JP2018536655A - ポリマーナノ粒子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、薬学的な組み合わせを含むポリマーナノ粒子と、それを含む医薬組成物と、特定の疾患を処置するための方法であって、これらのポリマーナノ粒子をそれを必要とする被験体に投与することを含む方法とに関する。上記意訳組成物は、ａ）ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子；ｂ）１つまたはそれを超える化学療法剤または抗癌標的薬剤；およびｃ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドを含み得る。

Description

関連出願
本出願は、２０１５年１１月３日に出願された米国仮出願番号第６２／２５０，１３７号、および２０１６年７月５日に出願された米国仮出願番号第６２／３５８，３７３号に基づく優先権を主張しており、これら仮出願の内容は、それら全体が本明細書中に参考として援用される。
発明の分野
本発明は、ナノテクノロジーの分野、特に治療剤を送達するための生分解性ポリマーナノ粒子の使用に関する。
背景
癌は最も壊滅的な疾患の１つであり、それは様々な遺伝子変化および細胞異常を伴う。この複雑性および不均質性は、癌細胞の侵襲的な成長を促進して、患者の顕著な罹患率および死亡率をもたらす（Ｄａｓ，Ｍ．ら、（２００９）Ｌｉｇａｎｄ−ｂａｓｅｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓｓｕｅ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．６，２８５−３０４；Ｍｏｈａｎｔｙ，Ｃ．ら、（２０１１）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．８，４５−５８）。乳癌は、最も多く診断される癌の１つであり、女性の第２位の死亡原因である。パクリタキセル（「ＰＴＸ」）は、乳癌および他の固形腫瘍の処置において広く使用される化学療法薬である（Ｈｏｌｍｅｓ Ｆ．ら、Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔａｘｏｌ，ａｎ ａｃｔｉｖｅ ｄｒｕｇ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．１９９１，８３（２４）：１７９７−１８０５；Ｂｒｏｗｎ Ｔ．ら、Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔａｘｏｌ ｇｉｖｅｎ ｂｙ ａ ６−ｈｏｕｒ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｆｕｓｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９１，９（７）：１２６１−１２６７；ＭｃＧｕｉｒｅ Ｗ．ら、Ｔａｘｏｌ：ａ ｕｎｉｑｕｅ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｏｖａｒｉａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１９８９，１１１（４）：２７３−２７９）。それは、集合チューブリンに結合すると微小管の分解を阻害し、微小管を重合状態に固定して（Ｊｏｒｄａｎ Ｍ．，Ｋａｍａｔｈ Ｋ．：Ｈｏｗ ｄｏ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇｓ ｗｏｒｋ？ Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２００７，７（８）：７３０−７４２）、細胞周期の停止をもたらす（Ｆｕｃｈｓ Ｄ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｒ．：Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔａｘｏｌ，ａｎ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ，ａｃｔｓ ａｓ ａ ｍｉｔｏｔｉｃ ｓｐｉｎｄｌｅ ｐｏｉｓｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．．Ｒｅｐ．１９７８，６２（８）：１２１９−１２２２；Ｓｃｈｉｆｆ Ｐ．，Ｈｏｒｗｉｔｚ ＳＢ：Ｔａｘｏｌ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８０，７７（３）：１５６１−１５６５；Ｓｃｈｉｆｆ Ｐ．，Ｈｏｒｗｉｔｚ Ｓ．：Ｔａｘｏｌ ａｓｓｅｍｂｌｅｓ ｔｕｂｕｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｒ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８１，２０（１１）：３２４７−３２５２；Ｓｃｈｉｆｆ Ｐ．ら、Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｔａｘｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９７９，２７７（５６９８）：６６５−６６７）。パクリタキセルはまた、抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ−２を阻害し、癌細胞のアポトーシスを誘導する（Ｈａｌｄａｒ Ｓ．ら、Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＣＬ−２ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５，９２（１０）：４５０７−４５１１）。パクリタキセルは非常に有効な抗腫瘍剤であるが、その高用量および反復処置は高い細胞毒性および薬剤耐性をもたらし得、患者における長期使用を制限する（Ｂｒｏｗｎ Ｔ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９１，９（７）：１２６１−１２６７；Ｗｉｅｒｎｉｋ Ｐ．ら、Ｐｈａｓｅ Ｉ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔａｘｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８７，４７（９）：２４８６−２４９３；Ｗｉｅｒｎｉｋ Ｐ．ら、Ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔａｘｏｌ ｇｉｖｅｎ ａｓ ａ ２４−ｈｏｕｒ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｅｖｅｒｙ ２１ ｄａｙｓ：ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９８７，５（８）：１２３２−１２３９）。
最初、ＰＴＸは、ポリオキシエチル化ヒマシ油からなる溶媒系製剤（これは、臨床的に顕著な過敏性反応に関連していた）で、乳癌処置のために開発された。ｎａｂ−パクリタキセル（アブラキサン）は、ＰＴＸが無溶媒アルブミンＮＰに封入された第２世代製剤である（Ｙａｒｄｌｅｙ ＤＡら、（２０１３）Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｐｈａｓｅ ＩＩ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ ｉｎ ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｌｏｃａｌｌｙ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｏｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ ｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｒｏｍａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３１（１７）：２１２８−２１３５）。ｎａｂ−パクリタキセルは、過敏性反応を部分的に回避することによって、ＰＴＸよりも高用量で送達され得る（Ｉｂｒａｈｉｍ ＮＫら、（２００５）Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ＡＢＩ−００７，ａｎ ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｏｕｎｄ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，ｉｎ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ ２３（２５）：６０１９−６０２６；Ｙａｒｄｌｅｙ ＤＡら、（２０１３），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ ３１（１７）：２１２８−２１３５）。加えて、ｎａｂ−パクリタキセルは、乳癌を有する患者の処置においてＰＴＸよりも有効であることが見出された（Ｇｒａｄｉｓｈａｒ ＷＪら、（２００５）Ｐｈａｓｅ ＩＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｏｕｎｄ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ−ｂａｓｅｄ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ ２３（３１）：７７９４−７８０３；Ｂｌｕｍ ＪＬら、（２００７）Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｗｅｅｋｌｙ ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｏｕｎｄ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｈｅａｖｉｌｙ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔａｘａｎｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ７（１１）：８５０−８５６；３０；Ｇｒａｄｉｓｈａｒ ＷＪら、（２０１２）Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｎａｂ−ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ａｓ ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｆｉｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｃｌｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ １２（５）：３１３−３２１）。したがって、乳癌ならびにＮＳＣＬＣおよび膵臓癌の処置に関するｎａｂ−パクリタキセルの承認は、ＮＰ製剤でＰＴＸを送達することの有効性によって裏付けられた。しかしながら、局所再発性または転移性乳癌の第１選択処置としてのＰＴＸおよびｎａｂ−パクリタキセルの無増悪生存は、それぞれ１１カ月間および９．３カ月間であり（Ｒｕｇｏ ＨＳら、（２０１５）Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｐｈａｓｅ ＩＩＩ Ｔｒｉａｌ ｏｆ Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ Ｏｎｃｅ Ｐｅｒ Ｗｅｅｋ Ｃｏｍｐａｒｅｄ Ｗｉｔｈ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｌｂｕｍｉｎ−Ｂｏｕｎｄ Ｎａｂ−Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ Ｏｎｃｅ Ｐｅｒ Ｗｅｅｋ ｏｒ Ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ Ｗｉｔｈ Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ Ａｓ Ｆｉｒｓｔ−Ｌｉｎｅ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｌｏｃａｌｌｙ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｏｒ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ：ＣＡＬＧＢ ４０５０２／ＮＣＣＴＧ Ｎ０６３Ｈ（Ａｌｌｉａｎｃｅ）．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．３３（２１）：２３６１−２３６９）、耐性の発現を回避するより有効な治療の必要性を強調している。
ＰＴＸは、主にＡＢＣファミリーのトランスポーターの過剰発現によって、多剤耐性（ＭＤＲ）表現型を誘導する（Ｂａｒｂｕｔｉ ＡＭ＆Ｃｈｅｎ ＺＳ（２０１５）Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ａｇｅｓ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ Ｉｔｓ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）７（４）：２３６０−２３７１；Ｚｈａｏ Ｙ，Ｍｕ Ｘ，＆Ｄｕ Ｇ（２０１５）Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ：Ｎｅｗ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．）。ＡＢＣトランスポーターのサブクラスの中でも、Ｐｇｐ１（ＡＢＣＢ１、ＭＤＲ１）の過剰発現は、ＰＴＸ耐性の主要機構に相当する（Ｂａｒｂｕｔｉ ＡＭ＆Ｃｈｅｎ ＺＳ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）７（４）：２３６０−２３７１；Ｚｈａｏ Ｙ，Ｍｕ Ｘ，＆Ｄｕ Ｇ（２０１５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．）。しかしながら、長年の研究にもかかわらず、許容され得ない毒性を伴わずにＰＴＸの有効性を増加させるＰ−ｇｐ阻害剤の開発における進歩は限定的であった（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ ＭＭ，Ｆｏｊｏ Ｔ，＆Ｂａｔｅｓ ＳＥ（２００２）Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２（１）：４８−５８）。
パクリタキセル癌処置に関連する問題に対処するために、診療所では併用療法が採用されている。パクリタキセルと、シスプラチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）またはゲムシタビンのような１つまたはそれを超える薬剤とを組み合わせることによって、高用量に関連する化学療法耐性および副作用は、異なる生物学的シグナル伝達経路を相乗的に相殺して、各化合物の低投与量を可能にすることによって克服され得る。異なる分子標的を有する複数の薬物の適用は、癌細胞突然変異の克服に必要な遺伝的バリアを作り、それにより、癌の適合プロセスを遅延させ得る。同じ細胞経路をターゲティングする複数の薬物は、より高い治療有効性およびより高い標的選択性のために相乗的に機能し得ることも実証されている（Ｌｅｈａｒ Ｊ．ら、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｔｅｎｄ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（７），６５９−６６６（２００９））。ナノテクノロジーは、スマート薬物送達系を提供することによって、癌治療における大幅な進歩をもたらし得る。
しかしながら、低いバイオアベイラビリティおよび標的部位における薬物の最適な生体内分布のために、従来の併用療法は、癌について成功が証明されていない。Ｗａｎｇらは、ステアレートをグラフトしたキトサンオリゴ糖（ＣＳＯ−ＳＡ）のミセルを使用して、パクリタキセル（ＰＴＸ）およびドキソルビシンの同時投与を示した（Ｚｈａｏ，Ｍ．ら、Ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００９，２０，０５５１０２）。別の研究では、ビンクリスチン（ＶＣＲ）およびベラパミル（ＶＲＰ）の同時送達のために、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド酸）（ＰＬＧＡ）のナノ粒子が用いられた（Ｓｏｎｇ，Ｘ．ら、ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ ａｎｄ ｖｅｒａｐａｍｉｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２００８，３５，３２０−３２９）。ケルセチンおよびＶＣＲのためのリポソーム送達製剤も開発された（Ｗｏｎｇ，Ｍ．−Ｙ．；Ｃｈｉｕ，Ｇ．Ｎ．Ｃ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ａｎｄ ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ２０１０，２１，４０１−４１０）。しかしながら、化学療法薬の組み合わせにより、これらの製剤は依然として高い毒性を示した。
生体分子は、より低い毒性およびより良好な治療有効性のために、化学療法薬と一緒に研究で採用されている。Ｋｗｏｎらは、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ）ミセルが、ＰＴＸ／１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）の組み合わせを含む複数の薬物を送達し得ることを報告した（Ｋｗｏｎ，Ｇ．Ｓ．ら、Ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｌｏａｄｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｏｒｌｙ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００９，１４０，２９４−３００）。ＢＣＬ−２標的ｓｉＲＮＡと共にカチオン性コアシェルナノ粒子を使用したＰＴＸが、乳癌処置について報告されている。Ｓｕｇａｈａｒａらは、ｉＲＧＤ（腫瘍透過性ペプチド）と異なる種類の抗癌薬との同時投与が、腫瘍成長および腫瘍蓄積の阻害において有効であることを示した（Ｓｕｇａｈａｒａ ＫＮら、Ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔｕｍｏｒ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０；３２８：１０３１−１０３５）。このような組み合わせでは、化学療法薬の有効細胞毒性用量は劇的に減少し、同時に有害事象も減少するので、この戦略は、生体分子と共に単一化学療法薬を使用する優れたアプローチである（Ｗａｎｇ Ｓ．Ｚ．ら、ＴＲＡＩＬ ａｎｄ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｎｄ Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ Ｓｏｆｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓａｒｃｏｍａ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０；１６：２５９１−２６０４；Ｈｏｓｓａｉｎ ＭＡら、Ａｓｐｉｒｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２０１２；４０：１６３６−１６４２；Ｊｉｎ Ｃ．ら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ａｎｄ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．２０１０；１３６：２６７−２７４）。
さらに、分子標的療法は、癌処置における従来の化学療法薬の特異性の欠如を克服する有望な手段として登場した。癌治療における合成ペプチド薬は、従来のタンパク質と比較して高い特異性、安定性および合成容易性を示す。しかしながら、標的部位へのこれらの抗癌ペプチドの送達は、酵素分解、免疫原性および血液中での短い寿命などの要因による大きな問題を引き起こす。送達系が、血液循環中におけるその体積または活性の損失を最小化して体内の障壁の透過によって所望の腫瘍組織に達し、腫瘍細胞を選択的に死滅させることができる場合、抗癌薬の標的送達はより有効であろう。これは、薬物の細胞内濃度を増加させ、それと同時に用量制限毒性を減少させることによって、患者の生存および生活の質を改善するであろう。ペプチド薬の送達戦略の１つは、薬物を細胞質ゾルに直接送達するために、ペプチドを細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）にコンジュゲートすることを伴う。しかしながら、ＣＰＰとのコンジュゲーションはペプチド薬の費用を増加させ、ペプチド薬の有効性および安定性を減少させ、いくつかの場合では毒性を増加させ得る。ＮｕＢＣＰ−９およびＢａｘ−ＢＨ３のようないくつかのペプチド治療剤は、癌性細胞に対する選択的結合を示し、アポトーシスを開始させる。残念ながら、ペプチド治療剤の遊離薬物製剤は、ペプチドの大量使用および頻繁な投与を必要とし、それにより、治療の費用および不便さを増加させる。
治療用ペプチドなどの治療剤を単独で、または化学療法剤などの他の治療剤と組み合わせて癌性細胞に有効に送達し得る送達系に対する緊急の必要性が存在する。さらに、伝統的な化学療法薬、例えばパクリタキセルまたはｎａｂ−パクリタキセルに対して耐性の癌を処置することができる送達系に対する必要性が存在する。
Ｄａｓ，Ｍ．ら、（２００９）Ｌｉｇａｎｄ−ｂａｓｅｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓｓｕｅ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．６，２８５−３０４ Ｍｏｈａｎｔｙ，Ｃ．ら、（２０１１）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．８，４５−５８ Ｈｏｌｍｅｓ Ｆ．ら、Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔａｘｏｌ，ａｎ ａｃｔｉｖｅ ｄｒｕｇ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．１９９１，８３（２４）：１７９７−１８０５ Ｂｒｏｗｎ Ｔ．ら、Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔａｘｏｌ ｇｉｖｅｎ ｂｙ ａ ６−ｈｏｕｒ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｆｕｓｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９１，９（７）：１２６１−１２６７ ＭｃＧｕｉｒｅ Ｗ．ら、Ｔａｘｏｌ：ａ ｕｎｉｑｕｅ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｏｖａｒｉａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ．Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１９８９，１１１（４）：２７３−２７９ Ｊｏｒｄａｎ Ｍ．，Ｋａｍａｔｈ Ｋ．：Ｈｏｗ ｄｏ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇｓ ｗｏｒｋ？ Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２００７，７（８）：７３０−７４２ Ｆｕｃｈｓ Ｄ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｒ．：Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔａｘｏｌ，ａｎ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ，ａｃｔｓ ａｓ ａ ｍｉｔｏｔｉｃ ｓｐｉｎｄｌｅ ｐｏｉｓｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．．Ｒｅｐ．１９７８，６２（８）：１２１９−１２２２ Ｓｃｈｉｆｆ Ｐ．，Ｈｏｒｗｉｔｚ ＳＢ：Ｔａｘｏｌ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８０，７７（３）：１５６１−１５６５ Ｓｃｈｉｆｆ Ｐ．，Ｈｏｒｗｉｔｚ Ｓ．：Ｔａｘｏｌ ａｓｓｅｍｂｌｅｓ ｔｕｂｕｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｒ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８１，２０（１１）：３２４７−３２５２ Ｓｃｈｉｆｆ Ｐ．ら、Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｔａｘｏｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９７９，２７７（５６９８）：６６５−６６７ Ｈａｌｄａｒ Ｓ．ら、Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＣＬ−２ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５，９２（１０）：４５０７−４５１１ Ｂｒｏｗｎ Ｔ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９１，９（７）：１２６１−１２６７ Ｗｉｅｒｎｉｋ Ｐ．ら、Ｐｈａｓｅ Ｉ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔａｘｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８７，４７（９）：２４８６−２４９３ Ｗｉｅｒｎｉｋ Ｐ．ら、Ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔａｘｏｌ ｇｉｖｅｎ ａｓ ａ ２４−ｈｏｕｒ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｅｖｅｒｙ ２１ ｄａｙｓ：ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９８７，５（８）：１２３２−１２３９ Ｙａｒｄｌｅｙ ＤＡら、（２０１３）Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｐｈａｓｅ ＩＩ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ ｉｎ ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｌｏｃａｌｌｙ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｏｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ ｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｒｏｍａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３１（１７）：２１２８−２１３５ Ｉｂｒａｈｉｍ ＮＫら、（２００５）Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ＡＢＩ−００７，ａｎ ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｏｕｎｄ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，ｉｎ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ ２３（２５）：６０１９−６０２６ Ｙａｒｄｌｅｙ ＤＡら、（２０１３），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ ３１（１７）：２１２８−２１３５ Ｇｒａｄｉｓｈａｒ ＷＪら、（２００５）Ｐｈａｓｅ ＩＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｏｕｎｄ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ−ｂａｓｅｄ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ ２３（３１）：７７９４−７８０３ Ｂｌｕｍ ＪＬら、（２００７）Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｗｅｅｋｌｙ ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｏｕｎｄ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｈｅａｖｉｌｙ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔａｘａｎｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ７（１１）：８５０−８５６；３０ Ｇｒａｄｉｓｈａｒ ＷＪら、（２０１２）Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｎａｂ−ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ａｓ ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｆｉｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｃｌｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ １２（５）：３１３−３２１ Ｒｕｇｏ ＨＳら、（２０１５）Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｐｈａｓｅ ＩＩＩ Ｔｒｉａｌ ｏｆ Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ Ｏｎｃｅ Ｐｅｒ Ｗｅｅｋ Ｃｏｍｐａｒｅｄ Ｗｉｔｈ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｌｂｕｍｉｎ−Ｂｏｕｎｄ Ｎａｂ−Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ Ｏｎｃｅ Ｐｅｒ Ｗｅｅｋ ｏｒ Ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ Ｗｉｔｈ Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ Ａｓ Ｆｉｒｓｔ−Ｌｉｎｅ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｌｏｃａｌｌｙ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｏｒ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ：ＣＡＬＧＢ ４０５０２／ＮＣＣＴＧ Ｎ０６３Ｈ（Ａｌｌｉａｎｃｅ）．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．３３（２１）：２３６１−２３６９ Ｂａｒｂｕｔｉ ＡＭ＆Ｃｈｅｎ ＺＳ（２０１５）Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ａｇｅｓ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ Ｉｔｓ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）７（４）：２３６０−２３７１ Ｚｈａｏ Ｙ，Ｍｕ Ｘ，＆Ｄｕ Ｇ（２０１５）Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ：Ｎｅｗ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ． Ｂａｒｂｕｔｉ ＡＭ＆Ｃｈｅｎ ＺＳ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）７（４）：２３６０−２３７１ Ｚｈａｏ Ｙ，Ｍｕ Ｘ，＆Ｄｕ Ｇ（２０１５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ． Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ ＭＭ，Ｆｏｊｏ Ｔ，＆Ｂａｔｅｓ ＳＥ（２００２）Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２（１）：４８−５８ Ｌｅｈａｒ Ｊ．ら、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｔｅｎｄ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（７），６５９−６６６（２００９） Ｚｈａｏ，Ｍ．ら、Ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｌｏａｄｉｎｇ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００９，２０，０５５１０２ Ｓｏｎｇ，Ｘ．ら、ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ ａｎｄ ｖｅｒａｐａｍｉｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２００８，３５，３２０−３２９ Ｗｏｎｇ，Ｍ．−Ｙ．；Ｃｈｉｕ，Ｇ．Ｎ．Ｃ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ａｎｄ ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ２０１０，２１，４０１−４１０ Ｋｗｏｎ，Ｇ．Ｓ．ら、Ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｌｏａｄｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｏｒｌｙ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００９，１４０，２９４−３００ Ｓｕｇａｈａｒａ ＫＮら、Ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔｕｍｏｒ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１０；３２８：１０３１−１０３５ Ｗａｎｇ Ｓ．Ｚ．ら、ＴＲＡＩＬ ａｎｄ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｎｄ Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ Ｓｏｆｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓａｒｃｏｍａ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０；１６：２５９１−２６０４ Ｈｏｓｓａｉｎ ＭＡら、Ａｓｐｉｒｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２０１２；４０：１６３６−１６４２ Ｊｉｎ Ｃ．ら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ａｎｄ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．２０１０；１３６：２６７−２７４
概要
一態様では、
ａ）ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子；
ｂ）１つまたはそれを超える化学療法剤または抗癌標的薬剤；および
ｃ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
を含む組成物が本明細書で提供される。
組成物の一実施形態では、組成物は、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドを含む。
組成物の別の実施形態では、組成物は、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドを含む。
組成物の一実施形態では、前記ＰＬＡの分子量が約２，０００〜約８０，０００ダルトンである。
組成物の一実施形態では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーは、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧトリブロックコポリマーとＰＬＡとの化学的コンジュゲーションから形成され、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧトリブロックコポリマーは、異なる分子量であり得る。
組成物の一実施形態では、ポリマーナノ粒子は、
ａ）化学療法剤または標的抗癌剤；および
ｂ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
がロードされている。
組成物のさらなる実施形態では、ポリマーナノ粒子は、
ａ）化学療法剤または標的抗癌剤；および
ｂ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチド
がロードされている。
組成物の別のさらなる実施形態では、ポリマーナノ粒子は、
ａ）化学療法剤または標的抗癌剤；および
ｂ）ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
がロードされている。
組成物のさらなる実施形態では、前記化学療法剤がパクリタキセルである。
組成物のなおさらなる実施形態では、前記ポリマーナノ粒子に、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、パクリタキセルと、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドとがロードされている。
組成物の別の実施形態では、前記化学療法剤がゲムシタビンである。組成物のさらなる実施形態では、前記ポリマーナノ粒子に、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、ゲムシタビンと、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドとがロードされている。
組成物の別の実施形態では、前記化学療法剤または標的抗癌剤が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトライド、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキセートおよびボルテゾミブからなる群より選択される。
別の態様では、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心臓血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経学的障害からなる群より選択される疾患の処置に使用するための医薬組成物であって、
ａ）ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子；
ｂ）１つまたはそれを超える治療剤；および
ｃ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
医薬組成物の一実施形態では、組成物は、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドを含む。
医薬組成物の別の実施形態では、組成物は、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドを含む。
本明細書で提供される組成物のいずれかの実施形態では、前記ポリマーナノ粒子が、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーから本質的になる。
本明細書で提供される組成物のいずれかの実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ポリマーナノ粒子の外側に結合したターゲティング部分をさらに含み、ターゲティング部分は、抗体、ペプチドまたはアプタマーである。
別の態様では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーから本質的になるポリマーナノ粒子であって、パクリタキセルと、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドとがロードされているポリマーナノ粒子が本明細書で提供される。
別の態様では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーから本質的になるポリマーナノ粒子であって、パクリタキセルと、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドとがロードされているポリマーナノ粒子が本明細書で提供される。
別の態様では、癌の処置を必要とする被験体における癌を処置するための方法であって、
ａ）ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子；
ｂ）化学療法剤および／または抗癌標的薬剤；ならびに
ｂ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
を含む治療有効量の医薬組成物を前記被験体に投与することを含む方法が本明細書で提供される。
方法の一実施形態では、前記医薬組成物が、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドを含む。
方法の別の実施形態では、前記医薬組成物が、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドを含む。
方法の一実施形態では、前記化学療法剤がパクリタキセルである。前記方法のさらなる実施形態では、前記ポリマーナノ粒子に、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、パクリタキセルと、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドとがロードされている。
方法の別の実施形態では、前記化学療法剤がゲムシタビンである。前記方法のさらなる実施形態では、前記ポリマーナノ粒子に、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、ゲムシタビンと、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドとがロードされている。
方法の別の実施形態では、前記化学療法剤または標的抗癌剤が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトライド、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキセートおよびボルテゾミブからなる群より選択される。
方法の一実施形態では、前記癌が、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、転移性結腸癌、膵臓癌または血液学的悪性腫瘍である。
方法の一実施形態では、パクリタキセルまたはｎａｂ−パクリタキセルによる処置に対して耐性である。
方法の一実施形態では、パクリタキセルまたはｎａｂ−パクリタキセルによる処置に対して不応性である。
方法の別の実施形態では、パクリタキセルまたはｎａｂ−パクリタキセルによる処置後に再発状態にある。
別の態様では、細胞におけるパクリタキセル流出を阻害するため方法であって、前記細胞と、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含む有効量のポリマーナノ粒子とを接触させることを含む、方法が本明細書に提供される。
方法の一実施形態では、前記ポリマーナノ粒子にパクリタキセルがロードされている。
また別の態様では、細胞におけるＰ−糖タンパク質発現を遮断するため方法であって、前記細胞と、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含む有効量のポリマーナノ粒子とを接触させることを含む、方法が本明細書に提供される。
別の態様では、細胞におけるＰ−糖タンパク質媒介性薬剤耐性を打ち消すための方法であって、前記細胞と、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含む有効量のポリマーナノ粒子とを接触させることを含む、方法が本明細書に提供される。
本明細書で提供される方法のいずれかの実施形態では、前記ポリマーナノ粒子がＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーから本質的になる。
別の態様では、第１の化学療法薬に対する耐性を有する癌細胞を生じさせるための方法であって、前記癌細胞と、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子とを接触させることを含み、前記ポリマーナノ粒子に第２の化学療法薬がロードされており、Ｐ−糖タンパク質のアップレギュレーションによって、前記第１の化学療法薬に対する前記癌細胞の前記耐性を生じさせる、方法が本明細書に提供される。
一実施形態において、前記ポリマーナノ粒子がＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーから本質的になる。
一実施形態において、前記癌細胞が乳癌細胞である。
一実施形態において、前記第１の化学療法薬がパクリタキセルである。
一実施形態において、前記第２の化学療法薬がパクリタキセルである。
一実施形態において、前記ポリマーナノ粒子に、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドがロードされている。
別の実施形態において、前記ポリマーナノ粒子に、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドがロードされている。
以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明の態様をさらに例証するために含まれる。本発明は、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて図を参照することによってより良く理解され得る。
図１は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーのポリマーナノ粒子の概略図を提供する。
図２は、ＰＬＡ、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧおよびＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子のＦＴＩＲスペクトルを提供する。
図３Ａは、１，１００ｇ／ｍｏｌのＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのブロックコポリマーから合成したＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示す。
図３Ｂは、４，４００ｇ／ｍｏｌのＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのブロックコポリマーから合成したＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示す。
図３Ｃは、８，４００ｇ／ｍｏｌのＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのブロックコポリマーから合成したＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示す。
図４Ａおよび４Ｂは、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）画像を示す。
図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃは、蛍光色素ローダミンＢを封入したＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子のＭＣＦ−７細胞への細胞インターナリゼーションを示す。
図６Ａは、２５℃で異なるコポリマーを使用して合成したＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子からの封入Ｌ−ＮｕＢＣＰ−９の経時的なインビトロ放出を示す。
図６Ｂは、陰性対照として正常ＨＵＶＥＣ細胞における、Ｌ−ＮｕＢＣＰ−９をロードした異なるブロックコポリマーを使用して合成したＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の有効性の欠如を示す。
図７Ａは、別の一次ＨＵＶＥＣ細胞株に対する、抗癌ペプチドＬ−ＮｕＢＣＰ−９ロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の有効性の欠如を示す。
図７Ｂは、ＭＣＦ−７細胞増殖に対する抗癌ペプチドＬ−ＮｕＢＣＰ−９ロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の送達の有効性を、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を使用した薬物送達と比較して示す。
図８Ａは、１５０ｍｇ／体重ｋｇの用量で血液化学を行うことによって任意の一般毒性を定義するために単純ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で処置したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるヘモグロビンのレベルを示す。
図８Ｂは、１５０ｍｇ／体重ｋｇの用量で血液化学を行うことによって任意の一般毒性を定義するために単純ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で処置したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける好中球およびリンパ球数のレベルを示す。
図８Ｃは、１５０ｍｇ／体重ｋｇの用量で血液化学を行うことによって任意の一般毒性を定義するために単純ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で処置したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血中血球容積、ＭＣＶ（平均赤血球容積）、ＭＣＨ（平均赤血球ヘモグロビン量）およびＭＣＨＣ（平均赤血球ヘモグロビン濃度）を示す。
図９Ａは、１５０ｍｇ／体重ｋｇの用量で血液化学を行うことによって任意の一般毒性を定義するために単純ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で処置したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるアスパラギン酸トランスアミナーゼおよびアラニントランスアミナーゼのレベルを示す。
図９Ｂは、１５０ｍｇ／体重ｋｇの用量で血液化学を行うことによって任意の一般毒性を定義するために単純ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で処置したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるアルカリホスファターゼのレベルを示す。
図９Ｃは、１５０ｍｇ／体重ｋｇの用量で血液化学を行うことによって任意の一般毒性を定義するために単純ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で処置したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける尿素および血中尿素窒素（ＢＵＮ）のレベルを示す。
図１０は、異なる器官の組織病理学を行うことによって任意の一般毒性を定義するために単純ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を注射したＢＡＬＢ／ｃマウスの脳、心臓、肝臓、脾臓、腎臓および肺の組織病理学を示す。
図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＬＮｕＢＣＰ−９封入ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子（８，８００ｇ／ｍｏｌ）で処置したエールリッヒ腹水腫瘍（ＥＡＴ）マウスにおける腫瘍退縮を示す。 図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＬＮｕＢＣＰ−９封入ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子（８，８００ｇ／ｍｏｌ）で処置したエールリッヒ腹水腫瘍（ＥＡＴ）マウスにおける腫瘍退縮を示す。
図１２Ａは、１日目のＢＡＬＢ−ｃマウスにおけるエールリッヒ腹水腫瘍を示す。
図１２Ｂは、Ｌ−ＮｕＢＣＰ−９封入ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子（８，８００ｇ／ｍｏｌ）で処置したＥＡＴマウスの２１日目の腫瘍成長抑制を示す。
図１２Ｃは、２１日目の未処置対照マウスを示す。
図１３は、糖尿病ウサギの血中グルコースレベルの制御に対するインスリンロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の有効性を示す。
図１４は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子からの、ポリアルギニン配列（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＣＱＣＲＲＫＮ）に連結されたＭＵＣ１細胞質ドメインペプチドの放出データを示す。
図１５Ａは、ＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ１２Ｋ ＮＰのＳＥＭを示す。
図１５Ｂは、ＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ１２Ｋ ＮＰのＴＥＭを示す。
図１６は、ローダミンＢロードＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ１２Ｋ ＮＰの細胞インターナリゼーションを示す。
図１７Ａは、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ ＮＰからのパクリタキセル（本明細書では「ＰＴＸ」とも称される）放出を示す。
図１７Ｂは、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ ＮＰからのＬ−ＮｕＢＣＰ−９放出を示す。
図１７Ｃは、両薬物を同じナノ粒子に封入した二重／ハイブリッドＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ ＮＰからのＰＴＸおよびＬ−ＮｕＢＣＰ−９放出を示す。
図１８Ａは、異なる比のＰＴＸ：ＮｕＢＣＰ−９（３：１、１：１および１：３）を封入したＮＰへの曝露によるＭＣＦ−７細胞（左のパネル）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（右のパネル）細胞の処置を示す。７２時間後、ＸＴＴアッセイによって、細胞を分析した。結果は、生存率（３回の独立した実験の平均±ＳＤ）として表されている。
図１８Ｂは、ホルモン依存性乳癌腫細胞株ＭＣＦ−７を使用して、単一ロードＮＰと比較した二重ロードＮＰ（すなわち、ＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９を含むポリマーＮＰ）の時間依存研究（時点は、０時間（１）；処置の１２時間後（２）；処置の２４時間後（３）；処置の４８時間後（４）および処置の７２時間後（５）である）を示す。
図１８Ｃは、異なる濃度の薬物を使用して、遊離または単一ロードＮＰと比較した単一製剤のＭＣＦ−７細胞の増殖阻害を示す。
図１８Ｄは、異なる濃度の薬物を使用して、遊離または単一ロードＮＰと比較した単一製剤のＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の増殖阻害を示す。
図１８Ｅは、ＭＣＦ７細胞の阻害における相乗作用に関連するパクリタキセルおよびＬ−ＮｕＢＣＰ−９分析のＣＩ（組み合わせ指数）を示す。１．０未満のＣＩは、相乗作用を示す。この分析で達成されたＣＩ数値は、異なる用量で０．１〜０．３であったが、これは、ＭＣＦ−７細胞の死滅における非常に高い相乗作用を実証している。
図１８Ｆは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の阻害における相乗作用に関連するパクリタキセルおよびＬ−ＮｕＢＣＰ−９分析のＣＩ（組み合わせ指数）を示す。この分析で達成されたＣＩ数値は、異なる用量で０．１〜１．０であったが、これは、ＭＣＦ−７細胞の死滅における顕著に高い相乗作用を実証している。
図１８Ｇは、異なる濃度の空ＮＰ（円）、ＰＴＸ／ＮＰ（三角）またはＮｕＢＣＰ−９／ＮＰ（四角）で７２時間処置したＭＣＦ−７細胞を示す。ＸＴＴアッセイによって、細胞生存を決定した。結果は、生存率（３回の独立した実験の平均±ＳＤ）として左のパネルに表されている。異なる濃度の空ＮＰ（円）、ＰＴＸ／ＮＰ＋ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰ（四角）またはＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰ（三角）で、示されている細胞を７２時間処置した。ＸＴＴアッセイによって、細胞生存を決定した。結果は、生存率（３回の独立した実験の平均±ＳＤ）として右のパネルに表されている。
図１８Ｈは、異なる濃度の空ＮＰ（円）、ＰＴＸ／ＮＰ（三角）またはＮｕＢＣＰ−９／ＮＰ（四角）で７２時間処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を示す。ＸＴＴアッセイによって、細胞生存を決定した。結果は、生存率（３回の独立した実験の平均±ＳＤ）として左のパネルに表されている。異なる濃度の空ＮＰ（円）、ＰＴＸ／ＮＰ＋ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰ（四角）またはＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰ（三角）で、示されている細胞を７２時間処置した。ＸＴＴアッセイによって、細胞生存を決定した。結果は、生存率（３回の独立した実験の平均±ＳＤ）として右のパネルに表されている。
図１８Ｉは、示されている濃度のＰＴＸ／ＮＰ単独、示されている濃度のＮｕＢＣＰ−９／ＮＰ単独、および示されている濃度のＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰでＭＣＦ−７細胞を７２時間処置した際の組み合わせ指数を示す。ＸＴＴアッセイによって、平均細胞生存を３回反復で評価した。グラフ（左）の数字１〜７は、表（右）に列挙されている組み合わせを表す。Ｆａは影響を受けた割合を示し、ＣＩは組み合わせ指数を示す。
図１８Ｊは、示されている濃度のＰＴＸ／ＮＰ単独、示されている濃度のＮｕＢＣＰ−９／ＮＰ単独、および示されている濃度のＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰでＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を７２時間処置した際の組み合わせ指数を示す。ＸＴＴアッセイによって、平均細胞生存を３回反復で評価した。グラフ（左）の数字１〜７は、表（右）に列挙されている組み合わせを表す。Ｆａは影響を受けた割合を示し、ＣＩは組み合わせ指数を示す。
図１９Ａは、細胞死の誘導に対するＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９（単一／二重）ロードナノ粒子（ＮＰ）の効果を示す。未処置のＭＣＦ−７細胞（対照；最上段）、ＮｕＢＣＰ−９ロードＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ ＮＰ（中央２番目）、ＰＴＸロードＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子（中央３番目）、対照として遊離ＰＴＸのみ（下から２番目）およびＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９ロードＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ Ｎｐ（最下段）で示されている時間処置したＭＣＦ−７細胞のアネキシンＶ／ＰＩ二重染色の共焦点レーザー走査型顕微鏡画像。
図１９Ｂは、Ｌ−ＮｕＢＣＰ−９／ＰＴＸ組み合わせＮＰ、ＮｕＢＣＰ−９ ＮＰ、ＰＴＸ ＮＰ、ＰＴＸおよびＮＰへの曝露により、初期アポトーシス状態の陽性細胞、後期アポトーシス状態の陽性細胞または死亡した陽性細胞のパーセントを示す。
図１９Ｃは、ＭＣＦ−７細胞におけるＢＣＬ−２、チューブリン、切断型カスパーゼ３および切断型ＰＡＲＰタンパク質のレベルを決定するために使用したウエスタンブロットデータを示す。
図１９Ｄは、図１９Ｃに示されているウエスタンブロット分析によって決定した、乳癌細胞株におけるＢＣＬ−２、チューブリン、切断型カスパーゼ３および切断型ＰＡＲＰタンパク質のレベルを示す。
図２０Ａは、パクリタキセル（ＰＴＸ）と組み合わせてＮＰにロードしたＬ−ＮｕＢＣＰ−９ペプチドの週１回および週２回腹腔内投与から作成した腫瘍成長曲線（ＥＡＴ同系腫瘍モデル）を示す。腫瘍成長曲線により、パクリタキセル（ＰＴＸ）と組み合わせてナノ粒子にロードしたＬ−ＮｕＢＣＰ−９ペプチドの週２回腹腔内投与は、未処置または週１回投与と比較して、ＥＡＴ腫瘍成長の制御において有効であることが示された。各点は、すべての腫瘍ＥＡＴマウスの体積の平均±ＳＥを表す。＊Ｐ＜０．０１、対照ＰＢＳ群と有意に異なる；＊＊Ｐ＜０．００１、対照ＰＢＳと有意に異なる；Ｐ＜０．００１、ペプチドまたはパクリタキセル単独群と有意に異なる。
ＮＰにロードしたパクリタキセル（ＰＴＸ）の週２回腹腔内投与から作成した腫瘍成長曲線（ＥＡＴ同系腫瘍モデル）を示す。腫瘍成長曲線により、ナノ粒子にロードしたＬ−ＮｕＢＣＰ−９パクリタキセル（ＰＴＸ）の週２回腹腔内投与は、未処置または週１回投与と比較して、ＥＡＴ腫瘍成長の制御において有効であることが示された。
図２０Ｃは、ＮＰにロードしたＮｕＢＣＰ−９ペプチドの週２回腹腔内投与から作成した腫瘍成長曲線を示す。腫瘍成長曲線により、ナノ粒子にロードしたＬ−ＮｕＢＣＰ−９ペプチドの週２回腹腔内投与は、未処置または週１回投与と比較して、ＥＡＴ腫瘍成長の制御において有効であることが示された。
図２１は、対照、ＰＴＸ対照、ＰＴＸロードＮＰ、Ｌ−ＮｕＢＣＰ−９ロードＮＰおよび二重薬物ロードＮＰ（右から左）で２１日間処置したマウスから得た腫瘍組織であって、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した腫瘍組織の組織病理学を示す（×４００）。組み合わせ試験では、非常に低いＫｉ６７発現が見られる；Ｌ−ＮｕＢＣＰ−９ロードＮｐおよびＰＴＸロードＮｐでは、Ｋｉ６７発現は減少しているが、ビヒクル対照およびＰＴＸ対照では、高発現が見られる（Ｐ＜０．０５）。組み合わせ薬物ロードＮＰでは、ＴＵＮＥＬ陽性細胞が最も多く見られ、Ｌ−ＮｕＢＣＰ−９ロードＮｐおよびＰＴＸロードＮｐでは、いくつかのＴＵＮＥＬ陽性細胞が見られるが、ビヒクル対照では、ＴＵＮＥＬ陽性細胞が見られない（Ｐ＜０．０５）。
図２２は、ＰＴＸおよびＬ−ＮｕＢＣＰ−９（単一／二重）ロードナノ粒子の抗腫瘍活性を示す。空ＮＰ（腹腔内、四角、週２回）、１０ｍｇ／ｋｇ Ｌ−ＮｕＢＣＰ−９ロードＮＰ（腹腔内、三角、週２回）、１０ｍｇ／ｋｇ ＰＴＸロードＮＰ（腹腔内、菱形、週２回）または１０ｍｇ／ｋｇ ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９二重薬物ロードＮＰ（腹腔内、円、週２回）でエールリッヒ腫瘍担持マウスを２１日周期で処置した。示されている日に、腫瘍測定を実施した。結果は、腫瘍体積（平均±ＳＤ）として表されている。
図２３は、カプラン・マイヤー分析によって決定した場合の、生存率として表した図２２に記載されている実験の結果を示す。空ＮＰ（四角）、Ｌ−ＮｕＢＣＰ−９ロードＮＰ（三角）、ＰＴＸロードＮＰ（円）およびＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９ロードＮＰ（白色の四角）。ビヒクル対照とＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９ロードナノ粒子群との間で、統計分析を実施した（Ｐ＜０．００１）。
図２４は、３０ｍｇ／ｋｇの用量におけるＰＴＸおよびＬ−ＮｕＢＣＰ−９（単一／二重）ロードナノ粒子の抗腫瘍活性を示す。３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内週１回投与×３で、パクリタキセル／ＮＰ、Ｌ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰとパクリタキセル＋ＮｕＢＣＰ−９二重／ＮＰとを比較した同系ＥＡＴモデル。
図２５は、ＦＩＴＣ標識Ｌ−ＮｕＢＣＰ−９ナノ粒子で１２時間処置したＭＣＦ−７細胞の共局在性研究を示す。洗浄後、細胞を固定し、共焦点顕微鏡法によって視覚化した。ミトコンドリア選択的Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ色素でミトコンドリアを染色した（上のパネル）。別途、緑色蛍光色素（ＦＩＴＣ）で標識したＬ−ＮｕＢＣＰ−９−Ｒｈｏ Ｂおよびパクリタキセルを封入したＮＰでＭＣＦ−７細胞を１２時間処置した。洗浄後、細胞を固定し、共焦点顕微鏡法によって視覚化した。ミトコンドリアにおいて、Ｌ−ＮｕＢＣＰ−９およびＰＴＸの共局在が見られた（下のパネル）。
図２６は、複数の標的に作用して相乗効果を示すＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９二重ロードＮＰの概略図を示す。
図２７Ａは、抗Ｐ ｇｐ１、抗ＢＣＬ−２および抗β−アクチン抗体を用いたイムノブロッティングによる、野生型ＭＣＦ−７（ＭＣＦ−７）およびＰＴＸ耐性ＭＣＦ−７（ＭＣＦ−７／ＰＴＸ−Ｒ）由来の全細胞溶解物の分析を示す（実施例９を参照のこと）。
図２７Ｂは、１００ｎＭ ＰＴＸまたは１００ｎＭ ＰＴＸ／ＮＰで１２時間処置したＭＣＦ−７またはＭＣＦ−７／ＰＴＸ−Ｒ細胞を示す。洗浄後、細胞を固定し、共焦点顕微鏡法によって視覚化した（実施例９を参照のこと）。
図２７Ｃは、１００ｎＭ ＰＴＸまたは１００ｎＭ ＰＴＸ／ＮＰで４８時間処置し、次いでアネキシンＶ／ＰＩで染色したＭＣＦ−７（上の２つのパネル）およびＭＣＦ−７／ＰＴＸ−Ｒ（下の２つのパネル）細胞の共焦点レーザー走査型顕微鏡画像を示す（実施例９を参照のこと）。
図２７Ｄは、１００ｎＭ ＰＴＸまたは１００ｎＭ ＰＴＸ／ＮＰで４８時間処置したＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７／ＰＴＸ−Ｒ細胞を示す。次いで、アネキシンＶ／ＰＩで細胞を染色し、ＦＡＣＳによって分析した。ＰＩ＋および／またはアネキシンＶ＋細胞の割合は、パネルに含まれている（実施例９を参照のこと）。
図２７Ｅは、１００ｎＭ ＰＴＸ、１００ｎＭ ｎａｂ−パクリタキセル（ｎａｂ−ＰＴＸ；アブラキサン）または１００ｎＭ ＰＴＸ／ＮＰで４８時間処置したＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７／ＰＴＸ−Ｒ由来の全細胞溶解物を示す。抗カスパーゼ−３ ＣＦ、抗ＰＡＲＰ ＣＦおよび抗β−アクチン抗体を用いたイムノブロッティングによって、分析を実施した（実施例９を参照のこと）。
図２７Ｆは、１００ｎＭ ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰで７２時間処置したＭＣＦ−７／ＰＴＸ−Ｒ細胞由来の全細胞溶解物の分析を示す。抗Ｐ−ｇｐ、抗ＢＣＬ−２および抗β−アクチン抗体を用いたイムノブロッティングによって、分析を実施した（実施例９を参照のこと）。
詳細な説明
ＮｕＢＣＰ−９は、ＢＣＬ−２ＢＨ３ドメインを露出させてＢＣＬ−ｘＬ生存機能を遮断することによって、癌細胞のアポトーシスを選択的に誘導する非常に有望な抗癌ペプチドである（Ｋｏｌｌｕｒｉ ＳＫら、Ａ ｓｈｏｒｔ Ｎｕｒ７７−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｖｅｒｔｓ Ｂｃｌ−２ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ ｔｏ ａ ｋｉｌｌｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２００８；１４：２８５−９８）。ＮｕＢＣＰ−９は、細胞内送達のためにＤ−Ａｒｇオクタマーｒ８（膜破壊を伴うＢＣＬ−２非依存性細胞死滅を誘導することによって、選択性を減少させると報告されている改変）に連結された。新規ポリマーＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の腹腔内投与によるＬ−ＮｕＢＣＰ−９ペプチドの持続送達は、エールリッヒ腫瘍の完全退縮の誘導において有効であった（例えば、図１１および図１２ならびに実施例７を参照のこと）。この種類のナノ粒子を調製するための特徴およびプロセスは、国際公開第２０１３／１６０７７３号に開示されている（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
ナノ粒子（本明細書では「ＮＰ」とも称される）は、ナノカプセルまたはナノスフィアとして生成され得る。ナノ粒子へのタンパク質ロードは、吸着プロセスまたは封入プロセスのいずれかによって行われ得る（Ｓｐａｄａら、２０１１；Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；Ｗｏｒｌｄ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：７６）。受動的および能動的なターゲティング戦略の両方を使用することによって、正常細胞における毒性を回避しながら、ナノ粒子は、癌細胞における薬物の細胞内濃度を増強し得る。ナノ粒子が特定の受容体に結合して細胞に進入すると、それらは、通常、受容体媒介性エンドサイトーシスを介してエンドソームで覆われ、それにより、主要な薬剤耐性機構の１つであるＰ−糖タンパク質の認識を回避する（Ｃｈｏら、２００８，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００８，１４：１３１０−１３１６）。ナノ粒子は、オプソニン作用および食作用によって身体から除去される（Ｓｏｓｎｉｋら、２００８；Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｎｅｗ Ｅｎｄｅａｖｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ；Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔｅｎｔｓ ｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１：４３−５９）。ナノ担体ベースの系は、細胞内透過性の改善、局所送達、早期分解からの薬物の保護、薬物動態および薬物組織分布プロファイルの制御、より低い用量必要性および費用対効果の利点を有する有効な薬物送達のために使用され得る（Ｆａｒｏｋｈｚａｄ ＯＣら、Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ａｐｔａｍｅｒ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００６，１０３（１６）：６３１５−２０；Ｆｏｎｓｅｃａ Ｃら、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ−ｌｏａｄｅｄ ＰＬＧＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００２；８３（２）：２７３−８６；Ｈｏｏｄら、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１１，６（７）：１２５７−１２７２）。
ナノ粒子の取り込みは、その小さい寸法に間接的に比例する。その小さいサイズにより、ポリマーナノ粒子は、細網内皮系（ＲＥＳ）による認識および取り込みを逃れることが見出されているので、血液中で長時間循環し得る（Ｂｏｒｃｈａｒｄら、１９９６，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．７：１０５５−１０５８）。ナノ粒子はまた、固形腫瘍の漏出性脈管構造のような病的部位で浸出することができ、受動的なターゲティング機構を提供する。より速い可溶化速度をもたらすより大きな表面積により、ナノサイズの構造は、通常、より高い血漿濃度および曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す。小さい粒径は、宿主防御機構を逃れるのに役立ち、血液循環時間を増加させる。ナノ粒子のサイズは、薬物放出に影響する。より大きな粒子は、系への薬物のより緩徐な拡散を有する。より小さい粒子は、より大きい表面積を提供するが、速い薬物放出をもたらす。より小さい粒子は、ナノ粒子分散液の保存および輸送の間に凝集する傾向がある。よって、ナノ粒子の小さいサイズと最大安定性との折衷が望ましい。薬物送達系において使用されるナノ粒子のサイズは、その毛細血管への急速な漏出を防ぐ程度には十分大きいが、肝臓および脾臓などの細網内皮系中に留まっている固定マクロファージによる捕捉を逃れる程度には十分小さいものとするべきである。
そのサイズに加えて、ナノ粒子の表面特性もまた、循環中の寿命および運命の決定における重要な要因である。ナノ粒子は、理想的には、マクロファージ捕捉を逃れるために親水性表面を有するべきである。親水性ドメインおよび疎水性ドメインを有するブロックコポリマーから形成されたナノ粒子は、これらの基準を満たす。制御されたポリマー分解もまた、疾患状態への薬剤送達のレベルの増加を可能にする。ポリマー分解はまた、粒径の影響を受け得る。分解速度は、インビトロの粒径の増加と共に増加する（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；Ｓｕｎｄａｒら、２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ；ｄｏｉ：１０．１０８８／１４６８−６９９６／１１／１／０１４１０４）。
ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）は、組織工学、医療材料および薬物担体における適用のためにＵＳ ＦＤＡによって承認されており、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）ＰＬＡ−ＰＥＧベースの薬物送達系は、当技術分野で公知である。米国特許出願公開第２００６／０１６５９８７号には、ポリ（エステル）−ポリ（エチレン）マルチブロックコポリマーおよびナノ球体に強剛性を与える任意の成分を含み、医薬化合物を組み込む、ステルス性のポリマー生分解性ナノ球体が記載されている。米国特許出願公開第２００８／００８１０７５号には、グラフト高分子および１つまたはそれを超えるブロックコポリマーから自己組織化した、機能的内部コアおよび親水性外部シェルを有する新規の混合ミセル構造が記載されている。米国特許出願公開第２０１０／０００４３９８号には、相間領域を有するシェル／コア立体配置のポリマーナノ粒子およびそれを生成するためのプロセスが記載されている。
しかしながら、これらのポリマーナノ粒子は本質的に、ナノ粒子の安定性のために約１％〜２％の乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、媒質中の分散粒子を安定化させる。ＰＶＡ、ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ ８０およびＴｗｅｅｎ ２０は、一般的な乳化剤の一部である。しかしながら、乳化剤の使用は、乳化剤の浸出が被験体に対して毒性であり得るので、インビボ用途の懸念理由である（Ｓａｆｅｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｎ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌｓ（ＰＥＧＳ）ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｃｏｓｍｅｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２００５ Ｏｃｔ．１５；２１４（１−２）：１−３８）。乳化剤の使用はまた、ナノ粒子の質量を増加させ、それにより薬物ロードを減少させ、より多い投与量必要性をもたらす。ナノ粒子薬物担体系において依然として広く存在する他の不利益は、不十分な経口バイオアベイラビリティ、循環中の不安定性、不適切な組織分布および毒性である。上記不利益を伴わずにＮｕＢＣＰ−９などの治療用ペプチドを含む治療剤を罹患（例、癌性）細胞の細胞質ゾルに有効に送達し得る送達系が本明細書に記載される。
当業者であれば、本明細書に記載される本発明は、具体的に記載されているもの以外のバリエーションおよび改変に供されることを認識するであろう。本明細書に記載される本発明は、すべてのこのようなバリエーションおよび改変を含むことを理解すべきである。本発明はまた、個々にもしくは集合的に本明細書で言及されもしくは示されているすべてのこのような工程、特徴、組成物および化合物、ならびに任意の２つもしくはそれを超える前記工程もしくは特徴のありとあらゆる組み合わせを含む。
定義
便宜上、本発明のさらなる説明の前に、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語をここにまとめる。これらの定義は、残りの開示を考慮して解釈し、当業者によって理解されるように理解すべきである。他に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書全体を通して使用される用語は、特定の場合で他に制限がない限り、以下のように定義される。
「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という冠詞は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つを超えるもの（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有すること」、「を特徴とする」およびそれらの文法的同等物は、包括的な非限定的意味で使用され、さらなる要素が含まれ得ることを意味する。それは、「のみからなる」と解釈されることを意図しない。
本明細書で使用される「からなる」およびその文法的同等物は、特許請求の範囲で特定されていないいかなる要素、工程または成分も除外する。
本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、通常、所定の値または範囲の２０％以内、より好ましくは１０％以内、最も好ましくはさらに５％以内を意味する。
本明細書で使用される「生分解性」という用語は、ポリマー構造の酵素的および非酵素的の両方の場合の破壊または分解を指す。
本明細書で使用される「ナノ粒子」という用語は、直径１０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲内の粒子を指し、直径は、粒子と同じ容積を有する完全な球体の直径を指す。「ナノ粒子」という用語は、「ナノ粒子（単数または複数）」と互換的に使用される。いくつかの場合では、粒子の直径は、約１〜１０００ｎｍ、１０〜５００ｎｍ、３０〜２７０ｎｍ、３０〜２００ｎｍまたは３０〜１２０ｎｍの範囲内である。
いくつかの場合では、粒子の集団が存在し得る。本明細書に使用される場合、ナノ粒子の直径は、特定の集団における分布の平均である。
本明細書で使用される「ポリマー」という用語は、当技術分野で使用されるその通常の意味が与えられる（すなわち、共有結合によって接続された１つまたはそれを超える反復単位（モノマー）を含む分子構造）。反復単位はすべてが同一のものであり得るか、またはいくつかの場合では、１種類を超える反復単位がポリマー内に存在し得る。
「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、その変異体およびその誘導体などのポリヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される「治療剤」および「薬物」という用語は互換的に使用され、本質的に薬学的もしくは生物学的に活性な化合物または種だけではなく、それらの活性化合物または種の１つまたはそれよりも多くを含む材料、ならびにそれらのコンジュゲーション、改変体および薬理学的に活性な断片ならびに抗体誘導体を包含することも意図する。
「ターゲティング部分」または「標的薬剤」は、ターゲティングされる細胞の表面に選択的に結合し得る分子である。例えば、ターゲティング部分は、特定の種類の細胞上に見られるか、または標的細胞上で他の細胞よりも高頻度で発現される細胞表面受容体に結合するリガンドであり得る。
標的薬剤または治療剤は、ペプチドまたはタンパク質であり得る。「タンパク質」および「ペプチド」は当技術分野で周知の用語であり、本明細書に使用される場合、これらの用語は、当技術分野におけるその通常の意味が与えられる。一般に、ペプチドは、約１００個未満のアミノ酸長であるが、最大３００個までのアミノ酸を含み得るアミノ酸配列である。タンパク質は、一般に、少なくとも１００個のアミノ酸の分子であると考えられる。アミノ酸は、Ｄ−またはＬ−立体配置であり得る。タンパク質は、例えば、タンパク質薬、抗体、組換え抗体、組換えタンパク質、酵素などであり得る。いくつかの場合では、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸の１つまたはそれよりも多くは、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーションのためのリンカーなどの化学的実体の添加、機能化または他の改変、例えば環化、副次的環化、ならびにペプチドおよびタンパク質により有利な特性を付与することを目的とする多数の他の改変のいずれかによって改変され得る。他の場合では、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸の１つまたはそれよりも多くは、１つまたはそれを超える天然に存在しないアミノ酸による置換によって改変され得る。ペプチドまたはタンパク質は、ファージライブラリー、酵母ライブラリーまたはインビトロコンビナトリアルライブラリーなどのコンビナトリアルライブラリーから選択され得る。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、任意の種由来の分子を含有する免疫グロブリン可変領域によって示される結合親和性と同様またはそれよりも大きい結合親和性を所定の抗原に付与する二次または三次構造類似性を有するアミノ酸配列または分子を組み込んだ任意の分子を指す。抗体という用語は、限定されないが、単一特異性または二重特異性かにかかわらず、およびイメージング剤または化学療法薬分子などの二次診断用または治療用部分とコンジュゲーションされるかにかかわらず、２つの重鎖および２つの軽鎖からなるネイティブな抗体；軽鎖、重鎖もしくはその両方の断片、可変ドメイン断片、重鎖もしくは軽鎖のみの抗体、またはこれらのドメインの任意の操作された組み合わせに由来する結合分子を含む。この用語は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ラマ、ラクダ、ヒトまたは任意の他の脊椎動物種に由来するかにかかわらず、免疫グロブリン可変領域由来結合部分を含む。この用語は、発見方法（ハイブリドーマ由来、ヒト化、ファージ由来、酵母由来、コンビナトリアルディスプレイ由来、または当技術分野で公知の任意の類似の誘導方法）または生産方法（細菌、酵母、哺乳類細胞培養または遺伝子導入動物または当技術分野で公知の任意の類似の生産方法）にかかわらず、任意のこのような免疫グロブリン可変領域結合部分を指す。
本明細書で使用される「組み合わせ」、「治療的組み合わせ」または「薬学的組み合わせ」という用語は、２つまたはそれを超える治療剤の併用投与（例えば、同時送達）を指す。
本明細書で使用される「薬学的に許容され得る」という用語は、過度の毒性、刺激性アレルギー反応および他の問題の合併症を伴わずに、健全な医学的判断の範囲内で温血動物、例えば哺乳類またはヒトの組織との接触に適切であり、合理的な利益／リスク比に見合った化合物、材料、組成物および／または剤形を指す。
１つまたはそれを超える治療剤を含むポリマーナノ粒子の「治療有効量」は、組み合わせで処置された障害のベースラインの臨床的に観察可能な兆候および症候に対する観察可能なまたは臨床的に顕著な改善を提供するために十分な量である。
本明細書で使用される「被験体」または「患者」という用語は、癌または癌が直接的もしくは間接的に関与する任意の障害を患うかまたはそれに罹患する可能性がある動物を含むことを意図する。被験体の例としては、哺乳類、例えばヒト、類人猿、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラットおよびトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。一実施形態では、被験体は、ヒト、例えば、癌を患っているヒト、癌を患うリスクがあるヒト、または潜在的に癌を患う可能性があるヒトである。
本明細書で使用される「処置すること」または「処置」という用語は、被験体における少なくとも１つの症候を軽減、低減もしくは緩和し、または疾患進行の遅延をもたらす処置を含む。例えば、処置は、癌などの障害の１つもしくは複数の症候の縮小または障害の完全な根絶であり得る。本開示の意味の範囲内では、「処置する」という用語はまた、疾患の悪化を停止し、および／またはそのリスクを減少させることを示す。本明細書で使用される「予防する」、「予防すること」または「予防」という用語は、予防される状態、疾患または障害に関連するか、またはそれによって引き起こされる少なくとも１つの症候の予防を含む。
ポリマーナノ粒子
１つまたはそれを超える治療薬を送達するためのブロックコポリマーから構成される非毒性かつ安全な生分解性ポリマーナノ粒子が本明細書で提供される。本発明の生分解性ポリマーナノ粒子は、親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に改変されたポリ（乳酸）（ＰＬＡ）から本質的になるブロックコポリマーから形成され、前記親水性−疎水性ブロックコポリマーは、ポリ（メチルメタクリレート）−ポリ（メタクリル酸）（ＰＭＭＡ−ＰＭＡＡ）、ポリ（スチレン）−ポリ（アクリル酸）（ＰＳ−ＰＡＡ）、ポリ（アクリル酸）−ポリ（ビニルピリジン）（ＰＡＡ−ＰＶＰ）、ポリ（アクリル酸）−ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＡＡ−ＰＤＭＡＥＭＡ）、ポリ（エチレングリコール）−ポリ（ブチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＢＧ）およびポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）から選択される。
本明細書で使用される「本発明のポリマーナノ粒子」は、親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に改変されたポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を含むブロックコポリマーから形成されたポリマーナノ粒子を指し、前記親水性−疎水性ブロックコポリマーは、ポリ（メチルメタクリレート）−ポリ（メタクリル酸）（ＰＭＭＡ−ＰＭＡＡ）、ポリ（スチレン）−ポリ（アクリル酸）（ＰＳ−ＰＡＡ）、ポリ（アクリル酸）−ポリ（ビニルピリジン）（ＰＡＡ−ＰＶＰ）、ポリ（アクリル酸）−ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＡＡ−ＰＤＭＡＥＭＡ）、ポリ（エチレングリコール）−ポリ（ブチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＢＧ）およびポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）から選択される。したがって、「本発明のポリマーナノ粒子」は、ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）で化学的に改変されたポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を含むかまたはそれから本質的になるブロックコポリマーから形成されたポリマーナノ粒子を包含する。
本発明は、１つまたはそれを超える治療剤を含む生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスを提供する。得られたナノ粒子は、非毒性、安全および生分解性であるだけではなく、インビボで安定しており、高い保存安定性を有し、医療分野におけるナノ担体系または薬物送達系で安全に使用され得る。実際、本発明のナノ粒子は、送達可能薬物または治療剤のインビボ半減期を増加させる。
本発明はまた、活性剤の早期分解を防止して、癌治療における大きな使用可能性を有する有効な標的薬物送達ナノ担体系を形成するために、薬物（例えば、単一薬剤としてＮｕＢＣＰ−９を含むペプチド、またはＮｕＢＣＰ−９および化学療法剤または標的抗癌剤）を生分解性ポリマーナノ粒子に効率的にロードするためのプロセスを提供する。
医療および他の分野において使用するための生分解性ポリマーナノ粒子を含む組成物であって、ナノ粒子の担体系またはリザーバーもしくはデポーを用いる組成物も提供される。本発明のナノ粒子は、予後用組成物、治療用組成物、診断用組成物またはセラノスティクス組成物において広く使用され得る。適切には、本発明のナノ粒子は、薬物および薬剤送達のために、ならびにヒトまたは動物における疾患診断および医用画像のために使用される。したがって、本発明は、本明細書に記載される治療剤をさらに含むナノ粒子を使用して疾患を処置するための方法を提供する。本発明のナノ粒子はまた、リザーバーもしくはデポーが必要とされる場合、バイオセンサーとして、固定化酵素のための薬剤としてなど、化学反応または生体反応などの他の用途において使用され得る。
本明細書に記載されるプロセスによると、いかなる乳化剤または安定剤も用いずに生分解性ポリマーナノ粒子の生産中に、予想外の驚くべき結果が得られた。前記プロセスによって得られた生分解性ポリマーナノ粒子は、安全、安定および非毒性である。一実施形態では、ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧは、ポリ−乳酸（ＰＬＡ）マトリックスと共有結合されており、その結果、ブロックコポリマーはマトリックスの一部となる（すなわち、ナノ粒子送達系）。対照的に、先行技術では、乳化剤（例えば、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）は、ナノ粒子マトリックスの一部ではないので浸出する（図１）。先行技術のナノ粒子とは対照的に、本明細書で提供されるナノ粒子から媒質への乳化剤の浸出はない。
本プロセスによって得られたナノ粒子は、インビボで浸出し得る乳化剤の添加がないので、非毒性および安全である。乳化剤の欠如またはその量の減少はまた、より高い薬物対ポリマー比を有するナノ粒子をもたらす。これらのナノ粒子は、当技術分野に存在するポリマーナノ粒子と比較して、より高い安定性および増加した保存期間を有する。本発明のポリマーナノ粒子は、分解産物が体から容易に排泄され得るような生分解性であるように調製される。分解はまた、ナノ粒子中の封入内容物が体内のある部位で放出され得る方法を提供する。
ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）は疎水性ポリマーであり、本発明のポリマーナノ粒子の合成に好ましいポリマーである。しかしながら、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）およびポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）のブロックコポリマーも使用され得る。疎水性ポリマーはまた生物学的に誘導され得るか、またはバイオポリマーであり得る。
使用されるＰＬＡの分子量は、一般に、約２，０００ｇ／ｍｏｌ〜８０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内である。したがって、一実施形態では、使用されるＰＬＡは、約２，０００ｇ／ｍｏｌ〜８０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内である。ＰＬＡの平均分子量はまた、約７２，０００ｇ／ｍｏｌであり得る。本明細書で使用される場合、１ｇ／モルは、１「ダルトン」と同等である（すなわち、ポリマーの分子量について言及する場合、ダルトンおよびｇ／ｍｏｌは互換的である。
ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）、ポリ（メチルメタクリレート）−ポリ（メタクリル酸）（ＰＭＭＡ−ＰＭＡＡ）、ポリ（スチレン）−ポリ（アクリル酸）（ＰＳ−ＰＡＡ）、ポリ（アクリル酸）−ポリ（ビニルピリジン）（ＰＡＡ−ＰＶＰ）、ポリ（アクリル酸）−ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＡＡ−ＰＤＭＡＥＭＡ）、ポリ（エチレングリコール）−ポリ（ブチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＢＧ）、ならびにＰＧ−ＰＲ（ポリグリセロール（ＰＧ）およびアジピン酸、ピメリン酸およびセベシン酸を含むポリエステル（ＰＲ）とのそのコポリマー）のようなブロックコポリマーは、本発明において使用され得る親水性または親水性−疎水性コポリマーであり、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧなどのＡＢＡ型ブロックコポリマー、ＰＰＧ−ＰＥＧ−ＰＰＧなどのＢＡＢブロックコポリマー、（ＡＢ）ｎ型交互マルチブロックコポリマーおよびランダムマルチブロックコポリマーを含む。ブロックコポリマーは、２つ、３つまたはそれを超える数の異なるブロックを有し得る。ＰＥＧは、親水性、マクロファージに対する抗食作用および免疫認識への耐性を与えるため、好ましい成分である。
いくつかの実施形態では、親水性−疎水性ブロックコポリマーの平均分子量（Ｍｎ）は一般に、１，０００〜２０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内である。さらなる実施形態では、親水性−疎水性ブロックコポリマーの平均分子量（Ｍｎ）は、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌである。いくつかの場合では、親水性−疎水性ブロックコポリマーの平均分子量（Ｍｎ）は、４，４００ｇ／ｍｏｌ、８，４００ｇ／ｍｏｌまたは１４，６００ｇ／ｍｏｌである。
本発明のブロックコポリマーは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）のセグメントおよびポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）のセグメントから本質的になり得る。
本発明の特定の生分解性ポリマーナノ粒子は、ブロックコポリマーポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）から形成される。
本発明の別の特定の生分解性ポリマーナノ粒子は、ブロックコポリマーポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（乳酸）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−ＰＬＡ）から形成される。
本発明の生分解性ポリマーは、共有結合を使用してＰＬＡを親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に改変することによって形成可能である。
本発明の生分解性ポリマーナノ粒子は、約３０〜３００ｎｍの範囲内のサイズを有し得る。さらなる実施形態では、本発明の生分解性ポリマーナノ粒子は、約３０〜１２０ｎｍの範囲内のサイズを有する。
一実施形態では、本発明の生分解性ポリマーは、乳化剤を実質的に含まないか、または約０．５重量％〜５重量％の量の外部乳化剤を含み得る。
一実施形態では、本発明の生分解性ポリマーナノ粒子は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧであり、ポリ（乳酸）ブロックの平均分子量は約６０，０００ｇ／ｍｏｌであり、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックの平均重量は約８，４００または約１４，６００ｇ／ｍｏｌであり、外部乳化剤は約０．５重量％〜５重量％である。
別の実施形態では、本発明の生分解性ポリマーナノ粒子はＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧであり、ポリ（乳酸）ブロックの平均分子量はおよそ１６，０００ｇ／ｍｏｌまたはそれ未満であり、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックの平均重量は約８，４００ｇ／ｍｏｌまたは約１４，６００ｇ／ｍｏｌであり、その組成物は、乳化剤を実質的に含まない。
ポリマーナノ粒子の調製
本発明の生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）および親水性−疎水性ブロックコポリマーを有機溶媒に溶解して、溶液を得ること；、カルボジイミドカップリング剤および塩基を前記溶液に添加して、反応混合物を得ること；前記反応混合物を撹拌して、前記親水性−疎水性ブロックコポリマーで化学的に改変されたＰＬＡのブロックコポリマーを得ること；前工程のブロックコポリマーを有機溶媒に溶解し、ホモジナイズして、均一化混合物を得ること；前記均一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること；前記エマルジョンを撹拌して、ポリマーナノ粒子を得ることを含む。
カルボジイミドカップリング剤は、当技術分野で周知である。適切なカルボジイミドカップリング剤としては、限定されないが、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−（３−ジエチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドが挙げられる。
カップリング反応は、通常、トリアルキルアミン、ピリジンまたは４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの触媒および／または補助塩基の存在下で行われる。
カップリング反応はまた、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などのヒドロキシ誘導体と組み合わせて行われ得る。他のヒドロキシ誘導体としては、限定されないが、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｃｌ−ＨＯＢｔ）が挙げられる。
本明細書で調製されるナノ粒子の調製において有用な有機溶媒は、適切には、アセトニトリル（Ｃ２Ｈ３Ｎ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；Ｃ３Ｈ７ＮＯ）、アセトン（（ＣＨ３）２ＣＯ）およびジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）である。
上記プロセスは、場合により、生分解性ポリマーナノ粒子を水で洗浄し、ポリマー生分解性ポリマーナノ粒子を乾燥させるさらなる工程を含み得る。前記プロセスはまた、場合により、乳化剤を添加する最初の工程を含み得る。このプロセスから得られたナノ粒子は、約３０〜３００ｎｍまたは約３０〜１２０ｎｍの範囲内のサイズを有し得る。
特定のプロセスでは、ＰＬＡおよびコポリマーＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧを有機溶媒に溶解し、ポリマー溶液を得る。この溶液にＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を−４℃〜０℃で添加し、続いて、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を添加する。この溶液を２５０〜３００ｒｐｍ、−４０℃〜０℃の範囲の低温で２０〜２８時間撹拌し得る。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのナノ粒子は、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧに共有結合するＰＬＡを有し、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧマトリックスを形成する。ジエチルエーテル、メタノールまたはエタノールのような有機溶媒によってナノ粒子を沈殿させ、ろ過、超遠心分離または限外ろ過を含む当技術分野における従来の方法によって溶液から分離する。ナノ粒子を２℃〜８℃の範囲の温度で保存する。
前記プロセスでは、乳化剤が全く使用されないかまたは最小量の乳化剤が使用されるので、本発明のプロセスは、さらなる凍結工程またはデコイタンパク質の使用を必要としないさらなる利点を提供する。本発明は、２５℃〜３０℃の環境室温条件下で容易に行われ、所望の小粒径を得るために過剰なせん断を必要としない。
本発明のナノ粒子の一例のＦＴＩＲスペクトルは、図２に提供されている。ナノ粒子のＮＭＲスペクトルは、図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃに提供されている。図４Ａおよび４ＢのＴＥＭ画像に示されているように、ナノ粒子は立体配置で実質的に球状であるが、しかしながら、ナノ粒子は、膨張または収縮により非球状立体配置をとり得る。ナノ粒子は、本質的に両親媒性である。ナノ粒子のゼータ電位およびＰＤＩ（多分散指数）は、表２に提供されている。いかなる遊離乳化剤もプロセスに添加せず、ＰＥＧ部分を含むブロックコポリマーは、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧマトリックス全体と共有結合により連結されているので、本発明のナノ粒子の保存安定性は、従来の乳化剤ベースの系と比較して優れている。ナノ粒子の保存可能期間は、６〜１８カ月間の範囲である。
透過型電子顕微鏡を使用して測定した場合、本発明のナノ粒子は、３０〜１２０ｎｍの範囲の寸法を有し得る（図４）。適切な実施形態では、本発明のナノ粒子の直径は、直径５００ｎｍ未満、直径３００ｎｍ未満または直径２００ｎｍ未満である。特定のこのような実施形態では、本発明のナノ粒子は、直径約１０〜５００ｎｍ、約１０〜３００ｎｍ、約１０〜２００ｎｍの範囲内、約２０〜１５０ｎｍの範囲内または約３０〜１２０ｎｍの範囲内となる。
参照目的のために、ナノ粒子形成のための特定のプロセスおよび医薬組成物における使用が本明細書で提供される。これらのプロセスおよび使用は、当業者に明らかな様々な方法によって行われ得る。
本発明の実施形態では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を有機溶媒に溶解して、溶液を得ること、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を前記溶液に−４℃〜０℃の範囲内の温度で添加して、反応混合物を得ること、（ｃ）前記反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍ、−４℃〜０℃の範囲の温度で２０〜２８時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ること、（ｄ）前記ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒に溶解し、２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、均一化混合物を得ること、（ｅ）前記均一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること、ならびに（ｆ）前記エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの前記ナノ粒子を得ることを含むプロセスが本明細書で提供される。
本発明の別の実施形態では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を有機溶媒に溶解して、溶液を得ること、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を前記溶液に−４℃〜０℃の範囲内の温度で添加して、反応混合物を得ること、（ｃ）前記反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍ、−４℃〜０℃の範囲の温度で２０〜２８時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ること、（ｄ）前記ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒に溶解し、２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、均一化混合物を得ること、（ｅ）前記均一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること、ならびに（ｆ）前記エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの前記ナノ粒子を得ることを含み、場合により、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの前記ナノ粒子を水で洗浄し、従来の方法によって前記ナノ粒子を乾燥させる工程を含むプロセスが提供される。
本発明の別の実施形態では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ−乳酸（ＰＬＡ）を有機溶媒に溶解して、溶液を得ること、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を前記溶液に−４℃〜０℃の範囲内の温度で添加して、反応混合物を得ること、（ｃ）前記反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍ、−４℃〜０℃の範囲の温度で２０〜２８時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ること、（ｄ）前記ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒に溶解し、２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、均一化混合物を得ること、（ｅ）前記均一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること、ならびに（ｆ）前記エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの前記ナノ粒子を得ることを含み、前記ナノ粒子のサイズが、約３０〜３００ｎｍまたは約３０〜１２０ｎｍの範囲内であるプロセスが提供される。
本発明のまた別の実施形態では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ−乳酸（ＰＬＡ）を有機溶媒に溶解して、溶液を得ること、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を前記溶液に−４℃〜０℃の範囲内の温度で添加して、反応混合物を得ること、（ｃ）前記反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍ、−４℃〜０℃の範囲の温度で２０〜２８時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ること、（ｄ）前記ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒に溶解し、２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、均一化混合物を得ること、（ｅ）前記均一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること、ならびに（ｆ）前記エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの前記ナノ粒子を得ることを含み、前記ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーの分子量が、１，０００ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内であるプロセスが提供される。
本発明のさらなる実施形態では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を有機溶媒に溶解して、溶液を得ること、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を前記溶液に−４℃〜０℃の範囲内の温度で添加して、反応混合物を得ること、（ｃ）前記反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍ、−４℃〜０℃の範囲の温度で２０〜２８時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ること、（ｄ）前記ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒に溶解し、２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、均一化混合物を得ること、（ｅ）前記均一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること、ならびに（ｆ）前記エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの前記ナノ粒子を得ることを含み、ＰＬＡの分子量が、１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜６０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内であるプロセスが提供される。
本発明のさらなる実施形態では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を有機溶媒に溶解して、溶液を得ること、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を前記溶液に−４℃〜０℃の範囲内の温度で添加して、反応混合物を得ること、（ｃ）前記反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍ、−４℃〜０℃の範囲の温度で２０〜２８時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ること、（ｄ）前記ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒に溶解し、２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、均一化混合物を得ること、（ｅ）前記均一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること、ならびに（ｆ）前記エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの前記ナノ粒子を得ることを含み、工程（ａ）の溶液が、場合により、乳化剤などの添加剤を含むことがあるプロセスが提供される。
本発明の別の実施形態は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスによって得られるＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子であって、前記プロセスが、（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を有機溶媒に溶解して、溶液を得ること、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を前記溶液に−４℃〜０℃の範囲内の温度で添加して、反応混合物を得ること、（ｃ）前記反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍ、−４℃〜０℃の範囲の温度で２０〜２８時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ること、（ｄ）前記ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒に溶解し、２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、均一化混合物を得ること、（ｅ）前記均一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること、ならびに（ｆ）前記エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの前記ナノ粒子を得ることを含む、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を提供する。
本発明の別の実施形態は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスによって得られるＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を含む組成物であって、前記プロセスが、（ａ）ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーおよびポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を有機溶媒に溶解して、溶液を得ること、（ｂ）Ｎ，Ｎ，−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を前記溶液に−４℃〜０℃の範囲内の温度で添加して、反応混合物を得ること、（ｃ）前記反応混合物を２５０〜４００ｒｐｍ、−４℃〜０℃の範囲の温度で２０〜２８時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを得ること、（ｄ）前記ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを有機溶媒に溶解し、２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、均一化混合物を得ること、（ｅ）前記均一化混合物を水相に添加して、エマルジョンを得ること、ならびに（ｆ）前記エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの前記ナノ粒子を得ることを含む、組成物を提供する。
治療薬を含むポリマーナノ粒子
本発明のナノ粒子は、活性剤または実体を特定の部位に送達することができる（図５）。本発明のＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の粒径および放出特性は、ポリマーマトリックス中のＰＬＡまたはＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの分子量を変化させることによって制御され得る。活性剤または実体の放出は１２時間〜６０日間制御され得るが、これは、当技術分野で利用可能な従来のＰＬＡ−ＰＥＧ系に対する改善である（図６Ａ）。ナノ粒子の薬物ロード容量もまた、ナノ粒子のポリマーマトリックス中のブロックコポリマーの平均分子量を変化させることによって制御され得る。ナノ粒子の薬物ロード容量は、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのブロック長の増加と共に増加する（表３）。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーから構成されるポリマーナノ粒子は本質的に両親媒性であるので、疎水性薬物および親水性薬物は両方ともナノ粒子にロードされ得る。乳化剤を使用しないかまたは乳化剤の使用が最小限であるので、本発明のナノ粒子は、高い薬物ロード容量を有し、その結果、ロード用量および治療頻度が減少する。乳化剤の重量は総製剤重量の５０％になり得るので、ナノ粒子に対する活性剤または実体の比は、本発明のナノ粒子では、乳化剤を用いる従来の系と比較して高い（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１５ Ｊｕｎｅ ２０１１，Ｖｏｌｕｍｅ ４１１，Ｉｓｓｕｅｓ １−２，Ｐａｇｅｓ １７８−１８７；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１０，３８７：２５３−２６２）。ナノ粒子は、毒性の減少を伴う単回低用量薬物送達の達成を支援する。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのナノ担体系に対する活性剤の重量割合は、ナノ粒子に対して２〜２０％の範囲である。低い投与量レベルで有効量が投与され得るので、ナノ粒子へのより高い薬物ロードは、薬物用量の必要性を減少させる。ナノ粒子の総ロード容量を損なわずに、ポリマーナノ粒子への長期活性のロード実体の内部ロードの増強は、非常に将来性のある治療薬の有効な送達をもたらす。図７Ｂは、一次ＨＵＶＥＣ細胞株における、ナノ粒子製剤にロードした抗癌ペプチドＬ−ＮｕＢＣＰ−９（本明細書では、「ＮｕＢＣＰ−９」（アミノ酸配列ＦＳＲＳＬＨＳＬＬのＬ−立体配置）とも称される）の有効性を、遊離ペプチド薬製剤および従来の細胞透過性ペプチドコンジュゲート薬物製剤と比較して示す。
インビトロ細胞株研究およびインビボマウスモデル研究によって確認されたように、本発明のＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子は非毒性である。１５０ｍｇ／体重ｋｇの用量のＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で処置したマウスにおいて評価した血液学的パラメータにより、対照群と比べて全血球数、赤血球数、白血球数、好中球およびリンパ球レベルの有意な変化はないことが示された（図８）。肝機能および腎機能について評価した生化学的パラメータにより、対照群とナノ粒子処置群との間で、総タンパク質、アルブミンおよびグロブリンレベルの有意な変化はないことが示された。図９Ａおよび９Ｂに示されているように、肝臓酵素（アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ））のレベルは、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子処置群では、対照群と比較して非有意に増加した。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で処置したマウスでは、対照と比較して、尿素および血中尿素窒素（ＢＵＮ）のレベルの有意な変化はない（図９Ｃ）。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を注射したマウスの器官（脳、心臓、肝臓、脾臓、腎臓および肺）の組織病理学は、図１０に示されている。
本発明のナノ粒子は、１つまたはそれを超える実体を封入および／または吸着し得る。実体はまた、生分解性ナノ粒子のブロックコポリマーに直接コンジュゲートされ得る。本発明の実体としては、限定されないが、有機小分子、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＳｉＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、アミン、抗体およびその変異体、抗生物質、低分子量分子、化学療法薬、薬物もしくは治療剤、金属イオン、色素、放射性同位体、造影剤ならびに／またはイメージング剤が挙げられる。
封入され得る適切な分子は、治療剤である。タンパク質もしくはペプチドまたはそれらの断片、インスリンなど、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｃｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｉｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｅｔａｂｉｎ）、ドセタキセルなどの疎水性薬物、アンホテリシンＢ、イソニアジド（ＩＮＨ）などの抗生物質および核酸が治療剤に含まれる。治療剤としては、パクリタキセル、ドキソルビシンピモジド、ペリメタミン、インデノイソキノリンまたはノル−インデノイソキノリンなどの化学療法薬も挙げられる。
治療剤は、天然および非天然（合成）アミノ酸を含み得る。非限定的な例としては、二環式化合物および環状ペプチド模倣薬などのペプチド模倣薬が挙げられる。
Ｌ形態またはＬ−立体配置の治療用ペプチドは、経済的に安価に製造され得るが、それらは、それらのＤ形態と比較してインビボ系において急速に分解することが公知であるので、薬物適用における不利益を有することが公知である。しかしながら、インビボ研究で確認されたように、本発明のナノ粒子によるこのようなＬ−ペプチドの封入は、ナノ粒子のコアへの封入により、循環中の分解をもたらさない（図１１、１２および１３）。
当技術分野で普及している遊離薬物製剤と比較して、抗癌薬をロードしたナノ粒子の標的送達が達成され得る。本発明のナノ粒子はまた、ナノ粒子の表面上にターゲティング部分を含む１つまたはそれを超える実体と表面コンジュゲート、バイオコンジュゲートまたは吸着され得る。ターゲティング部分は、ナノ粒子を腫瘍または疾患部位に局在化させ、治療剤を放出させる。ターゲティング部分は、リンカー分子と結合または会合し得る。ターゲティング分子としては、限定されないが、抗体分子、成長受容体リガンド、ビタミン、ペプチド、ハプテン、アプタマーおよび当業者に公知の他のターゲティング分子が挙げられる。薬物分子およびイメージング分子はまた直接的に、またはリンカー分子を介してナノ粒子の表面上のターゲティング部分に結合され得る。
ターゲティング部分の非限定的な具体例としては、ビタミン、リガンド、アミン、ペプチド断片、抗体、アプタマー、トランスフェリン、抗体もしくはその断片、シアリルルイスＸ抗原、ヒアルロン酸、マンノース誘導体、グルコース誘導体、細胞特異的レクチン、ガラプチン、ガレクチン、ラクトシルセラミド、ステロイド誘導体、ＲＧＤ配列、ＥＧＦ、ＥＧＦ結合ペプチド、ウロキナーゼ受容体結合ペプチド、トロンボスポンジン由来ペプチド、アルブミン誘導体および／またはコンビナトリアルケミストリーに由来する分子が挙げられる。
さらに、本発明のナノ粒子は、目的の対象である他の分子と表面官能化および／またはコンジュゲートされ得る。葉酸のような低分子量小分子、前立腺膜特異的抗原（ＰＳＭＡ）、抗体、アプタマー、細胞表面の受容体もしくは抗原に結合する分子などは、ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧまたはポリマーマトリックスのＰＥＧ成分に共有結合され得る。本発明の適切な実施形態では、マトリックスは、ポリマーおよび実体を含む。いくつかの場合では、実体またはターゲティング部分は、ポリマーマトリックスの表面と共有結合され得る。治療剤は、ポリマーマトリックスの表面と会合され得るか、またはナノ粒子のポリマーマトリックス全体に封入され得る。コンジュゲートナノ粒子の細胞取り込みは、単純ナノ粒子と比較して高い。
本発明のナノ粒子は、当技術分野で周知の方法によってナノ粒子の表面に結合された１つまたはそれを超える薬剤を含み得、さらに、多機能ナノ粒子として機能するように１つまたはそれを超える薬剤を封入し得る。本発明のナノ粒子は、オールインワンシステムで腫瘍ターゲティング、腫瘍治療および腫瘍イメージングを併せ持ち得る多機能ナノ粒子として機能して、癌との闘いにおいて有用な集学的アプローチを提供し得る。多機能ナノ粒子は、類似のもしくは異なる作用機構、類似のもしくは異なる作用部位；または類似のおよび異なる機能を有する１つまたはそれを超える活性剤を有し得る。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子への実体の封入は、エマルジョン沈殿法によって調製される。本発明のプロセスを使用して調製されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子を、有機溶媒を含む有機溶媒に溶解する。ポリマーの１０〜２０重量％の重量範囲で、実体をポリマー溶液に添加する。次いで、ポリマー溶液を水相に滴下し、溶媒を蒸発させ、ナノ粒子を安定化させるために室温で１０〜１２時間撹拌する。遠心分離によって実体ロードナノ粒子を収集し、乾燥させ、さらなる使用まで２℃〜８℃で保存する。実体ロードポリマーナノ粒子の調製のためのプロセスでは、糖、アミノ酸、メチルセルロースなどのような他の添加剤を水相に添加し得る。
表３に示されているように、本発明のナノ粒子の実体ロード容量は高く、ほぼ約７０〜９０％に達する。本発明のＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧベースのナノ担体系は早期分解を防止し、抗癌ペプチドを癌細胞に有効に標的送達する。ＮｕＢＣＰ−９、Ｂａｘ ＢＨ３などの治療用ペプチドをコアに封入した表面葉状生分解性ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子は、いかなる細胞透過性ペプチドも使用せずに、癌細胞の細胞質ゾル中に有効に送達され得る。ＮｕＢＣＰ−９ロードナノ粒子をチャレンジしたＭＣＦ−７細胞株を用いたインビトロ研究では、ＸＴＴアッセイ（図７Ｂ）およびインビボ研究（図１１および１２）によって評価したように、４８〜７２時間で細胞の完全な死滅が示された。図７Ｂはまた、ＭＣＦ−７細胞株における、薬物の持続放出および効率的な送達に関するナノ粒子の有効性を、遊離薬物製剤と比較して示す。
適切な実施形態では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子への実体のより高いロードは、活性剤を低分子量ＰＬＡと結合させることによって達成される。実体は、ヒドロキシ誘導体と組み合わせたカルボジイミドカップリング試薬との反応によって、低分子量ＰＬＡと共有結合により連結される。一例として、カルボジイミドカップリング剤はエチル−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドであり、ヒドロキシ誘導体はＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）化学である。ＰＬＡの分子量は、約２，０００〜１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内である。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子への疎水性薬物および親水性薬物の両方のより高いロードが達成される（実施例５、表４および５）。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の助けを用いずに、封入ＰＬＡ−薬物を有するナノ粒子を細胞質ゾルに送達した。
したがって、１つまたはそれを超える実体（例えば、１つまたはそれを超える治療剤）を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスが本明細書で提供される。
一実施形態では、１つまたはそれを超える実体（例えば、１つまたはそれを超える治療剤）を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、（ａ）有機溶媒に溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子と共に前記実体を２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、一次エマルジョンを得ること、（ｂ）水相中の前記一次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍで乳化して、二次エマルジョンを得ること、および（ｃ）前記二次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、前記実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの前記ナノ粒子を得ることを含むプロセスが本明細書で提供される。
本発明の別の実施形態では、少なくとも１つの実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、（ａ）有機溶媒に溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子と共に前記実体を２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、一次エマルジョンを得ること、（ｂ）水相中の前記一次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍで乳化して、二次エマルジョンを得ること、および（ｃ）前記二次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、前記実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの前記ナノ粒子を得ることを含み、場合により、前記実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの前記ナノ粒子を水で洗浄し、従来の方法によって前記ナノ粒子を乾燥させる工程を含むことがあるプロセスが提供される。
本発明の別の実施形態では、少なくとも１つの実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、（ａ）有機溶媒に溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子と共に前記実体を２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、一次エマルジョンを得ること、（ｂ）水相中の前記一次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍで乳化して、二次エマルジョンを得ること、および（ｃ）前記二次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、前記実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの前記ナノ粒子を得ることを含み、前記実体が、有機小分子、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗生物質、低分子量分子、薬理学的に活性な分子、薬物、金属イオン、色素、放射性同位体、造影剤、イメージング剤およびターゲティング部分からなる群より選択される、プロセスが提供される。
本発明の別の実施形態では、少なくとも１つの実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、（ａ）有機溶媒に溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子と共に前記実体を２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、一次エマルジョンを得ること、（ｂ）水相中の前記一次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍで乳化して、二次エマルジョンを得ること、および（ｃ）前記二次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、前記実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの前記ナノ粒子を得ることを含み、前記実体が、ビタミン、リガンド、アミン、ペプチド断片、抗体およびアプタマーからなる群より選択される、プロセスが提供される。
本発明の別の実施形態では、少なくとも１つの実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、（ａ）有機溶媒に溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子と共に前記実体を２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、一次エマルジョンを得ること、（ｂ）水相中の前記一次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍで乳化して、二次エマルジョンを得ること、および（ｃ）前記二次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、前記実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの前記ナノ粒子を得ることを含み、前記実体がＰＬＡに連結されているプロセスが提供される。
本発明の別の実施形態では、少なくとも１つの実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの生分解性ポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、（ａ）有機溶媒に溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子と共に前記実体を２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、一次エマルジョンを得ること、（ｂ）水相中の前記一次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍで乳化して、二次エマルジョンを得ること、および（ｃ）前記二次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、前記実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの前記ナノ粒子を得ることを含み、前記実体が、２，０００ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内の分子量のＰＬＡに連結されているプロセスが提供される。
本発明の別の実施形態は、（ａ）有機溶媒に溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子と共に前記実体を２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、一次エマルジョンを得ること、（ｂ）水相中の前記一次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍで乳化して、二次エマルジョンを得ること、および（ｃ）前記二次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、前記実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの前記ナノ粒子を得ることを含むプロセスによって得られた少なくとも１つの実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの生分解性ポリマーナノ粒子を提供する。
本発明の別の実施形態は、（ａ）有機溶媒に溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子と共に前記実体を２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、一次エマルジョンを得ること、（ｂ）水相中の前記一次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍで乳化して、二次エマルジョンを得ること、および（ｃ）前記二次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、前記実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの前記ナノ粒子を得ることを含むプロセスによって得られた少なくとも１つの実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの生分解性ポリマーナノ粒子を含む組成物を提供する。
本発明の別の実施形態では、（ａ）有機溶媒に溶解されたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子と共に前記実体を２５０〜４００ｒｐｍでホモジナイズして、一次エマルジョンを得ること、（ｂ）水相中の前記一次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍで乳化して、二次エマルジョンを得ること、および（ｃ）前記二次エマルジョンを２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間撹拌して、前記実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの前記ナノ粒子を得ることを含むプロセスによって得られた少なくとも１つの実体を含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの生分解性ポリマーナノ粒子を含む組成物であって、場合により、保存剤、抗酸化剤、増粘剤、キレート剤、等張剤、香味剤、甘味剤、着色剤、可溶化剤、色素、香味料、結合剤、軟化剤、充填剤、潤滑剤および保存剤からなる群より選択される少なくとも１つの薬学的賦形剤を含んでいてもよい組成物が提供される。
薬学的組み合わせを含むポリマーナノ粒子
本明細書に記載される生分解性ポリマーナノ粒子は、薬学的組み合わせを送達するために使用され得る。例えば、本明細書に開示されるナノ粒子によって送達され得る薬学的組み合わせは、化学療法薬、例えばパクリタキセルおよび抗癌ペプチド、例えばＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドを含む。ナノ粒子を介して送達した場合、ＥＡＴモデルのＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるそれらの活性のように、乳癌細胞株に対するパクリタキセルおよびＮｕＢＣＰ−９のインビトロ活性は相乗的に増加した（例えば、実施例８を参照のこと）。結果は、ＮｕＢＣＰ−９と同時送達した場合、単一薬物のみの場合と比較して、パクリタキセルのＩＣ５０の約４０倍の減少を示した（例えば、実施例８および表８を参照のこと）。ＰＴＸ／ＮｕＢＣＰ−９組み合わせの機構は、アポトーシスの増強を伴うことが見出され、これはカスパーゼ依存性であり、ＭＣＦ７細胞におけるカスパーゼカスケードの本質的な部分に関与すると思われた。低濃度におけるＮｕＢＣＰ−９およびＰＴＸの併用適用は、ＥＡＴ腫瘍モデルＢａｌｂ／ｃマウスに対して、いずれかの薬物のみの場合よりも顕著に有効であった。したがって、パクリタキセルとＮｕＢＣＰ−９抗癌ペプチドとの同時送達は、乳癌などの癌を有効に処置するために使用され得る。
一態様では、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子であって、
ａ）１つまたはそれを超える化学療法剤；および
ｂ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
がロードされているポリマーナノ粒子が本明細書で提供される。
一実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドがロードされる。
別の実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドがロードされる。
一実施形態では、ＰＬＡの分子量は、約２，０００〜約８０，０００ダルトンである。
別の実施形態では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーは、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧトリブロックコポリマーとＰＬＡとの化学的コンジュゲーションから形成され、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧトリブロックコポリマーは、異なる分子量のものであり得る。
一実施形態では、ポリマーナノ粒子は、
ａ）化学療法剤または標的抗癌剤；および
ｂ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
がロードされる。
一実施形態において、ポリマーナノ粒子は、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドがロードされる。
別の実施形態において、ポリマーナノ粒子は、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドがロードされる。
一実施形態において、前記化学療法剤がパクリタキセルである。さらなる実施形態では、ポリマーナノ粒子は、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、パクリタキセルと、ＮｕＢＣＰ−９を含むペプチドとがロードされる。
別の実施形態において、前記化学療法剤がゲムシタビンである。さらなる実施形態では、ポリマーナノ粒子は、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、ゲムシタビンと、ＮｕＢＣＰ−９を含むペプチドとがロードされる。
他の実施形態では、化学療法剤または標的抗癌剤は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトライド（ジテルピノイドエポキシド）、ゲルダナマイシン（ＨＳＰ９０阻害剤）、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキセートおよびボルテゾミブからなる群より選択される。
一実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーから本質的になる。
別の態様では、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心臓血管疾患、肝臓疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経学的障害からなる群より選択される疾患の処置に使用するためのポリマーナノ粒子であって、
ａ）ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマー；
ｂ）１つまたはそれを超える治療薬；および
ｃ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
を含むポリマーナノ粒子が本明細書で提供される。
一実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーから本質的になる。
組成物
一態様では、癌などの疾患の処置または予防のための医薬の調製において使用するための本発明のポリマーナノ粒子であって、薬学的組み合わせを含む本発明のポリマーナノ粒子が本明細書で提供される。一実施形態では、薬学的組み合わせを含むポリマーナノ粒子は、癌の処置のための医薬の調製において使用するためのものである。
別の態様では、本発明は、医薬を製造するための、薬学的組み合わせを含むＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーから本質的になる生分解性ポリマーナノ粒子の使用を提供する。
また、本発明のポリマーナノ粒子を含む組成物であって、前記ポリマーナノ粒子が、治療剤の薬学的組み合わせ（例えば、ＮｕＢＣＰ−９を含むペプチドおよび化学療法剤または標的抗癌剤）と、薬学的に許容され得る担体とを含む組成物も本明細書で提供される。
一態様では、癌などの疾患の処置または予防のための医薬を製造するための、薬学的組み合わせを含むポリマーナノ粒子の使用が本明細書で提供される。一実施形態では、薬学的組み合わせを含むポリマーナノ粒子の使用は、癌などの疾患の処置のための医薬を製造するためのものである。
本明細書で提供される組成物の一実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ポリマーナノ粒子の外側に結合したターゲティング部分をさらに含み、ターゲティング部分は、抗体、ペプチドまたはアプタマーである。
一態様では、
ａ）ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子；
ｂ）１つまたはそれを超える化学療法剤または抗癌標的薬剤；および
ｃ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
を含む組成物が本明細書で提供される。
組成物の一実施形態では、組成物は、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドを含む。
組成物の別の実施形態では、組成物は、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドを含む。
組成物の一実施形態では、前記ＰＬＡの分子量が約２，０００〜約８０，０００ダルトンである。
組成物の一実施形態では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーは、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧトリブロックコポリマーとＰＬＡとの化学的コンジュゲーションから形成され、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧトリブロックコポリマーは、異なる分子量のものであり得る。
組成物の一実施形態では、ポリマーナノ粒子は、
ａ）化学療法剤または標的抗癌剤；および
ｂ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
がロードされる。
一実施形態において、ポリマーナノ粒子は、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドがロードされる。
別の実施形態において、ポリマーナノ粒子は、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドがロードされる。
組成物のさらなる実施形態では、前記化学療法剤がパクリタキセルである。
組成物のなおさらなる実施形態では、前記ポリマーナノ粒子に、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、パクリタキセルと、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドとがロードされている。
組成物の別の実施形態では、前記化学療法剤がゲムシタビンである。組成物のさらなる実施形態では、前記ポリマーナノ粒子に、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、ゲムシタビンと、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドとがロードされている。
組成物の別の実施形態では、前記化学療法剤または標的抗癌剤が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトライド、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキセートおよびボルテゾミブからなる群より選択される。
別の態様では、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心臓血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経学的障害からなる群より選択される疾患の処置に使用するための医薬組成物であって、
ａ）ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子；
ｂ）１つまたはそれを超える治療剤；および
ｃ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチド
を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
一実施形態では、組成物は、癌の処置において使用するためのものである。さらなる実施形態において、前記癌が、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、転移性結腸癌、膵臓癌または血液学的悪性腫瘍である。
またさらなる実施形態では、癌は、乳癌である。
別の態様では、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心臓血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経学的障害からなる群より選択される疾患の処置に使用するための医薬組成物であって、
ａ）ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子；
ｂ）１つまたはそれを超える治療剤；および
ｃ）ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
一実施形態では、組成物は、癌の処置において使用するためのものである。さらなる実施形態において、前記癌が、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、転移性結腸癌、膵臓癌または血液学的悪性腫瘍である。またさらなる実施形態では、癌は、乳癌である。
本明細書で提供される組成物のいずれかの実施形態では、前記ポリマーナノ粒子が、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーから本質的になる。
本明細書で提供される組成物のいずれかの実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ポリマーナノ粒子の外側に結合したターゲティング部分をさらに含み、ターゲティング部分は、抗体、ペプチドまたはアプタマーである。
適切な医薬組成物または製剤は、例えば、有効成分（単数または複数）の約０．１％〜約９９．９％、好ましくは約１％〜約６０％を含有し得る。経腸または非経口投与用の医薬製剤は、例えば、糖コーティング錠剤、錠剤、カプセルもしくは坐剤などの単位剤形のものまたはアンプルである。他に指示がない場合、これらは、それ自体が公知の手法において、例えば、従来の混合、造粒、糖コーティング、溶解または凍結乾燥プロセスの方法によって、調製される。各剤形の個々の用量に含まれている併用パートナーの単位含有量は、必須有効量が複数の投薬単位の投与によって達し得るため、それ自体が有効量を構成する必要はないと認識されよう。
医薬組成物は、有効成分として、１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体（賦形剤）と組み合わせて本発明のナノ粒子の１つまたはそれよりも多くを含有し得る。本発明の組成物の作製において、有効成分は通常、賦形剤と混合されるか、賦形剤によって希釈されるか、または例えば、カプセル、小袋、紙もしくは他の容器の形態のこのような担体内に封入される。賦形剤が希釈剤としての役割を果たす場合、それは、有効成分のビヒクル、担体もしくは媒質として作用する固体、半固体または液体材料であり得る。したがって、組成物は、例えば、活性化合物の最大１０重量％を含有する、錠剤、丸剤、粉末、トローチ剤、小袋、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ剤、エアロゾル（固体としてまたは液体媒質中で）、軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射液および滅菌パッケージ化粉末の形態であり得る。
適切な賦形剤のいくつかの例としては、ラクトース（例えば、ラクトース一水和物）、右旋糖、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム）、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、コロイド状二酸化ケイ素、微晶性セルロース、ポリビニルピロリドン（例えば、ポビドン）、セルロース、水、シロップ、メチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。製剤は、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油などの潤滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、メチル−およびプロピルヒドロキシ−安息香酸塩などの保存剤、甘味剤および香味剤をさらに含み得る。
本発明の化合物および組成物が経口または注射による投与のために組み込まれ得る液体形態としては、水溶液、好適には香味シロップ、水性もしくは油性懸濁液および綿実油、胡麻油、ヤシ油もしくは落花生油などの食用油を使用した香味エマルジョン、ならびにエリキシル剤および類似の薬学的ビヒクルが挙げられる。
処置方法
また別の態様では、本発明は、疾患を処置するための方法であって、薬学的組み合わせ（すなわち、１つを超える治療剤）を含む（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧから本質的になる）本発明の生分解性ポリマーナノ粒子をそれを必要とする被験体に投与することを含む方法を提供する。
一実施形態では、疾患は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心臓血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経学的障害からなる群より選択される。
癌の処置を必要とする被験体における癌を処置するための方法であって、
ａ）化学療法剤および／または標的抗癌剤；ならびに
ｂ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
がロードされたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含む治療有効量のポリマーナノ粒子を前記被験体に投与することを含む方法も本明細書で提供される。
一実施形態において、ポリマーナノ粒子は、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドがロードされる。
別の実施形態において、ポリマーナノ粒子は、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドがロードされる。
一実施形態において、前記化学療法剤がパクリタキセルである。さらなる実施形態では、ポリマーナノ粒子は、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、パクリタキセルと、ＮｕＢＣＰ−９を含むペプチドとがロードされる。
別の実施形態において、前記化学療法剤がゲムシタビンである。さらなる実施形態では、ポリマーナノ粒子は、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、ゲムシタビンと、ＮｕＢＣＰ−９を含むペプチドとがロードされる。
他の実施形態では、化学療法剤または標的抗癌剤は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトライド、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキセートおよびボルテゾミブからなる群より選択される。さらなる実施形態では、ポリマーナノ粒子は、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、化学療法剤または標的抗癌剤（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトライド、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキセートまたはボルテゾミブ）と、ＮｕＢＣＰ−９を含むペプチドとがロードされる。
一実施形態において、前記癌が、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、転移性結腸癌、膵臓癌または血液学的悪性腫瘍である。特定の実施形態では、癌は、乳癌である。
一態様では、疾患の処置を必要とする被験体における疾患を処置するための方法であって、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーから本質的になる治療有効量のポリマーナノ粒子を前記被験体に投与することを含み、前記ポリマーナノ粒子に、
ａ）１つまたはそれを超える治療剤；および
ｂ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
がロードされている方法が本明細書で提供される。
一実施形態において、ポリマーナノ粒子は、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドがロードされる。
別の実施形態において、ポリマーナノ粒子は、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドがロードされる。
一実施形態において、疾患は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心臓血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経学的障害からなる群より選択される。
別の態様では、癌の処置を必要とする被験体における癌を処置するための方法であって、
ａ）ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子；
ｂ）化学療法剤および／または抗癌標的薬剤；ならびに
ｃ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
を含む治療有効量の医薬組成物を前記被験体に投与することを含む方法が本明細書で提供される。
方法の一実施形態では、前記医薬組成物が、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドを含む。
方法の別の実施形態では、前記医薬組成物が、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドを含む。
方法の一実施形態では、前記化学療法剤がパクリタキセルである。前記方法のさらなる実施形態では、前記ポリマーナノ粒子に、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、パクリタキセルと、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドとがロードされている。
方法の別の実施形態では、前記化学療法剤がゲムシタビンである。前記方法のさらなる実施形態では、ポリマーナノ粒子は、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、ゲムシタビンと、ＮｕＢＣＰ−９を含むペプチドとがロードされる。
方法の別の実施形態では、前記化学療法剤または標的抗癌剤が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトライド、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキセートおよびボルテゾミブからなる群より選択される。
方法の一実施形態では、前記癌が、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、転移性結腸癌、膵臓癌または血液学的悪性腫瘍である。
薬学的組み合わせを含むポリマーナノ粒子の投与は、本発明の組み合わせにおいて使用される薬学的治療剤の１つのみを適用する単剤療法（ポリマーナノ粒子送達系を使用する単剤療法、または従来の手段によって薬剤を送達する単剤療法のいずれか）と比較して、有益な効果、例えば症候の緩和、症候の進行の遅延または症候の阻害に関する相乗的な治療効果をもたらし得るだけではなく、さらに驚くべき有益な効果、例えばより少ない副作用、より持続的な反応、生活の質の改善、または罹患率の減少ももたらし得る。
薬学的組み合わせを含むポリマーナノ粒子が前記の有益な効果をもたらすことは、確立された試験モデルによって示され得る。当業者であれば、このような有益な効果を証明するために関連試験モデルを十分に選択することができる。薬学的組み合わせを含むポリマーナノ粒子の薬理学的活性は、例えば、臨床研究または動物モデルにおいて実証され得る。
１つまたはそれを超える成分間の相乗的相互作用の決定において、効果のための最適範囲および効果のための各成分の絶対用量範囲は、異なるｗ／ｗ比範囲における前記成分の投与および処置を必要とする被験体への投薬によって最終的に測定され得る。ヒトの場合、患者の臨床研究を行うための複雑性および費用は、相乗作用の主要モデルとしてこの形式の試験を使用することを非現実的にし得る。しかしながら、特定の実験における相乗作用の観察結果（例えば、実施例８を参照のこと）は、他の種における効果を予測するものであり得、動物モデルの存在は、相乗効果をさらに定量するために使用され得る。このような研究の結果はまた、有効用量比範囲および絶対用量および血漿濃度を予測するために使用され得る。
一実施形態では、本明細書で提供される薬学的組み合わせを含むポリマーナノ粒子または薬学的組み合わせを含むポリマーナノ粒子を含む医薬組成物またはそれらの両方は、相乗効果を示す。本明細書で使用される「相乗効果」という用語は、例えば、癌またはその症候の症候性進行を遅らせる効果であって、単独投与（ポリマーナノ粒子送達系を使用する単独投与、または従来の手段によって薬剤を送達する単独投与のいずれか）した各薬物の効果の単純加算よりも大きな効果を生じさせる２つの薬剤（例えば、パクリタキセル、およびＮｕＢＣＰ−９を含むペプチド）の作用を指す。相乗効果は、Ｓ字形Ｅｍａｘ方程式（Ｈｏｌｆｏｒｄ，Ｎ．Ｈ．Ｇ．ａｎｄ Ｓｃｈｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｂ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．６：４２９−４５３（１９８１））、ローウェ加法性方程式（Ｌｏｅｗｅ，Ｓ．ａｎｄ Ｍｕｉｓｃｈｎｅｋ，Ｈ．，Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１４：３１３−３２６（１９２６））および半有効方程式（Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｃ．ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ，Ｐ．，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．２２：２７−５５（１９８４））などの適切な方法を使用して計算され得る。上記で言及されている各方程式を実験データに適用して対応するグラフを作成し、薬学的組み合わせの効果の評価を支援し得る。上記で言及されている方程式に関連する対応するグラフは、それぞれ濃度−効果曲線、アイソボログラム曲線および組み合わせ指標曲線である。
さらなる実施形態では、被験体に投与するための、相乗的な薬学的組み合わせを含むポリマーナノ粒子であって、各成分の用量範囲が、適切な腫瘍モデルまたは臨床研究において示唆される相乗的範囲に対応するポリマーナノ粒子が本明細書で提供される。
本明細書で提供されるポリマーナノ粒子の形成において使用される組み合わせにおいて用いられる各組み合わせパートナーの有効投与量は、用いられる特定の化合物または医薬組成物、投与様式、処置される症状、および処置される症状の重症度に応じて変動し得る。したがって、薬学的組み合わせを含むポリマーナノ粒子の投与レジメンは、投与経路ならびに患者の腎機能および肝機能を含む様々な要因にしたがって選択される。
特定の比の薬学的組み合わせが開示されるが、本明細書で提供されるポリマーナノ粒子の形成において使用される組み合わせパートナー（例えば、ＮｕＢＣＰ−９を含むペプチドおよびパクリタキセル）の最適な比および濃度であって、毒性を伴わずに有効性をもたらす最適な比および濃度は、標的部位に対する治療剤のアベイラビリティの動態に基づくものであり、当業者に公知の方法を使用して決定される。
本明細書に開示される処置方法は、本明細書に記載されるポリマーナノ粒子の使用によって処置可能と記載されている癌の少なくとも１つと診断された被験体に特に適切であり得る。例えば、細胞内ＰＴＸ送達のための生分解性テトラブロックポリマーナノ粒子（ＰＴＸ／ＮＰ）は、ＰＴＸ流出の阻害において非常に有効である。実施例９に記載されているように、ＰＴＸ／ＮＰは、ＰＴＸおよびｎａｂ−パクリタキセルに対して耐性のＰ−ｇｐ発現乳癌細胞に対して活性である。
いくつかの実施形態では、被験体は、本明細書で指定される癌と診断されており、少なくとも１つの従来の化学療法剤、例えばパクリタキセル、ｎａｂ−パクリタキセル（アブラキサン）、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソールによる処置に対して不応性であることが判明している。したがって、一実施形態では、本発明の処置は、従来の化学療法薬による１回または１回を超える処置を受けた被験体または患者であって、より有効な処置を依然として必要とする被験体または患者を対象とする。特定の実施形態では、本発明の処置は、パクリタキセルまたはｎａｂ−パクリタキセルによる処置を受けた被験体または患者であって、より有効な処置を依然として必要とする被験体または患者を対象とする。
本明細書で提供される方法のいずれかの実施形態では、パクリタキセルまたはｎａｂ−パクリタキセルによる処置に対して耐性である。
本明細書で提供される方法のいずれかの実施形態では、パクリタキセルまたはｎａｂ−パクリタキセルによる処置に対して不応性である。
本明細書に提供される方法の別の実施形態において、パクリタキセルまたはｎａｂ−パクリタキセルによる処置後に再発状態にある。
別の態様では、細胞におけるパクリタキセル流出を阻害するため方法であって、前記細胞と、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含む有効量のポリマーナノ粒子とを接触させることを含む、方法が本明細書に提供される。
本発明の実施形態において、前記ポリマーナノ粒子にパクリタキセルがロードされている。
また別の態様では、細胞におけるＰ−糖タンパク質発現を遮断するため方法であって、前記細胞と、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含む有効量のポリマーナノ粒子とを接触させることを含む、方法が本明細書に提供される。
別の態様では、細胞におけるＰ−糖タンパク質媒介性薬剤耐性を打ち消すための方法であって、前記細胞と、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含む有効量のポリマーナノ粒子とを接触させることを含む、方法が本明細書に提供される。
本明細書で提供される方法のいずれかの実施形態では、前記ポリマーナノ粒子がＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーから本質的になる。
別の態様では、第１の化学療法薬に対する耐性を有する癌細胞を生じさせるための方法であって、前記癌細胞と、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子とを接触させることを含み、前記ポリマーナノ粒子に第２の化学療法薬がロードされており、Ｐ−糖タンパク質のアップレギュレーションによって、前記第１の化学療法薬に対する前記癌細胞の前記耐性を生じさせる、方法が本明細書に提供される。
本方法の一実施形態において、前記ポリマーナノ粒子がＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーから本質的になる。
本方法の一実施形態において、前記癌細胞が乳癌細胞である。
本方法の一実施形態において、前記第１の化学療法薬がパクリタキセルである。
本方法の一実施形態において、前記第２の化学療法薬がパクリタキセルである。
本方法の一実施形態において、前記ポリマーナノ粒子に、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドがロードされている。
本発明の別の実施形態において、前記ポリマーナノ粒子に、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドがロードされている。
主題は、その特定の好ましい実施形態を参照してかなり詳細に記載されているが、他の実施形態も可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨と範囲は、そこに含まれるその好ましい実施形態の説明に制限されるべきではない。
次に、実施例を用いて本開示を例証するが、これは本開示の実施を例証するためのものであり、本開示の範囲に対していかなる限定も制限的に意図するものではない。特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。開示される方法および組成物の実施に際して、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料が使用され得るが、例示的な方法、装置および材料が本明細書に記載される。
実施例１：ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子の調製
ポリ（乳酸）（Ｍｗ．約４５，０００〜７２，０００ｇ／ｍｏｌ）、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ（表１）および組織培養試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。すべての試薬は分析グレードかまたはそれを超えるものであり、特に指定がない限りそのまま使用した。細胞株は、ＮＣＣＳ Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａから入手した。９５％の純度でＮｕＢＣＰ−９ペプチドをカスタム合成した。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの調製
２５０ｍｌ丸底フラスコ中で、６０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する５ｇｍのポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を１００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２（ジクロロメタン）に溶解した。この溶液に、０．７ｇのＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマー（分子量範囲１１００〜１２，５００Ｍｎ）を添加した。この溶液を０℃で１０〜１２時間撹拌した。この反応混合物に、５ｍｌの１％Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）溶液を添加し、続いて、５ｍｌの０．１％４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を−４℃〜０℃／サブゼロ温度で徐々に添加した。この反応混合物をさらに２４時間撹拌し、続いて、ジエチルエーテルを用いてＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを沈殿させ、Ｗｈａｔｍａｎろ紙Ｎｏ．１を使用してろ過した。そのようにして得られたこのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマー沈殿物を低減圧下で乾燥させ、さらなる使用まで２℃〜８℃で保存した。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の調製
エマルジョン沈殿法によって、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を調製した。上記プロセスによって得た１００ｍｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーを有機溶媒、例えばアセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジクロロメタンに別々に溶解して、ポリマー溶液を得た。
このポリマー溶液を２０ｍｌの蒸留水の水相に滴下することによって、ナノ粒子を調製した。この溶液を室温で１０〜１２時間磁気撹拌して、残りの溶媒を蒸発させ、ナノ粒子を安定化させた。次いで、２５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによってナノ粒子を収集し、蒸留水を使用して３回洗浄した。ナノ粒子をさらに凍結乾燥させ、さらなる使用まで２℃〜８℃で保存した。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子の特性評価
図４Ａ〜Ｂに示されている透過型電子顕微鏡画像に見られるように、上記プロセスによって得たナノ粒子の形状は、本質的に球状である。ＴＥＭ画像により、粒径範囲が約３０〜１２０ｎｍであると決定した。動的光散乱（ＤＬＳ）機器を使用してナノ粒子の流体力学半径を測定したところ、１１０〜１２０ｎｍの範囲内である（表２）。
ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの分子量の範囲を使用して合成したＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の特性は、表２に示されている。
ＰＬＡ、ＰＬＡ−ＰＥＧ、ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧおよびポリマーナノ粒子ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのＦＴＩＲスペクトルは、図２Ａに示されている。ＦＴＩＲは、これらの種間の差異に対して非感受性であることが判明した。したがって、ＮＭＲを使用して、さらなる特性評価を行った。
異なる分子量のブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧを使用して得たＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子のＮＭＲスペクトルは、図３Ａ〜Ｃに示されている。図中において、約５．１の化学シフトを有するプロトンは、ＰＬＡのエステルプロトンを表し、約３．５の化学シフトを有するプロトンは、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのエーテルプロトンを表す。スペクトルにおける両プロトンの存在は、ＰＬＡとＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧとのコンジュゲーションを裏付けている。
実施例２：実体封入ナノ粒子の調製
薬物封入ポリマーナノ粒子の調製
本発明のナノ粒子は本質的には両親媒性であり、ドキソルビシンのような疎水性薬物および抗癌９量体ペプチド（Ｌ−ＮｕＢＣＰ−９、ＦＳＲＳＬＨＳＬＬのＬ−立体配置）、１６量体ＢＨ３ドメインなどのような親水性薬物の両方をロードすることができる。
実施例１のプロセスを使用して調製した１００ｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子をアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；Ｃ３Ｈ７ＮＯ）、アセトンまたはジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）のような５ｍｌの有機溶媒に溶解する。
１〜５ｍｇの薬物実体、ＮｕＢＣＰ−９（ＦＳＲＳＬＨＳＬＬのＬ−立体配置）を水溶液に溶解し、上記ポリマー溶液に添加した。実体は、通常、ポリマーの約１０〜２０％重量の重量範囲で用いられる。この溶液を２５０〜４００ｒｐｍで簡単に１０〜１５秒間超音波処理して、微細一次エマルジョンを生成する。
シリンジ／マイクロピペットを使用して、微細一次エマルジョンを２０ｍｌの蒸留水の水相に滴下し、溶媒を蒸発させ、ナノ粒子を安定化させるために２５０〜４００ｒｐｍ、２５℃〜３０℃で１０〜１２時間磁気撹拌する。水相は、糖添加剤をさらに含む。得られたナノ粒子懸濁液を開放無蓋条件下で一晩撹拌して、残りの有機溶媒を蒸発させた。１０，０００ｇで１０分間遠心分離することによって、または３０００ｇで１５分間限外ろ過することによって、ＮｕＢＣＰ−９封入ポリマーナノ粒子を収集する（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ，Ｕｌｔｒａｃｅｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ、１００，０００ＮＭＷＬ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）。ナノ粒子を蒸留水に再懸濁し、３回洗浄し、凍結乾燥させる。さらなる使用まで、これらを２℃〜８℃で保存する。このポリマーナノ粒子は高度に安定しており、隠れた特徴はない。
異なる重量のコポリマーを使用して調製したポリマーナノ粒子のロード効果の比較
上記プロセスを使用し、異なる分子量のＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーを使用して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子を調製した。異なる分子量のＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーを使用して合成したＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーを使用して、ピレンロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子を調製した。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの２〜２０％重量の範囲内でピレンを用い、蛍光色素ロードナノ粒子を調製した。ナノ粒子の実体ロード容量は、ナノ粒子の合成に使用したＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーの分子量に応じて変動した。表３は、異なる分子量のブロックコポリマーを使用して生成したポリマーナノ粒子によって封入したイメージング分子の割合を提供する。
蛍光色素ローダミンの細胞インターナリゼーション
上記プロセスを使用して、ローダミンロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子を調製した。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの２〜２０％重量の範囲内でローダミンを用い、蛍光色素ロードナノ粒子を調製した。
最初に、１×１０５個のＭＣＦ−７細胞をプレーティングし、カバースリップフラスコ上で６０％コンフルエンスまで成長させた。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する１０ｍｌのＤＭＥＭ培地中で２４時間培養した。次いで、成長培地を吸引し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。カバースリップに付着させた細胞にローダミンロードナノ粒子を添加し、３７℃で１２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、カバースリップを取り出した。この後、ＰＢＳ溶液で洗浄し、最後に、４％パラホルムアルデヒドによって室温で２０分間固定した。固定剤を除去した後、細胞を洗浄し、ＤＡＰＩ（蛍光色素染色核細胞）で細胞を５分間染色し、次いで、水道水で１分間リンスした。次いで、共焦点蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ＦＶ１０００ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｊａｐａｎ）を使用して、カバースリップを分析した。共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）と併せて蛍光色素（ローダミンＢ）ロードナノ粒子を使用することによって、ＭＣＦ−７細胞へのナノ粒子の細胞インターナリゼーションを確認した（図５）。
実施例３：ターゲティング部分を有する薬物封入ポリマーナノ粒子の調製
それぞれ−ＣＯＯＨまたは−ＮＨ２官能基を提供するアミンまたはアミノ酸のような様々な小分子は、本発明のポリマーナノ粒子への生体分子（ターゲティング部分として）のコンジュゲーションに使用され得る。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−リジンの調製
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーをアミノ酸リジンにコンジュゲートして、−ＮＨ２基をもたらした。２５０ｍｌ ＲＢフラスコ中で、５ｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧおよび０．０５ｇのリジンを１００ｍｌのアセトニトリル／ジクロロメタン（１：１）に溶解し、−４〜０℃で撹拌した。この溶液に、１％Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）溶液を添加し、続いて、０．１％４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を０℃で徐々に添加した。この反応混合物を２４時間撹拌し、続いて、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−リジンをジエチルエーテルで沈殿させ、Ｗｈａｔｍａｎろ紙Ｎｏ．１に通してろ過した。沈殿物を低減圧下で乾燥させ、さらなる使用まで２℃〜８℃で保持した。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−リジンからのナノ粒子の調製
ナノ粒子の調製のために、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−リジンコポリマー（１００ｍｇ）をアセトニトリル（またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）もしくはジクロロメタン）に溶解した。次いで、薬物（ポリマーの約１０〜２０％重量）を溶液に添加し、簡単に１５秒間超音波処理して、一次エマルジョン生成した。得られた一次エマルジョンを蒸留水（２０ｍｌ）の水相に滴下し、溶媒を蒸発させ、ナノ粒子を安定化させるために室温で１０〜１２時間磁気撹拌した。形成されたナノ粒子を、２５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって収集し、蒸留水を使用して３回洗浄し、凍結乾燥させ、続いて、さらなる使用のために２〜８℃で保存した。
ナノ粒子と葉酸（ＦＡ）とのバイオコンジュゲーション
２０ｍｇの凍結乾燥ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子をｍｉｌｌｉＱ水に溶解し、Ｎ−（３−ジエチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）（５０μｌ、４００ｍＭ）およびＮ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）（５０μｌ、１００ｍＭ）で処理し、混合物を穏やかに２０分間振盪した。この後、１０ｍＭの葉酸溶液を添加し、溶液を穏やかに３０分間振盪し、続いて、アミコンフィルタを使用してろ過し、ろ液中に残った未反応ＦＡを除去した。葉酸コンジュゲートナノ粒子を凍結乾燥させ、続いて、−２０℃で保存した。
実施例４：ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子の送達可能性の評価
ポリマーナノ粒子ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧによる封入薬物のインビトロ放出
１０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水と、ローダミンＢコンジュゲートＮｕＢＣＰ−９（薬物）を封入した１０ｍｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子とを含有する混合物を２００ｒｐｍ、３７℃で撹拌した。異なる時間間隔において２５，０００ｒｐｍで６日間遠心分離することによって、混合物の上清サンプルを収集した。各遠心分離後、ナノ粒子を新たな緩衝液に再懸濁した。ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）を使用して２ｍｌの上清をタンパク質評価に供して、５６２ｎｍにおける分光測定で薬物放出の量を評価した。標準検量線を用いて、薬物放出を計算した。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子による薬物の放出は、従来のＰＬＡナノ粒子よりも良好に制御され得ることが観察された（図６Ａ）。
ＸＴＴ（ナトリウム２，３，−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）−カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム内塩）アッセイ
一次ＨＵＶＥＣ細胞株およびＭＣＦ−７細胞株において、ＸＴＴ（ナトリウム２，３，−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）−カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム内塩）を使用した細胞生存アッセイを行った（図６Ｂ、７Ａおよび７Ｂ）。
合計１×１０４個のＭＣＦ−７細胞を９６ウェルプレートの各ウェル上に播種し、２４時間培養した。２４時間後、５μＭ ＮｕＢＣＰ−９ペプチドを含有する本発明のポリマーナノ粒子、またはいかなるペプチドも含まない対照ナノ粒子で、各プレート中の細胞を処置した。また、いかなる細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）も有しない同じ濃度のＮｕＢＣＰ−９ペプチドで、細胞を別々に処置した。１６時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間の範囲の異なる時間間隔で、細胞をナノ粒子と共にインキュベートした。インキュベーション後、抗癌ペプチドＮｕＢＣＰ−９をロードしたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を含有する培地を新たな培地と交換し、１０μｌの再構成ＸＴＴ混合物キット試薬を各ウェルに添加した。４時間培養した後、マイクロタイタープレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用することによって、サンプルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。未処置対照の生存細胞に対する割合として細胞の増殖を決定し、３回反復で分析した。図６Ｂは、時間との関連で、ＭＣＦ−７細胞株の細胞生存に対するＮｕＢＣＰ−９ロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の効果を示す。図７Ａは、時間との関連で、一次ＨＵＶＥＣ細胞株の細胞生存に対する薬物ＮｕＢＣＰ−９ロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の効果を示す。
実施例５：ナノ粒子へのより高い治療剤ロードを達成するためのペプチド薬の改変
低分子量ＰＬＡで薬物部分を共有結合により改変することによって、疎水性治療剤および親水性治療剤のより高いロードを達成した。エチル−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）化学を使用し、低分子量のＰＬＡを使用して、ペプチド薬を改変する。実体の連結に使用したＰＬＡの平均分子量は、通常、約２，０００〜１０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲内である。
５，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する１ｇのＰＬＡを１０ｍｌのアセトニトリルに溶解した。この溶液に、５００μｌのジクロロメタン中Ｎ−（３−ジエチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ；４００ｍＭ）および５００μｌのジクロロメタン中Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ；１００ｍＭ）を添加した。混合物を穏やかに２時間振盪し、続いて、ジエチルエーテルでＰＬＡを沈殿させた。このＰＬＡを「活性化」ＰＬＡと命名した。１ｍｍｏｌの活性化ＰＬＡをアセトニトリルに溶解し、この溶液に１ｍｍｏｌのペプチド薬ＮｕＢＣＰ−９を添加し、反応混合物を再度穏やかに３０分間振盪した。次いで、混合物をジエチルエーテルで沈殿させ、低減圧下で乾燥させ、続いて、さらなる使用まで−２０℃で保存した。
ポリマーナノ粒子の薬物ロード容量は、ナノ粒子の調製に使用したブロックコポリマーの重量の増加と共に増加した。表４および５に示されているように、ナノ粒子の薬物ロード容量はまた、薬物をポリマーナノ粒子にロードする前に、低分子量ＰＬＡを治療剤（すなわち、ＮｕＢＣＰ−９）にコンジュゲートすることによって顕著に増加する。本発明のナノ粒子の薬物ロード容量の増加は、５％〜１０％である。
実施例６：ナノ粒子の安全性および毒性を評価するためのインビボ研究
実施例１に示されているプロセスを使用して調製したＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子の毒性および安全性を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて研究を行った。
血液学的パラメータ
１５０ｍｇ／体重ｋｇの単回用量でＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を動物群に静脈内注射し、対照群およびナノ粒子処置群において２１日間にかけて７日間隔で血液学的パラメータを評価した。対照群にはナノ粒子を投与しなかった。
図８に見られるように、対照群とナノ粒子処置群との間で、全血球数（ＣＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）数、白血球（ＷＢＣ）数、好中球、リンパ球、血中血球容積、ＭＣＶ（平均赤血球容積）、ＭＣＨ（平均赤血球ヘモグロビン量）およびＭＣＨＣ（平均赤血球ヘモグロビン濃度）の顕著な変化はなかった。
肝機能および腎機能の生化学血液アッセイ
１５０ｍｇ／体重ｋｇの単回用量でＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を動物群に静脈内注射し、対照群およびナノ粒子処置群において２１日間にかけて７日間隔で血液学的パラメータを評価した。
対照群と処置群との間で、総タンパク質、アルブミンおよびグロブリンレベルの顕著な変化はなかった。図９に見られるように、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子処置群では、肝臓酵素（アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ））のレベルの増加は無視できるものであった。尿素および血中尿素窒素（ＢＵＮ）は、腎機能の優れた指標である。図９に見られるように、処置マウスの尿素およびＢＵＮレベルは、対照と比較して顕著な変化はなかった。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子で処置したマウスの器官の組織病理学
１５０ｍｇ／体重ｋｇの単回用量のＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子でＢＡＬＢ／ｃマウスを処置した。２１日後、動物を屠殺し、器官組織の組織学的検査を行って、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子またはその分解産物によって引き起こされた毒性による任意の組織損傷、炎症または病変を評価した。図１０に示されているように、ナノ粒子処置動物の脳、心臓、肝臓、脾臓、肺および腎臓では、明白な病理組織学的な異常または病変は観察されなかった。
実施例７：インビボにおけるナノ担体系としてのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の有効性
ナノ担体系としてのナノ粒子の有効性を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃ型系統のエールリッヒ腹水腫瘍（ＥＡＴ）モデルトランスジェニックマウスを使用した。２０ｇの体重を有する動物を研究に用いた（図１２Ａ）。
抗癌ペプチド薬ＮｕＢＣＰ−９をＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子にロードした。２００〜１０００μｇのペプチドの用量で、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧに封入した抗癌ペプチドＮｕＢＣＰ−９を含むポリマーナノ粒子（実施例２で調製したもの）の腹腔内製剤をマウスに投与した。動物に投与した抗癌ペプチドの総重量は、３００μｇ〜６００μｇ／マウスであった。製剤の投与頻度は、２１日間にわたって週２回であり、動物を６０日間観察した。
ＮｕＢＣＰ−９をロードしたナノ粒子の投与後、マウスにおいて腫瘍成長抑制が６０日間観察された（図１１）。ＮｕＢＣＰ−９ロードナノ粒子で処置したマウスは、対照群（図１２ｃ）と比較して完全に腫瘍が治癒していることが見出された（図１２ｂ）。いかなる治療剤も含まない単純ナノ粒子を対照群に投与した。
糖尿病ウサギにおける非経口デポーとしてのインスリンロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の評価
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子へのインスリンの封入
ダブルエマルジョン溶媒蒸発法によって、インスリン封入ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を調製した。ナノ粒子の調製のために、１ｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーをアセトニトリルに溶解した。インスリン（５００Ｉ．Ｕ．）を溶液に添加し、簡単に１５秒間超音波処理して、一次エマルジョン生成した。得られた一次エマルジョンを３０ｍｌの水相に滴下し、溶媒を蒸発させ、ナノ粒子を安定化させるために室温で６〜８時間磁気撹拌した。２１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによってナノ粒子を収集し、蒸留水を使用して３回洗浄した。インスリンロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を凍結乾燥させ、さらなる使用まで４℃で保存した。
インビボ研究
インスリンロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を５０Ｉ．Ｕ．／体重ｋｇの単回用量で糖尿病ウサギに皮下投与し、１０日間モニタリングした。
５０Ｉ．Ｕ．／体重ｋｇのインスリン用量を投与した動物では、血中グルコースレベルは１２０〜１５０ｍｇ／ｄｌで最大８日間まで維持された後、血中グルコースレベルの緩やかな増加が観察された。薬物ロードポリマーナノ粒子は注射部位でデポーを形成し、緩徐な分解および拡散により、封入インスリンを持続的に放出する。８日後においてさえ、グルコースレベルは元の糖尿病レベル（５００ｍｇ／ｄｌ）に戻らなかったが、これは、１週間を超える期間にわたって生物活性インスリンを保持して持続的に放出するポリマーナノ粒子の能力を示している（図１３）。
ＭＵＣ１ロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の評価：
ポリマーナノ粒子ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧによる封入ＭＵＣ１のインビトロ放出
１０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水と、ポリアルギニンタンパク質導入ドメイン（Ａｃ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＣＱＣＲＲＫＮ−ＮＨ２）に連結されたＭＵＣ１細胞質ドメインペプチドにコンジュゲートされたローダミンＢを封入した１０ｍｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子とを含有する混合物を２００ｒｐｍ、３７℃で撹拌した。異なる時間間隔において２５，０００ｒｐｍで６日間遠心分離することによって、混合物の上清サンプルを収集した。各遠心分離後、ナノ粒子を新たな緩衝液に再懸濁した。ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）を使用して２ｍｌの上清をタンパク質評価に供して、５６２ｎｍにおける分光測定で薬物放出の量を評価した。標準検量線を用いて、薬物放出を計算した。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマーナノ粒子による薬物の放出は、最大６０日間制御され得ることが観察された（図１４）。
ＸＴＴ（ナトリウム２，３，−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）−カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム内塩）アッセイ
一次ＨＵＶＥＣ細胞株およびＭＣＦ−７細胞株において、ＸＴＴ（ナトリウム２，３，−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）−カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム内塩）を使用した細胞生存アッセイを行った。
合計１×１０４個のＭＣＦ−７細胞を９６ウェルプレートの各ウェル上に播種し、２４時間培養した。２４時間後、ポリアルギニン配列（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＣＱＣＲＲＫＮ）に連結された２０もしくは３０μＭのＭＵＣ１細胞質ドメインペプチドを含有する本発明のポリマーナノ粒子、またはいかなるペプチドも含まない対照ナノ粒子で、各プレート中の細胞を処置した。１６時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間の範囲の異なる時間間隔で、細胞をナノ粒子と共にインキュベートした。インキュベーション後、ＭＵＣ１細胞質ドメインペプチドをロードしたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を含有する培地を新たな培地と交換し、１０μｌの再構成ＸＴＴ混合物キット試薬を各ウェルに添加した。４時間培養した後、マイクロタイタープレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用することによって、サンプルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。未処置対照の生存細胞に対する割合として細胞の増殖を決定し、３回反復で分析した。表６は、ホルモン依存性乳癌腫細胞株ＭＣＦ−７の細胞生存に対するＭＵＣ１細胞質ドメインペプチドロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の効果を示す。
当業者であれば、ルーチンな実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または確認することができるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
実施例８：ポリマーナノ粒子によって同時送達したＰＴＸおよびＬ−ＮｕＢＣＰ−９ペプチドの相乗効果
パクリタキセルおよびＬ−ＮｕＢＣＰ−９を、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックポリマーナノ粒子に封入して、インビトロおよびインビボで悪性細胞に対する相乗効果を評価した。
Ｉ．材料および方法
Ａ．ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーの合成および特性評価：
７０−ｋＤａ ＰＬＡ（ＮａｔｕｒｅＷｏｒｋｓ，ＵＳＡ）または１２−ｋＤａ ＰＬＡ（Ｐｕｒａｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＥＵＲＯＰＥ）ならびにＰｏｌｏｘａｍｅｒ−Ｆ１２７（１２．５ＫＤａ）およびＰｏｌｏｘｏｍｅｒ Ｆ６８（６ＫＤａ）；（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を使用して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロック（ｔｅｒａｂｌｏｃｋ）コポリマーを合成した。ＤＣＣ−ＤＭＡＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）法によって、テトラブロックコポリマーを合成した。
Ｂ．Ｌ−ＮｕＢＣＰ９およびＰＴＸ薬物ロードナノ粒子の調製：Ｋｕｍａｒ Ｍ，Ｇｕｐｔａ Ｄ，Ｓｉｎｇｈ Ｇ，Ｓｈａｒｍａ Ｓ，Ｂｈａｔ Ｍ，Ｐｒａｓｈａｎｔ ＣＫ，Ｄｉｎｄａ ＡＫ，Ｋｈａｒｂａｎｄａ Ｓ，Ｋｕｆｅ Ｄ，ａｎｄ Ｓｉｎｇｈ Ｈ．による前出の論文Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７４（１２）：３２７１−３２８１，２０１４に報告されているように、ダブルエマルジョン溶媒蒸発法を使用して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子へのＬ−ＮｕＢＣＰ−９ペプチド（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，Ｉｎｄｉａによるカスタム合成）のロードを実施した。エマルジョン溶媒蒸発法を使用して、ＰＴＸロードナノ粒子を生産した。簡潔に言えば、５ｍｌのアセトニトリル（ＡＣＮ）中の５０ｍｇのコポリマーおよび５ｍｇのＰＴＸ（ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳ）を１００μｌのＡＣＮに溶解し、５０ｍｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのＡＣＮ溶液５ｍｌに添加した。次いで、得られた混合物を、蒸留水中Ｆ１２７から構成される２０ｍｌの水相に添加し、室温で６〜８時間撹拌して、溶媒の蒸発およびナノ粒子の安定化を促進した。ダブルエマルジョンプロセスによって、ＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９ペプチドロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ（５０ｍｇ）ナノ粒子を調製した。溶解したＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーにパクリタキセルを添加し、その直後にペプチドを添加して軽い超音波処理を行った。次いで、この混合物全体を、ポロキサマーＦ１２７を含有する２０ｍｌの水相に添加した。また、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の細胞取り込み研究のために、同じ手順によって、ローダミン（ＲｈＢ）（親水性色素として）およびクマリン６（疎水性色素として）ロードナノ粒子も調製した。
Ａｍｉｋｏｎ ３０−ｋＤａウルトラフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）によってナノ粒子をろ過し、ＭＱ水で２回洗浄して、遊離薬物／色素を除去した。ナノ粒子を凍結乾燥させ、使用まで−２０℃で保存した。ろ液を収集し、遊離ＮｕＢＣＰ−９ペプチドについて、Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）によって分析し、ＥＰＯＣＨマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ，ＵＳ）によって５９０ｎｍで測定した。同様に、移動相としてアセトニトリル、水、メタノール（体積比６０：３５：５）を用いて、Ｃ１８カラムを使用して高速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＳ）アッセイ法によって、遊離パクリタキセルを測定した。以下の式：
ＥＥ％＝［全薬物（ペプチド／ＰＴＸ）−ろ液］Ｘ１００
合計（初期ペプチド／ＰＴＸ）
を使用して、ＮｕＢＣＰ−９ペプチド／ＰＴＸの封入効率（ＥＥ％）を決定した。
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ，Ｚｅｉｓｓ ＥＶＯ ５０ Ｓｅｒｉｅｓ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ，Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｍｏｄｅｌ ＣＭ１２）を使用して、ナノ粒子の形態および粒径を決定した。ナノ粒子追跡分析（Ｍａｌｖｅｒｎ ｎａｎｏｓｉｇｈｔ，ＵＫ）によって、ナノ粒子のゼータ電位を評価した。
Ｃ．ナノ粒子からのペプチドおよびパクリタキセル放出の評価：限外ろ過法によって、ナノ粒子からのＮｕＢＣＰ−９およびパクリタキセルのインビトロ放出速度を決定した。簡潔に言えば、凍結乾燥ナノ粒子（１０ｍｇ）のサンプルをＰＢＳに懸濁し、１５０〜１６０ｒｐｍで常に振盪しながら３７℃でインキュベートした。６０日までの所定の時点で、インキュベーターからサンプルを取り出し、３０−ｋＤａ Ａｍｉｋｏｎフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって限外ろ過した。分析のためにろ液を収集し、新たな緩衝液を各チューブに添加した。マイクロＢＣＡアッセイキットによってろ液中のペプチド濃度を決定し、ＨＰＬＣによってＰＴＸを測定した。
Ｄ．インビトロ細胞毒性分析：２つの癌細胞株において、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子のインビトロ細胞毒性を評価した。１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００ｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で、ヒトＥＲ＋ＭＣＦ−７およびＥＲ−ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞を成長させた。実験の期間中、細胞を３７℃および５％ＣＯ２雰囲気で維持した。指数関数的に成長している癌細胞を１ウェル当たり細胞３０００個の播種密度で９６ウェルプレートにプレーティングし、２４時間インキュベートした。遊離ＰＴＸのＤＭＳＯ溶液ならびにＰＴＸ−およびＮｕＢＣＰ−９ロード（単一／二重）ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を、．００１、０．０１、０．１、１、５、１０および２０μＭの最終薬物濃度でウェルに別個に添加した。細胞培地による希釈後、培養プレートウェル中のＤＭＳＯの最終レベルは＜０．１％であった。７２時間後、製造業者の説明書にしたがってＸＴＴベースのインビトロ細胞増殖アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ，ＵＳＡ）によって、遊離薬物、薬物ロード単一または二重薬物ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の腫瘍細胞増殖阻害挙動を別個に評価した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ ｐｒｉｓｍを使用して半有効方程式によって、半最大阻害薬物濃度（ＩＣ５０）を決定し、データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示されている。
ナノ粒子の取り込みを評価するために、ＭＣＦ−７細胞をカバースリップ上に播種し、２４時間成長させ、次いで、ローダミンＢおよびクマリン６ロードナノ粒子と共にインキュベートし、カバースリップを除去し、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。次いで、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）で細胞を染色し、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ；Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ＦＶ１０００ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）下で視覚化した。
Ｅ．組み合わせ指数（ＣＩ）分析：ＰＴＸおよびＮｕｂＣＰ−９ペプチドの組み合わせについて、ｃｏｍｐｕｓｙｎソフトウェア（バージョン１．０，ｃｏｍｂｏｓｙｎ Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．）を使用して、チョウ・タラレー法に基づくＣＩ分析を実施し、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞に対する相乗効果、相加効果または拮抗細胞毒性効果を決定した。
ＣＩ＞１の値は拮抗作用を表し、ＣＩ＝１は相加作用を表し、ＣＩ＜１は相乗作用を表す。一定の薬物組み合わせ比で、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０，Ｕ．Ｓ．）を用いて、薬物組み合わせのｆａ（効果分率）（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ａｆｆｅｃｔ）対ＣＩプロットを得た（例えば、図１８Ｅ、１８Ｆ、１８Ｉ、１８Ｊ）。
Ｆ．アポトーシスの評価：アネキシンＶ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８／ＰＩアポトーシスアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して、細胞を染色した。定性分析のために、ＣＬＳＭ顕微鏡を使用して、細胞をイメージングした。ＦＡＣＳ（Ａｒｉａ ＬＬＣ）を使用して、アポトーシス／壊死の定量を実施した。
Ｇ．ウエスタンブロット分析：Ｍ−ＰＥＲ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）を用いて細胞溶解物を調製し、抗Ｂｃｌ−２、抗β−チューブリン、抗カスパーゼ−３（Ｂｉｏｓｅｐｓｅｓ，Ｃｈｉｎａ）、抗ＰＡＲＰおよび抗β−アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）を用いたイムノブロッティングによって分析した。化学発光のソフトウェア（Ｌｉ−Ｃｏｒ ｂｌｏｔ ｓｃａｎｎｅｒ，ＵＳＡ）から、バンド強度の相対変化倍率を計算した。
Ｈ．抗腫瘍活性の分析：マウスエールリッヒ腫瘍細胞を同系Ｂａｌｂ／ｃマウス（１７〜２２ｇ）の後肢に皮下注射した。腫瘍担持マウス（約１５０ｍｍ３）を９群（マウス６匹／群）に分け、２１日間にわたって異なる製剤で週１回または週２回で腹腔内（ｉ．ｐ．）処置した。ノギスによって腫瘍体積を決定し、式（Ａ×Ｂ２）×０．５（式中、ＡおよびＢは、それぞれ最長腫瘍径および最短腫瘍径である）を使用して計算した。病理組織学的検査のための腫瘍を採取するために、各群から、７日目、１４日目および２１日目に１匹のマウスを屠殺した。１０％ホルマリン／生理食塩水で腫瘍を固定し、パラフィンに包埋した。さらなる免疫組織化学、ＴＵＮＮＥＬおよびＫｉ６７アッセイのために、ヘマトキシリンおよびエオシンで５マイクロメートル切片を染色した。Ｇｒａｐｈ ｐａｄ ｐｒｉｓｍを使用して一元ＡＮＯＶＡによって、腫瘍体積の統計分析を実施した。Ｐｒｉｓｍ ４．０ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してカプラン・マイヤー法によって、マウスの生存を決定した。
Ｉ．データ／統計分析：すべての結果は平均±標準偏差として報告されており、スチューデントｔ検定を使用して、対照群と試験群との間の差異を試験した。分析のために、少なくとも３つのサンプルサイズを使用した。結果は、Ｐ＜０．０５のレベルで、対照処置と試験処置との間で統計的に有意であるとみなした。
ＩＩ．結果
Ａ．ＮｕＢＣＰ−９ロードポリマーナノ粒子の調製および特性評価：
前述のようにＤＣＣ ＤＭＡＰを使用して、１２ＫＤａまたは７２ＫＤａのＰＬＡおよび６ＫＤａまたは１２．５ＫＤａのＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックを使用して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを調製した。ＰＬＡ１２ＫＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧおよびＰＬＡ７２ＫＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧは１５．６ＫＤａおよび８３ＫＤａであることが見出され、前述のように１ＨＮＭＲによって、ブロック（ｂｏｃｋ）コポリマーの合成を確認した。
ＳＥＭおよびＴＥＭによって、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーの形態およびサイズを分析した。ＳＥＭにより、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の球形形態が示され、ＴＥＭにより、ＰＬＡが疎水性コアとして存在し、ＰＥＧが親水性シェルとして存在し、疎水性ＰＰＧが２つの層に挟まれた多層構造が示された。粒径は、直径４５〜９０ｎｍの範囲であった（図１５Ａおよび１５Ｂ）。
ローダミンＢ（親水性薬物のモデル）およびクマリン６（疎水性薬物のモデル）色素ロードＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ１２．５Ｋナノ粒子をＭＣＦ−７乳癌細胞と共にインキュベートすると、蛍光共焦点レーザー走査型顕微鏡によって、３時間後にナノ粒子の取り込みが示された（図１６）。結果は、細胞質ゾル全体にわたるローダミンＢおよびクマリン６ロードナノ粒子の細胞内蛍光を示していた。これらの観察結果に基づくと、ＰＬＡベースのＮＰの取り込みはエンドサイトーシスによるものであり、エンドリソソームの酸性ｐＨにおける（アニオン性からカチオン性への）表面電荷反転に関連する。この電荷反転は、ＮＰと小胞膜との相互作用を促進して一過性の局所的な膜不安定化をもたらし、それにより、ＮＰが細胞質ゾルに漏出する（Ｋｕｍａｒ Ｍら、（２０１４）Ｎｏｖｅｌ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃａｒｇｏｓ：ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ＢＣＬ−２ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ＮｕＢＣＰ−９．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７４（１２）：１−１１；Ｈａｓｅｇａｗａ Ｍら、（２０１５）Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ＭＵＣ１−Ｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ＧＯ−２０３ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１（１０）：２３３８−２３４７）。
ＮｕＢＣＰ−９は、ＢＣＬ−２をターゲティングしてそれを細胞保護物質から細胞殺傷物質に変換する（Ｋｏｌｌｕｒｉ ＳＫら、（２００８）Ａ ｓｈｏｒｔ Ｎｕｒ７７−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｖｅｒｔｓ Ｂｃｌ−２ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ ｔｏ ａ ｋｉｌｌｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １４（４）：２８５−２９８）。したがって、ＦＩＴＣ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰでＭＣＦ−７細胞を処置した場合のＮｕＢＣＰ−９の細胞内局在を調査した。Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒによる染色によって明らかなように、ＦＩＴＣ−ＮｕＢＣＰ−９は、細胞質およびミトコンドリアに局在した（図２５）。光親和性架橋研究では、微小管（Ｒａｏ Ｓら、（１９９５）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｘｏｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ．２−（ｍ−Ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ）ｔａｘｏｌ ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｓ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ２１７−２３１）ｏｆ ｂｅｔａ−ｔｕｂｕｌｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３５）：２０２３５−２０２３８；Ｒａｏ Ｓら、（１９９９）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔａｘｏｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｇ（２８２）ｉｎ ｂｅｔａ−ｔｕｂｕｌｉｎ ａｓ ｔｈｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｐｈｏｔｏｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ７−ｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｔａｘｏｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５３）：３７９９０−３７９９４）およびミトコンドリア（Ｃａｒｒｅ Ｍら、（２００２）Ｔｕｂｕｌｉｎ ｉｓ ａｎ ｉｎｈｅｒｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３７）：３３６６４−３３６６９）におけるチューブリンに対するＰＴＸ結合の局在が実証されている。これらのおよび上記の研究と一致して、ＦＩＴＣ−ＰＴＸ／ＮＰおよびＲｈｏＢ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰで処置したＭＣＦ−７細胞の共焦点分析により、細胞質ゾルおよびミトコンドリアにおけるＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９の共局在が実証された（図２５）。
Ｂ．薬物ロード効率およびインビトロ放出研究
異なる分子量のＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を用いたＮｕＢＣＰ−９およびＰＴＸの封入率は、表７に掲載されている。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーは、その高いＰＬＡ含有量（８４％）により高疎水性であり、その結果、親水性ペプチドＮｕＢＣＰ−９の封入は、パクリタキセル（すなわち、８７％）と比較して低かった（６４．５％）。
最小濃度のＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９ペプチドで最大の細胞増殖阻害を達成することを目的として、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子中にＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９ペプチド組み合わせを含む異なる製剤を調製した。さらに、表７に示されているように、サイズおよびゼータ電位について、これらの製剤を観察した。ＰＴＸの封入効率は、すべての製剤において＞９０％であると決定されたのに対して、ＮｕＢＣＰ−９ペプチドの場合、ペプチド量の増加と共にロードが増加した。すべての製剤の中でも、ＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９ペプチドの比がそれぞれ１：４の場合に最大ロードが観察され、続いて、比が増加すると微粒子が形成される。
ナノ粒子のゼータ電位はまた、ペプチド封入の増加と共によりマイナスになることも観察された（表７）。ゼータ電位のこの減少の正確な理由は不明である；しかしながら、正電荷の吸着ペプチドと負電荷のＰＬＡとの相互作用により、ペプチドカルボキシル基は負電荷を有すると思われる。ＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９ロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ ＮＰ（単一／二重）のサイズ分布は１００〜１７０ｎｍの範囲であり、これは、すべての製剤においてほぼ同様であることが観察された。
ＰＬＡ７２Ｋ／１２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ１２．５ｋナノ粒子からのＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９のインビトロ放出プロファイルは、図１７Ａおよび１７Ｂに示されている。生理的ｐＨにおけるＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ１２．５ＫおよびＰＬＡ１２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ６ＫからのＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９ペプチドの同時放出は、７日以内にそれぞれ薬物の３０％および４０％の遅い持続的な累積放出を示したのに対して、単一薬物としてナノ粒子にロードした場合、それはＰＴＸでは４７％であり、ペプチドでは５８％であった（図１７Ｃ）。しかしながら、おそらくは低分子量ＰＬＡのより急速な分解および生体可溶性のために、低分子量ＰＬＡ１２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ６ＫからのＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９（単一／二重）の完全インビトロ放出プロファイルは、それぞれ７日間および１０日間しか持続しなかったのと比較して、高分子量ＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧＰＰＧ−ＰＥＧ１２．５Ｋでは６０日間であった。
これらの発見は、（ｉ）ＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９の両方の封入が同じＮＰで達成可能であり、（ｉｉ）ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰからのＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９の放出が持続することを実証している。
これらの結果に基づいて、低分子量テトラブロックナノ粒子と比較して、より長期間にわたる薬物の制御持続送達のために、ＮｕＢＣＰ−９およびＰＴＸ封入（単一および二重）ＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ１２．５Ｋナノ粒子をさらに採用し、インビトロ研究およびインビボ研究において、生物学的活性についてさらに研究した。
Ｃ．インビトロ細胞毒性および組み合わせ分析
同時送達系の相乗効果を検証するために、ＭＣＦ７およびＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞において、遊離薬物および単一／二重薬物ロードナノ粒子に対するインビトロ細胞生存効果について、異なる製剤を用量依存的に研究した。図１８Ａに示されているように、ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９組み合わせロードナノ粒子の１：１製剤は、他の様々な薬物製剤と比較して、ＭＣＦ７およびＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞の両方において最高の細胞増殖阻害を示すことが観察された。したがって、さらなるインビトロおよびインインビボ研究のために、ＰＴＸ−Ｌ−ＮｕＢＣＰ−９ロードナノ粒子の１：１製剤を使用した。
１ｕＭにおける遊離と薬物ロード（単一／二重）ＮＰとの有効性を比較するために、時間依存性研究を９６時間まで実施した。図１８Ｂでは、ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９ペプチドの１：１組み合わせをロードしたＮＰは、４８時間の時点で＞８０％の細胞阻害を示した。ＰＴＸロードおよびＬ−ＮｕＢＣＰ−９ロード混合物は共に、約７０％の阻害（これは、遊離ＰＴＸと同程度である）を示した。しかしながら、単一ロードＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９は、それぞれ４０％および２０％の細胞増殖阻害しか示さなかった。したがって、４８時間の時点における細胞増殖阻害によって、ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９ペプチドの１：１組み合わせをロードしたナノ粒子の相乗効果を確認した。１１５μＭまでの異なる濃度で単純ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の細胞生存も試験したところ、８５％超であったが、これは、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の非毒性および生体適合性を示している（図１８Ｃおよび１８Ｄ）。
単一薬物ＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９ペプチドロードナノ粒子を１：１の比で混合して、二重ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９ペプチドロードナノ粒子と比較し、細胞増殖阻害研究のために評価した。４８時間の時点では、二重ロードＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９ペプチドロードＮＰによる９０％の阻害と比較して、混合ナノ粒子は７０％の阻害しか示さなかった。単一薬物ロードナノ粒子を同じ比で混合した場合、１ｕＭではほとんど効果がないのに対して、両薬物を同じナノ粒子に一緒にロードした場合、単一ＰＴＸまたはＮｕＢＣＰ−９ロードＮＰよりもはるかに優れた最大相乗効果が示された。したがって、二重ロードナノ製剤の相乗効果が確認された。
上記観点から、細胞へのＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９ ＮＰの最適化同時送達は、インビトロにおける抗腫瘍効果の増強のために非常に重要であると結論付けることができる。
ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ細胞において、広範囲の濃度で、異なるナノ製剤の組み合わせ指数を分析した。１未満、１または１超の組み合わせ指数（ＣＩ）値は、それぞれ相乗作用、相加作用または拮抗作用を示す。ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９ペプチドロードナノ粒子の１：１ナノ製剤は、遊離または単一薬物ロードナノ粒子と比較して、最良適合レベルの高い相乗作用を有することが観察された（図１８Ｅおよび１８Ｆ）。これらの知見をさらに立証するために、異なる濃度のＰＴＸ／ＮＰ、ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰまたはＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰでＭＣＦ−７細胞を処置した。Ｃｏｍｐｕｓｙｎソフトウェアを使用して、チョウ・タラレー法に基づくＣＩ分析を実施した。結果は、異なる組み合わせのすべてが相乗的であり、ＣＩ値が＜０．２であることを実証している（図１８Ｉ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いても同様の結果が得られたが（図１８Ｊ）、これは、乳癌腫細胞の成長および生存の阻害において、ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰが相乗的であることを示している。
Ｄ．乳癌細胞のアポトーシスに対するＮｕＢＣＰ−９−ＰＴＸ組み合わせロードナノ粒子の効果：
単一または二重ロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を用いてアポトーシス効果に対するＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９ナノ粒子の効果を評価するために、ナノ粒子でＭＣＦ−７細胞処置し、細胞膜におけるホスファチジルセリンのエクスターナリゼーションをモニタリングした。アネキシンＶ−Ａｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ４８８／ＰＩで染色したＭＣＦ−７細胞の共焦点画像により、ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９および単一薬物の組み合わせをロードしたナノ粒子による処置は、４８時間の時点で、単一ロードナノ粒子よりも高いアポトーシスをもたらし、アポトーシス応答の誘導に関連することが実証された。対照的に、空ナノ粒子による処置は、明らかな効果を有しなかった。
ＦＡＣＳ（Ａｒｉａ ＢＤ ｆａｌｃｏｎ）によるアネキシンＶおよびＰＩ染色の定量により、ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９ ＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ１２．５Ｋナノ粒子の組み合わせは、２４時間の時点で、ＭＣＦ−７細胞のアポトーシスの誘導に関して単一ロードナノ粒子よりも有効であることがさらに確認された（図１９Ａ／１９Ｂ）。
ウエスタンブロット分析によって、乳癌細胞株におけるＢＣＬ−２、チューブリン、カスパーゼ３の切断断片およびＰＡＲＰタンパク質の切断断片のレベルを調べた（図１９Ｃ）。ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９ナノ製剤の組み合わせは、いずれかの単一薬物ロードナノ粒子のみの場合よりも、ＢＣＬ−２およびチューブリンの発現レベルを減少させ、カスパーゼ３の切断断片およびＰＡＲＰの切断断片の発現を増加させた（図１９Ｄ）。これらの知見は、ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰが、ＭＣＦ−７細胞のアポトーシスの誘導に関してＰＴＸ／ＮＰまたはＮｕＢＣＰ−９／ＮＰよりも活性が高いという仮説を裏付けている。
Ｅ．インビボにおける相乗抗腫瘍効果の評価：
ＥＡＴ腫瘍モデルＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、二重薬物および単一薬物ロードナノ粒子のインビボ抗腫瘍効果および全身毒性を評価した。狭い尾静脈では、薬物ロードナノ粒子の粘性懸濁液の正確な投与は困難であったので、腸間膜血管および門脈を介してナノ粒子が全身循環に入ることを可能にする腹腔内投与経路を使用した。個別にまたは組み合わせでロードし、最大２１日間にわたって週２回および週１回スケジュールで投与する異なる薬物製剤でマウスを処置したところ、生理食塩水対照で得られた効果と比較して、腫瘍成長に対する有意な効果を示した。
以前の研究は、ＮｕＢＣＰ−９ペプチドのみおよびＮｕＢＣＰ−９ロードＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ１２．５ｋ ＮＰを使用して、２０ｍｇ／ｋｇ週２回腹腔内注射を与えることによって実施したところ、腫瘍体積のほぼ９０％の退縮が示された。これと比較して、ＮｕＢＣＰ−９−ＰＴＸの組み合わせは、腫瘍成長の完全な阻害を伴うより良好な有効性を示し、処置全体の間に明白な腫瘍再発を示さなかった。３つのセット（二重−、ＰＴＸ−、ＮｕＢＣＰ−９ペプチドロードＮＰ）すべてにおいて、週２回腹腔内投与は、週１回投与よりも有効性を示すことも観察された（図２０Ａ、２０Ｂおよび２０Ｃ）。重要なことに、ＰＴＸ／ＮｕＢＣＰ−９ナノ粒子（単一／二重）処置マウスのいずれにおいても、体重減少または他の明白な毒性は観察されなかった。
エールリッヒ腫瘍担持マウスを３週間にわたって週２回腹腔内処置した。空ＮＰで処置したマウスと比較して、１０ｍｇ／ｋｇ ＰＴＸ／ＮＰによる処置は、腫瘍の部分的な退縮に関連していた（図２２）。また重要なことに、１０ｍｇ／ｋｇ ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰによる処置は、長期の完全腫瘍退縮に関連していた（図２２）。カプラン・マイヤープロットによって決定した生存の分析により、ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰで処置したマウスは、空ＮＰ、ＰＴＸ／ＮＰまたはＮｕＢＣＰ−９／ＮＰで処置したマウスよりも顕著に長く生存することがさらに実証された（図２３）。高い抗腫瘍効果および低い薬物関連毒性により、二重薬物ロード系は、癌処置において有望である。薬物組み合わせの原理は、より低い薬物用量で効率的な抗腫瘍効果を達成し、マイナスの副作用を減少させながら最大の治療効果を得ることである。
Ｆ．組織学的および免疫組織化学的分析：
Ｃｏ−ＮＰの抗腫瘍活性をさらに調査するために、処置後（２１日目）に腫瘍担持Ｂａｌｂ／Ｃマウスを屠殺し、腫瘍を解剖し、病理学的分析のためにＨ＆ＥおよびＴＵＮＥＬで染色した。ＰＢＳ、ＮｕＢＣＰ−ＮＰ、ＰＴＸ−ＮＰおよびＣｏ−ＮＰ処置群のデータを図２１に示した。
Ｈ＆Ｅ染色では、正常腫瘍細胞は、球形または紡錘形およびより多くのクロマチンを有する大きな核を有していた。壊死細胞は明確な細胞形態を有していなかったのに対して、クロマチンは、より暗色で濃縮していたか、または細胞外では欠如していた。図７に示されているように、ＰＢＳ群では、正常な形状およびより多くのクロマチンを有する腫瘍細胞が観察されたが、これは、活発な腫瘍成長を示している。しかしながら、単一ロードＰＴＸまたはＮｕＢＣＰ ９ ＮＰ処置群では、広範囲の組織壊死が観察された。しかしながら、Ｃｏ−ＮＰ処置群では、ＮｕＢＣＰ−９−ＮＰおよびＰＴＸ−ＮＰで処置した群と比較して、腫瘍の完全な退縮を示す正常な筋組織が示されなかったが、これは、Ｃｏ−ＮＰ処置群では、ほとんどの腫瘍細胞が壊死性であることを示していた。
ＴＵＮＥＬアッセイにより、腫瘍細胞の核におけるＤＮＡ断片化を検出することができた。ＰＢＳ処置腫瘍組織では、アポトーシスはほとんど検出されなかった。一方、ＮｕＢＣＰ−９−ＮＰ、ＰＴＸ−ＮＰおよびＣｏ−ＮＰ処置群では、明白な細胞アポトーシス領域が観察された。Ｈ＆Ｅ分析と一致して、Ｃｏ−ＮＰの処置は、単一薬物ロードナノ粒子と比較してアポトーシスレベルを明らかに増加させた。
ＩＩＩ．考察
パクリタキセルは、乳癌および様々な固形腫瘍のための主な化学療法剤であった。パクリタキセルの主な臨床的限界は、長期処置後の神経毒性および細胞耐性である。ＮｕＢＣＰ−９ペプチドは、ＢＣＬ−２媒介性アポトーシスの二重効果を有する新規エピジェネティック剤である、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２００８；１４：２８５−２９８。実施例８は、ナノ粒子によって送達した場合に、パクリタキセルおよびＮｕＢＣＰ−９が、２つの異なる乳癌細胞株（ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の成長に対して顕著な相乗的阻害効果を有することを実証している。ＮｕＢＣＰ−９およびＰＴＸのＩＣ５０は、これら２つの薬剤を組み合わせて使用した場合に劇的に減少する。結果は、これら２つの薬物を組み合わせることによって、臨床的有効性を維持または増強しながら、ＰＴＸの副作用を大幅に減少させることが可能であることを示唆している。
二重薬物ロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ ＮＰを特性評価するために、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ１２．５ｋ／６Ｋ ＮＰを用いて異なる分子量のＰＬＡ７２ＫＤａ／１２ＫＤａで一緒にパクリタキセル、ＮｕＢＣＰ−９およびＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９ナノ粒子のロード量を決定し、それらのインビトロ放出特性を調査した。異なるＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ ＮＰを用いたＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９の平均ロード度合（ｌｏａｄｉｎｇｄｅｇｒｅｅｓ）は、表７に掲載されている。表７に示されているように、ロード薬物にかかわらず、高分子量ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ ＮＰのロード度合は、対応する低分子量ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ ＮＰよりも常に高かった。さらに、個々の薬物分子のロード度合は、二重薬物ロード（ＰＬＡ１２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−ＰＴＸ−ＰＥＰおよびＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＴＸ−ＰＥＰ）では、単一薬物ロード（ＰＬＡ１０ＫＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−ＰＴＸ／ＰＬＡ１０ＫＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−ＰＥＰおよびＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＴＸ／ＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＰ）の場合よりも低かった。したがって、ロード度合の差異は、ペイロード間の静電引力および疎水性力の異なる強度に起因する可能性がある。
二重薬物ロード手順においてＰＴＸのより高いロード度合が得られたのは、その後のＮｕＢＣＰ−９ペプチドのロードに起因する可能性があり、これが、ＮＰからのＮｕＢＣＰ−９のわずかな放出をもたらした可能性がある。類似物質は溶け合うという理論にしたがえば、疎水性の性質により、ＰＴＸはペプチドよりも多くのＰＬＡの疎水性コアを捕捉し、さらにＰＴＸは立体障害も引き起こし、その結果単一薬物ロードと比較して低いロード度合がもたらされた。他方、二重薬物ロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ ＮＰの全ロード度合は、単一薬物ロードのものよりも高かった。これはおそらく、ＰＴＸをロードした後に、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ ＮＰの細孔が不完全に充填されたことに起因する可能性がある。加えて、すべての細孔がＰＴＸで充填または遮断された場合であっても、ペプチドはまた、ペプチドの疎水性部分と粒子の表面との間の疎水性相互作用を介して、ＰＴＸロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ ＮＰの外表面に吸着することができた。静電気引力もまた、もっともらしい説明である。ＮｕＢＣＰ−９の等電点は約ｐＨ７．２であるが、これは、ロード過程中に、水中のペプチドが当然正に帯電することを意味する。ＰＴＸロードＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ（−３．２１±１．５ｍＶ）は負に帯電したので、ＰＴＸを最初にロードして細孔へのペプチド拡散を防止したとしても、ペプチドは、静電引力によってもＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ粒子表面上に吸着することができた。
ｐＨ７．４における高分子量および低分子量ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧＳ ＮＰからのＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９ペプチドの放出プロファイルは、図３に示されている。ペプチドおよびＰＴＸ（単一または二重）は、６０日まで高分子量ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子から徐々に放出され得るのに対して、薬物の沈殿またはコポリマーのより急速な分解により、低分子量ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ粒子は安定性を示すことができなかった。
相乗効果は、各薬物の個々の抗腫瘍機構の組み合わせから生じ得ることが示唆された。前述のように、ＮｕＢＣＰ−９はＢＣＬ−２カスケードに結合し、それにより、このタンパク質をアポトーシス促進性から抗アポトーシス性に変換するのに対して、ＰＴＸは微小管の分解を阻害し得、有糸分裂および細胞増殖に必要な微小管ネットワークの正常な動的再構成を妨げ、そして細胞アポトーシスを引き起こす。ＰＴＸはＢＣＬ−２に直接結合し、Ｎｕｒ７７の活性を機能的に模倣することも報告された。報告されているように、同じ細胞経路を有する複数の薬物は、より高い治療有効性およびより高い標的選択性のために相乗的に機能し得る。
ＮｕＢＣＰ−９およびＰＴＸ Ｎｐの混合物によるＭＣＦ−７の処理はＰＴＸの場合と同様に作用するが、同じビヒクルで両治療剤を同時送達して同時に作用させた場合、最高の相乗効果が達成された（図１８Ｇおよび１８Ｈ、右のパネル）。インビトロ研究によれば、他の薬物比を使用した場合、相乗効果は効率的に示され得ず、２つの薬物の互いにバランスの取れた投与量が最高の腫瘍有効性をもたらした。
ＭＣＦ−７細胞およびＭＤＡ−ＭＢ２３１トリプルネガティブ細胞では、ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９ ＮｐのＩＣ５０が劇的に減少し、通常のパクリタキセルと比較して約４０および４倍の差異であることが示されている（表８）。したがって、同時処置は、パクリタキセルの細胞毒性を強化する能力を示唆しており、臨床的有効性を拡大する可能性を提供する。
可能な機構を調べるために、インビトロ研究により、同じビヒクルで２つの薬物を同時送達することの相乗効果が実証された。アポトーシス促進性ＢＣＬ−２およびチューブリンの発現は、組み合わせＮｕＢＣＰ−９−ＰＴＸロードＮｐでは、単一薬物のみの場合と比較して顕著に減少する。これらの生化学的データにより、アポトーシスおよび細胞周期停止に対する２つの薬剤の相乗効果の機構の根拠が提供された。
可能なアポトーシス経路をさらに調べるために、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰを含むいくつかの重要なアポトーシス関連タンパク質の発現をアッセイした。この研究では、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰタンパク質のレベルは、二重薬物ロードＮＰ群では、単一ロード群と比較して顕著に上昇していた。切断ＰＡＲＰは、内因性アポトーシス経路に決定的に関与し、アポトーシスのマーカーであると考えられる。
腹腔内投与したＮｕＢＣＰ−９ナノ粒子の抗腫瘍効果の以前の研究では、長期の腫瘍退縮が示された。インビボにおいて、二重薬物ロードＮＰを注射したマウスの腫瘍体積は、単一ロードＮＰで処置したマウスの腫瘍体積と比べてほぼ消失しており、Ｎｐ／生理食塩水のみがマウスの腫瘍体積に影響を与えなかった（図２０Ａ〜Ｃ）。これらの結果により、二重薬物ロードＮＰがより顕著な抗腫瘍活性を示すことが示された。さらに、二重／単一ロードＮＰは、最大６０日間の持続的な制御放出によって、薬物を腫瘍細胞に有効に送達すると推測され得る。さらに重要なことに、単一／二重Ｎｐの投与は忍容性良好であり、体重減少または明白な毒性の証拠はなかった。これらの結果は、二重ロードナノ製剤によって用量を減少させて腫瘍組織縮小を増強することの実行可能性を支持し得る。
ＩＶ．結論
要約すると、ＮｕＢＣＰ−９（抗癌ペプチド）およびＰＴＸの同時送達のためのＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーを有するポリ乳酸（ＰＬＡ）テトラブロックを開発した。高分子量ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのロバストな構造安定性、効率的な送達能力、優れた生体適合性および良好なサイズ分布は、癌処置において腹腔内注射を介して抗腫瘍薬を送達するための大きな可能性を示した。Ｃｏ−ＮＰは、ＭＣＦ−７の抑制およびトリプルネガティブＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞の成長において相乗効果を有していた。Ｃｏ−ＮＰは、インビボにおいて高い腫瘍集積、優れた抗腫瘍効率および非常に低い毒性を示した。本研究は、同時送達系が、乳癌およびおそらくは他の種類の癌の処置における併用療法として有望なプラットフォームを提供することを示している。
実施例９：ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰは、ＰＴＸおよびｎａｂ−パクリタキセルに対して耐性のＭＣＦ−７細胞に対して活性である。
パクリタキセル（ＰＴＸ）は、乳癌および他の癌の処置のために広く使用されている微小管阻害剤である。ＰＴＸはまた、アルブミン結合ナノ粒子製剤（ｎａｂ−パクリタキセル；アブラキサン）で投与される。しかしながら、ＰＴＸの有効性は、薬物排出ポンプ、例えばＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）および抗アポトーシスＢＣＬ−２タンパク質のアップレギュレーションによって伝達される耐性機構によって制限される。本明細書に記載される細胞内ＰＴＸ送達のための生分解性テトラブロックポリマーナノ粒子（ＰＴＸ／ＮＰ）は、ＰＴＸ流出の阻害において非常に有効である。具体的には、ＰＴＸ／ＮＰは、ＰＴＸおよびｎａｂ−パクリタキセルに対して耐性のＰ−ｇｐ発現乳癌細胞に対して活性である。これらのナノ粒子は、抗アポトーシスＢＣＬ−２タンパク質を細胞保護物質から細胞殺傷物質に変換するＮｕＢＣＰ−９ペプチド（ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰ）を全身送達するために使用されている。ＰＴＸ ＩＣ５０の４０倍の減少およびアポトーシス応答の増強によって明らかなように、ＰＴＸおよびＮｕＢＣＰ−９の両方を含有するＮＰ（ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰ）による乳癌細胞の処置は、インビトロで乳癌細胞に対して著しく相乗的である。ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰによる同系エールリッヒ乳房腫瘍モデルマウスの処置もまた、ＰＴＸ／ＮＰおよび／またはＮｕＢＣＰ−９／ＮＰのいずれかで得られたものよりも顕著に有効であった（実施例８を参照のこと）。これらの結果は、ｎａｂ−パクリタキセル耐性の状況でＰＴＸ／ＮＰが活性であり、ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰでＮｕＢＣＰ−９と同時送達すると、ＰＴＸの活性が相乗的に増加することを実証している。これらの知見はまた、Ｐ−ｇｐ基質でありおよび／またはＢＣＬ−２過剰発現によって阻害される他の細胞毒性剤の活性を増強するために、このプラットフォームが広く適用可能であり得るという考えを裏付けている。
ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰは、アポトーシスの誘導において相乗的であるという知見により、これらのＮＰが、ＰＴＸ耐性細胞に対して有効であり得るという可能性がもたらされた。したがって、漸増ＰＴＸ濃度への曝露によって、ＰＴＸに対して耐性のＭＣＦ−７細胞が生じた（表９）。注目すべきことに、ＭＣＦ−７／ＰＴＸ−Ｒ細胞もｎａｂ−パクリタキセルに対して耐性であったが、ＰＴＸ／ＮＰに対して耐性ではなかった（表９）。ＰＴＸ／ＮＰに対するＭＣＦ−７／ＰＴＸ−Ｒ細胞の感受性の機構的根拠を明らかにするために、Ｐ−ｇｐ発現について野生型およびＰＴＸ耐性ＭＣＦ−７細胞を分析したところ、以前の報告（Ｂｒｏｗｎ Ｔら、（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．９（７）：１２６１−１２６７；Ｗｉｅｒｎｉｋ ＰＨら、（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４７（９）：２４８６−２４９３；Ｗｉｅｒｎｉｋ ＰＨら、（１９８７）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．５（８）：１２３２−１２３９）と一致して、耐性はＰ−ｇｐのアップレギュレーションに関連することが見出された（図２７Ａ）。Ｐ−ｇｐ過剰発現と協調して、細胞内ＦＩＴＣ−ＰＴＸは、ＭＣＦ−７／ＰＴＸ−Ｒでは、野生型ＭＣＦ−７細胞と比較して顕著に減少していた（図２７Ｂ）。また印象的なことに、ＦＩＴＣ−ＰＴＸ／ＮＰによるＭＣＦ−７／ＰＴＸ−Ｒ細胞の処置は、ＦＩＴＣ−ＰＴＸの細胞内保持に関連していたが（図２７Ｂ）、これは、これらのポリマーＮＰがＰＴＸ流出を阻害するという考えを裏付けている。（ｉ）アネキシンＶ／ＰＩ染色（図２７Ｃ）、（ｉｉ）ＦＬＯＷ分析による定量（図２７Ｄ）ならびに（ｉｉｉ）カスパーゼ−３およびＰＡＲＰ切断（図２７Ｅ）によって明らかなように、ＰＴＸまたはｎａｂ−パクリタキセルではなくＰＴＸ／ＮＰによるＭＣＦ−７／ＰＴＸ−Ｒ細胞の処置もアポトーシスの誘導に関連していた。ＭＣＦ−７／ＰＴＸ−Ｒ細胞では、Ｐ−ｇｐおよびＢＣＬ−２がアップレギュレートされているという観察結果により、ＰＴＸ活性を十分に増強するためには、両方の潜在的ＰＴＸ耐性機構をターゲティングすることが必要であり得ることが示唆された。したがって、ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰでＭＣＦ−７／ＰＴＸ−Ｒ細胞を処置したところ、ＩＣ５０は１０．３ｎＭであり、ＰＴＸ／ＮＰで得られたものよりも５倍低いことが見出された（表９）。加えて、ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰによるＭＣＦ−７／ＰＴＸ−Ｒ細胞の処置は、Ｐ−ｇｐおよびＢＣＬ−２レベルの大幅な阻害に関連していた（図２７Ｆ）。
これらの知見により、ＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰは、Ｐｇｐ１を遮断してＢＣＬ−２をターゲティングし、ＰＴＸ耐性を有効に打ち消すことによって、ＰＴＸの細胞内レベルを増加させるというモデルの証拠が提供された。
表のリスト
表１は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーの調製に使用したＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの詳細を提供する。
表２は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の特性評価を示す。
表３は、様々な分子量のポリマーＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧを使用して合成したＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子のロード効率を示す。
表４は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子への非改変抗癌ペプチド薬ＮｕＢＣＰ−９のロード率を提供する。
表５は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子への改変抗癌ペプチド薬ＮｕＢＣＰ−９のロード率を提供する。
表６は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子にロードしたポリアルギニンタンパク質導入ドメインに連結されたＭＵＣ１細胞質ドメインペプチドの増殖研究から得られたデータを提供する。（＊は、１ｍｇ／ウェルの濃度を示す）
表７は、単一または二重ロードＰＬＡ７２Ｋ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ１２．５Ｋ ＮＰのサイズ、ゼータ電位、ＥＥ％を提供する
表８は、図１８Ａ〜Ｆに関するデータを示す：これらの結果は、ナノ粒子中でＰＴＸとＬ−ＮｕＢＣＰ−９とを組み合わせることにより、ＰＴＸの有効用量が実質的に３８倍（３８ｎＭから１ｎＭに）減少することを実証している。ＮｕＢＣＰ−９用量も３６００ｎＭから１２ｎＭに減少する（約３００倍の減少）。
表９は、ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７／ＰＴＸ−Ｒ細胞株におけるＰＴＸ、ｎａｂ−パクリタキセル、ＰＴＸ／ＮＰおよびＰＴＸ−ＮｕＢＣＰ−９／ＮＰのＩＣ５０値を示す。

配列番号１：ＮｕＢＣＰ−９、配列ＦＳＲＳＬＨＳＬＬ
Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
配列番号２：ＭＵＣ１ペプチド、配列ＣＱＣＲＲＫＮ、ＭＵＣ１−ＣＤドメイン由来の配列
Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｓｎ
配列番号３：ＧＯ−２０３−２ｃ、配列ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＣＱＣＲＲＫＮ、ポリアルギニンに共有結合したＭＵＣ１−ＣＤドメイン由来の配列
Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｓｎ
配列番号４：ＭＵＣ１−ＣＤ突然変異体配列、配列ＡＱＡＲＲＫＮ、ＭＵＣ１−ＣＤドメイン由来の改変配列
Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｓｎ
配列番号５：ＣＰ−３、配列ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＡＱＡＲＲＫＮ、ポリアルギニンに共有結合したＭＵＣ１−ＣＤドメイン由来の改変配列
Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｓｎ
図１８Ｆは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の阻害における相乗作用に関連するパクリタキセルおよびＬ−ＮｕＢＣＰ−９分析のＣＩ（組み合わせ指数）を示す。この分析で達成されたＣＩ数値は、異なる用量で０．１〜１．０であったが、これは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の死滅における顕著に高い相乗作用を実証している。

Claims (44)

  1. ａ）ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子；
    ｂ）１つまたはそれを超える化学療法剤または抗癌標的薬剤；および
    ｃ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
    を含む、組成物。
  2. 前記組成物がＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記組成物がＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記ＰＬＡの分子量が約２，０００〜約８０，０００ダルトンである、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーが、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧトリブロックコポリマーとＰＬＡとの化学的コンジュゲーションから形成され、前記ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧトリブロックコポリマーが異なる分子量であり得る、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記ポリマーナノ粒子に、
    ａ）化学療法剤または標的抗癌剤；および
    ｂ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
    がロードされている、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記ポリマーナノ粒子に、
    ａ）化学療法剤または標的抗癌剤；および
    ｂ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチド
    がロードされている、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記ポリマーナノ粒子に、
    ａ）化学療法剤または標的抗癌剤；および
    ｂ）ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
    がロードされている、請求項６に記載の組成物。
  9. 前記化学療法剤がパクリタキセルである、６に記載の組成物。
  10. 前記ポリマーナノ粒子に、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、パクリタキセルと、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドとがロードされている、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記化学療法剤がゲムシタビンである、請求項６に記載の組成物。
  12. 前記ポリマーナノ粒子に、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、ゲムシタビンと、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドとがロードされている、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記化学療法剤または標的抗癌剤が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトライド、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキセートおよびボルテゾミブからなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
  14. 癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心臓血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経学的障害からなる群より選択される疾患の処置に使用するための医薬組成物であって、
    ａ）ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子；
    ｂ）１つまたはそれを超える治療剤；および
    ｃ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
    を含む、医薬組成物。
  15. 前記組成物がＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドを含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記組成物がＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドを含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
  17. 前記ポリマーナノ粒子が、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーから本質的になる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記ポリマーナノ粒子が、前記ポリマーナノ粒子の外側に結合したターゲティング部分をさらに含み、前記ターゲティング部分が抗体、ペプチドまたはアプタマーである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーから本質的になるポリマーナノ粒子であって、パクリタキセルと、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドとがロードされている、ポリマーナノ粒子。
  20. ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーから本質的になるポリマーナノ粒子であって、パクリタキセルと、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドとがロードされている、ポリマーナノ粒子。
  21. 癌の処置を必要とする被験体における癌を処置するための方法であって、
    ａ）ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子；
    ｂ）化学療法剤および／または抗癌標的薬剤；ならびに
    ｃ）ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドまたはＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチド
    を含む治療有効量の医薬組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
  22. 前記医薬組成物が、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記医薬組成物が、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドを含む、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記化学療法剤がパクリタキセルである、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記ポリマーナノ粒子に、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、パクリタキセルと、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドとがロードされている、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記化学療法剤がゲムシタビンである、請求項２１に記載の方法。
  27. 前記ポリマーナノ粒子に、約９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８または１：９の比で、ゲムシタビンと、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドとがロードされている、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記化学療法剤または標的抗癌剤が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトライド、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキセートおよびボルテゾミブからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
  29. 前記癌が、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、転移性結腸癌、膵臓癌または血液学的悪性腫瘍である、請求項２１に記載の方法。
  30. 前記被験体が、パクリタキセルまたはｎａｂ−パクリタキセルによる処置に対して耐性である、請求項２１に記載の方法。
  31. 前記被験体が、パクリタキセルまたはｎａｂ−パクリタキセルによる処置に対して不応性である、請求項２１に記載の方法。
  32. 前記被験体が、パクリタキセルまたはｎａｂ−パクリタキセルによる処置後に再発状態にある、請求項２１に記載の方法。
  33. 細胞におけるパクリタキセル流出を阻害するため方法であって、前記細胞と、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含む有効量のポリマーナノ粒子とを接触させることを含む、方法。
  34. 前記ポリマーナノ粒子にパクリタキセルがロードされている、請求項３３に記載の方法。
  35. 細胞におけるＰ−糖タンパク質発現を遮断するため方法であって、前記細胞と、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含む有効量のポリマーナノ粒子とを接触させることを含む、方法。
  36. 細胞におけるＰ−糖タンパク質媒介性薬剤耐性を打ち消すための方法であって、前記細胞と、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含む有効量のポリマーナノ粒子とを接触させることを含む、方法。
  37. 前記ポリマーナノ粒子がＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーから本質的になる、請求項２１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 第１の化学療法薬に対する耐性を有する癌細胞を生じさせるための方法であって、前記癌細胞と、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子とを接触させることを含み、前記ポリマーナノ粒子に第２の化学療法薬がロードされており、Ｐ−糖タンパク質のアップレギュレーションによって、前記第１の化学療法薬に対する前記癌細胞の前記耐性を生じさせる、方法。
  39. 前記ポリマーナノ粒子がＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーから本質的になる、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記癌細胞が乳癌細胞である、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記第１の化学療法薬がパクリタキセルである、請求項３８に記載の方法。
  42. 前記第２の化学療法薬がパクリタキセルである、請求項３８に記載の方法。
  43. 前記ポリマーナノ粒子に、ＮｕＢＣＰ−９（配列番号１）を含むペプチドがロードされている、請求項３８に記載の方法。
  44. 前記ポリマーナノ粒子に、ＭＵＣ１（配列番号２）を含むペプチドがロードされている、請求項３８に記載の方法。
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