KR20140084144A - 출혈 제어 및 약물 전달을 위한 나노입자 - Google Patents

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KR20140084144A
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에린 라빅
앤드류 쇼프스털
제프리 우스틴
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케이스 웨스턴 리저브 유니버시티
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Abstract

중심부, 수용성 중합체 및 RGD 펩티드를 포함하는 나노입자가 제공된다.

Description

출혈 제어 및 약물 전달을 위한 나노입자{NANOPARTICLES FOR CONTROLLING BLEEDING AND DRUG DELIVERY}
본 출원은 2011년 10월 13일에 제출된, 미국 가출원 특허 번호 제61/564826호의 우선권을 주장하고, 이의 개시는 이의 전체로 참조로서 편입된다.
정부 이익의 명시
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 수여 번호 제1DP2OD007338-01호 그리고 미국 국방부(United States Department of Defense)에 의해 수여된 수여 번호 제W81XWH-11-2-0014호 하에 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정한 권리를 갖는다.
배경
정상적으로, 상처가 나면, 혈소판은 손상 부위에서 활성화되고 활성화된 혈소판은 피브린을 생산하고 그리고 세포와 피브린은 출혈을 중지시키는 플러그(plug)를 형성한다 (5). 제어되지 않는 출혈에서, 혈소판은 플러그를 형성할 수 없다. 압박 붕대, 흡수 물질 가령 QuikClot®, 및 활성화된 재조합 인자 VII (rFVIIa)의 정맥내 (IV) 주입을 비롯하여, 현장에서 그리고 치료소에서 지혈을 증대시키기 위한 다수의 기법이 있지만, 앞의 두 가지만이 노출된 상처에 적용가능하고, rFVIIa는 두 가지가 다 혼합된 결과를 가졌고, 냉동을 요구하고, 그리고 이례적으로 비싸서 현장에서 또는 외상의 부위에 투여되는 것을 도전적으로 만든다. 명확하게, 현장에서 투여를 할 수 있게 출혈을 중지시키는 새로운 기법이 필요하다.
출혈은 또한 손상 캐스케이드(cascade)에서, 예를 들어, 중추 신경계 (CNS)에서 첫 번째 단계이다. 척수 및 외상적인 뇌 손상에서, 첫 번째 관찰가능한 현상은, 상해의 기작에 상관없이, 출혈이다. 만약 출혈을 멈추게 할 수 있다면, 아마도 조직을 보존하고 결과를 향상시킬 수 있을 것이다. 일차 기계적인 상해는 매우 종종 손상의 작은 부분이다. 손상 후 몇 시간, 며칠, 그리고 몇 주에 걸쳐 발생하는 이차 손상 과정은 진행 및 불량한 기능적 결과를 야기한다. 이들 이차 손상 과정을 멈추게 하는 것은 더 많은 양의 조직의 보존을 의미할 것이다. 조직의 보존은 더 나은 기능적 결과를 의미한다.
손상 후, 지혈은 일련의 응고성 사건을 통해 확립된다. 혈소판에 관하여 중요한 단계는 그들의 활성화, 결합, 및 다수의 성장인자 및 피브리노겐을 비롯한 다른 분자의 방출을 수반한다. 혈관 손상 동안, 콜라겐은 노출되며 이는 혈소판의 활성화를 야기한다. 혈소판 형태학은 원반 모양에서 성상으로 바뀌고, 그들은 노출된 콜라겐에 부착한다. 혈소판 집합이 시작되고 나면, 여러 가지 염증 작용제는 가까이에 순환하는 혈소판의 표면을 부착성이 되도록 야기하는, 아데노신 디포스페이트 (ADP)를 포함한 그들의 저장 과립으로부터 방출된다. 세로토닌, 에피네프린, 및 트롬복산 A 2는 극도의 혈관수축을 추가로 유도한다. 궁극적인 단계, 혈전 형성은 간에 의해 생산되는 그리고 일반적으로 혈장에서 존재하는 크고, 용해성의 혈장 단백질인, 피브리노겐을 불용성의 가늘고 긴 분자인 피브린으로 전환하는 것이다.
중상에서, 이들 내생 과정은 결핍되고 그리고 제어되지 않는 출혈 결과가 된다. 이들 과정을 증대시키고 외부 방법을 능가하는 지혈을 유도하는 다수의 기법이 있어 왔다. 존재하는 혈소판을 교체하거나 또는 증대시키는 혈소판 대체물이 수년 동안 추구되어왔다 (6). 동종이계 혈소판의 투여는 출혈을 중지시키는 것을 도울 수 있다; 하지만, 혈소판은 짧은 저장 수명을 갖고, 그리고 동종이계 혈소판의 투여는 이식편대숙주병, 동종면역, 및 수혈-연관 폐 손상을 야기할 수 있다 (6). Arg-Gly-Asp (RGD) 서열로 변형된 적혈구 세포, 알부민에 기반한 피르리노겐-코팅된 미세캡슐, 그리고 리포솜 시스템을 비롯한 비-혈소판 대안은 응고제로서 연구되어 왔지만 (7), 독성, 혈전증, 및 제한된 효능이 이들 산물의 임상적인 적용에서 주요한 사안이다 (8).
rFVIIa (NovoSeven®)을 비롯한 재조합 인자는 피브리노겐의 생산을 촉진함으로써 지혈을 증대시킬 수 있지만, 면역성 및 혈전색전성 합병증은 불가피한 위험요소이다 (9). 그럼에도 불구하고, NovoSeven®은 치료소에서 다수의 외상 및 수술이 아니면 출혈이 제어될 수 없는 수술 상황에서 이용되고 있다 (9). 이의 효능에 대한 데이터는 가변적이지만, NovoSeven이 대단히 비싸다고 할 수는 없다. 단일 용량은 대략 $10,000이고, 그리고 지혈에 효과를 주기 위해 전형적으로 복수 용량이 요구된다 (9).
복합 외상에 유효한 지혈제의 경우, 시스템은 실온 (즉, 위생병의 가방)에서 저장될 때 비-독성이고, 안정적이어야 하고, 즉각적인 I.V. 투여의 가능성을 가지고, 그리고 비-특이적 혈전증을 피하기 위해 손상 부위-특이적 집합 특성을 가진다. 이 시스템이 임상적으로 변환가능하도록 하기 위하여, 이상적으로 이것은 FDA에 의해 이전에 승인된 물질로 만들어져야 한다. 실용적으로, 이것은 또한 감당할 수 있는 비용이어야 한다.
발명의 요약
온도 안정 나노입자는 중심부, 수용성 중합체 및 펩티드를 포함하여 제공되고, 수용성 중합체는 수용성 중합체의 일차 말단에서 중심부에 부착되고, 펩티드는 수용성 중합체의 이차 말단에 부착되고, 펩티드는 RGD 아미노산 서열을 포함하고, 수용성 중합체는 글리코단백질 IIb/IIIa (GPIIb/IIIa)에 펩티드의 결합을 허용하는 데에 충분한 길이를 갖는다. 하나의 측면에서, 나노입자는 35℃ 초과의 융해 온도를 갖는다. 다양한 측면에서, 나노입자는 스페로이드(spheroid) 모양 및 1 마이크론 미만의 지름을 갖는다.
다양한 측면에서, 나노입자는 0.1 마이크론 내지 1 마이크론의 지름을 갖는다.
다양한 측면에서, 나노입자는 비-스페로이드, 로드(rod), 섬유(fiber) 또는 위스커(whisker)이다. 본 측면의 여러 가지 구체예에서, 나노입자는 적어도 3의 가로 세로 종횡비를 갖는다.
다양한 측면에서, 나노입자는 적어도 14일 동안 실온에서 안정하다.
다수의 나노입자가 또한 제공되며, 여기서 본 개시에 의해 제공되는 바와 같은 각각의 나노입자는 0.1 마이크론 내지 1 마이크론의 평균 지름을 갖는다.
다수의 나노입자의 다양한 측면에서, 모든 나노입자 중 75% 초과가 0.1 마이크론 내지 1 마이크론의 지름을 갖는다.
다양한 측면에서, 본 개시의 나노입자는 결정성 중합체, 단일 중합체, 블록 공중합체(block copolymer), 삼중블록 공중합체 또는 사중블록 중합체인 중심부를 갖는다. 다양한 측면에서, 중심부는 PLGA, PLA, PGA, (폴리 (ε-카프로락톤) PCL, PLL 또는 이의 조합을 포함한다.
다양한 측면에서, 나노입자 중심부는 생분해성, 고체, 비-생분해성이고 및/또는 금, 은, 백금, 알루미늄, 팔라듐, 구리, 코발트, 인듐, 니켈, ZnS, ZnO, Ti, TiO2, Sn, SnO2, Si, SiO2, Fe, Fe+4, 강철, 코발트-크롬 합금, Cd, CdSe, CdS, 및 CdS, 티타늄 합금, AgI, AgBr, HgI2, PbS, PbSe, ZnTe, CdTe, In2S3, In2Se3, Cd3P2, Cd3As2, InAs, GaAs, 셀룰로오스 또는 덴드리머 구조로 구성된 군에서 선택된 물질로 구성된다.
다양한 측면에서, 나노입자내 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 분지 PEG, 폴리시알산 (PSA), 카르보하이드레이트, 다당류, 폴루란, 키토산, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 전분, 덱스트란, 카르복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드 (PAO), 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리옥사졸린, 폴리 아크릴로일모르폴린, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포르말) (PHF), 2-메타크릴로일옥시-2'-에틸트리메틸암모늄포스페이트 (MPC), 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아세탈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리 (β-아미노산) (호모중합체 또는 랜덤 공중합체 중 하나), 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 호모중합체 (PPG) 및 다른 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (POG) (가령, 글리세롤) 및 다른 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리옥시에틸화 소르비톨, 또는 폴리옥시에틸화 글루코오스, 콜로닉산(colonic acid) 또는 다른 카르보하이드레이트 중합체, 피콜 또는 덱스트란 및 이의 조합 또는 혼합물로 구성된 군에서 선택된다. 다양한 측면에서, 수용성 중합체는 100 Da 내지 10,000 Da 또는 적어도 100의 평균 분자량을 갖는 PEG이다.
다양한 측면에서, 나노입자의 펩티드는 RGD, RGDS, GRGDS, GRGDSP, GRGDSPK, GRGDN, GRGDNP, GGGGRGDS, GRGDK, GRGDTP, cRGD, YRGDS 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함한다. 다양한 측면에서, 펩티드는 선형이고 다른 측면에서, 펩티드는 환형이다. 환형 펩티드는 공유결합의 결과로서 환형인 것들, 및 입체구조 선호도에 의해 환형인 것들을 포함하는 것으로 당분야에서 이해된다. 이에 따라, 환형 펩티드는 공유 결합을 통해 환형이 아닌 것들을 포함한다. 다양한 측면에서, RGD 펩티드는 종열 중복(tandem repeat)으로 있다. 다양한 측면에서, 나노입자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 RGD 펩티드, 또는 복수 개의 RGD 펩티드를 포함한다. 다양한 측면에서, 나노입자내 모든 RGD 펩티드는 동일하고, 다른 측면에서, 2개의 RGD 펩티드는 상이한 서열을 갖는다.
다양한 측면에서, 수용성 중합체는 0.1:1 내지 1:10 이상의 몰비로 중심부에 부착된다.
다양한 측면에서, 본 개시의 나노입자는 치료학적 화합물을 추가로 포함한다. 다양한 측면에서, 치료학적 화합물은 소수성이고, 치료학적 화합물은 친수성이고, 치료학적 화합물은 나노입자에 공유결합으로 부착되고, 나노입자와 비-공유결합으로 회합되고, 정전기 상호작용을 통해 나노입자와 회합되고, 또는 소수성 상호작용을 통해 나노입자와 회합되고, 치료학적 화합물은 성장 인자, 사이토카인, 스테로이드, 또는 소분자이고, 및/또는 치료학적 화합물은 항-암 화합물이다.
본 개시의 나노입자를 포함하는 제약학적 조성물이 제공된다. 다양한 측면에서, 제약학적 조성물은 정맥내 투여 제제, 동결건조된 제제, 또는 분말이다.
개체내 질환을 치료하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 본 개시의 나노입자를 질환을 치료하는 데에 유효한 양으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 측면에서, 개체는 출혈 장애를 갖는다. 본 방법의 다양한 측면에서, 나노입자는 식염수의 투여 없음 또는 투여와 비교하여 15% 초과까지 출혈 시간을 감소시키는 데에 유효한 양으로 투여된다. 다양한 측면에서, 출혈 장애는 응고 장애, 혈소판감소증, 상처치유 장애, 외상, 폭발 외상, 척수 손상 또는 출혈의 증상이다.
발명의 설명
기능화된 나노입자는 복수의 용도를 가진 FDA-승인 물질에 기반하여 제공된다. 다양한 측면에서, 나노입자는 손상 부위에서 출혈 시간을 감소시키고, 중추 신경계 (CNS)에 대한 외상 후 지혈의 역할을 하고 그리고 국부화 약물 전달을 위한 수단을 제공한다.
나노입자는 중합체 중심부, 수용성 중합체, 및 아르기닌-글리신-아스파르트산 (RGD) 모이어티 상에서의 변이체에 기반하여 제공된다.
I. 나노입자
본 개시는 중심부, 수용성 중합체 및 펩티드를 포함하는 나노입자를 제공하며, 수용성 중합체는 수용성 중합체의 일차 말단에서 중심부에 부착되고, 펩티드는 수용성 중합체의 이차 말단에 부착되고, 펩티드는 RGD 아미노산 서열을 포함하고, 수용성 중합체는 글리코단백질 IIb/IIIa (GPIIb/IIIa)에 펩티드의 결합을 허용하는 데에 충분한 길이를 갖는다. 다양한 측면에서, 펩티드는 선형 또는 환형이다. 본 개시의 다수의 나노입자를 포함하는 조성물에서, 조성물은 나노입자를 포함하는 것으로 고려되며 여기서 모든 펩티드는 선형이고, 모든 펩티드는 환형이고, 또는 선형 및 환형 펩티드의 혼합물이 존재한다는 점이 이해될 것이다.
본 개시의 나노입자는 그들이 광범위한 온도에 걸쳐 본질적으로 동일한 구조 및/또는 본질적으로 동일한 기능을 유지한다는 점에서 온도가 안정하다. "본질적으로 동일한 구조" 및 "본질적으로 동일한 기능"으로써, 본 개시는 10% 안팎의 원래 투여량, 10% 안팎의 원래 투여량, 10% 안팎의 원래 투여량, 9% 안팎의 원래 투여량, 8% 안팎의 원래 투여량, 7% 안팎의 원래 투여량, 6% 안팎의 원래 투여량, 5% 안팎의 원래 투여량, 또는 5%-10% 안팎의 원래 투여량의 투여량에서 나노입자의 용도를 수행하는 나노입자의 능력에 영향을 준다는 것을, 변화 없이 의미하는 것으로 "본질적으로 동일한"을 고려한다. 다양한 구체예에서, 나노입자는 나노입자가 생성되었던 온도에 상관없이, 생리학적 온도에서 본질적으로 동일한 구조 및/또는 본질적으로 동일한 기능을 유지한다. 생리학적 온도를 훨씬 넘어 상승된 온도에서 본질적으로 동일한 구조 및/또는 본질적으로 동일한 기능을 유지하는 나노입자가 또한 고려된다. 상승된 온도에서 본질적으로 동일한 구조 및/또는 본질적으로 동일한 기능을 유지하는 능력은 예를 들어 그리고 제한 없이, 멸균화 공정을 비롯하여, 많은 근거에 있어 중요하다. 다른 한편으로, 감소된 온도에서 본질적으로 동일한 구조 및/또는 본질적으로 동일한 기능을 유지하는 나노입자가 또한 고려된다. 예를 들어, 냉동 온도에서 또는 상기 온도 아래에서 본질적으로 동일한 구조 및/또는 본질적으로 동일한 기능을 유지하는 나노입자는 장기간 저장으로부터 이익을 얻거나 또는 요구하는 제제를 위해 고려된다. 다양한 측면에서, 본 개시의 나노입자는 35℃ 초과, 40℃ 초과, 45℃ 초과, 50℃ 초과, 55℃ 초과, 60℃ 초과, 65℃ 초과, 70℃ 초과, 71℃ 초과, 72℃ 초과, 73℃ 초과, 74℃ 초과, 75℃ 초과, 76℃ 초과, 77℃ 초과, 78℃ 초과, 79℃ 초과 또는 80℃ 초과의 융해 온도를 갖는다.
본 개시의 모든 측면의 나노입자는 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일 이상 동안 실온에서 안정하다.
본 개시의 나노입자는 다수의 상이한 모양 중 어느 하나를 갖는 것으로 고려된다. 나노입자의 모양은 특정한 측면에서, 이의 생산 방법의 기능이다. 다른 측면에서, 나노입자는 이의 생산 공정 전에, 동안에 또는 후에 형성된 모양을 획득한다. 다양한 구체예에서, 나노입자는 스페로이드 모양을 갖는 것으로 제공된다. 다양한 크기를 갖는 스페로이드 나노입자 (본 명세서에서 나노구체(nanosphere)로서 언급됨)가 고려되며, 여기서, 예를 들어 0.1 마이크론 내지 0.5 마이크론, 0.2 마이크론 내지 0.4 마이크론, 0.25 마이크론 내지 0.375 마이크론, 0.3 마이크론 내지 0.375 마이크론, 0.325 마이크론 내지 0.375 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.13 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.14 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.15 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.16 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.17 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.18 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.19 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.20 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.21 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.21 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.20 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.19 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.18 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.17 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.16 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.15 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.14 마이크론, 또는 0.12 마이크론 내지 0.13 마이크론의 지름을 갖는 나노입자가 고려된다. 다양한 측면에서, 나노입자는 0.01 마이크론 내지 1.0 마이크론, 0.05 마이크론 내지 1.0 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.95 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.9 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.85 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.8 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.75 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.7 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.65 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.6 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.55 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.5 마이크론, 0.1 마이크론 내지 1 마이크론, 0.15 마이크론 내지 1.0 마이크론, 0.2 마이크론 내지 1 마이크론, 0.25 마이크론 내지 1.0 마이크론, 0.3 마이크론 내지 1 마이크론, 0.35 마이크론 내지 1.0 마이크론, 0.4 마이크론 내지 1 마이크론, 0.45 마이크론 내지 1.0 마이크론, 또는 0.5 마이크론 내지 1 마이크론의 지름을 갖는 것으로 고려된다. 본 개시에 의해 제공된 나노입자의 조성물에서, 구체의 나노입자(spherical nanoparticle)는 모든 것이 동일한 지름을 가진다는 점에서 상동이거나, 또는 그들은 조성물내 적어도 2개의 나노입자가 상이한 지름을 가진다는 점에서 비상동이다.
비-스페로이드인 나노입자가 또한 제공된다. 다른 나노입자는 로드, 섬유, 위스커 모양을 갖는 것들을 포함한다. 로드, 섬유 또는 위스커의 구체예에서, 나노입자는 순환으로부터 클리어런스(clearance)의 속도를 방지하고, 늦추고 또는 감소시키기 위해 충분히 높은 종횡비를 갖는다.
종횡비는 당분야에서 이해되는 용어이고, 높은 종횡비는 길고 좁은 모양을 명시하고 낮은 종횡비는 짧고 두툼한 모양을 명시한다.
본 개시의 나노입자는 적어도 3, 적어도 3.5, 적어도 4.0, 적어도 4.5, 적어도 5.0, 적어도 5.5, 적어도 6.0, 적어도 6.5, 적어도 7.0, 적어도 7.5, 적어도 8.0, 적어도 8.5, 적어도 9.0, 적어도 9.5, 적어도 10.0 이상의 가로 세로 종횡비로 고려된다. 고려되는 나노입자의 조성물에서, 나노입자는 한 가지 구체예에서, 동일한 종횡비를 가지고, 그리고 대안적인 구체예에서, 조성물내 적어도 2개의 나노 입자는 상이한 종횡비를 갖는다. 나노입자의 조성물은 평균적으로, 본질적으로 동일한 종횡비를 갖는 것으로써 또한 특징된다. 본 예시에서 사용된 바와 같은 "본질적으로 동일한"은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6% 또는 약 5%까지의 종횡비에서의 변형이 포괄된다는 점을 명시하였다. 다른 측면에서, 나노입자의 조성물이 제공되며 여기서 조성물내 나노입자는 약 1% 내지 200%, 약 1% 내지 150%, 약 1% 내지 100%, 약 1% 내지 약 50%, 약 50% 내지 200%, 약 100% 내지 200%, 및 약 150% 내지 200%의 종횡비를 갖는다. 대안으로, 조성물내 나노입자는 약 X% 내지 Y%의 종횡비를 가지며, 여기서 X는 1부터 최대 100까지이고 그리고 Y는 100부터 최대 200까지이다.
본 개시는 다수의 나노입자를 또한 제공한다. 본 개시에 의해 제공된 다수의 구체의 나노입자를 포함하는 조성물에서, 다수내 나노입자는 0.1 마이크론 내지 0.5 마이크론, 0.2 마이크론 내지 0.4 마이크론, 0.25 마이크론 내지 0.375 마이크론, 0.3 마이크론 내지 0.375 마이크론, 0.325 마이크론 내지 0.375 마이크론, 약 0.12 마이크론, 약 0.13 마이크론, 약 0.14 마이크론, 약 0.15 마이크론, 약 0.16 마이크론, 약 0.17 마이크론, 약 0.18 마이크론, 약 0.19 마이크론, 약 0.20 마이크론, 약 0.21 마이크론, 약 0.22 마이크론, 약 0.23 마이크론, 약 0.24 마이크론, 약 0.25 마이크론, 약 0.26 마이크론, 약 0.27 마이크론, 약 0.28 마이크론, 약 0.29 마이크론, 약 0.30 마이크론, 약 0.31 마이크론, 약 0.32 마이크론, 약 0.33 마이크론, 약 0.34 마이크론, 약 0.35 마이크론, 약 0.36 마이크론, 약 0.37 마이크론, 약 0.38 마이크론, 약 0.39 마이크론, 약 0.40 마이크론, 약 0.41 마이크론, 약 0.42 마이크론, 약 0.43 마이크론, 약 0.44 마이크론, 약 0.45 마이크론, 약 0.46 마이크론, 약 0.47 마이크론, 약 0.48 마이크론, 약 0.49 마이크론, 약 0.50 마이크론, 약 0.41 마이크론, 약 0.52 마이크론, 약 0.53 마이크론, 약 0.54 마이크론, 약 0.55 마이크론, 약 0.56 마이크론, 약 0.57 마이크론, 약 0.58 마이크론, 약 0.59 마이크론, 약 0.60 마이크론, 약 0.61 마이크론, 약 0.62 마이크론, 약 0.63 마이크론, 약 0.64 마이크론, 약 0.65 마이크론, 약 0.66 마이크론, 약 0.67 마이크론, 약 0.68 마이크론, 약 0.69 마이크론, 약 0.70 마이크론, 약 0.71 마이크론, 약 0.72 마이크론, 약 0.73 마이크론, 약 0.74 마이크론, 약 0.75 마이크론, 약 0.76 마이크론, 약 0.77 마이크론, 약 0.78 마이크론, 약 0.79 마이크론, 약 0.80 마이크론, 약 0.81 마이크론, 약 0.82 마이크론, 약 0.83 마이크론, 약 0.84 마이크론, 약 0.85 마이크론, 약 0.86 마이크론, 약 0.87 마이크론, 약 0.88 마이크론, 약 0.89 마이크론, 약 0.90 마이크론, 약 0.91 마이크론, 약 0.92 마이크론, 약 0.93 마이크론, 약 0.94 마이크론, 약 0.95 마이크론, 약 0.96 마이크론, 약 0.97 마이크론, 약 0.98 마이크론, 약 0.99 마이크론, 약 1.0 마이크론 이상의 평균 지름을 갖는다.
다양한 측면에서, 다수의 구체의 나노입자는 모든 나노 입자 중 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과가 0.1 마이크론 내지 0.5 마이크론, 0.2 마이크론 내지 0.4 마이크론, 0.25 마이크론 내지 0.375 마이크론, 0.3 마이크론 내지 0.375 마이크론, 0.325 마이크론 내지 0.375 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.13 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.14 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.15 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.16 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.17 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.18 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.19 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.20 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.21 마이크론 내지 0.22 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.21 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.20 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.19 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.18 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.17 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.16 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.15 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.14 마이크론, 0.12 마이크론 내지 0.13 마이크론, 0.01 마이크론 내지 1.0 마이크론, 0.05 마이크론 내지 1.0 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.95 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.9 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.85 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.8 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.75 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.7 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.65 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.6 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.55 마이크론, 0.05 마이크론 내지 0.5 마이크론, 0.1 마이크론 내지 1 마이크론, 0.15 마이크론 내지 1.0 마이크론, 0.2 마이크론 내지 1 마이크론, 0.25 마이크론 내지 1.0 마이크론, 0.3 마이크론 내지 1 마이크론, 0.35 마이크론 내지 1.0 마이크론, 0.4 마이크론 내지 1 마이크론, 0.45 마이크론 내지 1.0 마이크론, 또는 0.5 마이크론 내지 1 마이크론의 지름을 갖는다는 점으로 특징된다.
본 개시는 본질적으로 임의의 모양의 나노입자가 당분야에서 잘 공지되고 일과적으로 실시되는 미세제작 공정을 이용하여 형성된다는 점을 추가로 제공한다. 미세제작 방법에서, 나노입자의 크기 및 모양은 설계에 의해 예정된다.
나노입자는 모양이 비-구체인 것으로 이용되는 측면에서, 당분야에서 잘 공지되고 일과적으로 사용되는 나노제작 기술이 생산을 위해 고려된다. Daum et al., (2012) Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol 4: 52-65; Gang et al., (2011) ACS Nano 5: 8459-8465; Grilli et al., (2011) Proc Natl Acad Sci U S A 108: 15106-15111; Lin, et al., (2011) Control Release 154: 84-92; Slingenbergh et al., (2012) Selective Functionalization of Tailored Nanostructures. ACS Nano. 주형(mold)은 물질, 가령 실리콘, PDMS (폴리디메틸실록산) 또는 당분야에서 잘 공지된 다른 물질의 밖에서 생산되고, 그리고 하이드로겔, 가령 젤라틴으로 주조된다. 본 명세서에서 기술된 바와 같은 임의의 중합체는 나노입자를 주조하는 데에 이용된다. 원래의 주형에 기반하여, 결과적 구조는 다양한 측면에서, 200 nm 내지 몇몇 마이크론 길이의 아암(arm) 그리고 200 nm 내지 몇몇 마이크론의 지름의 아암을 가진 다중아암(multiarmed) 별모양이다. 주조 공정은 아암이 3개의 아암 내지 10개의 아암의 상이한 길이 및 치수가 되도록 하는데 그 이유는 이것이 주조 절차이기 때문이다.
A. 중심부
상기 기술된 바와 같은 나노입자가 제공되며 여기서 중심부는 중합체이다. 다양한 측면에서, 중심부는 결정성 중합체이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 그리고 당분야에서 이해되는 "결정성"은 정기적인 3차원 어레이(regular three dimensional array)에서 분자의 배열을 의미하는 것으로 정의된다. 다른 측면에서, 중합체는 정기적인 3차원 어레이에서 배열된 모든 분자 대신 결정성 및 무정형 영역 둘 모두를 함유하는 반-결정성이다. 다양한 측면에서, 중심부는 단일 중합체, 블록 공중합체, 또는 삼중블록 공중합체이다. 특이적인 측면에서, 중심부는 PLGA, PLA, PGA, (폴리 (ε-카프로락톤) PCL, PLL, 셀룰로오스, 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 덴드리머-기반 중합체 또는 이의 조합을 포함한다.
다양한 측면에서, 중심부는 생분해성 또는 비-생분해성이거나, 또는 다수의 나노입자에서, 생분해성 및 비-생분해성 중심부의 조합은 고려되어 조제된다. 다양한 측면에서, 중심부는 고체이거나, 다공성이거나 또는 속이 비어있다. 다수의 나노입자에서, 고체인, 다공성인 및/또는 속이 빈 중심부의 혼합이 포함된다는 점이 구상된다.
본 개시의 임의의 측면의 나노입자는 중심부가 대안으로 금, 은, 백금, 알루미늄, 팔라듐, 구리, 코발트, 인듐, 니켈, ZnS, ZnO, Ti, TiO2, Sn, SnO2, Si, SiO2, Fe, Fe+4, 강철, 코발트-크롬 합금, Cd, CdSe, CdS, 및 CdS, 티타늄 합금, AgI, AgBr, HgI2, PbS, PbSe, ZnTe, CdTe, In2S3, In2Se3, Cd3P2, Cd3As2, InAs, GaAs, 셀룰로오스 또는 덴드리머 구조로 구성된 군에서 선택된 물질인 것들을 포함한다.
하이드로겔 중심부가 또한 제공된다. 하나의 측면에서, 하이드로겔 중심부는 더 높은 정도의 안정한 온도를 제공하고, 혈관을 전단할 가능성이 더 적고 비-특이적 혈전증을 유도하고 그리고 더 큰 나노입자의 형성을 허용한다.
B. 수용성 중합체
본 개시의 나노입자가 제공되며 여기서 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 분지 PEG, 폴리시알산 (PSA), 카르보하이드레이트, 다당류, 폴루란, 키토산, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 전분, 덱스트란, 카르복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드 (PAO), 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리옥사졸린, 폴리 아크릴로일모르폴린, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포르말) (PHF), 2-메타크릴로일옥시-2'-에틸트리메틸암모늄포스페이트 (MPC), 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아세탈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리 (β-아미노산 서열) (호모중합체 또는 랜덤 공중합체 중 하나), 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 호모중합체 (PPG) 및 다른 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (POG) (가령, 글리세롤) 및 다른 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리옥시에틸화 소르비톨, 또는 폴리옥시에틸화 글루코오스, 콜로닉산 또는 다른 카르보하이드레이트 중합체, 피콜 또는 덱스트란 및 이의 조합 또는 혼합물로 구성된 군에서 선택된다. 본 개시에 의해 고려되는 다수의 나노입자에서, 각각의 나노입자는 다양한 측면에서, 동일한 수용성 중합체를 갖는 것으로 고려되거나, 또는 대안으로, 다수 각각에서 적어도 2개의 나노입자는 이에 부착된 상이한 수용성 중합체를 갖는다.
특이적인 측면에서, 본 개시의 나노입자는 수용성 중합체가 PEG인 것이다. 본 측면에서 나노입자에 대하여, PEG는 100 Da 내지 10,000 Da, 500 Da 내지 10,000 Da, 1000 Da 내지 10,000 Da, 1500 Da 내지 10,000 Da, 2000 Da 내지 10,000 Da, 2500 Da 내지 10,000 Da, 3000 Da 내지 10,000 Da, 3500 Da 내지 10,000 Da, 4000 Da 내지 10,000 Da, 4500 Da 내지 10,000 Da, 5000 Da 내지 10,000 Da, 5500 Da 내지 10,000 Da, 1000 Da 내지 9500 Da, 1000 Da 내지 9000 Da, 1000 Da 내지 8500 Da, 1000 Da 내지 8000 Da, 1000 Da 내지 7500 Da, 1000 Da 내지 7000 Da, 1000 Da 내지 6500 Da, 또는 1000 Da 내지 6000 Da의 평균 분자량을 갖는다. 대안으로, 나노입자는 PEG가 약 100, Da, 200 Da, 300 Da, 400 Da, 1000 Da, 1500 Da, 3000 Da, 3350 Da, 4000 Da, 4600 Da, 5,000 Da, 8,000 Da, 또는 10,000 Da의 평균 분자량을 갖는 것이다. 다수의 나노입자에서, 각각의 나노입자는 동일한 분자량의 PEG 수용성 중합체에 부착되거나, 또는 대안으로, 다수에서 적어도 2개의 나노입자가 동일한 분자량을 갖지 않는 PEG 수용성 중합체에 각각 부착된다는 점이 고려된다.
본 개시의 나노입자는 수용성 중합체가 0.1:1, 0.2:1, 0.3:1, 0.4:1, 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10 이상의 몰비에서 중심부에 부착되는 것들을 포함한다. 여러 가지 측면에서, 다수는 수용성 중합체 대 중심부 비가 다수에서 각각의 나노입자에 대해 동일하고, 대안적인 측면에서, 다수에서 적어도 2개의 나노입자는 상이한 수용성 중합체 대 중심부 비를 갖는다는 점이 입증된다.
나노입자가 수용성 중합체와 회합되는 정도는 다양한 측면에서, 선택된 투여의 경로에 의해 결정된다.
C. 펩티드
본 개시의 나노입자는 그것과 회합된 펩티드를 가짐으로써 특징된다. 본 개시의 여러 가지 측면에서, 펩티드는 선형 또는 환형이다. 특이적인 구체예에서, 펩티드는 RGD, RGDS, GRGDS, GRGDSP, GRGDSPK, GRGDN, GRGDNP, GGGGRGDS, GRGDK, GRGDTP, cRGD, YRGDS 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택된 중심부 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 변이체는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 중심부 서열 및 중심부 서열의 양쪽 끝 또는 그 중 하나에 부착된 하나 이상의 추가적인 아미노산 서열 잔기를 갖는 펩티드, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 중심부 서열을 갖지만 여기서 중심부 서열내 하나 이상의 아미노산 서열 잔기는 대안적인 아미노산 서열 잔기로 치환되는 펩티드; 대안적인 아미노산 서열 잔기는 자연적으로-발생하는 아미노산 서열 잔기 또는 비-자연적으로-발생하는 아미노산 서열 잔기임, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 중심부 서열을 갖지만 여기서 중심부 서열내 하나 이상의 아미노산 서열 잔기는 결실되는 펩티드, 또는 이의 조합을 포함하며, 여기서 추가적인 아미노산 서열 잔기, 아미노산 서열 치환, 아미노산 서열 결실 또는 변화의 조합은 나노입자의 활성을 본질적으로 변경시키지 않는다. 본 측면에서 사용된 바와 같은 "본질적으로"는 본 개시의 다른 곳에서 기술된 의미와 동일하다.
다양한 측면에서, RGD 펩티드는 종열 중복 배열로 있고 본 측면의 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 RGD 펩티드가 고려된다. 또 다른 측면에서, 랜덤 반복 배열이 아니더라도, 복수 개의 RGD 펩티드가 동일한 나노입자에 부착된다.
나노입자가 복수의　RGD　펩티드와 회합되는 여러 가지 측면에서,　본 개시는 모든　RGD　펩티드가 동일한　나노입자,　그리고　RGD　펩티드 중　2개는 상이한 서열을 갖는　측면을 제공한다.
고려되는 다수의 나노입자에서, RGD 펩티드 (또는 복수 개의 RGD 펩티드)가 다수에서 각각의 나노입자와 동일하다는 구체예가 제공된다. 대안적인 측면에서, 다수에서 적어도 2개의 나노입자는 각각 하나 이상의 별개의 RGD 펩티드와 회합된다.
여러 가지 측면에서, 나노입자 상에서 펩티드의 수, 즉 펩티드 밀도는 혈소판 집합에 영향을 준다.
E. 나노입자를 가진 다른 화합물
본 개시의 나노입자는 치료학적 화합물을 추가로 포함하는 것으로 또한 고려된다. 다양한 측면에서, 치료학적 화합물은 소수성이고 다른 측면에서, 치료학적 화합물은 친수성이다. 본 개시의 나노입자가 제공되며 여기서 치료학적 화합물은 나노입자에 공유결합으로 부착되고, 나노입자와 비-공유결합으로 회합되고, 정전기 상호작용을 통해 나노입자와 회합되고, 또는 소수성 상호작용을 통해 나노입자와 회합된다. 여러 가지 구체예에서, 치료학적 화합물은 성장 인자, 사이토카인, 스테로이드, 또는 소분자이다. 하나 이상의 치료학적 화합물이 나노입자와 회합되는 구체예가 고려된다. 본 측면에서, 나노입자와 회합되는 각각의 치료학적 화합물은 동일하거나, 또는 나노입자와 회합되는 각각의 치료학적 화합물은 상이하다. 본 개시에 의해 제공되는 다수의 나노입자에서, 다수에서 각각의 나노입자는 동일한 치료학적 화합물 또는 화합물과 회합되거나, 또는 대안으로, 다수에서 적어도 2개의 나노입자는 하나 이상의 상이한 치료학적 화합물과 각각 회합된다.
다양한 측면에서, 치료학적 화합물은 항-암 화합물이고, 특이적인 구체예에서, 치료학적 화합물은 다음으로 구성된 군에서 선택된다: 제한 없이 질소 머스타드, 가령 메클로르-에타민, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란 및 클로람부실을 비롯한 알킬화제; 니트로우레아, 가령 제한 없이 카르무스틴 (BCNU), 로무스틴 (CCNU), 및 세무스틴 (메틸-CCNU); 에틸렌이민/메틸멜라민 가령 트리에틸렌멜라민 (TEM), 트리에틸렌, 티오포스포라미드 (티오테파), 헥사메틸멜라민 (HMM, 알트레타민); 알킬 설포네이트 가령 제한 없이 부설판; 트리아진 가령 다카르바진 (DTIC); 엽산 유사체 가령 메토트렉세이트 및 트리메트렉세이트를 비롯한 항대사물질; 피리딘 유사체 가령 제한 없이 5-플루오로우라실, 플루오로데옥시우리딘, 젬시타빈, 사이토신 아라비노시드 (AraC, 사이타라빈), 5-아자사이티딘, 2,2'-디플루오로데옥시사이티딘; 퓨린 유사체 가령 제한 없이 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 아자티오프린, 2'-데옥시코포르마이신 (펜토스타틴), 에리트로하이드록시노닐아데닌 (EHNA), 플루다라빈 포스페이트, 및 2-클로로데옥시아데노신 (클라드리빈, 2-CdA); 제한 없이 항유사분열 약물 가령 파클리탁셀을 비롯한 천연 산물; 제한 없이 빈블라스틴 (VLB), 빈크리스틴, 및 비노렐빈, 택소테르, 에스트라무스틴, 및 에스트라무스틴 포스페이트를 비롯한 빈카 알칼로이드; 에피포도필로톡신 가령 제한 없이 에토포시드 및 테니포시드; 항생제 가령 제한 없이 액티모마이신 D, 다우노마이신 (루비도마이신), 독소루비신, 미톡산트론, 이다루비신, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라마이신), 미토마이신C, 및 액티노마이신; 효소 가령 제한 없이 L-아스파라기나아제; 생체 반응 조절물질 가령 제한 없이 인터페론-알파, IL-2, G-CSF 및 GM-CSF; 제한 없이 백금 배위 복합체 가령 시스플라틴 및 카르보플라틴을 비롯한 여러 가지 종류의 작용제; 안트라세네디온 가령 제한 없이 미톡산트론; 치환된 우레아 가령 제한 없이 하이드록시우레아; 제한 없이 N-메틸하이드라진 (MIH) 및 프로카르바진을 비롯한 메틸하이드라진 유도체; 부신피질 억제제 가령 제한 없이 미토탄 (o,p'-DDD) 및 아미노글루데티미드; 제한 없이 부신피질스테로이드 길항제 가령 프레드니손 및 등가물, 덱사메타손 및 아미노글루테티미드를 비롯한 길항제 및 호르몬; 프로게스틴 가령 제한 없이 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트 및 메게스트롤 아세테이트; 에스트로겐 가령 제한 없이 디에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올 등가물; 항에스트로겐 가령 제한 없이 타목시펜; 테스토스테론 프로피오네이트 및 플루옥시메스테론/등가물을 비롯한 안드로겐; 항안드로겐 가령 제한 없이 플루타미드, 고나도트로핀-방출 호르몬 유사체 및 류프롤리드; 비-스테로이드성 항안드로겐 가령 제한 없이 플루타미드; 폴레이트 저해제; 타이로신 키나아제 저해제 가령 제한 없이 AG1478, 및 방사선민감화 화합물.
다양한 측면에서, 치료학적 화합물은 AG1478, 아시비신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로닌, 아도젤레신, 알데스류킨, 알리트레티노인, 알로퓨리놀, 알트레타민, 암보마이신, 아메탄트론, 아미포스틴, 아미노글루테티미드, 암사크린, 아나스트로졸, 안트라마이신, 아르세닉 트리옥사이드, 아스파라기나아제, 아스페를린, 아자시티딘, 아제테파, 아조토마이신, 바티마스타트, 벤조데파, 비칼루타미드, 비산트렌, 비스나피드 디메실레이트, 비젤레신, 블레오마이신, 브레퀴나르, 브로피리민, 부설판, 칵티노마이신, 칼루세테론, 카페시타빈, 카라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 카루비신, 카르젤레신, 세데핀골, 셀레콕시브, 클로람부실, 시롤레마이신, 시스플라틴, 클라드리빈, 크리스나톨 메실레이트, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 다카르바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데시타빈, 덱소르마플라틴, 데자구아닌, 데자구아닌 메실레이트, 디아지쿠원, 도세탁셀, 독소루비신, 드롤록시펜, 드롤로식펜, 드로모스타놀론, 다우조마이신, 에다트렉세이트, 에플로미틴, 엘사미트루신, 엔로플라틴, 엔프로메이트, 에피프로피딘, 에피루비신, 에르불로졸, 에소루비신, 에스트라무스틴, 에스트라무스틴, 에타니다졸, 에토포시드, 에토포시드, 에토프린, 파드로졸, 파자라빈, 펜레티니드, 플록스우리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 플루로시타빈, 포스퀴돈, 포스트리에신, 풀베스트란트, 젬시타빈, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 일모포신, 인터류킨 II (재조합 인터류킨 II 또는 rIL2를 비롯한, IL-2), 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-n1, 인터페론 알파-n3, 인터페론 베타-1a, 인터페론 감마-I b, 이프로플라틴, 이리노테칸, 란레오티드, 레트로졸, 류프롤리드, 리아로졸, 로메트렉솔, 로무스틴, 로속산트론, 마소프로콜, 메이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 메게스트롤, 멜렌게스트롤 아세테이트, 멜팔란, 메노가릴 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 메토트렉세이트, 메토프린, 메투레데파, 미틴도미드, 미토카르신, 미토크로민, 미토킬린, 미토말신, 미토마이신, 니토스페르, 미토탄, 미톡산트론, 마이코페놀산, 넬라라빈, 노코다졸, 노갈라마이신, 오름나플라틴, 옥시수란, 파클리탁셀, 페가스파라가아제, 페클리오마이신, 펜타무스틴, 페플로마이신, 페르포스파미드, 피포브로만, 피포설판, 피록산트론 하이드로클로라이드, 플리카마이신, 플로메스탄, 포르피머, 포르피로마이신, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 퓨로마이신, 퓨로마이신, 피라조푸린, 리보프린, 로글레티미드, 사핀골, 사핀골, 세무스틴, 심트라젠, 스파르포세이트, 스파르소마이신, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스피로플라틴, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 설포페누르, 탈리소마이신, 타목시펜, 테코갈란, 테가푸르, 텔록산트론, 테모포르핀, 테니포시드, 테록시론, 테스토락톤, 티아미프린, 티오구아닌, 티오테파, 티아조푸린, 티라파자민, 토포테칸, 토레르니펜, 트레스톨론, 트리시리빈, 트리에틸렌멜라민, 트리메트렉세이트, 트립토렐린, 튜불로졸, 우라실 머스타드, 우레데파, 바프레오티드, 베르테포를린, 빈블라스틴, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비네피딘, 빈글리시네이트, 빈레우로신, 비노렐빈, 빈로시딘, 빈졸리딘, 보로졸, 제니플라틴, 지노스타틴, 졸레드로네이트, 및 조루비신으로 구성된 군에서 선택된다. 이들 및 다른 항종양 치료제가 예를 들어, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill Professional, 10th ed., 2001에서 기술된다.
다양한 측면에서, 치료학적 화합물은 글루코코르티코이드; 칼리크레인 저해제; 코르티코스테로이드 (가령 제한 없이, 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 또는 트리암시날론 아세티니드); 항-염증제 (가령 제한 없이 비코르티코스테로이드 항-염증 화합물 (가령, 제한 없이 이부프로펜 또는 플루비프로벤)); 비타민 및 미네랄 (가령, 제한 없이 아연); 항-산화제 (가령, 제한 없이 카로테노이드 (가령 제한 없이 잔토필 카르테노이드 유사 제아잔틴 또는 루테인)) 및 종양 괴사 인자(TNF) 활성을 저해하는 작용제, 가령 제한 없이 안달리무맙 (HUMIRA®), 인플릭시맙 (REMICADE®), 세르톨리주맙 (CIMZIA®), 골리무맙 (SIMPONI®), 및 에타네르셉트 (ENBREL®)로 구성된 군에서 선택된 항-염증제이다.
다양한 측면에서, 치료학적 화합물은 M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNF
Figure pct00001
, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, 트롬보포이에틴, 줄기 세포 인자, 및 에리트로포이에틴이다. 본 명세서에서 이용하기 위한 추가적인 성장 인자는 안지오게닌, 골 형성 단백질-1, 골 형성 단백질-2, 골 형성 단백질-3, 골 형성 단백질-4, 골 형성 단백질-5, 골 형성 단백질-6, 골 형성 단백질-7, 골 형성 단백질-8, 골 형성 단백질-9, 골 형성 단백질-10, 골 형성 단백질-11, 골 형성 단백질-12, 골 형성 단백질-13, 골 형성 단백질-14, 골 형성 단백질-15, 골 형성 단백질 수용체 IA, 골 형성 단백질 수용체 IB, 뇌 유래 신경영양 인자, 섬모 신경영양 인자, 섬모 신경영양 인자 수용체
Figure pct00002
, 사이토카인-유도된 호중구 화학주성 인자 1, 사이토카인-유도된 호중구, 화학주성 인자 2
Figure pct00003
, 사이토카인-유도된 호중구 화학주성 인자 2
Figure pct00004
,
Figure pct00005
내피 세포 성장 인자, 엔도텔린 1, 상피-유래된 호중구 유인물질, 신경교 세포주-유래된 신경영양 인자 수용체
Figure pct00006
1, 신경교 세포주-유래된 신경영양 인자 수용체
Figure pct00007
2, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질
Figure pct00008
, 성장 관련 단백질
Figure pct00009
, 성장 관련 단백질
Figure pct00010
, 헤파린 결합 표피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 간세포 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 I, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 II, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, 케라틴세포 성장 인자, 백혈병 저해 인자, 백혈병 저해 인자 수용체
Figure pct00011
, 신경 성장 인자, 신경 성장 인자 수용체, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 전-B 세포 성장 자극 인자, 줄기 세포 인자, 줄기 세포 인자 수용체, 형질전환 성장 인자
Figure pct00012
, 형질전환 성장 인자
Figure pct00013
, 형질전환 성장 인자
Figure pct00014
, 형질전환 성장 인자
Figure pct00015
.2, 형질전환 성장 인자
Figure pct00016
, 형질전환 성장 인자
Figure pct00017
, 형질전환 성장 인자
Figure pct00018
, 잠재 형질전환 성장 인자
Figure pct00019
, 형질전환 성장 인자
Figure pct00020
결합 단백질 I, 형질전환 성장 인자
Figure pct00021
결합 단백질 II, 형질전환 성장 인자
Figure pct00022
결합 단백질 III, 종양 괴사 인자 수용체 유형 I, 종양 괴사 인자 수용체 유형 II, 우로키나아제-유형 플라스미노겐 활성자 수용체, 세포간 시그마 펩티드 (ISP), 및 키메라 단백질 및 이의 생물학적으로 또는 면역학적으로 활성인 단편을 포함한다.
방법은 또한 항응고 약물로 제공된다. 예를 들어 그리고 제한 없이, 플라빅스, 아스피린, 와파린, 헤파린, 티클로피딘, 에녹사파린, 코우마딘, 디쿠마롤, 아세노코우마롤, 시트르산, 레피루딘 및 이의 조합을 포함한다.
이 측면에서 방법은 수술에서 매우 도움이 될 이들 항응고 약물의 효과를 능가한다.
II. 제약학적 조성물
본 개시는 본 개시의 나노입자를 포함한 제약학적 조성물을 제공한다. 다양한 측면에서, 제약학적 조성물은 단위 용량 제제이다. 다양한 측면에서, 제약학적 조성물은 정맥내 투여 제제이다. 다양한 측면에서, 제약학적 조성물은 동결건조되거나 또는 분말이다. 여러 가지 측면에서, 제약학적 조성물은 폴리아크릴산을 추가로 포함한다.
다양한 측면에서, 국소 제제가 제공된다. 내부 및 외부 용도가 본 명세서에서 제공된다. 국소 제제에 대한 제약학적 조성물은 담체를 선택적으로 포함하고, 용액, 에멀젼, 연고 또는 젤 베이스(base)로서 조제된다. 예를 들어, 베이스는 다음 중 하나 이상을 선택적으로 포함한다: 페트롤라텀, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀랍, 미네랄 오일, 희석제 가령 물과 알코올, 및 에멀젼화제 및 안정화제. 증점제는 국소 투여를 위해 제약학적 조성물에 선택적으로 존재한다. 특정한 측면에서, 용매는 제제 내에 있으며, 상기 용매는 예를 들어 그리고 제한 없이, MMP, DMSO 또는 유사한 화합물을 포함한다.
본 개시는 1 mg/kg 내지 1 g/kg, 10 mg/kg 내지 1 g/kg, 20 mg/kg 내지 1 g/kg, 30 mg/kg 내지 1 g/kg, 40 mg/kg 내지 1 g/kg, 50 mg/kg 내지 1 g/kg, 60 mg/kg 내지 1 g/kg, 70 mg/kg 내지 1 g/kg, 80 mg/kg 내지 1 g/kg, 90 mg/kg 내지 1 g/kg, 10 mg/kg 내지 900 mg/kg, 10 mg/kg 내지 800 m/kg, 10 mg/kg 내지 700 mg/kg, 10 mg/kg 내지 600 mg/kg, 10 mg/kg 내지 500 mg/kg, 10 mg/kg 내지 400 mg/kg, 10 mg/kg 내지 300 mg/kg, 10 mg/kg 내지 200 mg/kg, 10 mg/kg 내지 100 mg/kg, 10 mg/kg 내지 75 mg/kg, 10 mg/kg 내지 50 mg/kg, 50 mg/kg 내지 900 mg/kg, 100 mg/kg 내지 800 mg/kg, 200 mg/kg 내지 700 mg/kg, 300 mg/kg 내지 600 mg/kg, 400 mg/kg 내지 500 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg, 700 mg/kg, 800 mg/kg, 900mg/kg, 1000 mg/kg 이상으로 나노입자의 전달을 위해 조제된 제약학적 조성물을 제공한다.
단일 용량 투여, 그리고 복수 용량 투여가 제공된다. 복수 용량 투여는 초기 투여 후 몇 분, 몇 시간, 며칠, 몇 주, 또는 몇 개월 이내에 이차 용량이 투여되는 것들을 포함한다. 방법에서
III. 용도
개체에서 질환을 치료하는 방법이 제공되며 상기 방법은 본 개시의 나노입자를 질환을 치료하는 데에 유효한 양으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 측면에서, 개체는 출혈 장애를 갖는다. 나노입자가 식염수의 투여 없음 또는 투여와 비교하여 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 또는 30% 초과까지 출혈 시간을 감소시키는 데에 유효한 양으로 투여되는 방법이 제공된다. 다양한 측면에서, 출혈 장애는 응고 장애, 후천적 혈소판 기능 결함, 선천적 혈소판 기능 결함, 선천적 단백질 C 또는 S 결핍, 파종성 혈관내 응고 (DIC), 인자 II 결핍, 인자 V 결핍, 인자 VII 결핍, 인자 X 결핍, 인자 XII 결핍, 혈우병 A, 혈우병 B, 특발성 혈소판 감소성 자반증 (ITP), 폰 빌리브란트(von Willebrand) 병 (유형 I, II, 및 III), 거핵세포/혈소판 결핍인 방법이 이용된다. 다양한 측면에서, 질환은 여러 가지 약물을 이용한 화학요법 및 다른 요법, 방사선 요법, 수술, 우발적인 실혈(blood loss), 및 다른 특이적인 질병 상태에서 발생한 혈소판감소증인 방법이 제공된다. 다양한 측면에서, 질환이 재생불량성 빈혈, 혈소판감소증을 야기하는 유방암 전이성 종양과 연관된 특발성 혈소판 감소성 자반증을 비롯한, 특발성 또는 면역성 혈소판 감소증 (ITP), 신생아 낭창 증후군을 비롯한, 전신성 홍반 낭창, 혈소판감소증을 야기하는 전이성 종양, 비종, 판코니(Fanconi) 증후군, 비타민 B12 결핍, 엽산 결핍, 메이-헤글린(May-Hegglin) 이상, 비스코트-알드리히(Wiskott-Aldrich) 증후군, 발작성 야간혈색소 요증, HIV 연관된 ITP 및 HIV-관련된 혈전성 혈소판 감소성 자반증; 만성 간 질환; 혈소판감소증과 연관된 골수이형성 증후군; 발작성 야간혈색소 요증, C7E3 Fab (Abciximab) 요법 후 급성 극심 혈소판감소증; 모계 동종면역 혈소판감소증을 비롯한, 동종면역 혈소판감소증; 항인지질 항체 및 혈전증과 연관된 혈소판감소증; 자가면역 혈소판감소증; 카르보플라틴-유도된 혈소판감소증을 비롯한 약물-유도된 면역 혈소판감소증, 헤파린-유도된 혈소판감소증; 태아 혈소판감소증; 임신성 혈소판감소증; 휴스(Hughes) 증후군; 루포이드 혈소판감소증; 우발적인 및/또는 다량의 실혈; 골수증식성 질환; 악성종양을 가진 환자내 혈소판감소증; 암 환자내 혈전성 혈소판감소증 자반증/용혈성 요독증성 증후군으로서 명시되는 혈전성 세소혈관증을 비롯한, 혈전성 혈소판감소증 자반증; 자가면역 용혈성 빈혈; 잠재성 공장게실천공; 순수 적혈구 무형성증; 자가면역 혈소판감소증; 유행성 신증; 리팜피신-연관된 급성 신부전; 패리스-트루소(Paris-Trousseau) 혈소판감소증; 신생아 동종면역 혈소판감소증; 발작성 야간혈색소 요증; 위암에서의 혈액학적 변화; 아동기에서의 용혈성 요독증성 증후군; 및 간염 A 바이러스 및 CMV-연관된 혈소판감소증을 비롯한 바이러스 감염과 관련된 혈액학적 징후인 방법이 제공된다. 다양한 측면에서, 질환은 혈소판감소증을 야기하는 AIDS에 대한 치료에서 발생하는 방법이 제공된다. 다양한 측면에서, AIDS에 대한 치료는 AZT의 투여이다.
여러 가지 측면에서, 치료되는 개체는 상처치유 장애, 외상, 폭발 외상, 척수 손상, 출혈성 뇌졸중, TPA의 투여 후 출혈, 또는 많은 질환에서 하지만 특히 조산에서 급성으로 나타나는 뇌실내 출혈을 앓는다.
실시예 1
출혈의 제어를 위해 나노입자를 검사하기 위한 일차 모델은 햄스터 정소거근 표본(prep)이었으며 여기서 미세혈관은 플루오레세인을 투여함으로써 그리고 미세혈관을 손상시키고 혈소판의 활성을 유도하기 위해 이를 UV 빛으로 자극시킴으로써 노출되고 손상되었다. 혈전을 형성하기까지 시간을 기록하였다.
일차 나노입자는 10,000 g/몰의 분자량을 가진 4-아암 PEG이었다. PEG 분자를 N,N'-카르보닐디이미다졸(CDI)로 활성화하고 그리고 말단에 RGD와 커플링시켰다. 이 나노입자는 활성화된 혈소판 사이에 가교로서 작용할 것이고 혈전 형성 시간을 감소시킬 것이라고 생각되었지만 발견되었던 것은 이 나노입자가 출혈을 극적으로 악화시켰다는 점이었다.
이 결과에 기반하여 더 큰 분자량의 PEG가 입자 사이를 가교하기 위해 제안되었지만, PEG가 더 커질수록, 이는 펩티드를 노출시키는 것이 바람직하지 않은 입체구조를 띠었다. 따라서 펩티드의 제시를 촉진하도록 그리고 혈전 형성에 참여하기 위해 활성화된 혈소판 사이를 가교하는 데에 충분히 커지도록 중심부-기반 시스템을 설계하였다.
실시예 2
나노입자의 분해 속도는 분자량 및 유산(lactic acid) 대 글리콜산 단위의 비를 통해 조절된다. FDA 승인된 산물에서의 이의 용도를 능가하는 PLGA를 이용한 주요 흥미 중 하나는 약물을 전달하는 데에 이를 이용할 수 있다는 점이며, 이는 합성 혈소판 플랫폼(platform)에 약물 전달 기술이 영향력을 미친다. PLL은 N,N'-카르보닐디이미다졸(CDI)에 기반한 전통적인 커플링 화학을 이용하여 PEG가 커플링될 수 있도록 하는 유리 아민을 제공한다. PLGA-b-PLL에 부착되는 PEG의 한 가지 흥미로운 점은 복수의 PEG 아암이 부착될 수 있다는 점이다. 복수의 분지는 표면 분리에 대한 성향을 증가시키고 그리고 기능적 모이어티의 더 큰 노출을 초래한다. PEG는 나노입자를 친수성으로 만들며 이는 그들이 혈류를 통해 이동하도록 허용하고 그리고 간에서 수집하는 나노입자에 대한 성향을 감소시킨다. PEG는 비-독성, 비-혈전성 물질이고, 이것은 나노입자가 그들 표적과 특이적으로 결합하도록 허용한다. RGD 모이어티, 또는 상기 모이어티에서의 변이는 활성화된 혈소판과 결합하는 그리고 그들의 응고 작용을 증대시키는 기능성을 제공한다. RGD 펩티드 또는 이의 변이체 (RGDS, GRGDS) 중 하나를 이용한 화학적 변형은 다른 시스템에서 혈소판 작용을 증대시키는 것으로 나타났다. RGD 모이어티는 많은 시스템에서 나타난다; 혈소판에서 혈소판이 활성화될 때, 손상 부위에서 혈소판의 집합을 야기하는 피브리노겐을 방출하는 것으로 나타난다.
1H-NMR, UV-vis, 아미노산 서열 분석, 및 역학적 광산란을 비롯하여 나노입자를 특징짓는 데에 여러 가지 수단을 이용하였다. 이 분석으로부터, 나노입자의 중심부가 대략 170 nm이고, 1500 Da 내지 8000 Da에서 PEG 분자량이 변화함으로써 PEG 아암의 길이가 90 내지 150 nm에서 변화된다는 점이 나타났다. RGD 모이어티에서의 3개의 변이체 (RGD, RGDS, 및 GRGDS)를 이용하였고 그리고 커플링 효율은 모든 펩티드에 대하여 대략 35%였다.
실시예 3
그 이후에,　CellTracker　녹색을 이용하여 표지된 혈소판으로 합성 혈소판의 응고 효율의 고속 대량 스크리닝을 위해 시험관내 시스템을 개발하여 분석의 용이함을 촉진시켰다. 본질적으로, 이 어세이는 CellTracker로 이전에 표지되었던 혈소판을 활성화시키는 것 그리고 교반 하에 중합체 시스템으로 변형된 표면에 결합한 수를 조사하는 것을 포함한다. 이 어세이는 콜라겐으로 실증되었다. 이 시스템은 PEG 분자량 및 RGD 모티프 (즉 RGD, RGDS, 및 GRGDS)를 효율적으로 그리고 독립적으로 변화시킬 수 있게 해주었다.
예비 작업에서, 활성화된 나노입자 결합을 PEG 4600으로 증대시켰고 GRGDS 펩티드는 효율적인 부착 및 집합을 초래하였다. RGD 모티프에 측면 아미노산 서열을 도입함으로써, 활성 입체형태를 얻는다는 점이 확립되었다. 이 생물활성은 결과적으로 RGD 모이어티에 대한 인테그린 친화도에 영향을 주고, 그리고 세포 부착을 증가시킨다. GRGDS 펩티드는 활성화된 혈소판의 양호한 결합 및 부착을 제공하는 것으로 나타났다.
다른 이들에 의한 이전 작업은 펩티드의 길이가 이의 온도 안정성 그리고 생산 비용에 영향을 줄 수 있다는 점을 나타내었다. 이들 합성 혈소판은 실온에서 안정한 것으로 설계되어 현장에서 이들 투여를 촉진시켰다.
실시예 4
시험관내 최적화 후, 대퇴동맥 부분 단절 모델에서 나노입자의 효능의 검사를 수행하였다. 대략 20 mg/ml의 입자를 정맥 내로 주사하고 혈류를 이미지화하여 응고 시간을 측정하였다.
PEG 4600 및 GRGDS 펩티드를 이용한 기능화된 나노입자의 전신 투여는 대퇴동맥에서 응고 시간을 반으로 감소시켰다. 절단된 혈전의 주사 전자 현미경은 혈전과 밀접하게 연관된 합성 혈소판 (적색 화살표로 표시됨)을 보여주었다. 중요하게도, CNS 또는 폐에서 혈전증 또는 축적된 입자와 연관된 뇌졸중 또는 호흡 문제의 울림을 비롯한 어떠한 부작용도 보이지 않았다. 생체분포 데이터는 결합되지 않은 합성 혈소판이 24 시간 이내에 제거되었고, 그리고 손상과 함께 또는 손상 없이도 어떠한 차이점이 나타나지 않았다는 점을 명시하였다. 이들 데이터는 합성 혈소판이 응고를 활발하게 증대시키고 그리고 CNS 외상 후 지혈의 역할을 연구하는 데에서 중요한 수단이라는 점을 증명한다.
실시예 5
CNS에 대한 기계적인 외상 후 일차 관찰된 현상은 미세혈관의 파열이다. 이 현상에 이어 손상 후 몇 시간 그리고 며칠에 걸쳐 일어나는 허혈, 무산소증, 자유-라디칼 형성, 및 흥분독성을 포함한 손상 캐스케이드가 따른다. 초기 출혈을 중지시킬 수 있다면, 이차 악화를 저해하고 조직 및 기능을 보존할 수 있는 지에 관한 의문이 생길 것이다.
출혈의 정도는 인간에서 CNS 외상 후 기능상 결함의 정도와 관련되었다. 또한 설치류 모델에서도 손상의 정도와 관련된다. 지혈을 유도하는 현재 약물이 CNS 외상 후 뇌졸중을 야기할 위험이 있기 때문에 출혈을 중지하는 것에 대해 조사한 제한된 문헌이 있지만, 초기 임상 증거는 rFVIIa를 투여함으로써 지혈을 유도하는 것이 결과를 향상시킨다는 점을 제시한다. 이 결과는 rFVIIa보다 더 유효한 출혈 중지 수단이 결과를 유의적으로 향상시킬 잠재성이 있다는 점을 제시한다.
궁극적으로, 나노입자는 손상 부위에서 혈전 내로 결합된다. CNS 손상의 경우, 이 결과는 국부화되고, 표적된 약물 전달을 위해 플랫폼이 제공되어 신경보호를 제공한다는 것을 의미한다.
나노입자 내로 편입될 수 있는 다수의 인자가 있다. 나노입자 중심부의 제작과 유사한 기술을 이용하여, 다른 이들에 의해 다수의 CNS 손상 및 질병에서 신경보호적인 것으로 나타난, 섬모 신경영양 인자 (CNTF)를 전달하는 합성 혈소판 중심부와 비슷한 지름으로 PLGA-기반 나노입자를 제조하였다. 이들 나노입자는 나노그램 분량의 CNTF를 14일 동안 전달하고 그리고 성장 인자는 생물 활성이다. CNTF로 로딩된 나노입자는 20일에 걸친 전달을 보여준다.
다른 이들에 의한 결과는 또한 다수의 손상 모델내 PLGA 입자로부터 신경교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF)의 전달, 그리고 CNS 손상 후 염증을 감소시키고, 혈관 누출을 감소시키는 것을 보조하고 그리고 보호를 제공하는 것과 관계된, 스테로이드인, 트리암시놀론의 전달을 증명하였다.
실시예 6
폴리(락틱-코-글리콜산)-폴리-L-리신 (PLGA-PLL) 블록 공중합체 중심부로 구성된 나노입자를 RGD 기능성으로 종결된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 아암에 접합시켰다. PLGA-PLL에 PEG의 접합을 1 -NMR을 이용하여 확인하였다. 단일 에멀젼 용매 증기 증발 기술을 이용하여 나노입자를 제작하였고, 그리고 크기를 주사 전자 현미경 (SEM)으로 확인하였다. 아미노산 서열 (AA) 분석을 이용하여 PLGA-PLL-PEG 나노입자에 GRGDS의 차후 접합을 정량화하였다. 구체의 수력학적 용적을 측정하는 데에 역학적 광산란을 이용하였다.
실시예 7
HPLC를 통해 444/538 nm의 여기(excitation) 및 방사(emission) 파장 쌍을 이용하여 탐지될 수 있는 쿠마린 6 (C6)을 가진 나노입자를 로딩함으로써 나노입자를 추적하였다. 이것은 나노입자의 생체분포를 정량화할 수 있게 해준다. C6은 입자의 크기 또는 작용을 변경하지 않고, 그리고 C6이 매우 소수성이기 때문에, 99%가 7일 동안 PLGA 중심부에 남아 있는다.
실시예 8
본 개시는 CNS내 외상에 대하여 나노입자의 적용을 제공한다. 예비 증거에 기반하여, 나노입자는 혈전에 축적된다. CNS 외상의 경우에, 이것은 입자가 혈액-뇌 장벽 (BBB)이 손상된 부위의 CNS 내에 있을 것이라는 점을 의미한다.
트리암시놀론은 염증 제어를 돕고 혈관을 봉인하고 그리고 신경 조직을 보호하는 능력을 갖는다. 추가로, 이것은 PLGA 입자를 전달한다. 따라서 트리암시놀론 아세테이트를 단일 에멀젼 공정을 이용하여 캡슐화하고 HPLC를 이용하여 방출을 정량화한다.
실시예 9
예비 작업에서, 대퇴동맥 손상 모델을 이용하였다. 이는 출혈에 대한 요법의 영향의 단순 평가를 허용하는 매우 완전한 모델이다. 둔기 외상 모델에서 나노입자의 효능을 측정하기 위하여 그리고 응고에 대한 나노입자의 영향 및 기작에 관하여 중요한 데이터를 얻기 위하여, 커플링된 간 손상 모델을 시간에 따른 응고의 평가와 함께 이용하였다.
수컷 스프라그-다우리(Sprague-Dawley) 쥐(rat)를 이소플루란으로 마취시켰다. 동물의 온도를 발열 패드(heating pad)를 이용하여 유지하였고 온도 프로브(temperature probe)를 이용하여 실험 내내 모니터링하였다. 채혈 및 혈압 측정을 위하여 동맥 카데터(catheter)를 이용하였고, 그리고 검사되는 작용제의 투여를 위하여 정맥 카데터를 이용하였다. 복강을 개방하였고, 그 이후에 간의 중간 엽을 민첩하게 상대 정맥으로부터 1.3 cm 잘라낸다. 복강을 바로 폐쇄시켰고, 실험 작용제를 전달하였다.
혈액 샘플을 손상 직전에, 손상 후 5분에, 그리고 손상 후 30분에 뽑아내었다. 동물을 60분 동안 또는 죽을 때까지 유지하였다. 60분의 말에, 실혈을 측정하기 위해 복강내 혈액을 수집하는 데에 미리-무게를 잰 스펀지를 이용하였다. 조직학 및 나노입자의 생체분포를 위해 모든 주요 기관을 수집하였다.
이 작업으로부터의 데이터는 나노입자의 효능, 안정성, 및 기작에 대한 중요 정보를 제공한다. 나노입자가 증대된 지혈을 유의적으로 보이지 않는다면, 말단 펩티드는 활성화된 혈소판에 결합을 증대시키기 위해 변경될 것이다.
실시예 10
TBI 작업을 위한 수컷 스프라그-다우리 쥐에서 제어된 피질 충격 (CCI) 모델을 이용하였다. CCI 모델은 생리학적으로 관련된 병리학적 결과와 행동 결과를 고도로 정량화할 수 있는 시스템과 결합시킨다. 중증 모델을 그 이후에 2 mm 깊이의 충격을 주는 피츠버그(Pittsburg) 정밀 충격 장치와 이용하였다.
이 손상은 로토로드 검사(rotorod test) 및 Morris Water Maze 검사 (MWM)를 이용하여 정량화된 그리고 병변 크기, 신경교증, 및 양성 신경 조직의 양을 비롯한 조직학적 결과와 관련된 유의한 운동 및 인지 결함을 초래한다.
본 연구는 TBI후 출혈을 중지시키는 것에서 나노입자가 얼마나 유효한지, 그리고 지혈의 유도가 어떻게 회복에 영향을 주는지 에 대해 결정하였다.
이 기법은 국부적으로 전달된 스테로이드에 대한 투여, 즉 정맥내 투여의 단순한 경로를 또한 제공하였다. 이들 인자를 전달하는 현재 기법은 주입가능한 펌프(pump)와 카데터에 주력하고 있는데 그 이유는 인자가 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 없고, 짧은 반감기를 가지고, 그리고 부작용을 유발할 수 있기 때문이다. 하지만, CNS에 주입가능한 카데터는 특히 외상으로 손상된 환자에 대해, 위험요소를 수반한다.
간편하게 투여되지만 효과적으로 표적되는 시스템을 갖는 것은 신경영양 투여와 연관된 다수의 전달 문제를 경감시킨다.
실시예 11
폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 아암 [1]과 접합된 폴리 (락틱-코-글리콜산)-폴리-L-리신 (PLGA-PLL) 블록 공중합체로부터 나노입자를 합성하였다. 본 명세서에서 기술된 바와 같은 나노 침전 방법을 이용하여 구체의 나노입자를 제작하였다. 덱사메타손을 용매에서 용해시켰고, 그리고 적절한 양의 중합체도 또한 용해시키고 약물과 혼합하였다. 약물/중합체 용액을 회전하는 1x PBS 내로 점적으로 피펫팅하였다. 실온에서 대략 20분 동안 결과 용액을 덮지 않은 채로 교반되도록 허용하였다. 나노구체를 교반-강화시킨 후, pH를 3.0 - 2.7까지 하향 조정하였다. 이 pH 범위는 발생할 응집을 위해 유용한 것으로 밝혀졌다. 나노구체를 원심분리로 정제하고 (500g, 3 분, 3x), 탈이온수에서 재현탁시키고, 냉동시키고, 그리고 동결건조기 상에서 동결-건조시켰다. 10 mg의 나노구체를 1 mL 1x PBS 내로 용해시킴으로써 방출 연구를 수행하였고, 3회 반복하였다.
역학적 광산란 (DLS)으로 나노구체의 크기를 측정하였다. 주사 전자 현미경 (SEM)으로 형태학 및 크기의 입체 형태를 측정하였다. DMSO에서 구체를 용해시킴으로써 그리고 UV-Vis 상에서 실행함으로써 약물의 양을 측정하였다. 방출 연구 데이터를 여러 시점에 모았고 UV-Vis 상에서 실행하여 어떻게 덱사메타손이 시간에 따라 나노입자 밖으로 용리시키는지 측정하였다.
실시예 12
수득률 및 산물을 만드는 시간은 중간 처리 단계를 위해 필요한 가장 짧은 시간을 측정함으로써 유의적으로 감소되었다. 수득률은 침전시킨 후 PLGA-PLL-PEG를 수집하기 위해 원심분리를 이용하여 유의적으로 증가된다. 수득률은 또한 나노침전 나노입자 형성 방법으로 유의적으로 증가되고 그리고 나노입자 수집을 위해 폴리(아크릴산) 코아세르베이트 침전 기술을 이용한다면 심지어 더 증가된다.
PLGA-PLL-PEG가 합성되고 나면, 활성 펩티드 가령 GRGDS는 중합체에 커플링될 필요가 있다.
사중 블록 중합체 (PLGA-PLL-PEG-펩티드)가 이용될 때, 구체의 수득률은 극히 낮았다. 펩티드가 중합체의 가장 비싼 부분이었기 때문에, 삼중블록 (PLGA-PLL-PEG)으로부터 구체를 형성하고 이후 구체 그 자체에 펩티드를 부착하는 방법을 이용하였다.
삼중블록 나노입자에 펩티드의 접합은 대략 50%의 접합 효율 (아르기닌 대 리신 비로서 계산됨)을 초래한다.
하지만, 아미노산 서열 분석 전에 나노구체의 추가적인 헹굼 단계가 11%의 접합 효율을 가진 펩티드의 유의한 손실을 초래한다는 점이 밝혀졌다. 1 g 배치(batch)의 나노구체에 대한 반응을 확대시, 접합 효율은 본질적으로 0%까지 떨어졌다. 따라서,　전체 사중 블록 중합체를 만들 수 있게 해줄 그리고　적어도 비교가능한 수득률로　빽빽한 크기 분포를 가진 나노입자를 생산할 수 있게 해줄 방법을 추구하였다.
이 기법은 나노입자의 형성에 앞서 사중블록 중합체의 제조를 초래한다. 사중블록 접합 효율은 대략 80%였지만, 폴리(아크릴산)으로 또는 이것 없이 나노침전 기술을 이용하여 나노구체 형성 후에는 13%까지 떨어졌다. 최종적으로, 사중블록은 펩티드의 첨가 직전에 DMSO에서 CDI와 중합체를 재활성화시킴으로써 만들어졌다. 이 단계는 50% 위까지 펩티드의 접합을 증가시킨다 (n=3).
에멀젼 방법
에멀젼 방법은 326-361 nm 지름의 구체를 만드는 것에 성공한다.
에멀젼 방법은 탈이온수내 50 ml의 5% PVA에서 나노구체를 교반-강화시킨다. 이 방법을 이용하여 나노구체의 생산을 확대하는 것은 교반 강화를 위해 큰 용적의 용액을 요구한다. 사전 방법이 입자 형성 후 접합 단계를 위해 펩티드를 첨가하였다는 사실과 결부된, 이 관찰은 매우 다량의 펩티드가 합리적인 커플링 효율을 성취하기 위해 큰 용적의 용액에 필요될 것이라는 점을 의미한다.
나노침전 방법을 위하여, 축소된 버전인, 10 ml PBS내 교반 강화를 펩티드의 동시 접합과 함께 수행하였다. 이 단계는 충분한 양의 펩티드를 첨가한다. 나노침전 방법은 또한 그 자체가 사중블록 중합체를 이용한 나노입자의 형성을 부여하기 때문에,　제작-후 커플링 반응에 대한 요구가 필요 없다.
입자의 균일성, 입자의 집합, 나노입자를 재현탁하는 것에서의 도전 및 동결건조 후 재현탁의 도전을 비롯한, 나노입자로 식별된 기본적인 사안이 있다.
연구진은 이들 도전을 다루기 위한 다수의 기법을 제시하였다. 예를 들어, 한 연구진은 동결건조 후 작은 나노입자를 재현탁시키기 위해 동결건조보호제(lyoprotectant)를 가질 수 있다. (Sauaia et al., J Trauma 38, 185 (1995)), Champion, et al., J Trauma 54, S13 (2003)). 다른 연구진은 입자를 응집시키기 위해 폴리(아크릴산)의 용도와 결부된 나노침전 기술을 통해, 용액에 동결건조보호제를 첨가해야할 필요성이 회피되었다는 점을 발견하였다.
나노침전
나노침전 방법은 수혼화성 용매(water miscible solvent) 가령 아세토니트릴에 용해된 중합체의 점적 첨가를 이용하여 일정한 크기의 구체를 만든다 (Regel, et al., Acta Anaesthesiol Scand Suppl 110, 71 (1997); Lee, et al., Expert Opin Investig Drugs 9, 457 (2000); Blajchman, Nat Med 5, 17 (1999); Lee, et al., Br J Haematol 114, 496 (2001)).
폴리(아크릴산) 코아세르베이트 침전
이전에 관찰되었던 바와 같은 원심분리 및 동결건조 동안에 구체의 집합을 감소시키는 데에 그리고 나노입자의 수득률을 증가시키는 데에 Regel, et al. (1997); Kim, et al., Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 34, 537 (2006))로부터 변형된 이 방법을 이용하였다. 침전은 부드러운 원심분리 <500g을 감안한다.
지금까지 크기 재현성은 에멀젼 및 나노침전 단독 방법에 대한 이점인 것으로 나타났으며, 이는 균질한 크기 분포를 만들기 위해 초음파 분해(sonication) 조건에 매우 의존한다. SEM 이미지는 나노입자의 형태학 그리고 크기의 균질성을 보여준다. 히스토그램 인레이(histogram inlay)는 100 치수의 나노입자 지름으로부터 만들어졌으며, 그리고 크기 분포가 236.1 nm +/- 56.6 nm에 집중된다는 점을 보여준다.
PAA-코팅된 나노침전된 합성 혈소판을 만들기 위한 방법
Evonik Industries로부터 PLGA (Resomer 503H)를 구매하였다. Sigma Aldrich로부터 폴리-l-리신 및 PEG (~4600 Da MW)를 구매하였다. 모든 시약은 ACS 등급이었고 Fisher Scientific으로부터 구매하였다. 이전에 기술된 바와 같은 표준 생체접합 기술을 이용하여 PLGA-PLL-PEG 공블록(coblock) 중합체를 만들었다 (Lavik et al).
사중블록 접합
PLGA-PLL-PEG을 100 mg/ml의 농도로 무수 DMSO에서 용해시켰다. 2몰 당량의 CDI를 첨가하여 PEG 기를 재활성화시키고 1시간 동안 교반하였다. 25 mg의 올리고펩티드 (GRGDS 또는 GRADSP)를 1 ml DMSO에서 용해시키고 그리고 교반하고 있는 중합체 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 3시간 동안 반응시켰고, 이후 투석 튜빙(dialysis tubing) (SpectraPor 2 kDa MWCO)으로 옮겼다. 4시간 동안 30분 마다 유형 I D.I. 물로 투석액을 변화시켰다. 이후 산물을 액체 질소에서 급속-냉동시키고 2일 동안 동결건조시켰다.
나노침전
이후 결과적 사중블록 공중합체 PLGA-PLL-PEG-GRGDS를 아세토니트릴에서 20 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 교반하고 있는 용적의 PBS에 이 용액을 점적하여 첨가하였다. 일반적인 규칙은 아세토니트릴 보다 2배 용적의 PBS를 이용하는 것이다. 수-혼화성 용매로서 형성된 침전 나노입자는 소멸된다. 하지만, 300 mg 초과의 시작 사중블록의 정량까지 확대하기 위하여, 아세토니트릴로 침전 용적을 프라이밍(priming)하는 것은 응집체의 자발적인 형성을 감소시켰다는 것으로 밝혀졌다. 침전 용적내 최종 농도가 2:1 PBS:아세토니트릴이 되도록 침전 공정에 걸쳐 용매:물 비를 조정하였다. 이후 입자를 3시간 동안 교반-강화시켰다. 이후 15000 g에서 원심분리를 이용하여 그리고 PBS로 3회 헹구어 입자를 수집하였다. 대안으로, 코아세르베이트 침전 방법을 이용하여 입자를 수집하였다.
아세르베이트 침전
교반하고 있는 입자 현탁액에 1 질량 당량의 건조 폴리(아크릴산)을 첨가하였다. 이후 응집이 생길 때까지 교반하고 있는 현탁액에 1% w/v pAA를 첨가하였다. 응집을 관찰하기 위해 pAA의 각각의 첨가 후 교반을 일시적으로 멈추었다. 5분 후, 응집된 입자를 500g에서 원심분리로 수집하고, 1% pAA로 3회 헹구었다 (헹굼의 사이에 4℃, 2m, 500 g에서 원심분리). 최종 헹굼에서, 입자를 D.I. 물로 재현탁시키고, 급속-냉동하고 그리고 물의 최종 용적에 의존하여 2-5일 동안 동결건조시켰다.
재현탁
입자를 운집시키고 1xPBS에서 20 mg/ml의 농도로 재현탁시켰다. 입자를 재현탁시키기 위해 와동하거나, 또는 대안으로 와동하고 프로브 초음파 분쇄기(probe sonicator) (VCX-130, Sonics & Materials, Inc.)를 이용하여 50 J의 총 에너지까지 4W에서 간단히 초음파로 분해시켰다.
실시예 13
폭발은 현재 분쟁에서 대부분의 손상을 야기하며 이는 전투 관련된 손상 중 79%를 차지한다. 제어되지 않는 출혈은 전장 외상에서 사망의 선두적인 원인이다. 손상 후, 지혈은 혈소판 활성화를 비롯한 일련의 응고 사건을 통해 확립된다. 하지만, 심각한 손상으로, 이들 과정은 불충분하고 제어되지 않는 출혈을 야기한다. 즉각적인 개입은 심각한 외상과 연관된 사망률을 최소화하는 가장 유효한 수단 중 하나이지만, 현장에서 유일하게 이용가능한 치료는 노출된 손상에 유효한 흡수 물질 및 압박 붕대인데, 상기 치료는 내부 손상에는 이용할 수 없다. 압박 붕대를 보완하고 출혈을 멈추게 하기 위해 위생병에 의해 현장에서 투여될 수 있는 요법이 요구된다.
본 명세서에서 기술된 나노입자는 상기 논의된 바와 같은 대퇴동맥 손상 모델에서 출혈 시간을 반으로 감소시킨다. 이들 나노입자는 근복적으로 합성 혈소판으로서 작용하고 실온에서 안정하며, 그리고 정맥 내로 투여될 수 있다. 그들은 출혈을 멈추게 할 수 있기 때문에, 그들이 폭발 후 생존률을 향상시키고 그리고 조직을 보존하여 더 나은 기능적인 결과를 초래하는 지에 대해 결정하기 위해 폭발 외상의 모델에서 그들을 이용하였다.
나노입자의 제조
활성화된 혈소판을 표적하기 위해 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 아암 및 RGD 펩티드를 가진 폴리(락틱-코-글리콜산)-기반나노입자를 제작하였다. 합성 혈소판을 위한 PLGA-PLL-PEG-GRGDS 또는 PLGA-PLL-PEG-GRADSP를 이전에 기술된 프로토콜을 이용하여 합성하였다. 쿠마린-6 (C6)을 함유한 아세토니트릴내 20 mg/ml의 농도에서 중합체를 용해시켰고, 주사 후 입자를 추적하기 위해 형광 염료를 이용하였다 (1% w/w로 로딩됨). 아세토니트릴의 용적의 2배인, 교반하고 있는 PBS의 용적에 이 용액을 점적하여 첨가하였다. 수-혼화성 용매가 대체되면서 침전된 나노입자가 형성된다. 이후 입자를 3시간 동안 교반-강화시켰다. 1 질량 당량의 건조 폴리(아크릴산) (pAA) (Sigma, MW = 1,800)을 교반하고 있는 입자 현탁액에 첨가한다. 이후 응집이 생길 때까지 교반하고 있는 현탁액에 1% w/v pAA를 대략 10 ml 첨가한다. 5분 후, 응집된 입자를 500g에서 원심분리로 수집하고, 1% pAA로 3회 헹군다 (헹굼의 사이에 섭씨 4도 (deg C), 2 분, 250 g에서 원심분리). 최종 헹굼에서, 입자를 탈이온수로 대략 10 mg/ml로 재현탁시키고, 액체 질소에서 급속-냉동하고 그리고 3일 동안 동결건조시킨다. 아래에 기술되는 코아세르베이트 침전을 이용하여 입자를 수집하였다.
20 psi에서 전신 폭발 외상의 생쥐(mouse) 모델의 생체 내에서 그리고 ROTEM 분석을 이용하여 시험관 내에서 입자를 특징지었다. 스프라그 다우리 쥐 혈액을 이용한, 응고 어세이를 식염수, GRGDS 접합된 합성 혈소판, 또는 나노입자 대조, GRADSP 접합된 나노입자의 존재에서 ROTEM의 NATEM 검사를 이용하여 수행하였다. 매우 민감한 NATEM 검사에서 가변성을 최소화하기 위해 혈액 수집 방법 (심장 천자)을 철저하게 따른다. 모든 동물 절차는 Case Western Reserve University의 기관의 동물 관리 및 이용 위원회에 의해 설정된 가이드라인에 따라 승인되고 착수되었다.
나노입자를 제조하는 이차 기법에서, 중합체 (PLGA-PLL-PEG-GRGDS)를 우선 만들고 그 다음 나노구체로 형성한다.
동물 모델
폭발 외상 손상 모델은 다음과 같이 발생되었다. 설치된 주문 제작 충격 튜브를 폭발 과압 유도를 위해 이용하였다. 마일러 시트(Mylar sheet)를 고압실 및 튜브 사이에 두어 피크(peak) 압력을 달성한다. 폭발 노출 동안, 폭발 압력 공급원에 대해 축으로 배치된 압전 센서 (모델 137A22 Free-Field ICP Blast Pressure Senor, PCB Piezotronics)를 이용하여 압력 대 시간 프로파일을 측정할 것이다. 하나의 센서 (모델 1022A06 ICP Dynamic Pressure Sensor, PCB Piezotronics)는 유도된 압력파에 수직으로 위치된 나삿니가 있는 인트라-튜브 카날 (threaded intra-tube canal)에 설치되고 유도된 압력 시간 프로파일을 또한 측정할 것이다. 디지털 데이터 획득 시스템 (Model DASH 8HF, Astro-Med Inc.)에 대한 휴대용 유사체는 채널(channel) 당 250 kHz로 모든 압력 변환기로부터의 데이터를 수집한다.
폭발 노출에 앞서, 두 마리의 생쥐를 케타민/자일라진 용액으로 마취시켰다. 마취 동안에 생쥐의 무게를 쟀고, 이후 폭발에 대한 생리학적 반응을 수집하기 위하여 전기 면도기 그 다음 직선형 면도기를 이용하여 오른쪽 뒷다리를 면도하였다. 마취된 동물을 발열 패드 상에 두었다. 허벅지 클립 센서(clip sensor)를 면도된 뒷다리에 배치하였으며 이는 MouseOx 생리학적 모니터링 시스템과 연결된다. 마취제 주사-후 20분 동안 생쥐를 모니터링하고, 이후 주문 제작한 규제 장치(restraint harness) (도 1)에 두고 그리고 전신 폭발에 노출시켰다.
폭발 노출 후, 동물을 치우고, 따뜻한 패드에 돌려보내고, 그리고 1-시간 평가 기간 동안 모니터링을 위해 허벅지 클립을 다시 적용시켰다. 여러 가지 생리학적 파라미터 가령, 심박동수, 호흡률, 산소 포화도, 맥박 확장 및 호흡 확장을 수집하는 데에 MouseOx 시스템을 이용하였다. 폭발 10분 이내에, 꼬리 정맥을 통해 치료제 (합성 혈소판, 유산을 가한 링거액내 20 mg/ml 용액의 50 ul; 나노입자 대조, GRADSP-입자, 유산을 가한 링거액내 20 mg/ml 용액의 50 ul; NovoSeven, 50 ul; 유산을 가한 링거액, 50 ul; 또는 치료 없음)를 정맥 내로 투여하였다.
1-시간 평가 전에 동물이 죽었다면, 조직학적 분석을 위해 조직을 재빨리 수집하였다. 1-시간 평가 때까지 동물이 생존했다면, 그들에게 케타민/자일라진을 과잉투여하고 아래에 기술된 바와 같이 4% 파라포름알데하이드로 관류시키고, 그리고 이후 조직학적 분석을 위해 조직을 수집하였다. 작은 코호트(cohort)의 동물은 급성기에서의 생존이 장기간 생존과 관련이 있는지 결정하기 위해 그리고 합성 혈소판 또는 나노입자 대조의 투여와 연관된 합병증이 있는지 알아보기 위해 최대 3주까지 생존하도록 하였다.
폭발 외상을 수행한 사람 및 치료제를 투여한 사람은 치료에 대해 맹검되었고, 그리고 치료에 대해 또한 맹검된 사람에 의해 사망이 독립적으로 기록되었다. 주사하지 않은 군 (n=3)이 참조로서 포함되지만, 통계에는 포함되지 않는다. 오즈-비(odds ratios) (SAS) 사이에서 카이-자승 검증(chi-squared test)과 이항 로지스틱 회귀분석으로 생존을 분석하였다.
합성 혈소판 또는 대조가 투여될 수 있기 전에, 생쥐내 폭발 모델이 실증되어야 했다. 15 PSI 폭발 노출에 동물을 노출시킴으로써 치사율 연구를 시작하였다. 이 군에서의 모든 생쥐는 1-시간 평가에서 살아남았다. 따라서, 과압을 증가시키고 그리고 생쥐의 이차 군을 20 PSI의 압력에 노출시켰다. 이 수준에서, 40% 치사율이 측정되었다. 동물의 삼차 군을 25 PSI의 과압에 노출시켰고 그리고 90%의 동물이 폭발 노출 후 1시간 이내에 죽었다는 것을 발견하였다.
더 높은 압력에 노출된 동물에 관하여 일관성을 보여준 생리학적 파라미터는 건강 상태의 감소를 나타내었다. 25 PSI 과압에 노출된 생쥐는 다른 모든 군과 비교하여 가장 낮은 수준의 산소 포화도를 갖는 것으로 밝혀졌다.
에오신-단독 염색된 폐 절편을 이용하여 폐 손상의 정도를 정량화하였다. 각각의 폐 조직 절편에서 3개의 관심 영역 (ROI)의 이미지를 촬영하였다. 에오신은 양으로 전하된 조직을 염색하는 음으로-전하된 분자이다. 특히, 이것은 적혈구 세포가 주변 조직으로부터 쉽게 구별되도록 하는 특유의 밝은 적색으로 적혈구 세포를 염색하고 그리고 폐에서 출혈의 정도를 특징 짓기 위한 단순한 수단을 제공한다.
폐 조직내 출혈 수준을 측정하기 위하여 이들 3개의 에오신 이미지를 흑백으로 전환하고 광학 밀도 측정값을 수집하였다. 손상된 영역-퍼센트를 계산한 후, 유의성을 결정하고 평균 ± SEM으로서 보고하였다. 특히, 20 psi에서 폐 손상의 유의한 증가가 있다. 이 관찰은 생리학적 발견 그리고 폭발 모델의 치사율과 매우 관련이 있고, 이에 기반하여, 폭발 손상 후 생존에 대한 합성 혈소판의 영향을 검사하기 위해 20 psi의 과압이 적절할 것이라고 결정하였다.
분석
20 psi에 1-시간 노출 후, 식염수 (0.9% 염화 나트륨), 그 다음 4% 포름알데하이드를 함유한 고정 용액을 이용하여 심장을 통한 관류로 생존 동물을 희생시켰다. 모든 주요 기관 (폐, 뇌, 신장, 간, GI)을 수집하고 15% 수크로오스를 함유한 고정 용액에 저장하였다. 48시간 후, 폐를 OCT 포매 배지에 두고 드라이 아이스 상에서 냉동되도록 하였다. 이후 샘플을 자르고 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 그리고 '에오신 단독'으로 염색하였다. 폐 손상을 정량화하는 데에 에오신 단독 절편을 이용하였다. 각각의 폐 조직 절편에서 3개의 관심 영역 (ROI)의 이미지를 촬영하였다. 폐 조직내 출혈 수준을 측정하기 위하여 Image J 소프트웨어 (NIH)를 이용하여, 이미지를 회색 스케일로 전환하고 광학 밀도 측정값을 수집하였다. 도 1은 각각의 절편이 어떻게 분석되었는지에 대한 한 가지 예시를 증명한다. 손상된 영역 퍼센트를 계산한 후, 유의성을 결정하고 평균 ± SD로서 보고하였다. 투 웨이 ANOVA(two way ANOVA)로 그 다음 p < 0.05로 얻은 유의성을 가진 사후 LSD 검증으로 조직학적 통계 분석을 계산하였다.
간, 신장, 비장, 폐, 및 뇌를 수확하고 생체분포 어세이를 위해 동결건조시켰다. 전체 기관의 건조 중량을 기록하였고 그리고 100-200 mg의 건조 조직을 균질화하고 (Precellys 24) 37℃의 아세토니트릴에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이것은 조직내 존재하는 합성 혈소판을 용해시켰고 유기성 용매 용액내 C6은 남겨두었다. 이후 튜브를 10분 동안 15,000 g에서 원심분리하여 고형 물질을 제거하고 그리고 상청액을 HPLC 상에서 검사하였다. 이동상은 80% 아세토니트릴, 및 20% 수성 (8% 아세트산)이었다. 정지상은 Waters Symmetry C18 Column, 100Å, 5 μm, 3.9 mm X 150 mm였다. 형광 탐지기 (450/490 nm ex/em) 상에서 과포화된 샘플을 희석시키고 재실행하였다. 입자의 주사 용적 및 공지된 C6 로딩에 기반하여, 데이터를 주사된 입자의 %로서 나타낸다.
스프라그 다우리 쥐 혈액을 이용한, 응고 어세이를 식염수, GRGDS 접합된 합성 혈소판, 또는 나노입자 대조, GRADSP 접합된 나노입자의 존재에서 ROTEM의 NATEM 검사를 이용하여 수행하였다. 매우 민감한 NATEM 검사에서 가변성을 최소화하기 위해 혈액 수집 방법 (심장 천자)을 철저하게 따른다. 모든 동물 절차는 Case Western Reserve University의 기관의 동물 관리 및 이용 위원회에 의해 설정된 가이드라인에 따라 승인되고 착수되었다.
5 ml 주사기를 1x PBS에서 제조된 0.5 ml의 3.8% 디나트륨 시트레이트로 로딩하였다. 쥐를 케타민:자일라진 설치류 혼합제 (90:10 mg/kg, i.p.)로 마취시키고, 심장박동을 감촉하였다. 이후 플래시(flash)가 일어날 때까지 흡입하면서 바늘을 천천히 진행시켰다. 4.5 ml의 혈액을 수집하여 항응고 용액과 1:9 비 (용액:혈액)로 혼합하였다. 주어진 실행을 위하여, 혈액의 컵은 다음으로 구성하였다: 300 μl 시트르산 처리된 혈액, 20 μl starTEM 시약 (0.2 mM 염화 칼슘), 20 μl 합성 혈소판 (1.25 또는 2.5 mg/ml), 총 340 μl 샘플. 응고 검사에 대한 시간 의존성을 설명하기 위하여, 실험 설계를 4가지 NATEM 검사의 블록이 단일 ~1.2 cc 분취량의 혈액 상에서 실행되도록 고안하였으며, 여기서 식염수는 4개의 검사 중 하나로서 항상 포함되어 직접적인 비교를 감안하였다. 분석된 주요 결과는 ROTEM에 의해 정의된 바와 같은 응고 시간, 혈전 형성 시간 및 최대 혈전 경도이다. 블록으로서 실행 시간 및 군 사이의 터키(Tukey) 비교와, 일반화된 선형 모델을 이용하여 미가공 데이터를 분석하였다. 고려되는 주요 결과는 표준 ROTEM 파라미터 응고 시간 (CT), 혈전 형성 시간 (CFT), 상기 두 가지의 합계 (CT+CFT), 및 최대 혈전 경도 (MCF)를 포함한다. CT는 어세이의 시작으로부터 초기 응고가 탐지될 때까지 (두께 = 2mm)의 시간으로서 정의된다. CFT는 초기 혈전 (두께 = 2mm)에서부터 20 mm의 혈전 두께가 탐지될 때까지 사이의 시간으로서 정의된다. MCF는 검사 기간 동안 혈전이 도달하는 최대 두께 (mm로)로서 정의된다.
결과
20 psi 폭발에 노출되고 합성 혈소판이 투여된 21마리 동물의 이들 결과에서, 오직 한 마리의 동물만이 1시간 시점에 전에 죽었다. 이 결과는 주사 하지 않은 대조군보다 유의적으로 더 나은 결과이다. 오즈-비 (SAS) 사이에서 카이-자승 검증과 이항 로지스틱 회귀분석으로 생존을 분석하였다. 합성 혈소판 대 주사하지 않음에 대한 오즈비는 1.24 내지 143의 95% 신뢰 구간을 가진 13.3이다.
합성 혈소판으로의 초기 작업에서, 비-생존 모델을 이용하였다. 이 작업에서, 나노입자 대조 및 합성 혈소판 군 (군 당 n=7) 둘 모두에서 폭발 후 최대 3주 동안 동물을 유지하였다. 합성 혈소판 3주 군에서 1시간 후 오직 1 마리 동물만이 죽었고, 그리고 죽음은 뇌졸중, 가쁜 호흡의 증세, 또는 차단된 혈관의 다른 증세와 같은 입자 투여로부터의 어떠한 합병증의 증세도 보여주지 않았다. 오히려, 동물은 허약해졌고 그리고 동물을 손상 후 1일에 안락사 시켰다. 나노입자 대조군에서 2마리 동물은 3주 시점까지 생존하지 못했다.
대조 및 치료군의 예비 조직학적 분석은 활성 합성 혈소판 치료군이 더 낮은 수준의 폐 손상이 있었다는 점을 증명하였다. 20 μg/ml 농도는 출혈에 대한 현재 임상 치료인, 스크램블된(scrambled) 혈소판 및 NovoSeven과 비교하여 감소된 수준의 손상을 야기하였다. 폐 손상 데이터의 경향은 합성 혈소판 군에서 보이는 생존의 증가와 관련 있는 손상 (적혈구 세포)의 감소가 있는 생존 데이터와 매우 관련이 있다.
폭발 후 1시간에 합성 혈소판 및 나노입자 대조 (n=3)의 생체분포는 입자가 폐, 비장, 및 간에서 가장 큰 백분율로 조직 도처에 있다는 점을 증명한다. 나노입자 대조군에서, 대략 10%는 폐 각각에 있다. 합성 혈소판 군에서는 더 낮은 백분율이지만, 이 작업에 대한 n은 여전히 낮으며, 연구를 지속함에 따라, 소량으로 계속 있는지 또는 수가 대조와 더욱 일치하는 지를 알아보는 것이 흥미로울 것이다. 모조 (비-폭발) 생쥐에서 합성 혈소판 또는 나노입자 대조의 생체분포는 서로 유사하다.
응고 시간 플러스 혈전 형성 시간은 혈액 단독 또는 식염수와 비교하여 합성 혈소판으로 감소되었다 (n=2). 본 연구를 위해 이용된 용량은 1.25 mg/ml였으며 이는 폭발 모델에서 이용된 20 mg/ml와 매우 관련이 있다. 식염수의 첨가는 혈액-단독 대조와 비교하여 응고 시간을 실제로 감소시키는 것으로 나타나며, 이는 이 첨가가 응고 캐스케이드를 활성화 할 수 있지만, n은 낮고 연구는 추가로 실증되어야 한다는 점을 제시한다. (n=2로 이 날짜에 대해 p=0.4).
전단 탄성계수 강도는 혈액-단독 혈전의 전단 탄성계수 강도를 재현하는 것으로 나타난다 (p=0.76). 나노입자 대조는 전단 탄성계수 강도를 감소시키는 것으로 나타나고 이는 불활성 펩티드 나노입자가 나노입자 대조에서 약간 증가된 치사율을 설명할 수 있는 혈전 형성을 방해할 수 있다는 점을 제시한다.
이 작업에 관련된 발견에 기반하여, 대형 동물 (돼지) 간 손상 연구를 시작하였다. 예비 데이터는 합성 혈소판이 대형 동물 모델에서 실혈을 감소시키고 그리고 돼지에 대한 투약이 예상보다 훨씬 더 낮다는 점 (3 mg/돼지만큼 낮음)을 제시한다. 쥐의 경우, 삼중블록을 위한 최적 용량은 20 mg/ml (주사된 합성 혈소판의 0.5 ml)였다. 사중블록 버전의 경우, 이는 2.5 mg/ml (투여된 0.5 ml)였다.
실시예 14
활성화된 혈소판을 표적하는 지혈 나노입자의 정맥내 투여가 공격의 범위 및 몇 가지 가능성으로 다수의 군에 의해 조사되었다. 트롬보적혈구(thromboerythrocyte)로 불리는 RGD 접합된 적혈구 세포 (RBC)는 시험관내 가능성을 보여주었지만 혈소판 감소 영장류에서 연장된 출혈 시간을 유의적으로 감소시키지는 않았다. 피브리노겐-코팅된 알부민 미세입자, "신토사이트(Synthocyte)"　및 피브리노겐 γ 사슬 도데카펩티드　(HHLGGAKQAGDV)를 수반하는 다른 것들에 의해 이용되는 리포좀은 혈소판감소 토끼의 출혈 모델에서 성공을 보여주었다. 하지만, 신토사이트는 정상적인 토끼에서 출혈을 치료하는 데에서는 유효하지 않았고, 그리고 리포좀은 아직 이 목적을 위해 연구된 것으로 나타나지 않는다.
이 작업으로부터, 몇 가지가 분명하다. 첫째, 입자가 너무 크거나 면역성 물질을 가지고 있다면, 그들은 비-특이적인 혈전증을 유발할 수 있다. 응고 시스템이 매우 복잡하기 때문에, 기능적으로-직접적인 결과를 가진 복수의 출혈 모델 (및 종)을, 시험관내 연구와 협력하여, 혈소판 대체물 21에 대해 발행된 가이드라인의 설정에서 FDA에 의해 승인되었던 것과 같이, 잠재적인 요법을 완전히 평가하는 데에 이용하였다. 첨가제에 기인하는 전혈전(prothrombotic) 잠재성, 면역원성, 및 독성은 안정 기준에 속하고, 효능 기준은 일련의 생체내 및 시험관내 검사에 기반한다.
나노입자 제조
카르보벤즈옥시-보호된 측면 아민 측면기 (Sigma P4510)를 가진 폴리(E-cbz-L-리신) (PLL-cbz) PLL 및 PLGA (Resomer 50311)로 시작하여, 단계적인 접합 반응을 이용하여 PLGA-PLL-PEG 삼중블록 중합체를 합성하였다. UV-Vis를 이용해서 이 접합 반응을 확인하여 cbz 기에 상응하는 특유의 삼중 피크에 대해 체크하였다. HBr로 PLGA-PLL-cbz를 탈보호한 후, PLL-NH3 상의 유리 아민을 CDI-활성화된 PEG와 5:1 몰 초과로 반응시켰다. 쿠마린-6 (C6)을 함유한 아세토니트릴에서 20 mg/ml의 농도로 접합 삼중블록 공중합체 PLGA-PLL-PEG (CDI 활성화된 PEG 말단기를 가짐)를 용해시켰고, 주사 후 (1% w/w로 로딩됨) 입자를 추적하는 데에 형광 염료를 이용한다. 아세토니트릴의 용적의 2배인, 교반하고 있는 PBS의 용적에 이 용액을 점적하여 첨가하였다. 수-혼화성 용매가 대체되면서 침전된 나노입자가 형성된다. 이후 나노입자를 GRGDS 또는 보존적으로 치환된 GRADSP 펩티드와 접합시키고 단일 단계에서 3시간 동안 교반-강화시켰다. 이후 아래에 기술된 코아세르베이트 침전 방법을 이용하여 나노입자를 수집하였다.
1 질량 당량의 건조 폴리(아크릴산) (pAA) (Sigma, MW = 1,800)을 교반하고 있는 입자 현탁액에 첨가하였다. 이후 응집이 생길 때까지 교반하고 있는 현탁액에 1% w/v용액의 pAA를 대략 10 ml 첨가하였다. 5분 후, 응집된 입자를 원심분리로 수집하고, 3회 헹구었다. 나노입자를 탈이온수로 대략 10 mg/ml로 재현탁시키고, 액체 질소에서 급속-냉동하고 그리고 3일 동안 동결건조시켰다. 나노입자를 lx PBS에서 20 mg/ml의 농도로 재현탁시키고 간단히 초음파로 분해시켰다 (VCX-130, Sonics & Materials, Inc.).
역학적 광산란 (90Plus, Brookhaven Instruments Comoration) 및 주사 전자 현미경 (Hitachi S4500)을 이용하여 크기 분포 및 다분산성에 대해 나노입자를 특징지었다. 90Plus 소프트웨어에 의해 계산된 바와 같은 유효한 지름으로서 DLS 데이터를 나타내었다. ImageJ 소프트웨어에서 SEM 이미지를 분석하였다. UV-분광학, 1H-NMR 및 아미노산 서열 분석 HPLC (각각 BioRad, Varian 및 Shimadzu)을 이용하여 PLL, PEG 및 펩티드 리간드의 성공적인 접합을 확인하였다. 1H-NMR은 삼중블록 구조를 분석하기 위해 클로로폼으로 수행하고 그리고 물을 중수소화하여 PEG 관상 외피(coronal shell) 27를 확증한다. W.M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory (New Haven, CT)에 의해 아미노산 서열 분석이 수행되었다.
응고 어세이
스프라그 다우리 쥐 혈액을 이용한, 응고 어세이를 상기 기술된 바와 같이 수행하였다.
생체내 간 손상 모델
치명적인 손상 모델에서 생존을 증대시키기 위한 나노입자의 효능을 평가하기 위하여, 간 손상 모델을 Ryan et al. 28 및 Holcomb et al. 29으로부터 응용하였고 이는 아래에서 기술된다. 손상 모델은 Case Western Reserve University의 기관의 동물 관리 및 이용 위원회에 의해 설정된 가이드라인에 따라 승인되고 착수되었다. 본 연구를 위해 기록된 주요 결과는 1시간에서의 생존 및 미리-무게를 잰 거즈(gauze)로 측정된 바와 같은 실혈을 포함한다.
수술 절차. 스프라그 다우리 쥐 (225-275 g, Charles River)를 복강내 케타민:자일라진 (각각, 90:10 mg/kg)으로 마취시켰다. 10분 후, 그들을 면도시켜 가열 패드 상에 반듯이 누운 자세로 두었다. 복부에 접근하였고 간의 중간엽을 휴대용의 수작 장치를 이용하여 간상부 대정맥으로부터 반지름 1.3 cm의 아치형으로 마킹하였다. 마킹하고 나면, 꼬리 정맥을 노출시키고, 그리고 식염수-분출된(flushed) 24G x 3/4" Excel Safelet Catheter로 카데터를 삽입하였다. 이후 간의 중간엽을 마킹된 선을 따라 잘라내고, 복부를 상처 클립(wound clip)으로 닫고, 그리고 0.5 cc 볼러스(bolus) 치료 용액을 바로 투여하고 그 다음 0.2 cc 식염수를 분출시켜 카데터 사용적(dead-volume)을 제거하였다.
쥐를 1시간 동안 또는 호흡 및 감지할 수 있는 심장박동 둘 모두의 결핍으로 확인되는 바와 같이, 죽을 때까지 출혈하도록 하였다. 실혈을 측정하기 전에, 모든 쥐에게 치사량의 나트륨 펜토바르비탈을 주사하였다 (i.v.). 이후 복부를 다시 열고 미리-무게를 잰 거즈로 혈액을 수집하였다. 간에 부착된 혈전은 마지막에 수집하였는데 그 이유는 이것이 주로 추가적인 출혈이 일어나는 것을 야기하였기 때문이다. 잘라낸 간의 무게를 재고 상기 간을 10% 완충된 포르말린 용액에서 고정시켰다. 남아있는 간, 신장, 비장, 폐 그리고 부착 혈전을 수확하고 10% 완충된 포르말린에서 유사하게 보존하였다.
절차 및 통계
처리는 주사 없음 (n=3), 식염수 (n=17), 스크램블된 NP (n=15), 및 지혈 GRGDS-NP (n=20)를 포함하였다. 입자 치료제를 PBS에서 20 mg/ml로 재현탁시켰다. 외과의는 치료에 대해 맹검되었고 그리고 치료에 대해 또한 맹검된 제2의 사람에 의해 모든 실혈 측정 및 사망이 독립적으로 기록되었다. 주사하지 않은 군 (n=3)이 참조로서 포함되었지만, 통계에는 포함되지 않았다. 실혈 데이터를 분석하는 데에 터키 비교와 ANOVA를 이용하였다 (Minitab). 오즈-비 (SAS) 사이에서 카이-자승 검증과 이항 로지스틱 회귀분석으로 생존을 분석하였다. 예비 연구에 기반한 파워(power) 분석은 생존 데이터에 대한 유의성을 위해 군 당 n=15를 제시하였다 (알파 = 0.05, 베타 = 0.2, 오즈비 = 3).
생체분포
간, 신장, 비장, 폐 및 부착 혈전을 수확하고 생체분포 어세이를 위해 동결건조시켰다. 전체 기관의 건조 중량을 기록하였고 그리고 100-200 mg의 건조 조직을 균질화하고 (Precellys 24) 37℃의 아세토니트릴에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이것은 조직내 존재하는 임의의 나노입자를 용해시켰고 유기성 용매 용액내 C6은 남겨두었다. 이후 튜브를 10분 동안 15,000 g에서 원심분리하여 고형 물질을 제거하고 그리고 상청액을 HPLC 상에서 검사하였다. 이동상은 80% 아세토니트릴, 및 20% 수성 (8% 아세트산)이었다. 정지상은 형광 탐지 (450/490 nm ex/em)로 Waters Symmetry C18 Column, 100A, 5 gm, 3.9 mm X 150 mm였다. 입자의 주사 용적 및 공지된 C6 로딩에 기반하여, 데이터를 주사된 입자의 퍼센트 (%)로서 나타내었다. 손상 표면 및 부착 혈전 이미지화. 간의 잘려진 부분을 헹구고 고-해상도 (1200 dpi) 평판 스캐너 (Cannon CanoScan LiDE 700F) 상에 바로 두어 손상 표면을 이미지화하였다. 간에 여전이 붙어있는, 부착 혈전을 10% 포르말린에서 고정시키고, 수크로오스에서 하룻밤 동안 담가두고, 냉동하고 그리고 20-마이크론 두께로 동결절단하였다. 이후 절편을 VectaShield DAPI로 염색하여 간세포 핵을 염색하였고 그리고 반전된 형광 현미경 (Zeiss Axio Observer.Z1)으로 이미지화하였다. 군 당 여러 개 혈전을 10% 포르말린으로 고정시켰고, 그리고 일련의 단계에서 에탄올로 탈수시켜 스캐닝 ACS Paragon Plus Environment 전자 현미경 (SEM)으로 이미지화하기 위해 상기 혈전을 준비시켰다. 이후 이들을 무수 헥사메틸디실라잔에서 하룻밤 동안 건조시키고 그리고 스퍼터 코팅시켰다(sputter coated). 샘플을 장착하고 5kx 배율에서 Hitachi S4500 전계 방출 SEM로 이미지화하였다.
결과
입자 합성 및 특성화. Bertram et al. 22' 23' 313에 따라 카르보벤즈옥시-보호된 측면 아민 측면기를 가진 폴리(E-cbz-L-리신) PLL 및 PLGA (Resomer 503H)로 시작하여, 단계적인 접합 반응을 이용하여 PLGA-PLL-PEG 삼중블록 중합체를 합성한다. 이 단계에 대한 접합 효율은 UV-vis에 의해 측정된 바와 같이, 대략 ― 30-40% 몰비 PLL:PLGA이다. 측면기의 탈보호 후, PLL 상의 유리 아민을 CDI-활성화된 PEG와 반응시켰다. 이 PEG는 나노입자 주위에 친수성 외피를 형성하여 나노입자가 혈액 순환에서 더 긴 체류 시간을 갖도록 허용한다. 중수소화된 물 및 중수소화된 클로로폼내 11-1-NMR을 수행하여 예상되는 표면-페길화 구조를 확증한다. 스펙트럼으로부터, 1:10 (PEG:PLGA) 몰비가 되도록 페길화 퍼센트를 계산한다. 중수소화된 물에서, PEG 피크는 다른 피크에 비해 훨씬 더 커지고 수성 환경내 나노입자의 PEG-관상 구조를 확인한다. 나노입자 중심부의 크기 및 분포 (SEM에 의함)는 수성 환경 (DLS에 의함)에서 각각, 약 400 nm 및 420 nm로 균질하게 분포된다. SEM에서 DLS로의 크기 증가는 PEG 아암에 의해 형성된, 수화 외피에 의해 설명될 수 있다. 접합된 GRGDS 또는 GRADSP 펩티드에 따라 크기에서 유의한 변화 없이, C6 로딩의 결과로서 크기에서 약간의 증가 (대략 5-10%)가 있는 것으로 나타난다.
생체내 손상 모델 개발. 중간엽의 손상 후, 쥐에게 식염수, 스크램블된 (GRADSP), 또는 지혈 (GRGDS-접합된) 나노입자를 투여하였다. 식염수는 기준선 대조로서 이용되는데, 그 이유는 유체의 투여가 출혈에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 예비 결과에 기반하여, 잘려진 간 질량 및 체질량이 출혈 결과와 매우-관련이 있었다는 점을 발견하였고, 그리고 Holcomb et al. 29와 유사하게, 쥐 체질량 (225-275 g) 및 간 절제 (체질량의 0.8-1.2%)에 대한 포함 기준을 엄격히 고수하기로 정한다. 연구의 결론에서, 이 포함 기준은 체질량에 기반하여 쥐-대-쥐 가변성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 간 절제 질량은 여전히 출혈 결과와 유의적으로 관련이 있었다 (p=0.0004). 잘려진 간 질량 및 치료가 ANOVA 모델에 포함될 때, 치료는 여전히 출혈 결과와 유의적으로 관련이 있지 않다 (p=0.113).
이 작업 중 가장 중요한 부분 중 하나는 나노입자의 투여가 둔기 외상 손상 후 향상된 생존을 초래하였는지에 대해 결정하기 위한 것이었다. 지혈제, GRGDS 나노입자의 투여는 치명적인 간 손상 후 생존을 유의적으로 향상시킨다. 특히, GRGDS-NP는 80%까지 생존의 가능성을 증가시킨다. 이것은 식염수 군에서의 47% (p=0.040, 오즈비 (OR)=4.5, 95% CI 1.1-19.2) 및 스크램블된-NP 군에서의 40% (p=0.019, OR=6, 95% CI 1.3-27.0)와 비교된다. GRGDS-NP를 투여하는 것은 이 치명적인 손상으로부터의 생존 기회를 거의 2배로 만든다. 실혈. 이전 작업 22로부터 GRGDS-NP가 출혈을 감소시킨다는 점을 알고 있다. 이 작업에서, 실험의 말에 체강내 혈액을 흡수하는 데에 이용된 거즈의 무게 변화를 통해 실혈을 측정하였다. 이 방법은 실혈에 대한 데이터를 제공하지만 이전 연구에서는 허용되었던 좋은 해답이 부족하다. 이 모델에서 총 실혈을 측정하는 것은 생존 시간의 영향에 의해 복잡하게 된다. 실혈 속도는 이 모델에 대해 더 나은 생존 지표일 수 있지만, 손상 모델이 쥐의 작고, 밀폐된 강(cavity) 에서 유지되기 때문에, 실혈을 역학적으로 측정할 수 없었다. 그럼에도 불구하고, 최소한의 실혈을 나타내는 GRGDS-NP로 생존과 관련이 있는 실혈의 경향을 보았다. 실혈의 감소에 대한 이 경향은 통계학적으로 유의하지 않지만 (13=0.0552), GRGDS-NP는 출혈의 경감을 통해 생존을 향상시킨다는 점을 제시한다. 임계 역치가 약 35% 혈액 용적 손실인 것으로 또한 나타나며, 그 이상에서 사망률의 비율이 빠르게 증가한다.
손상 표면 이미지화
GRGDS-NP가 손상 부위를 표적화하고, 혈전 내에 축적된다는 점을 실증하는 것을 돕기 위하여, 형광 현미경 및 SEM을 비롯한 여러 가지 방식을 이용하여 손상 표면을 이미지화하였다. 형광 화합물 쿠마린-6 (C6)으로 로딩된 나노입자가 혈전과 통합된, 손상 표면 내에서 발견된다. 손상 표면을 또한 평판 스캐너를 이용하여 특징화하여 손상의 성질을 묘사하는 것을 돕는다. 모델 개발 동안에 손상의 시각적인 관찰로부터, 대부분의 출혈이 중간엽 손상에서 가로로 절개된 2-4개의 주요 혈관을 통해 발생한다는 점이 명백하다.
생체분포
스크램블된-NP 군의 경우의 단지 6.8%에 대비하여 GRGDS-NP의 경우, 혈전에서 31.1%의 주사된 용량이 발견된다. 검사된 혈전과 기관 사이의 나노입자의 총 회수는 GRGDS-NP와 스크램블된-NP 군의 경우 각각, 53.7% 및 29.6%였다; 비회수 부분은 아마도 응고에 활발히 관여하지 않은,　출혈된 혈액에 위치되거나,　또는 혈장 순환에 남아 있는다. 각각의 군에 대하여 폐에서 발견된 나노입자의 상대적으로 큰 백분율, 20.8% 및 20.6% (각각, GRGDS 및 스크램블된), 그리고 검사된 다른 기관에서 발견된 작은 백분율 (<2%)이 있었다.
시험관내 응고 모델
시트르산 처리된 쥐를 가지고, 회전 트롬보엘라스토메트리(thromboelastometry) (ROTEM)를 이용하여 용량 연구를 수행하였다. 이 어세이에서, 나노입자의 변화하는 농도를 함유한 20 ill 용적의 PBS를 어세이 시작 직전에 300 ill 용적의 혈액에 첨가하였다. 식염수 외에도, 검사된 나노입자의 농도는 GRGDS 및 스크램블된 나노입자 군의 경우 0.625, 1.25, 2.5, 5.0, 및 20 mg/ml을 포함하였다. 스크램블된 군에서 검사된 모든 농도에서, 식염수와 비교하여 CT+CFT는 증가하고 MCF는 감소하였다. GRGDS-NP 1.25 및 2.5 mg/ml 농도에서, MCF는 증가하였다. 유사하게도, 응고 시간은 1.25 mg/ml, 및 5.0 mg/ml 군에서 감소되지만, 그 외에는 증가되었다. 이것은 68.6 ml/kg 혈액 용적 32를 가정하여, 250 g 수컷 쥐의 경우 5.2-20 mg/kg 용량 또는 혈액내 대략 73.5-294 gg/m1인, 최적 용량으로 나노입자로 치료될 때 더 빠르고 더 두껍게 혈전이 형성되는 것을 나타낸다.
1.25 및 2.5 mg/ml의 농도를 추가로 조사하였는데 그 이유는 이들이 응고 파라미터에 가장 바람직한 효과를 가졌기 때문이다. 각각의 검사-블록에 대해 대조로서 식염수로, 랜덤화된 블록 실험 방법을 이용하였다. 2.5 mg/ml GRGDS-NP 용량은 식염수 대조 (p=0.0437)와 비교하여 응고 시간을 유의적으로 감소시켰고 그리고 차이가 유의하지 않았지만 MCF를 증가시키는 것에 대한 경향이 있었다 (n=3 쥐, 각각의 치료-용량 수준으로 삼중 측정). 2.5 mg/ml GRGDS-NP 용량은 식염수 대조 (p=0.0437) 와 비교하여 응고 시간을 유의적으로 감소시켰고 그리고 통계학적으로 유의하지 않지만 MCF를 증가시키는 것에 대한 경향이 있었다. 흥미롭게도, 스크램블된-NP 군은 또한 응고시간은 감소시키고 MCF는 증가시키는 것으로 나타났지만, 차이는 식염수 또는 GRGDS 처리와 유의적으로 다르지 않았다.
지혈 나노입자의 투여는 1-시간 생존을 증가시켰다. 초기 개입은 외상 후 생존의 기회를 향상시키는 데에 중요하고, 이 작업에서 초기 개입의 효과를 보았다. 검사된 모든 군의 경우, 20분의 시간대가 있었고, 그 이후 대략 35% 혈액 용적의 임계 혈액 용적 손실뿐만 아니라, 생존의 가능성이 향상되었는데, 그 미만에서 95%의 쥐가 생존하였다.
대조와 비교하여 거의 2배가 많은 쥐가 지혈 나노입자의 투여로 1시간 생존한다. 이 결과는 통계학적으로 유의하고 임상적으로 엄청나다. 이전에, 이들 지혈 나노입자가 실온에서 안정하며 제어된 손상 모델에서 출혈을 감소시킨다는 점을 알아냈지만, 주요한 의문 중 하나는 실혈에서 이러한 감소가 출혈의 치명적인 외상 모델에서 생존에 영향을 줄 것인지에 대한 것이었다. 간 손상 모델은 현장 28' 29' 33에서 가장 재현할 수 있고 비교할 수 있는 것 중 하나이다. GRGDS-NP로 생존에서 거의　2배의 증가를 관찰한 것은 그들이 출혈을 감소시킬 뿐만 아니라　임계의 입원 전 시간대에서의 생존에 영향을 주는 수준으로도 출혈을 감소시킨다는 점을 확인해준다.
스크램블된-NP 군과 비교하여, 부착되어 있는 간 혈전에서 4.5-배 더 많은 양의 GRGDS-NP가 신장, 비장, 및 손상되지 않은 간에서 발견된 매우 적은 양의 나노입자와 함께 발견되었으며, 이는 그들의 손상-표적화 능력을 확인해준다. 거의 20%의 주사된 나노입자가 치료군과 관계 없이 폐에서 발견되었다. 수집 시간에 기관에 여전히 존재하는 폐 관류로 인해 폐에서 몇몇 기저 수준의 나노입자가 예상되는 반면, 무경험 쥐에서의 이전 연구는 이것이 주사된 용량 22의 단지 5-10%를 차지하는 것으로 추정한다. 이들 발견은 이 손상 모델 34의 대규모의 출혈 성질에 부수적으로 따르는, 폐에서의 혈전색전증에 나노입자가 축적될 수 있다는 점을 명시할 수 있다. 하지만, 생존에 유해하게 영향을 주는 것으로 나타나는 것이 아니라―오히려 그 반대라는 점에 주목하는 것이 특히 흥미롭다. 따라서, 이들 혈전이 식염수 대조에서도 또한 존재하고, 그리고 임의의 임상 소견 34' 35가 없을 수도 있는 미세색전으로서 제시될 수 있다는 점을 논증하는 것을 추리한다. 추후 연구는 예를 들어, 폐 관류, 조직 산소화, 또는 혈액 가스 수준을 모니터링함으로써, 폐에서 입자 집합의 위험요인을 평가하고 그리고 그들이 어떠한 기능적인 영향을 가질 수 있는지 결정하는 것을 목표로 할 수 있다. 해로운 기능적 결과 없이 나노입자의 유효한 손상-표적화와 결부된, 이들 나노입자의 정맥내 투여의 용이함으로 인하여, 본 요법은 치료소에서 적용하는 데에 적합하다.
기능화된 치료 대 대조로 실혈의 감소에 대한 경향을 관찰하였다. 하지만, 쥐의 외상 모델에서 혈액 수집을 위한 방법은 제한되며, 민감도는 기껏해야 소규모이다. 따라서, 통계적 유의성에 대해 이 영역에서의 군 사이에 어떠한 차이도 해결될 수 없다는 점이 놀랍지 않다. 이 모델이 실혈에서의 차이에 대해 몹시 민감하지는 않지만, 실혈에 관한 경향이 본 연구의 핵심점인, 생존 결과와 매우 관련이 있다.
나노입자가 응고 시간에 미치는 영향은 용량 의존적이었으며 검사된 효율적인 용량은 147 μg/ml의 혈액 농도 (입자 질량/혈액 용적)에 상응하여, 2.5 mg/ml 군이었다. 시험관내 발견에 기반하여, 나노입자가 응고 시간을 줄이고 혈전 경도를 증가시키는 성향이 있는 경우, 증가된 생존에 대하여, 더 빠른 혈전 형성과 혈전 강도의 증가가 실혈에서의 감소 및 생존에서의 증가를 일으킨다는 가설을 제기하였다.

Claims (41)

  1. 중심부, 수용성 중합체 및 펩티드를 포함하는 온도 안정 나노입자에 있어서, 수용성 중합체는 수용성 중합체의 일차 말단에서의 중심부에 부착되고, 펩티드는 수용성 중합체의 이차 말단에 부착되고, 펩티드는 RGD 아미노산 서열을 포함하고, 수용성 중합체는 글리코단백질 IIb/IIIa (GPIIb/IIIa)에 펩티드의 결합을 허용하는 데에 충분한 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 온도 안정 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 35℃ 초과의 융해 온도를 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 스페로이드(spheroid) 모양 및 1 마이크론 미만의 지름을 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  4. 제3항에 있어서, 0.1 마이크론 내지 1 마이크론의 지름을 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비-스페로이드인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  6. 제5항에 있어서, 로드(rod), 섬유(fiber) 또는 위스커(whisker)인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  7. 제6항에 있어서, 적어도 3의 가로 세로 종횡비를 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 14일 동안 실온에서 안정한 것을 특징으로 하는 나노 입자.
  9. 각각의 나노입자가 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 다수의 나노입자에 있어서, 다수의 나노입자는 0.1 마이크론 내지 1 마이크론의 평균 지름을 갖는 것을 특징으로 하는 다수의 나노입자.
  10. 제9항에 있어서, 모든 나노입자 중 75% 초과가 0.1 마이크론 내지 1 마이크론의 지름을 갖는 것을 특징으로 하는 다수의 나노입자.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 중심부는 결정성 중합체인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  12. 제11항에 있어서, 중심부는 단일 중합체, 블록 공중합체(block copolymer), 삼중블록 공중합체 또는 사중블록 중합체인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  13. 제1항 내지 제8항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 중심부는 PLGA, PLA, PGA, (폴리 (ε-카프로락톤) PCL, PLL 또는 이의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  14. 제1항 내지 제8항, 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 중심부는 생분해성인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 중심부는 고체인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  16. 제1항 내지 제8항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 중심부는 비-생분해성인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  17. 제1항 내지 제8항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 중심부는 금, 은, 백금, 알루미늄, 팔라듐, 구리, 코발트, 인듐, 니켈, ZnS, ZnO, Ti, TiO2, Sn, SnO2, Si, SiO2, Fe, Fe+4, 강철, 코발트-크롬 합금, Cd, CdSe, CdS, 및 CdS, 티타늄 합금, AgI, AgBr, HgI2, PbS, PbSe, ZnTe, CdTe, In2S3, In2Se3, Cd3P2, Cd3As2, InAs, GaAs, 셀룰로오스 또는 덴드리머 구조로 구성된 군에서 선택된 물질인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  18. 제1항 내지 제8항 및 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 분지 PEG, 폴리시알산 (PSA), 카르보하이드레이트, 다당류, 폴루란, 키토산, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 전분, 덱스트란, 카르복시메틸-덱스트란, 폴리알킬렌 옥사이드 (PAO), 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리옥사졸린, 폴리 아크릴로일모르폴린, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-하이드록시메틸에틸렌 하이드록시메틸포르말) (PHF), 2-메타크릴로일옥시-2'-에틸트리메틸암모늄포스페이트 (MPC), 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아세탈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리 (β-아미노산 서열) (호모중합체 또는 랜덤 공중합체 중 하나), 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 호모중합체 (PPG) 및 다른 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (POG) (가령, 글리세롤) 및 다른 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리옥시에틸화 소르비톨, 또는 폴리옥시에틸화 글루코오스, 콜로닉산(colonic acid) 또는 다른 카르보하이드레이트 중합체, 피콜 또는 덱스트란 및 이의 조합 또는 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  19. 제18항에 있어서, 수용성 중합체는 PEG인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  20. 제19항에 있어서, PEG는 100 Da 내지 10,000 Da의 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  21. 제19항에 있어서, PEG는 적어도 약 100의 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  22. 제1항 내지 제8항 및 제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 RGD, RGDS, GRGDS, GRGDSP, GRGDSPK, GRGDN, GRGDNP, GGGGRGDS, GRGDK, GRGDTP, cRGD, YRGDS 또는 이의 변이체로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  23. 제1항 내지 제8항 및 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, RGD 펩티드는 종열 중복(tandem repeat)으로 있는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  24. 제1항 내지 제8항 및 제11항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 RGD 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  25. 제1항 내지 제8항, 및 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 복수 개의 RGD 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  26. 제25항에 있어서, 모든 RGD 펩티드는 동일한 것을 특징으로 하는 나노입자.
  27. 제25항에 있어서, 2개의 RGD 펩티드는 상이한 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  28. 제1항 내지 제8항 및 제11항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 중합체는 0.1:1 내지 1:10 이상의 몰비로 중심부에 부착되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  29. 제1항 내지 제8항 및 제11항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 화합물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  30. 제29항에 있어서, 치료학적 화합물은 소수성인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  31. 제29항에 있어서, 치료학적 화합물은 친수성인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 화합물은 나노입자에 공유결합으로 부착되고, 나노입자와 비-공유결합으로 회합되고, 정전기 상호작용을 통해 나노입자와 회합되고, 또는 소수성 상호작용을 통해 나노입자와 회합되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  33. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 화합물은 성장 인자, 사이토카인, 스테로이드, 또는 소분자인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  34. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 화합물은 항-암 화합물인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  35. 제1항 내지 제8항 및 제11항 내지 제38항 중 어느 한 항의 나노입자를 포함하는 제약학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 정맥내 투여 제제인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  37. 제35항에 있어서, 동결건조되거나 분말인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  38. 개체내 질환을 치료하는 방법에 있어서, 제1항 내지 제8항 및 제11항 내지 제38항 중 어느 한 항의 나노입자를 질환을 치료하는 데에 유효한 양으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 방법.
  39. 제38항에 있어서, 개체는 출혈 장애를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 나노입자는 투여 없음 또는 식염수의 투여와 비교하여 15% 초과까지 출혈 시간을 감소시키는 데에 유효한 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 출혈 장애는 응고 장애, 혈소판감소증, 상처치유 장애, 외상, 폭발 외상, 척수 손상 또는 출혈의 증상인 것을 특징으로 하는 방법.
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