、二次エマルジョンを得ること、および(c)前記二次
エマルジョンを250〜400rpm、25℃〜30℃で10〜12時間撹拌して、前記
実体を含むPLA−PEG−PPG−PEGの前記ナノ粒子を得ることを含むプロセスに
よって得られた少なくとも1つの実体を含むPLA−PEG−PPG−PEGの生分解性
ポリマーナノ粒子を含む組成物であって、場合により、保存剤、抗酸化剤、増粘剤、キレ
ート剤、等張剤、香味剤、甘味剤、着色剤、可溶化剤、色素、香味料、結合剤、軟化剤、
充填剤、潤滑剤および保存剤からなる群より選択される少なくとも1つの薬学的賦形剤を
含んでいてもよい組成物が提供される。
薬学的組み合わせを含むポリマーナノ粒子
に使用され得る。例えば、本明細書に開示されるナノ粒子によって送達され得る薬学的組
み合わせは、化学療法薬、例えばパクリタキセルおよび抗癌ペプチド、例えばNuBCP
−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含むペプチドを含む
。ナノ粒子を介して送達した場合、EATモデルのBALB/cマウスにおけるそれらの
活性のように、乳癌細胞株に対するパクリタキセルおよびNuBCP−9のインビトロ活
性は相乗的に増加した(例えば、実施例8を参照のこと)。結果は、NuBCP−9と同
時送達した場合、単一薬物のみの場合と比較して、パクリタキセルのIC50の約40倍
の減少を示した(例えば、実施例8および表8を参照のこと)。PTX/NuBCP−9
組み合わせの機構は、アポトーシスの増強を伴うことが見出され、これはカスパーゼ依存
性であり、MCF7細胞におけるカスパーゼカスケードの本質的な部分に関与すると思わ
れた。低濃度におけるNuBCP−9およびPTXの併用適用は、EAT腫瘍モデルBa
lb/cマウスに対して、いずれかの薬物のみの場合よりも顕著に有効であった。したが
って、パクリタキセルとNuBCP−9抗癌ペプチドとの同時送達は、乳癌などの癌を有
効に処置するために使用され得る。
ル)−ポリ(エチレングリコール)(PLA−PEG−PPG−PEG)テトラブロック
コポリマーを含むポリマーナノ粒子であって、
a)1つまたはそれを超える化学療法剤;および
b)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含む
ペプチド
がロードされているポリマーナノ粒子が本明細書で提供される。
がロードされる。
ードされる。
EG−PPG−PEGトリブロックコポリマーとPLAとの化学的コンジュゲーションか
ら形成され、PEG−PPG−PEGトリブロックコポリマーは、異なる分子量のもので
あり得る。
a)化学療法剤または標的抗癌剤;および
b)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含む
ペプチド
がロードされる。
ドがロードされる。
ロードされる。
、ポリマーナノ粒子は、約9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、
2:8または1:9の比で、パクリタキセルと、NuBCP−9を含むペプチドとがロー
ドされる。
ポリマーナノ粒子は、約9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2
:8または1:9の比で、ゲムシタビンと、NuBCP−9を含むペプチドとがロードさ
れる。
、デシタビン、イリノテカン、SN−38、シタラビン、ドセタキセル、トリプトライド
(ジテルピノイドエポキシド)、ゲルダナマイシン(HSP90阻害剤)、17−AAG
、5−FU、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキセートおよ
びボルテゾミブからなる群より選択される。
ポリ(プロピレングリコール)−ポリ(エチレングリコール)(PLA−PEG−PPG
−PEG)テトラブロックコポリマーから本質的になる。
疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経学的障害からなる群より選択される疾
患の処置に使用するためのポリマーナノ粒子であって、
a)ポリ(乳酸)−ポリ(エチレングリコール)−ポリ(プロピレングリコール)−ポリ
(エチレングリコール)(PLA−PEG−PPG−PEG)テトラブロックコポリマー
;
b)1つまたはそれを超える治療薬;および
c)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含む
ペプチド
を含むポリマーナノ粒子が本明細書で提供される。
ポリ(プロピレングリコール)−ポリ(エチレングリコール)(PLA−PEG−PPG
−PEG)テトラブロックコポリマーから本質的になる。
組成物
の本発明のポリマーナノ粒子であって、薬学的組み合わせを含む本発明のポリマーナノ粒
子が本明細書で提供される。一実施形態では、薬学的組み合わせを含むポリマーナノ粒子
は、癌の処置のための医薬の調製において使用するためのものである。
EG−PPG−PEGブロックコポリマーから本質的になる生分解性ポリマーナノ粒子の
使用を提供する。
療剤の薬学的組み合わせ(例えば、NuBCP−9を含むペプチドおよび化学療法剤また
は標的抗癌剤)と、薬学的に許容され得る担体とを含む組成物も本明細書で提供される。
み合わせを含むポリマーナノ粒子の使用が本明細書で提供される。一実施形態では、薬学
的組み合わせを含むポリマーナノ粒子の使用は、癌などの疾患の処置のための医薬を製造
するためのものである。
子の外側に結合したターゲティング部分をさらに含み、ターゲティング部分は、抗体、ペ
プチドまたはアプタマーである。
a)ポリ(乳酸)−ポリ(エチレングリコール)−ポリ(プロピレングリコール)−ポリ
(エチレングリコール)(PLA−PEG−PPG−PEG)テトラブロックコポリマー
を含むポリマーナノ粒子;
b)1つまたはそれを超える化学療法剤または抗癌標的薬剤;および
c)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含む
ペプチド
を含む組成物が本明細書で提供される。
含む。
。
ンである。
は、PEG−PPG−PEGトリブロックコポリマーとPLAとの化学的コンジュゲーシ
ョンから形成され、PEG−PPG−PEGトリブロックコポリマーは、異なる分子量の
ものであり得る。
a)化学療法剤または標的抗癌剤;および
b)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含む
ペプチド
がロードされる。
チドがロードされる。
ロードされる。
:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8または1:9の比で、パクリタキセルと
、NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドとがロードされている。
施形態では、前記ポリマーナノ粒子に、約9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4
:6、3:7、2:8または1:9の比で、ゲムシタビンと、NuBCP−9(配列番号
1)を含むペプチドとがロードされている。
ノルビシン、デシタビン、イリノテカン、SN−38、シタラビン、ドセタキセル、トリ
プトライド、ゲルダナマイシン、17−AAG、5−FU、オキサリプラチン、カルボプ
ラチン、タキソテール、メトトレキセートおよびボルテゾミブからなる群より選択される
。
肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経学的障害からなる群より選択される
疾患の処置に使用するための医薬組成物であって、
a)ポリ(乳酸)−ポリ(エチレングリコール)−ポリ(プロピレングリコール)−ポリ
(エチレングリコール)(PLA−PEG−PPG−PEG)テトラブロックコポリマー
を含むポリマーナノ粒子;
b)1つまたはそれを超える治療剤;および
c)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチド
を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
施形態において、前記癌が、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、転移性結腸癌、膵臓癌また
は血液学的悪性腫瘍である。
またさらなる実施形態では、癌は、乳癌である。
肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経学的障害からなる群より選択される
疾患の処置に使用するための医薬組成物であって、
a)ポリ(乳酸)−ポリ(エチレングリコール)−ポリ(プロピレングリコール)−ポリ
(エチレングリコール)(PLA−PEG−PPG−PEG)テトラブロックコポリマー
を含むポリマーナノ粒子;
b)1つまたはそれを超える治療剤;および
c)MUC1(配列番号2)を含むペプチド
を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
施形態において、前記癌が、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、転移性結腸癌、膵臓癌また
は血液学的悪性腫瘍である。またさらなる実施形態では、癌は、乳癌である。
リ(乳酸)−ポリ(エチレングリコール)−ポリ(プロピレングリコール)−ポリ(エチ
レングリコール)(PLA−PEG−PPG−PEG)テトラブロックコポリマーから本
質的になる。
ーナノ粒子の外側に結合したターゲティング部分をさらに含み、ターゲティング部分は、
抗体、ペプチドまたはアプタマーである。
約99.9%、好ましくは約1%〜約60%を含有し得る。経腸または非経口投与用の医
薬製剤は、例えば、糖コーティング錠剤、錠剤、カプセルもしくは坐剤などの単位剤形の
ものまたはアンプルである。他に指示がない場合、これらは、それ自体が公知の手法にお
いて、例えば、従来の混合、造粒、糖コーティング、溶解または凍結乾燥プロセスの方法
によって、調製される。各剤形の個々の用量に含まれている併用パートナーの単位含有量
は、必須有効量が複数の投薬単位の投与によって達し得るため、それ自体が有効量を構成
する必要はないと認識されよう。
賦形剤)と組み合わせて本発明のナノ粒子の1つまたはそれよりも多くを含有し得る。本
発明の組成物の作製において、有効成分は通常、賦形剤と混合されるか、賦形剤によって
希釈されるか、または例えば、カプセル、小袋、紙もしくは他の容器の形態のこのような
担体内に封入される。賦形剤が希釈剤としての役割を果たす場合、それは、有効成分のビ
ヒクル、担体もしくは媒質として作用する固体、半固体または液体材料であり得る。した
がって、組成物は、例えば、活性化合物の最大10重量%を含有する、錠剤、丸剤、粉末
、トローチ剤、小袋、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ
剤、エアロゾル(固体としてまたは液体媒質中で)、軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル
、坐剤、滅菌注射液および滅菌パッケージ化粉末の形態であり得る。
右旋糖、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン(例えば、デンプングリコ
ール酸ナトリウム)、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガント、ゼ
ラチン、ケイ酸カルシウム、コロイド状二酸化ケイ素、微晶性セルロース、ポリビニルピ
ロリドン(例えば、ポビドン)、セルロース、水、シロップ、メチルセルロースおよびヒ
ドロキシプロピルセルロースが挙げられる。製剤は、タルク、ステアリン酸マグネシウム
および鉱油などの潤滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、メチル−およびプロピルヒドロ
キシ−安息香酸塩などの保存剤、甘味剤および香味剤をさらに含み得る。
形態としては、水溶液、好適には香味シロップ、水性もしくは油性懸濁液および綿実油、
胡麻油、ヤシ油もしくは落花生油などの食用油を使用した香味エマルジョン、ならびにエ
リキシル剤および類似の薬学的ビヒクルが挙げられる。
処置方法
(すなわち、1つを超える治療剤)を含む(例えば、PLA−PEG−PPG−PEGか
ら本質的になる)本発明の生分解性ポリマーナノ粒子をそれを必要とする被験体に投与す
ることを含む方法を提供する。
血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経学的障害からなる群より
選択される。
a)化学療法剤および/または標的抗癌剤;ならびに
b)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含む
ペプチド
がロードされたPLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含む治療有
効量のポリマーナノ粒子を前記被験体に投与することを含む方法も本明細書で提供される
。
チドがロードされる。
がロードされる。
ポリマーナノ粒子は、約9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2
:8または1:9の比で、パクリタキセルと、NuBCP−9を含むペプチドとがロード
される。
ポリマーナノ粒子は、約9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2
:8または1:9の比で、ゲムシタビンと、NuBCP−9を含むペプチドとがロードさ
れる。
、デシタビン、イリノテカン、SN−38、シタラビン、ドセタキセル、トリプトライド
、ゲルダナマイシン、17−AAG、5−FU、オキサリプラチン、カルボプラチン、タ
キソテール、メトトレキセートおよびボルテゾミブからなる群より選択される。さらなる
実施形態では、ポリマーナノ粒子は、約9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:
6、3:7、2:8または1:9の比で、化学療法剤または標的抗癌剤(例えば、ドキソ
ルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、SN−38、シタラビン、ドセ
タキセル、トリプトライド、ゲルダナマイシン、17−AAG、5−FU、オキサリプラ
チン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキセートまたはボルテゾミブ)と、Nu
BCP−9を含むペプチドとがロードされる。
または血液学的悪性腫瘍である。特定の実施形態では、癌は、乳癌である。
て、PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーから本質的になる治療有
効量のポリマーナノ粒子を前記被験体に投与することを含み、前記ポリマーナノ粒子に、
a)1つまたはそれを超える治療剤;および
b)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含む
ペプチド
がロードされている方法が本明細書で提供される。
チドがロードされる。
ロードされる。
心臓血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経学的障害からなる群
より選択される。
、
a)PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子
;
b)化学療法剤および/または抗癌標的薬剤;ならびに
c)NuBCP−9(配列番号1)を含むペプチドまたはMUC1(配列番号2)を含む
ペプチド
を含む治療有効量の医薬組成物を前記被験体に投与することを含む方法が本明細書で提供
される。
チドを含む。
を含む。
実施形態では、前記ポリマーナノ粒子に、約9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、
4:6、3:7、2:8または1:9の比で、パクリタキセルと、NuBCP−9(配列
番号1)を含むペプチドとがロードされている。
施形態では、ポリマーナノ粒子は、約9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6
、3:7、2:8または1:9の比で、ゲムシタビンと、NuBCP−9を含むペプチド
とがロードされる。
ノルビシン、デシタビン、イリノテカン、SN−38、シタラビン、ドセタキセル、トリ
プトライド、ゲルダナマイシン、17−AAG、5−FU、オキサリプラチン、カルボプ
ラチン、タキソテール、メトトレキセートおよびボルテゾミブからなる群より選択される
。
臓癌または血液学的悪性腫瘍である。
される薬学的治療剤の1つのみを適用する単剤療法(ポリマーナノ粒子送達系を使用する
単剤療法、または従来の手段によって薬剤を送達する単剤療法のいずれか)と比較して、
有益な効果、例えば症候の緩和、症候の進行の遅延または症候の阻害に関する相乗的な治
療効果をもたらし得るだけではなく、さらに驚くべき有益な効果、例えばより少ない副作
用、より持続的な反応、生活の質の改善、または罹患率の減少ももたらし得る。
された試験モデルによって示され得る。当業者であれば、このような有益な効果を証明す
るために関連試験モデルを十分に選択することができる。薬学的組み合わせを含むポリマ
ーナノ粒子の薬理学的活性は、例えば、臨床研究または動物モデルにおいて実証され得る
。
囲および効果のための各成分の絶対用量範囲は、異なるw/w比範囲における前記成分の
投与および処置を必要とする被験体への投薬によって最終的に測定され得る。ヒトの場合
、患者の臨床研究を行うための複雑性および費用は、相乗作用の主要モデルとしてこの形
式の試験を使用することを非現実的にし得る。しかしながら、特定の実験における相乗作
用の観察結果(例えば、実施例8を参照のこと)は、他の種における効果を予測するもの
であり得、動物モデルの存在は、相乗効果をさらに定量するために使用され得る。このよ
うな研究の結果はまた、有効用量比範囲および絶対用量および血漿濃度を予測するために
使用され得る。
は薬学的組み合わせを含むポリマーナノ粒子を含む医薬組成物またはそれらの両方は、相
乗効果を示す。本明細書で使用される「相乗効果」という用語は、例えば、癌またはその
症候の症候性進行を遅らせる効果であって、単独投与(ポリマーナノ粒子送達系を使用す
る単独投与、または従来の手段によって薬剤を送達する単独投与のいずれか)した各薬物
の効果の単純加算よりも大きな効果を生じさせる2つの薬剤(例えば、パクリタキセル、
およびNuBCP−9を含むペプチド)の作用を指す。相乗効果は、S字形Emax方程
式(Holford,N.H.G.and Scheiner,L.B.,Clin.P
harmacokinet.6:429−453(1981))、ローウェ加法性方程式
(Loewe,S.and Muischnek,H.,Arch.Exp.Patho
l Pharmacol.114:313−326(1926))および半有効方程式(
Chou,T.C.and Talalay,P.,Adv.Enzyme Regul
.22:27−55(1984))などの適切な方法を使用して計算され得る。上記で言
及されている各方程式を実験データに適用して対応するグラフを作成し、薬学的組み合わ
せの効果の評価を支援し得る。上記で言及されている方程式に関連する対応するグラフは
、それぞれ濃度−効果曲線、アイソボログラム曲線および組み合わせ指標曲線である。
リマーナノ粒子であって、各成分の用量範囲が、適切な腫瘍モデルまたは臨床研究におい
て示唆される相乗的範囲に対応するポリマーナノ粒子が本明細書で提供される。
用いられる各組み合わせパートナーの有効投与量は、用いられる特定の化合物または医薬
組成物、投与様式、処置される症状、および処置される症状の重症度に応じて変動し得る
。したがって、薬学的組み合わせを含むポリマーナノ粒子の投与レジメンは、投与経路な
らびに患者の腎機能および肝機能を含む様々な要因にしたがって選択される。
の形成において使用される組み合わせパートナー(例えば、NuBCP−9を含むペプチ
ドおよびパクリタキセル)の最適な比および濃度であって、毒性を伴わずに有効性をもた
らす最適な比および濃度は、標的部位に対する治療剤のアベイラビリティの動態に基づく
ものであり、当業者に公知の方法を使用して決定される。
って処置可能と記載されている癌の少なくとも1つと診断された被験体に特に適切であり
得る。例えば、細胞内PTX送達のための生分解性テトラブロックポリマーナノ粒子(P
TX/NP)は、PTX流出の阻害において非常に有効である。実施例9に記載されてい
るように、PTX/NPは、PTXおよびnab−パクリタキセルに対して耐性のP−g
p発現乳癌細胞に対して活性である。
くとも1つの従来の化学療法剤、例えばパクリタキセル、nab−パクリタキセル(アブ
ラキサン)、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソールによる処置に
対して不応性であることが判明している。したがって、一実施形態では、本発明の処置は
、従来の化学療法薬による1回または1回を超える処置を受けた被験体または患者であっ
て、より有効な処置を依然として必要とする被験体または患者を対象とする。特定の実施
形態では、本発明の処置は、パクリタキセルまたはnab−パクリタキセルによる処置を
受けた被験体または患者であって、より有効な処置を依然として必要とする被験体または
患者を対象とする。
パクリタキセルによる処置に対して耐性である。
クリタキセルによる処置に対して不応性である。
クリタキセルによる処置後に再発状態にある。
と、PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含む有効量のポリマー
ナノ粒子とを接触させることを含む、方法が本明細書に提供される。
。
記細胞と、PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含む有効量のポ
リマーナノ粒子とを接触させることを含む、方法が本明細書に提供される。
って、前記細胞と、PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含む有
効量のポリマーナノ粒子とを接触させることを含む、方法が本明細書に提供される。
PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーから本質的になる。
あって、前記癌細胞と、PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロックコポリマーを含
むポリマーナノ粒子とを接触させることを含み、前記ポリマーナノ粒子に第2の化学療法
薬がロードされており、P−糖タンパク質のアップレギュレーションによって、前記第1
の化学療法薬に対する前記癌細胞の前記耐性を生じさせる、方法が本明細書に提供される
。
Gテトラブロックコポリマーから本質的になる。
)を含むペプチドがロードされている。
含むペプチドがロードされている。
実施形態も可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨と範囲は、そこに含ま
れるその好ましい実施形態の説明に制限されるべきではない。
であり、本開示の範囲に対していかなる限定も制限的に意図するものではない。特に定義
がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する
分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。開示される方法および組成物の
実施に際して、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料が使用され
得るが、例示的な方法、装置および材料が本明細書に記載される。
実施例1:PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーのポリマーナノ粒子の調
製
PEG(表1)および組織培養試薬は、Sigma−Aldrich(St.Louis
,MO)から入手した。すべての試薬は分析グレードかまたはそれを超えるものであり、
特に指定がない限りそのまま使用した。細胞株は、NCCS Pune,Indiaから
入手した。95%の純度でNuBCP−9ペプチドをカスタム合成した。
PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーの調製
ポリ(乳酸)(PLA)を100mlのCH2Cl2(ジクロロメタン)に溶解した。こ
の溶液に、0.7gのPEG−PPG−PEGポリマー(分子量範囲1100〜12,5
00Mn)を添加した。この溶液を0℃で10〜12時間撹拌した。この反応混合物に、
5mlの1%N,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)溶液を添加し、続いて
、5mlの0.1%4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)を−4℃〜0℃/サブゼロ
温度で徐々に添加した。この反応混合物をさらに24時間撹拌し、続いて、ジエチルエー
テルを用いてPLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーを沈殿させ、What
manろ紙No.1を使用してろ過した。そのようにして得られたこのPLA−PEG−
PPG−PEGブロックコポリマー沈殿物を低減圧下で乾燥させ、さらなる使用まで2℃
〜8℃で保存した。
PLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子の調製
上記プロセスによって得た100mgのPLA−PEG−PPG−PEGコポリマーを有
機溶媒、例えばアセトニトリル、ジメチルホルムアミド(DMF)またはジクロロメタン
に別々に溶解して、ポリマー溶液を得た。
した。この溶液を室温で10〜12時間磁気撹拌して、残りの溶媒を蒸発させ、ナノ粒子
を安定化させた。次いで、25,000rpmで10分間遠心分離することによってナノ
粒子を収集し、蒸留水を使用して3回洗浄した。ナノ粒子をさらに凍結乾燥させ、さらな
る使用まで2℃〜8℃で保存した。
PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーのポリマーナノ粒子の特性評価
って得たナノ粒子の形状は、本質的に球状である。TEM画像により、粒径範囲が約30
〜120nmであると決定した。動的光散乱(DLS)機器を使用してナノ粒子の流体力
学半径を測定したところ、110〜120nmの範囲内である(表2)。
−PEG−PPG−PEGナノ粒子の特性は、表2に示されている。
ナノ粒子PLA−PEG−PPG−PEGのFTIRスペクトルは、図2Aに示されてい
る。FTIRは、これらの種間の差異に対して非感受性であることが判明した。したがっ
て、NMRを使用して、さらなる特性評価を行った。
EG−PPG−PEGナノ粒子のNMRスペクトルは、図3A〜Cに示されている。図中
において、約5.1の化学シフトを有するプロトンは、PLAのエステルプロトンを表し
、約3.5の化学シフトを有するプロトンは、PEG−PPG−PEGのエーテルプロト
ンを表す。スペクトルにおける両プロトンの存在は、PLAとPEG−PPG−PEGと
のコンジュゲーションを裏付けている。
実施例2:実体封入ナノ粒子の調製
薬物封入ポリマーナノ粒子の調製
よび抗癌9量体ペプチド(L−NuBCP−9、FSRSLHSLLのL−立体配置)、
16量体BH3ドメインなどのような親水性薬物の両方をロードすることができる。
ノ粒子をアセトニトリル(CH3CN)、ジメチルホルムアミド(DMF;C3H7NO
)、アセトンまたはジクロロメタン(CH2Cl2)のような5mlの有機溶媒に溶解す
る。
液に溶解し、上記ポリマー溶液に添加した。実体は、通常、ポリマーの約10〜20%重
量の重量範囲で用いられる。この溶液を250〜400rpmで簡単に10〜15秒間超
音波処理して、微細一次エマルジョンを生成する。
水相に滴下し、溶媒を蒸発させ、ナノ粒子を安定化させるために250〜400rpm、
25℃〜30℃で10〜12時間磁気撹拌する。水相は、糖添加剤をさらに含む。得られ
たナノ粒子懸濁液を開放無蓋条件下で一晩撹拌して、残りの有機溶媒を蒸発させた。10
,000gで10分間遠心分離することによって、または3000gで15分間限外ろ過
することによって、NuBCP−9封入ポリマーナノ粒子を収集する(Amicon U
ltra,Ultracel membrane、100,000NMWL,Milli
pore,USA)。ナノ粒子を蒸留水に再懸濁し、3回洗浄し、凍結乾燥させる。さら
なる使用まで、これらを2℃〜8℃で保存する。このポリマーナノ粒子は高度に安定して
おり、隠れた特徴はない。
異なる重量のコポリマーを使用して調製したポリマーナノ粒子のロード効果の比較
PLA−PEG−PPG−PEGポリマーナノ粒子を調製した。異なる分子量のPEG−
PPG−PEGポリマーを使用して合成したPLA−PEG−PPG−PEGコポリマー
を使用して、ピレンロードPLA−PEG−PPG−PEGポリマーナノ粒子を調製した
。PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーの2〜20%重量の範囲内でピレ
ンを用い、蛍光色素ロードナノ粒子を調製した。ナノ粒子の実体ロード容量は、ナノ粒子
の合成に使用したPEG−PPG−PEGポリマーの分子量に応じて変動した。表3は、
異なる分子量のブロックコポリマーを使用して生成したポリマーナノ粒子によって封入し
たイメージング分子の割合を提供する。
蛍光色素ローダミンの細胞インターナリゼーション
ナノ粒子を調製した。PLA−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーの2〜20%
重量の範囲内でローダミンを用い、蛍光色素ロードナノ粒子を調製した。
上で60%コンフルエンスまで成長させた。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PB
S)で2回洗浄し、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマ
イシンを含有する10mlのDMEM培地中で24時間培養した。次いで、成長培地を吸
引し、PBSで細胞を2回洗浄した。カバースリップに付着させた細胞にローダミンロー
ドナノ粒子を添加し、37℃で12時間インキュベートした。インキュベーション後、細
胞を洗浄し、カバースリップを取り出した。この後、PBS溶液で洗浄し、最後に、4%
パラホルムアルデヒドによって室温で20分間固定した。固定剤を除去した後、細胞を洗
浄し、DAPI(蛍光色素染色核細胞)で細胞を5分間染色し、次いで、水道水で1分間
リンスした。次いで、共焦点蛍光顕微鏡(Olympus,Fluoview FV10
00 Microscope,Japan)を使用して、カバースリップを分析した。共
焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)と併せて蛍光色素(ローダミンB)ロードナノ粒
子を使用することによって、MCF−7細胞へのナノ粒子の細胞インターナリゼーション
を確認した(図5)。
実施例3:ターゲティング部分を有する薬物封入ポリマーナノ粒子の調製
々な小分子は、本発明のポリマーナノ粒子への生体分子(ターゲティング部分として)の
コンジュゲーションに使用され得る。
PLA−PEG−PPG−PEG−リジンの調製
−NH2基をもたらした。250ml RBフラスコ中で、5gのPLA−PEG−PP
G−PEGおよび0.05gのリジンを100mlのアセトニトリル/ジクロロメタン(
1:1)に溶解し、−4〜0℃で撹拌した。この溶液に、1%N,N−ジシクロヘキシル
カルボジイミド(DCC)溶液を添加し、続いて、0.1%4−ジメチルアミノピリジン
(DMAP)を0℃で徐々に添加した。この反応混合物を24時間撹拌し、続いて、PL
A−PEG−PPG−PEG−リジンをジエチルエーテルで沈殿させ、Whatmanろ
紙No.1に通してろ過した。沈殿物を低減圧下で乾燥させ、さらなる使用まで2℃〜8
℃で保持した。
PLA−PEG−PPG−PEG−リジンからのナノ粒子の調製
0mg)をアセトニトリル(またはジメチルホルムアミド(DMF)もしくはジクロロメ
タン)に溶解した。次いで、薬物(ポリマーの約10〜20%重量)を溶液に添加し、簡
単に15秒間超音波処理して、一次エマルジョン生成した。得られた一次エマルジョンを
蒸留水(20ml)の水相に滴下し、溶媒を蒸発させ、ナノ粒子を安定化させるために室
温で10〜12時間磁気撹拌した。形成されたナノ粒子を、25,000rpmで10分
間遠心分離することによって収集し、蒸留水を使用して3回洗浄し、凍結乾燥させ、続い
て、さらなる使用のために2〜8℃で保存した。
ナノ粒子と葉酸(FA)とのバイオコンジュゲーション
し、N−(3−ジエチルアミノプロピル)−N−エチルカルボジイミド(EDC)(50
μl、400mM)およびN−ヒドロキシスクシンアミド(NHS)(50μl、100
mM)で処理し、混合物を穏やかに20分間振盪した。この後、10mMの葉酸溶液を添
加し、溶液を穏やかに30分間振盪し、続いて、アミコンフィルタを使用してろ過し、ろ
液中に残った未反応FAを除去した。葉酸コンジュゲートナノ粒子を凍結乾燥させ、続い
て、−20℃で保存した。
実施例4:PLA−PEG−PPG−PEGポリマーナノ粒子の送達可能性の評価
ポリマーナノ粒子PLA−PEG−PPG−PEGによる封入薬物のインビトロ放出
物)を封入した10mgのPLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子とを含有する混合物
を200rpm、37℃で撹拌した。異なる時間間隔において25,000rpmで6日
間遠心分離することによって、混合物の上清サンプルを収集した。各遠心分離後、ナノ粒
子を新たな緩衝液に再懸濁した。BCAキット(Pierce,USA)を使用して2m
lの上清をタンパク質評価に供して、562nmにおける分光測定で薬物放出の量を評価
した。標準検量線を用いて、薬物放出を計算した。PLA−PEG−PPG−PEGポリ
マーナノ粒子による薬物の放出は、従来のPLAナノ粒子よりも良好に制御され得ること
が観察された(図6A)。
XTT(ナトリウム2,3,−ビス(2−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホフェニル)
−5−[(フェニルアミノ)−カルボニル]−2H−テトラゾリウム内塩)アッセイ
−ビス(2−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホフェニル)−5−[(フェニルアミノ)
−カルボニル]−2H−テトラゾリウム内塩)を使用した細胞生存アッセイを行った(図
6B、7Aおよび7B)。
時間培養した。24時間後、5μM NuBCP−9ペプチドを含有する本発明のポリマ
ーナノ粒子、またはいかなるペプチドも含まない対照ナノ粒子で、各プレート中の細胞を
処置した。また、いかなる細胞透過性ペプチド(CPP)も有しない同じ濃度のNuBC
P−9ペプチドで、細胞を別々に処置した。16時間、24時間、48時間、72時間お
よび96時間の範囲の異なる時間間隔で、細胞をナノ粒子と共にインキュベートした。イ
ンキュベーション後、抗癌ペプチドNuBCP−9をロードしたPLA−PEG−PPG
−PEGナノ粒子を含有する培地を新たな培地と交換し、10μlの再構成XTT混合物
キット試薬を各ウェルに添加した。4時間培養した後、マイクロタイタープレートリーダ
ー(Bio−Rad,CA,U.S.A.)を使用することによって、サンプルの吸光度
を450nmで測定した。未処置対照の生存細胞に対する割合として細胞の増殖を決定し
、3回反復で分析した。図6Bは、時間との関連で、MCF−7細胞株の細胞生存に対す
るNuBCP−9ロードPLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子の効果を示す。図7A
は、時間との関連で、一次HUVEC細胞株の細胞生存に対する薬物NuBCP−9ロー
ドPLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子の効果を示す。
実施例5:ナノ粒子へのより高い治療剤ロードを達成するためのペプチド薬の改変
び親水性治療剤のより高いロードを達成した。エチル−ジメチルアミノプロピルカルボジ
イミドおよびN−ヒドロキシ−スクシンイミド(EDC/NHS)化学を使用し、低分子
量のPLAを使用して、ペプチド薬を改変する。実体の連結に使用したPLAの平均分子
量は、通常、約2,000〜10,000g/molの範囲内である。
解した。この溶液に、500μlのジクロロメタン中N−(3−ジエチルアミノプロピル
)−N−エチルカルボジイミド(EDC;400mM)および500μlのジクロロメタ
ン中N−ヒドロキシスクシンアミド(NHS;100mM)を添加した。混合物を穏やか
に2時間振盪し、続いて、ジエチルエーテルでPLAを沈殿させた。このPLAを「活性
化」PLAと命名した。1mmolの活性化PLAをアセトニトリルに溶解し、この溶液
に1mmolのペプチド薬NuBCP−9を添加し、反応混合物を再度穏やかに30分間
振盪した。次いで、混合物をジエチルエーテルで沈殿させ、低減圧下で乾燥させ、続いて
、さらなる使用まで−20℃で保存した。
の重量の増加と共に増加した。表4および5に示されているように、ナノ粒子の薬物ロー
ド容量はまた、薬物をポリマーナノ粒子にロードする前に、低分子量PLAを治療剤(す
なわち、NuBCP−9)にコンジュゲートすることによって顕著に増加する。本発明の
ナノ粒子の薬物ロード容量の増加は、5%〜10%である。
実施例6:ナノ粒子の安全性および毒性を評価するためのインビボ研究
ポリマーナノ粒子の毒性および安全性を評価するために、BALB/cマウスにおいて研
究を行った。
血液学的パラメータ
に静脈内注射し、対照群およびナノ粒子処置群において21日間にかけて7日間隔で血液
学的パラメータを評価した。対照群にはナノ粒子を投与しなかった。
球(RBC)数、白血球(WBC)数、好中球、リンパ球、血中血球容積、MCV(平均
赤血球容積)、MCH(平均赤血球ヘモグロビン量)およびMCHC(平均赤血球ヘモグ
ロビン濃度)の顕著な変化はなかった。
肝機能および腎機能の生化学血液アッセイ
に静脈内注射し、対照群およびナノ粒子処置群において21日間にかけて7日間隔で血液
学的パラメータを評価した。
変化はなかった。図9に見られるように、PLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子処置
群では、肝臓酵素(アラニントランスアミナーゼ(ALT)、アスパラギン酸トランスア
ミナーゼ(AST)およびアルカリホスファターゼ(ALP))のレベルの増加は無視で
きるものであった。尿素および血中尿素窒素(BUN)は、腎機能の優れた指標である。
図9に見られるように、処置マウスの尿素およびBUNレベルは、対照と比較して顕著な
変化はなかった。
PLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子で処置したマウスの器官の組織病理学
B/cマウスを処置した。21日後、動物を屠殺し、器官組織の組織学的検査を行って、
PLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子またはその分解産物によって引き起こされた毒
性による任意の組織損傷、炎症または病変を評価した。図10に示されているように、ナ
ノ粒子処置動物の脳、心臓、肝臓、脾臓、肺および腎臓では、明白な病理組織学的な異常
または病変は観察されなかった。
実施例7:インビボにおけるナノ担体系としてのPLA−PEG−PPG−PEGナノ粒
子の有効性
リッヒ腹水腫瘍(EAT)モデルトランスジェニックマウスを使用した。20gの体重を
有する動物を研究に用いた(図12A)。
ロードした。200〜1000μgのペプチドの用量で、PLA−PEG−PPG−PE
Gに封入した抗癌ペプチドNuBCP−9を含むポリマーナノ粒子(実施例2で調製した
もの)の腹腔内製剤をマウスに投与した。動物に投与した抗癌ペプチドの総重量は、30
0μg〜600μg/マウスであった。製剤の投与頻度は、21日間にわたって週2回で
あり、動物を60日間観察した。
間観察された(図11)。NuBCP−9ロードナノ粒子で処置したマウスは、対照群(
図12c)と比較して完全に腫瘍が治癒していることが見出された(図12b)。いかな
る治療剤も含まない単純ナノ粒子を対照群に投与した。
糖尿病ウサギにおける非経口デポーとしてのインスリンロードPLA−PEG−PPG−
PEGナノ粒子の評価
PLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子へのインスリンの封入
EGナノ粒子を調製した。ナノ粒子の調製のために、1gのPLA−PEG−PPG−P
EGコポリマーをアセトニトリルに溶解した。インスリン(500I.U.)を溶液に添
加し、簡単に15秒間超音波処理して、一次エマルジョン生成した。得られた一次エマル
ジョンを30mlの水相に滴下し、溶媒を蒸発させ、ナノ粒子を安定化させるために室温
で6〜8時間磁気撹拌した。21,000rpmで10分間遠心分離することによってナ
ノ粒子を収集し、蒸留水を使用して3回洗浄した。インスリンロードPLA−PEG−P
PG−PEGナノ粒子を凍結乾燥させ、さらなる使用まで4℃で保存した。
インビボ研究
の単回用量で糖尿病ウサギに皮下投与し、10日間モニタリングした。
は120〜150mg/dlで最大8日間まで維持された後、血中グルコースレベルの緩
やかな増加が観察された。薬物ロードポリマーナノ粒子は注射部位でデポーを形成し、緩
徐な分解および拡散により、封入インスリンを持続的に放出する。8日後においてさえ、
グルコースレベルは元の糖尿病レベル(500mg/dl)に戻らなかったが、これは、
1週間を超える期間にわたって生物活性インスリンを保持して持続的に放出するポリマー
ナノ粒子の能力を示している(図13)。
MUC1ロードPLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子の評価:
ポリマーナノ粒子PLA−PEG−PPG−PEGによる封入MUC1のインビトロ放出
RRRRRRRRRCQCRRKN−NH2)に連結されたMUC1細胞質ドメインペプ
チドにコンジュゲートされたローダミンBを封入した10mgのPLA−PEG−PPG
−PEGナノ粒子とを含有する混合物を200rpm、37℃で撹拌した。異なる時間間
隔において25,000rpmで6日間遠心分離することによって、混合物の上清サンプ
ルを収集した。各遠心分離後、ナノ粒子を新たな緩衝液に再懸濁した。BCAキット(P
ierce,USA)を使用して2mlの上清をタンパク質評価に供して、562nmに
おける分光測定で薬物放出の量を評価した。標準検量線を用いて、薬物放出を計算した。
PLA−PEG−PPG−PEGポリマーナノ粒子による薬物の放出は、最大60日間制
御され得ることが観察された(図14)。
XTT(ナトリウム2,3,−ビス(2−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホフェニル)
−5−[(フェニルアミノ)−カルボニル]−2H−テトラゾリウム内塩)アッセイ
−ビス(2−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホフェニル)−5−[(フェニルアミノ)
−カルボニル]−2H−テトラゾリウム内塩)を使用した細胞生存アッセイを行った。
時間培養した。24時間後、ポリアルギニン配列(RRRRRRRRRCQCRRKN)
に連結された20もしくは30μMのMUC1細胞質ドメインペプチドを含有する本発明
のポリマーナノ粒子、またはいかなるペプチドも含まない対照ナノ粒子で、各プレート中
の細胞を処置した。16時間、24時間、48時間、72時間および96時間の範囲の異
なる時間間隔で、細胞をナノ粒子と共にインキュベートした。インキュベーション後、M
UC1細胞質ドメインペプチドをロードしたPLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子を
含有する培地を新たな培地と交換し、10μlの再構成XTT混合物キット試薬を各ウェ
ルに添加した。4時間培養した後、マイクロタイタープレートリーダー(Bio−Rad
,CA,U.S.A.)を使用することによって、サンプルの吸光度を450nmで測定
した。未処置対照の生存細胞に対する割合として細胞の増殖を決定し、3回反復で分析し
た。表6は、ホルモン依存性乳癌腫細胞株MCF−7の細胞生存に対するMUC1細胞質
ドメインペプチドロードPLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子の効果を示す。
の実施形態の多くの同等物を認識し、または確認することができるであろう。このような
同等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
実施例8:ポリマーナノ粒子によって同時送達したPTXおよびL−NuBCP−9ペプ
チドの相乗効果
ブロックポリマーナノ粒子に封入して、インビトロおよびインビボで悪性細胞に対する相
乗効果を評価した。
I.材料および方法
A.PLA−PEG−PPG−PEGコポリマーの合成および特性評価:
A(Purac Chemicals,EUROPE)ならびにPoloxamer−F
127(12.5KDa)およびPoloxomer F68(6KDa);(Sigm
a−Aldrich,USA)を使用して、PLA−PEG−PPG−PEGテトラブロ
ック(terablock)コポリマーを合成した。DCC−DMAP(Sigma−A
ldrich)法によって、テトラブロックコポリマーを合成した。
pta D,Singh G,Sharma S,Bhat M,Prashant C
K,Dinda AK,Kharbanda S,Kufe D,and Singh
H.による前出の論文Cancer Research 74(12):3271−32
81,2014に報告されているように、ダブルエマルジョン溶媒蒸発法を使用して、P
LA−PEG−PPG−PEGナノ粒子へのL−NuBCP−9ペプチド(Biocon
cept,Indiaによるカスタム合成)のロードを実施した。エマルジョン溶媒蒸発
法を使用して、PTXロードナノ粒子を生産した。簡潔に言えば、5mlのアセトニトリ
ル(ACN)中の50mgのコポリマーおよび5mgのPTX(LC Laborato
ries,Boston,MA,US)を100μlのACNに溶解し、50mgのPL
A−PEG−PPG−PEGのACN溶液5mlに添加した。次いで、得られた混合物を
、蒸留水中F127から構成される20mlの水相に添加し、室温で6〜8時間撹拌して
、溶媒の蒸発およびナノ粒子の安定化を促進した。ダブルエマルジョンプロセスによって
、PTXおよびNuBCP−9ペプチドロードPLA−PEG−PPG−PEG(50m
g)ナノ粒子を調製した。溶解したPLA−PEG−PPG−PEGコポリマーにパクリ
タキセルを添加し、その直後にペプチドを添加して軽い超音波処理を行った。次いで、こ
の混合物全体を、ポロキサマーF127を含有する20mlの水相に添加した。また、P
LA−PEG−PPG−PEGナノ粒子の細胞取り込み研究のために、同じ手順によって
、ローダミン(RhB)(親水性色素として)およびクマリン6(疎水性色素として)ロ
ードナノ粒子も調製した。
てナノ粒子をろ過し、MQ水で2回洗浄して、遊離薬物/色素を除去した。ナノ粒子を凍
結乾燥させ、使用まで−20℃で保存した。ろ液を収集し、遊離NuBCP−9ペプチド
について、Micro−BCAキット(Pierce Chemicals,USA)に
よって分析し、EPOCHマイクロプレートリーダー(BioTek,US)によって5
90nmで測定した。同様に、移動相としてアセトニトリル、水、メタノール(体積比6
0:35:5)を用いて、C18カラムを使用して高速液体クロマトグラフィーHPLC
(Perkin Elmer,US)アッセイ法によって、遊離パクリタキセルを測定し
た。以下の式:
EE%=[全薬物(ペプチド/PTX)−ろ液]X100
合計(初期ペプチド/PTX)
を使用して、NuBCP−9ペプチド/PTXの封入効率(EE%)を決定した。
電子顕微鏡(TEM,Philips Model CM12)を使用して、ナノ粒子の
形態および粒径を決定した。ナノ粒子追跡分析(Malvern nanosight,
UK)によって、ナノ粒子のゼータ電位を評価した。
ナノ粒子からのNuBCP−9およびパクリタキセルのインビトロ放出速度を決定した。
簡潔に言えば、凍結乾燥ナノ粒子(10mg)のサンプルをPBSに懸濁し、150〜1
60rpmで常に振盪しながら37℃でインキュベートした。60日までの所定の時点で
、インキュベーターからサンプルを取り出し、30−kDa Amikonフィルタ(M
illipore)によって限外ろ過した。分析のためにろ液を収集し、新たな緩衝液を
各チューブに添加した。マイクロBCAアッセイキットによってろ液中のペプチド濃度を
決定し、HPLCによってPTXを測定した。
EGナノ粒子のインビトロ細胞毒性を評価した。10%FBS、100単位/mLペニシ
リンおよび100g/mLストレプトマイシンを含有するDMEM中で、ヒトER+MC
F−7およびER−MDA−MB231乳癌細胞を成長させた。実験の期間中、細胞を3
7℃および5%CO2雰囲気で維持した。指数関数的に成長している癌細胞を1ウェル当
たり細胞3000個の播種密度で96ウェルプレートにプレーティングし、24時間イン
キュベートした。遊離PTXのDMSO溶液ならびにPTX−およびNuBCP−9ロー
ド(単一/二重)PLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子を、.001、0.01、0
.1、1、5、10および20μMの最終薬物濃度でウェルに別個に添加した。細胞培地
による希釈後、培養プレートウェル中のDMSOの最終レベルは<0.1%であった。7
2時間後、製造業者の説明書にしたがってXTTベースのインビトロ細胞増殖アッセイキ
ット(Cayman,USA)によって、遊離薬物、薬物ロード単一または二重薬物PL
A−PEG−PPG−PEGナノ粒子の腫瘍細胞増殖阻害挙動を別個に評価した。Gra
ph Pad prismを使用して半有効方程式によって、半最大阻害薬物濃度(IC
50)を決定し、データは平均±SD(n=3)として示されている。
24時間成長させ、次いで、ローダミンBおよびクマリン6ロードナノ粒子と共にインキ
ュベートし、カバースリップを除去し、PBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固
定した。次いで、4,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)(Invi
trogen,US)で細胞を染色し、共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM;Oly
mpus,Fluoview FV1000 Microscope)下で視覚化した。
について、compusynソフトウェア(バージョン1.0,combosyn In
c.,U.S.)を使用して、チョウ・タラレー法に基づくCI分析を実施し、MCF−
7およびMDA−MB−231乳癌細胞に対する相乗効果、相加効果または拮抗細胞毒性
効果を決定した。
す。一定の薬物組み合わせ比で、GraphPad prismソフトウェア(バージョ
ン5.0,U.S.)を用いて、薬物組み合わせのfa(効果分率)(fraction
al affect)対CIプロットを得た(例えば、図18E、18F、18I、18
J)。
トーシスアッセイキット(Invitrogen,USA)を使用して、細胞を染色した
。定性分析のために、CLSM顕微鏡を使用して、細胞をイメージングした。FACS(
Aria LLC)を使用して、アポトーシス/壊死の定量を実施した。
USA)を用いて細胞溶解物を調製し、抗Bcl−2、抗β−チューブリン、抗カスパー
ゼ−3(Biosepses,China)、抗PARPおよび抗β−アクチン(San
ta Cruz Biotechnology,USA)を用いたイムノブロッティング
によって分析した。化学発光のソフトウェア(Li−Cor blot scanner
,USA)から、バンド強度の相対変化倍率を計算した。
〜22g)の後肢に皮下注射した。腫瘍担持マウス(約150mm3)を9群(マウス6
匹/群)に分け、21日間にわたって異なる製剤で週1回または週2回で腹腔内(i.p
.)処置した。ノギスによって腫瘍体積を決定し、式(A×B2)×0.5(式中、Aお
よびBは、それぞれ最長腫瘍径および最短腫瘍径である)を使用して計算した。病理組織
学的検査のための腫瘍を採取するために、各群から、7日目、14日目および21日目に
1匹のマウスを屠殺した。10%ホルマリン/生理食塩水で腫瘍を固定し、パラフィンに
包埋した。さらなる免疫組織化学、TUNNELおよびKi67アッセイのために、ヘマ
トキシリンおよびエオシンで5マイクロメートル切片を染色した。Graph pad
prismを使用して一元ANOVAによって、腫瘍体積の統計分析を実施した。Pri
sm 4.0ソフトウェア(Graph Pad Software)を使用してカプラ
ン・マイヤー法によって、マウスの生存を決定した。
ーデントt検定を使用して、対照群と試験群との間の差異を試験した。分析のために、少
なくとも3つのサンプルサイズを使用した。結果は、P<0.05のレベルで、対照処置
と試験処置との間で統計的に有意であるとみなした。
II.結果
A.NuBCP−9ロードポリマーナノ粒子の調製および特性評価:
び6KDaまたは12.5KDaのPEG−PPG−PEGブロックを使用して、PLA
−PEG−PPG−PEGブロックコポリマーを調製した。PLA12KPEG−PPG
−PEGおよびPLA72KPEG−PPG−PEGは15.6KDaおよび83KDa
であることが見出され、前述のように1HNMRによって、ブロック(bock)コポリ
マーの合成を確認した。
マーの形態およびサイズを分析した。SEMにより、PLA−PEG−PPG−PEGナ
ノ粒子の球形形態が示され、TEMにより、PLAが疎水性コアとして存在し、PEGが
親水性シェルとして存在し、疎水性PPGが2つの層に挟まれた多層構造が示された。粒
径は、直径45〜90nmの範囲であった(図15Aおよび15B)。
ードPLA72K−PEG−PPG−PEG12.5Kナノ粒子をMCF−7乳癌細胞と
共にインキュベートすると、蛍光共焦点レーザー走査型顕微鏡によって、3時間後にナノ
粒子の取り込みが示された(図16)。結果は、細胞質ゾル全体にわたるローダミンBお
よびクマリン6ロードナノ粒子の細胞内蛍光を示していた。これらの観察結果に基づくと
、PLAベースのNPの取り込みはエンドサイトーシスによるものであり、エンドリソソ
ームの酸性pHにおける(アニオン性からカチオン性への)表面電荷反転に関連する。こ
の電荷反転は、NPと小胞膜との相互作用を促進して一過性の局所的な膜不安定化をもた
らし、それにより、NPが細胞質ゾルに漏出する(Kumar Mら、(2014)No
vel polymeric nanoparticles for intracel
lular delivery of peptide cargos:antitum
or efficacy of the BCL−2 conversion pept
ide NuBCP−9.Cancer Res 74(12):1−11;Haseg
awa Mら、(2015)Intracellular targeting of
the oncogenic MUC1−C protein with a nove
l GO−203 nanoparticle formulation.Clin C
ancer Res 21(10):2338−2347)。
物質に変換する(Kolluri SKら、(2008)A short Nur77−
derived peptide converts Bcl−2 from a pr
otector to a killer.Cancer Cell 14(4):28
5−298)。したがって、FITC−NuBCP−9/NPでMCF−7細胞を処置し
た場合のNuBCP−9の細胞内局在を調査した。Mitotrackerによる染色に
よって明らかなように、FITC−NuBCP−9は、細胞質およびミトコンドリアに局
在した(図25)。光親和性架橋研究では、微小管(Rao Sら、(1995)Cha
racterization of the taxol binding site
on the microtubule.2−(m−Azidobenzoyl)tax
ol photolabels a peptide(amino acids 217
−231)of beta−tubulin.J.Biol.Chem.270(35)
:20235−20238;Rao Sら、(1999)Characterizati
on of the Taxol binding site on the micr
otubule.Identification of Arg(282)in bet
a−tubulin as the site of photoincorporat
ion of a 7−benzophenone analogue of Taxo
l.J.Biol.Chem.274(53):37990−37994)およびミトコ
ンドリア(Carre Mら、(2002)Tubulin is an inhere
nt component of mitochondrial membranes
that interacts with the voltage−dependen
t anion channel.J.Biol.Chem.277(37):3366
4−33669)におけるチューブリンに対するPTX結合の局在が実証されている。こ
れらのおよび上記の研究と一致して、FITC−PTX/NPおよびRhoB−NuBC
P−9/NPで処置したMCF−7細胞の共焦点分析により、細胞質ゾルおよびミトコン
ドリアにおけるPTXおよびNuBCP−9の共局在が実証された(図25)。
B.薬物ロード効率およびインビトロ放出研究
びPTXの封入率は、表7に掲載されている。PLA−PEG−PPG−PEGテトラブ
ロックコポリマーは、その高いPLA含有量(84%)により高疎水性であり、その結果
、親水性ペプチドNuBCP−9の封入は、パクリタキセル(すなわち、87%)と比較
して低かった(64.5%)。
を目的として、PLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子中にPTX−NuBCP−9ペ
プチド組み合わせを含む異なる製剤を調製した。さらに、表7に示されているように、サ
イズおよびゼータ電位について、これらの製剤を観察した。PTXの封入効率は、すべて
の製剤において>90%であると決定されたのに対して、NuBCP−9ペプチドの場合
、ペプチド量の増加と共にロードが増加した。すべての製剤の中でも、PTXおよびNu
BCP−9ペプチドの比がそれぞれ1:4の場合に最大ロードが観察され、続いて、比が
増加すると微粒子が形成される。
察された(表7)。ゼータ電位のこの減少の正確な理由は不明である;しかしながら、正
電荷の吸着ペプチドと負電荷のPLAとの相互作用により、ペプチドカルボキシル基は負
電荷を有すると思われる。PTXおよびNuBCP−9ロードPLA−PEG−PPG−
PEG NP(単一/二重)のサイズ分布は100〜170nmの範囲であり、これは、
すべての製剤においてほぼ同様であることが観察された。
びNuBCP−9のインビトロ放出プロファイルは、図17Aおよび17Bに示されてい
る。生理的pHにおけるPLA72K−PEG−PPG−PEG12.5KおよびPLA
12K−PEG−PPG−PEG6KからのPTXおよびNuBCP−9ペプチドの同時
放出は、7日以内にそれぞれ薬物の30%および40%の遅い持続的な累積放出を示した
のに対して、単一薬物としてナノ粒子にロードした場合、それはPTXでは47%であり
、ペプチドでは58%であった(図17C)。しかしながら、おそらくは低分子量PLA
のより急速な分解および生体可溶性のために、低分子量PLA12K−PEG−PPG−
PEG6KからのPTXおよびNuBCP−9(単一/二重)の完全インビトロ放出プロ
ファイルは、それぞれ7日間および10日間しか持続しなかったのと比較して、高分子量
PLA72K−PEGPPG−PEG12.5Kでは60日間であった。
能であり、(ii)PTX−NuBCP−9/NPからのPTXおよびNuBCP−9の
放出が持続することを実証している。
わたる薬物の制御持続送達のために、NuBCP−9およびPTX封入(単一および二重
)PLA72K−PEG−PPG−PEG12.5Kナノ粒子をさらに採用し、インビト
ロ研究およびインビボ研究において、生物学的活性についてさらに研究した。
C.インビトロ細胞毒性および組み合わせ分析
いて、遊離薬物および単一/二重薬物ロードナノ粒子に対するインビトロ細胞生存効果に
ついて、異なる製剤を用量依存的に研究した。図18Aに示されているように、PTX−
NuBCP−9組み合わせロードナノ粒子の1:1製剤は、他の様々な薬物製剤と比較し
て、MCF7およびMDA−MB231乳癌細胞の両方において最高の細胞増殖阻害を示
すことが観察された。したがって、さらなるインビトロおよびインインビボ研究のために
、PTX−L−NuBCP−9ロードナノ粒子の1:1製剤を使用した。
間依存性研究を96時間まで実施した。図18Bでは、PTX−NuBCP−9ペプチド
の1:1組み合わせをロードしたNPは、48時間の時点で>80%の細胞阻害を示した
。PTXロードおよびL−NuBCP−9ロード混合物は共に、約70%の阻害(これは
、遊離PTXと同程度である)を示した。しかしながら、単一ロードPTXおよびNuB
CP−9は、それぞれ40%および20%の細胞増殖阻害しか示さなかった。したがって
、48時間の時点における細胞増殖阻害によって、PTX−NuBCP−9ペプチドの1
:1組み合わせをロードしたナノ粒子の相乗効果を確認した。115μMまでの異なる濃
度で単純PLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子の細胞生存も試験したところ、85%
超であったが、これは、PLA−PEG−PPG−PEGナノ粒子の非毒性および生体適
合性を示している(図18Cおよび18D)。
、二重PTX−NuBCP−9ペプチドロードナノ粒子と比較し、細胞増殖阻害研究のた
めに評価した。48時間の時点では、二重ロードPTX−NuBCP−9ペプチドロード
NPによる90%の阻害と比較して、混合ナノ粒子は70%の阻害しか示さなかった。単
一薬物ロードナノ粒子を同じ比で混合した場合、1uMではほとんど効果がないのに対し
て、両薬物を同じナノ粒子に一緒にロードした場合、単一PTXまたはNuBCP−9ロ
ードNPよりもはるかに優れた最大相乗効果が示された。したがって、二重ロードナノ製
剤の相乗効果が確認された。
ロにおける抗腫瘍効果の増強のために非常に重要であると結論付けることができる。
合わせ指数を分析した。1未満、1または1超の組み合わせ指数(CI)値は、それぞれ
相乗作用、相加作用または拮抗作用を示す。PTX−NuBCP−9ペプチドロードナノ
粒子の1:1ナノ製剤は、遊離または単一薬物ロードナノ粒子と比較して、最良適合レベ
ルの高い相乗作用を有することが観察された(図18Eおよび18F)。これらの知見を
さらに立証するために、異なる濃度のPTX/NP、NuBCP−9/NPまたはPTX
−NuBCP−9/NPでMCF−7細胞を処置した。Compusynソフトウェアを
使用して、チョウ・タラレー法に基づくCI分析を実施した。結果は、異なる組み合わせ
のすべてが相乗的であり、CI値が<0.2であることを実証している(図18I)。M
DA−MB−231細胞を用いても同様の結果が得られたが(図18J)、これは、乳癌
腫細胞の成長および生存の阻害において、PTX−NuBCP−9/NPが相乗的である
ことを示している。
D.乳癌細胞のアポトーシスに対するNuBCP−9−PTX組み合わせロードナノ粒子
の効果:
効果に対するPTX−NuBCP−9ナノ粒子の効果を評価するために、ナノ粒子でMC
F−7細胞処置し、細胞膜におけるホスファチジルセリンのエクスターナリゼーションを
モニタリングした。アネキシンV−Alexa flour 488/PIで染色したM
CF−7細胞の共焦点画像により、PTX−NuBCP−9および単一薬物の組み合わせ
をロードしたナノ粒子による処置は、48時間の時点で、単一ロードナノ粒子よりも高い
アポトーシスをもたらし、アポトーシス応答の誘導に関連することが実証された。対照的
に、空ナノ粒子による処置は、明らかな効果を有しなかった。
により、PTX−NuBCP−9 PLA72K−PEG−PPG−PEG12.5Kナ
ノ粒子の組み合わせは、24時間の時点で、MCF−7細胞のアポトーシスの誘導に関し
て単一ロードナノ粒子よりも有効であることがさらに確認された(図19A/19B)。
スパーゼ3の切断断片およびPARPタンパク質の切断断片のレベルを調べた(図19C
)。PTX−NuBCP−9ナノ製剤の組み合わせは、いずれかの単一薬物ロードナノ粒
子のみの場合よりも、BCL−2およびチューブリンの発現レベルを減少させ、カスパー
ゼ3の切断断片およびPARPの切断断片の発現を増加させた(図19D)。これらの知
見は、PTX−NuBCP−9/NPが、MCF−7細胞のアポトーシスの誘導に関して
PTX/NPまたはNuBCP−9/NPよりも活性が高いという仮説を裏付けている。
E.インビボにおける相乗抗腫瘍効果の評価:
子のインビボ抗腫瘍効果および全身毒性を評価した。狭い尾静脈では、薬物ロードナノ粒
子の粘性懸濁液の正確な投与は困難であったので、腸間膜血管および門脈を介してナノ粒
子が全身循環に入ることを可能にする腹腔内投与経路を使用した。個別にまたは組み合わ
せでロードし、最大21日間にわたって週2回および週1回スケジュールで投与する異な
る薬物製剤でマウスを処置したところ、生理食塩水対照で得られた効果と比較して、腫瘍
成長に対する有意な効果を示した。
−PEG−PPG−PEG12.5k NPを使用して、20mg/kg週2回腹腔内注
射を与えることによって実施したところ、腫瘍体積のほぼ90%の退縮が示された。これ
と比較して、NuBCP−9−PTXの組み合わせは、腫瘍成長の完全な阻害を伴うより
良好な有効性を示し、処置全体の間に明白な腫瘍再発を示さなかった。3つのセット(二
重−、PTX−、NuBCP−9ペプチドロードNP)すべてにおいて、週2回腹腔内投
与は、週1回投与よりも有効性を示すことも観察された(図20A、20Bおよび20C
)。重要なことに、PTX/NuBCP−9ナノ粒子(単一/二重)処置マウスのいずれ
においても、体重減少または他の明白な毒性は観察されなかった。
したマウスと比較して、10mg/kg PTX/NPによる処置は、腫瘍の部分的な退
縮に関連していた(図22)。また重要なことに、10mg/kg PTX−NuBCP
−9/NPによる処置は、長期の完全腫瘍退縮に関連していた(図22)。カプラン・マ
イヤープロットによって決定した生存の分析により、PTX−NuBCP−9/NPで処
置したマウスは、空NP、PTX/NPまたはNuBCP−9/NPで処置したマウスよ
りも顕著に長く生存することがさらに実証された(図23)。高い抗腫瘍効果および低い
薬物関連毒性により、二重薬物ロード系は、癌処置において有望である。薬物組み合わせ
の原理は、より低い薬物用量で効率的な抗腫瘍効果を達成し、マイナスの副作用を減少さ
せながら最大の治療効果を得ることである。
F.組織学的および免疫組織化学的分析:
lb/Cマウスを屠殺し、腫瘍を解剖し、病理学的分析のためにH&EおよびTUNEL
で染色した。PBS、NuBCP−NP、PTX−NPおよびCo−NP処置群のデータ
を図21に示した。
する大きな核を有していた。壊死細胞は明確な細胞形態を有していなかったのに対して、
クロマチンは、より暗色で濃縮していたか、または細胞外では欠如していた。図7に示さ
れているように、PBS群では、正常な形状およびより多くのクロマチンを有する腫瘍細
胞が観察されたが、これは、活発な腫瘍成長を示している。しかしながら、単一ロードP
TXまたはNuBCP 9 NP処置群では、広範囲の組織壊死が観察された。しかしな
がら、Co−NP処置群では、NuBCP−9−NPおよびPTX−NPで処置した群と
比較して、腫瘍の完全な退縮を示す正常な筋組織が示されなかったが、これは、Co−N
P処置群では、ほとんどの腫瘍細胞が壊死性であることを示していた。
た。PBS処置腫瘍組織では、アポトーシスはほとんど検出されなかった。一方、NuB
CP−9−NP、PTX−NPおよびCo−NP処置群では、明白な細胞アポトーシス領
域が観察された。H&E分析と一致して、Co−NPの処置は、単一薬物ロードナノ粒子
と比較してアポトーシスレベルを明らかに増加させた。
III.考察
リタキセルの主な臨床的限界は、長期処置後の神経毒性および細胞耐性である。NuBC
P−9ペプチドは、BCL−2媒介性アポトーシスの二重効果を有する新規エピジェネテ
ィック剤である、Cancer Cell 2008;14:285−298。実施例8
は、ナノ粒子によって送達した場合に、パクリタキセルおよびNuBCP−9が、2つの
異なる乳癌細胞株(MCF−7およびMDA−MB−231)の成長に対して顕著な相乗
的阻害効果を有することを実証している。NuBCP−9およびPTXのIC50は、こ
れら2つの薬剤を組み合わせて使用した場合に劇的に減少する。結果は、これら2つの薬
物を組み合わせることによって、臨床的有効性を維持または増強しながら、PTXの副作
用を大幅に減少させることが可能であることを示唆している。
−PEG12.5k/6K NPを用いて異なる分子量のPLA72KDa/12KDa
で一緒にパクリタキセル、NuBCP−9およびPTX−NuBCP−9ナノ粒子のロー
ド量を決定し、それらのインビトロ放出特性を調査した。異なるPLA−PEG−PPG
−PEG NPを用いたPTXおよびNuBCP−9の平均ロード度合(loading
degrees)は、表7に掲載されている。表7に示されているように、ロード薬物に
かかわらず、高分子量PLA−PEG−PPG−PEG NPのロード度合は、対応する
低分子量PLA−PEG−PPG−PEG NPよりも常に高かった。さらに、個々の薬
物分子のロード度合は、二重薬物ロード(PLA12K−PEG−PPG−PEG−PT
X−PEPおよびPLA72K−PEG−PPG−PTX−PEP)では、単一薬物ロー
ド(PLA10KPEG−PPG−PEG−PTX/PLA10KPEG−PPG−PE
G−PEPおよびPLA72K−PEG−PPG−PTX/PLA72K−PEG−PP
G−PEP)の場合よりも低かった。したがって、ロード度合の差異は、ペイロード間の
静電引力および疎水性力の異なる強度に起因する可能性がある。
uBCP−9ペプチドのロードに起因する可能性があり、これが、NPからのNuBCP
−9のわずかな放出をもたらした可能性がある。類似物質は溶け合うという理論にしたが
えば、疎水性の性質により、PTXはペプチドよりも多くのPLAの疎水性コアを捕捉し
、さらにPTXは立体障害も引き起こし、その結果単一薬物ロードと比較して低いロード
度合がもたらされた。他方、二重薬物ロードPLA−PEG−PPG−PEG NPの全
ロード度合は、単一薬物ロードのものよりも高かった。これはおそらく、PTXをロード
した後に、PLA−PEG−PPG−PEG NPの細孔が不完全に充填されたことに起
因する可能性がある。加えて、すべての細孔がPTXで充填または遮断された場合であっ
ても、ペプチドはまた、ペプチドの疎水性部分と粒子の表面との間の疎水性相互作用を介
して、PTXロードPLA−PEG−PPG−PEG NPの外表面に吸着することがで
きた。静電気引力もまた、もっともらしい説明である。NuBCP−9の等電点は約pH
7.2であるが、これは、ロード過程中に、水中のペプチドが当然正に帯電することを意
味する。PTXロードPLA−PEG−PPG−PEG(−3.21±1.5mV)は負
に帯電したので、PTXを最初にロードして細孔へのペプチド拡散を防止したとしても、
ペプチドは、静電引力によってもPLA−PEG−PPG−PEG粒子表面上に吸着する
ことができた。
からのPTXおよびNuBCP−9ペプチドの放出プロファイルは、図3に示されている
。ペプチドおよびPTX(単一または二重)は、60日まで高分子量PLA−PEG−P
PG−PEGナノ粒子から徐々に放出され得るのに対して、薬物の沈殿またはコポリマー
のより急速な分解により、低分子量PLA−PEG−PPG−PEG粒子は安定性を示す
ことができなかった。
前述のように、NuBCP−9はBCL−2カスケードに結合し、それにより、このタン
パク質をアポトーシス促進性から抗アポトーシス性に変換するのに対して、PTXは微小
管の分解を阻害し得、有糸分裂および細胞増殖に必要な微小管ネットワークの正常な動的
再構成を妨げ、そして細胞アポトーシスを引き起こす。PTXはBCL−2に直接結合し
、Nur77の活性を機能的に模倣することも報告された。報告されているように、同じ
細胞経路を有する複数の薬物は、より高い治療有効性およびより高い標的選択性のために
相乗的に機能し得る。
同様に作用するが、同じビヒクルで両治療剤を同時送達して同時に作用させた場合、最高
の相乗効果が達成された(図18Gおよび18H、右のパネル)。インビトロ研究によれ
ば、他の薬物比を使用した場合、相乗効果は効率的に示され得ず、2つの薬物の互いにバ
ランスの取れた投与量が最高の腫瘍有効性をもたらした。
BCP−9 NpのIC50が劇的に減少し、通常のパクリタキセルと比較して約40お
よび4倍の差異であることが示されている(表8)。したがって、同時処置は、パクリタ
キセルの細胞毒性を強化する能力を示唆しており、臨床的有効性を拡大する可能性を提供
する。
送達することの相乗効果が実証された。アポトーシス促進性BCL−2およびチューブリ
ンの発現は、組み合わせNuBCP−9−PTXロードNpでは、単一薬物のみの場合と
比較して顕著に減少する。これらの生化学的データにより、アポトーシスおよび細胞周期
停止に対する2つの薬剤の相乗効果の機構の根拠が提供された。
いくつかの重要なアポトーシス関連タンパク質の発現をアッセイした。この研究では、カ
スパーゼ−3およびPARPタンパク質のレベルは、二重薬物ロードNP群では、単一ロ
ード群と比較して顕著に上昇していた。切断PARPは、内因性アポトーシス経路に決定
的に関与し、アポトーシスのマーカーであると考えられる。
縮が示された。インビボにおいて、二重薬物ロードNPを注射したマウスの腫瘍体積は、
単一ロードNPで処置したマウスの腫瘍体積と比べてほぼ消失しており、Np/生理食塩
水のみがマウスの腫瘍体積に影響を与えなかった(図20A〜C)。これらの結果により
、二重薬物ロードNPがより顕著な抗腫瘍活性を示すことが示された。さらに、二重/単
一ロードNPは、最大60日間の持続的な制御放出によって、薬物を腫瘍細胞に有効に送
達すると推測され得る。さらに重要なことに、単一/二重Npの投与は忍容性良好であり
、体重減少または明白な毒性の証拠はなかった。これらの結果は、二重ロードナノ製剤に
よって用量を減少させて腫瘍組織縮小を増強することの実行可能性を支持し得る。
IV.結論
−PPG−PEGコポリマーを有するポリ乳酸(PLA)テトラブロックを開発した。高
分子量PLA−PEG−PPG−PEGのロバストな構造安定性、効率的な送達能力、優
れた生体適合性および良好なサイズ分布は、癌処置において腹腔内注射を介して抗腫瘍薬
を送達するための大きな可能性を示した。Co−NPは、MCF−7の抑制およびトリプ
ルネガティブMDA−MB231乳癌細胞の成長において相乗効果を有していた。Co−
NPは、インビボにおいて高い腫瘍集積、優れた抗腫瘍効率および非常に低い毒性を示し
た。本研究は、同時送達系が、乳癌およびおそらくは他の種類の癌の処置における併用療
法として有望なプラットフォームを提供することを示している。
して耐性のMCF−7細胞に対して活性である。
小管阻害剤である。PTXはまた、アルブミン結合ナノ粒子製剤(nab−パクリタキセ
ル;アブラキサン)で投与される。しかしながら、PTXの有効性は、薬物排出ポンプ、
例えばP−糖タンパク質(P−gp)および抗アポトーシスBCL−2タンパク質のアッ
プレギュレーションによって伝達される耐性機構によって制限される。本明細書に記載さ
れる細胞内PTX送達のための生分解性テトラブロックポリマーナノ粒子(PTX/NP
)は、PTX流出の阻害において非常に有効である。具体的には、PTX/NPは、PT
Xおよびnab−パクリタキセルに対して耐性のP−gp発現乳癌細胞に対して活性であ
る。これらのナノ粒子は、抗アポトーシスBCL−2タンパク質を細胞保護物質から細胞
殺傷物質に変換するNuBCP−9ペプチド(NuBCP−9/NP)を全身送達するた
めに使用されている。PTX IC50の40倍の減少およびアポトーシス応答の増強に
よって明らかなように、PTXおよびNuBCP−9の両方を含有するNP(PTX−N
uBCP−9/NP)による乳癌細胞の処置は、インビトロで乳癌細胞に対して著しく相
乗的である。PTX−NuBCP−9/NPによる同系エールリッヒ乳房腫瘍モデルマウ
スの処置もまた、PTX/NPおよび/またはNuBCP−9/NPのいずれかで得られ
たものよりも顕著に有効であった(実施例8を参照のこと)。これらの結果は、nab−
パクリタキセル耐性の状況でPTX/NPが活性であり、PTX−NuBCP−9/NP
でNuBCP−9と同時送達すると、PTXの活性が相乗的に増加することを実証してい
る。これらの知見はまた、P−gp基質でありおよび/またはBCL−2過剰発現によっ
て阻害される他の細胞毒性剤の活性を増強するために、このプラットフォームが広く適用
可能であり得るという考えを裏付けている。
見により、これらのNPが、PTX耐性細胞に対して有効であり得るという可能性がもた
らされた。したがって、漸増PTX濃度への曝露によって、PTXに対して耐性のMCF
−7細胞が生じた(表9)。注目すべきことに、MCF−7/PTX−R細胞もnab−
パクリタキセルに対して耐性であったが、PTX/NPに対して耐性ではなかった(表9
)。PTX/NPに対するMCF−7/PTX−R細胞の感受性の機構的根拠を明らかに
するために、P−gp発現について野生型およびPTX耐性MCF−7細胞を分析したと
ころ、以前の報告(Brown Tら、(1991)J.Clin.Oncol.9(7
):1261−1267;Wiernik PHら、(1987)Cancer Res
47(9):2486−2493;Wiernik PHら、(1987).J.Cl
in.Oncol.5(8):1232−1239)と一致して、耐性はP−gpのアッ
プレギュレーションに関連することが見出された(図27A)。P−gp過剰発現と協調
して、細胞内FITC−PTXは、MCF−7/PTX−Rでは、野生型MCF−7細胞
と比較して顕著に減少していた(図27B)。また印象的なことに、FITC−PTX/
NPによるMCF−7/PTX−R細胞の処置は、FITC−PTXの細胞内保持に関連
していたが(図27B)、これは、これらのポリマーNPがPTX流出を阻害するという
考えを裏付けている。(i)アネキシンV/PI染色(図27C)、(ii)FLOW分
析による定量(図27D)ならびに(iii)カスパーゼ−3およびPARP切断(図2
7E)によって明らかなように、PTXまたはnab−パクリタキセルではなくPTX/
NPによるMCF−7/PTX−R細胞の処置もアポトーシスの誘導に関連していた。M
CF−7/PTX−R細胞では、P−gpおよびBCL−2がアップレギュレートされて
いるという観察結果により、PTX活性を十分に増強するためには、両方の潜在的PTX
耐性機構をターゲティングすることが必要であり得ることが示唆された。したがって、P
TX−NuBCP−9/NPでMCF−7/PTX−R細胞を処置したところ、IC50
は10.3nMであり、PTX/NPで得られたものよりも5倍低いことが見出された(
表9)。加えて、PTX−NuBCP−9/NPによるMCF−7/PTX−R細胞の処
置は、P−gpおよびBCL−2レベルの大幅な阻害に関連していた(図27F)。
2をターゲティングし、PTX耐性を有効に打ち消すことによって、PTXの細胞内レベ
ルを増加させるというモデルの証拠が提供された。
表のリスト
表1は、PLA−PEG−PPG−PEGコポリマーの調製に使用したPEG−PPG
−PEGブロックコポリマーの詳細を提供する。
P−9のロード率を提供する。
ク質導入ドメインに連結されたMUC1細胞質ドメインペプチドの増殖研究から得られた
データを提供する。(*は、1mg/ウェルの濃度を示す)
L−NuBCP−9とを組み合わせることにより、PTXの有効用量が実質的に38倍(
38nMから1nMに)減少することを実証している。NuBCP−9用量も3600n
Mから12nMに減少する(約300倍の減少)。
クリタキセル、PTX/NPおよびPTX−NuBCP−9/NPのIC50値を示す。
配列番号1:NuBCP−9、配列FSRSLHSLL
Phe Ser Arg Ser Leu His Ser Leu Leu
配列番号2:MUC1ペプチド、配列CQCRRKN、MUC1−CDドメイン由来の配
列
Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn
配列番号3:GO−203−2c、配列RRRRRRRRRCQCRRKN、ポリアルギ
ニンに共有結合したMUC1−CDドメイン由来の配列
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
Arg Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn
配列番号4:MUC1−CD突然変異体配列、配列AQARRKN、MUC1−CDドメ
イン由来の改変配列
Ala Gln Ala Arg Arg Lys Asn
配列番号5:CP−3、配列RRRRRRRRRAQARRKN、ポリアルギニンに共有
結合したMUC1−CDドメイン由来の改変配列
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg A
rg Ala Gln Ala Arg Arg Lys Asn
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- 本明細書に記載の発明。
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