CN104334162A - 多色的pH可激活的荧光纳米平台 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及pH可调的、高度可激活的多色荧光纳米平台,以及在多个应用中使用所述纳米平台的方法,所述应用包括但不限于研究基本的细胞生理学过程,例如胞吞小泡中的pH调节、内体/溶酶体成熟以及pH对受体循环和亚细胞器运输的影响。
Description
本申请要求于2012年4月5日提交的美国临时申请序列号61/620,774和于2013年3月14日提交的美国非临时申请序列号13/827,197的权益,其整体通过引用并入本文。
发明背景
本发明在国家卫生研究院授予的基金号RO1 EB013149的政府支持下进行。政府享有本发明的某些权利。
1.技术领域
本发明一般地涉及分子和细胞生物学、纳米技术和荧光传感器的领域。更特别地,其涉及用于检测pH变化的纳米平台。
2.背景技术
由于荧光成像能够提供微观、中观和宏观水平的时空信息,所以其已成为研究活细胞中的生物学分子、通路和过程的一种重要工具(参见例如,Tsien,R.Y.Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 2003,4,SS16;Weissleder,R.,Nature2008,452,580;Fernandez-Suarez,M.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2008,9,929)。荧光报道分子大致可分为两类:内在表达的荧光蛋白(例如,GFP)或外部施用的荧光探针(例如,合成染料)。通过靶蛋白的特异性标记以及蛋白质功能的活细胞成像,荧光蛋白报道子已经很大地影响了基础生物科学的研究(参见例如,Giepmans,B.N. G. Science 2006,312,217;Gross,S.,Cancer Cell 2005,7,5)。外部成像探针已被广泛用于多种细胞和动物成像研究。
最近,响应于生理学刺激例如离子和氧化还原电位、酶促表达和pH的可激活成像探针在探测细胞生理学过程中受到了相当大的关注(参见例如,de Silva,A.P.,Chem.Rev.1997,97,1515;Zhang,J.,Nat.Rev.Mol.CellBiol. 2002,3,906;Lee,S.,Chem.Commun.2008,4250;Kobayashi,H.;Chem.Res.2010,44,83;Lovell,J.F.,Chem.Rev.2010,110,2839;Ueno,T.,Nat.Methods 2011,8,642)。在这些刺激中,pH作为一个重要的生理学参数尤为突出,其在细胞内(pHi)环境和细胞外(pHe)环境二者中都起着关键作用(Alberts,B.,Molecular Biology of the Cell;第5版;GarlandScience:New York,2008)。例如,真核细胞中细胞内区室(例如胞吞小泡)的pH受到小心控制,并且直接影响许多过程,例如膜转运、受体循环、溶酶体降解以及病毒进入细胞(Maxfield,F. R.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004,5,121;Izumi,H.,Cancer Treat.Rev.2003,29,541;Nishi,T.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2002,3,94)。最近,异常调节的(desregulated)pH被认为是癌症的另一个特点,因为癌细胞表现出“逆转的”pH梯度,具有高于细胞外pH(pHe)之组成型升高的胞质pH(Webb,B.A.,Nat.Rev.Cancer 2011,11,671)。
虽然已报道了多种pH敏感性荧光探针(Kobayashi,H.,Chem.Rev.2010,110,2620;Han,J.Y.,Chem.Rev.2010,110,2709),但是其pH灵敏性主要来源于对荧光团具有pH依赖性的光诱导电子转移(PeT)性质的可电离残基。这些荧光剂的一个潜在缺点是其宽的pH响应(ΔpH~2),如Henderson-Hasselbalch方程所述(Atkins,P.,Physical Chemistry;Oxford University Press,2009)。这种敏锐的pH响应缺乏使其难以检测酸性胞内细胞器之间的细微pH差异(例如,早期内体与溶酶体之间<1的pH差异)(Maxfield,F.R.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004,5,121;Casey,J.R.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2010,11,50)或者实体瘤中的pHe(6.5-6.9)(Webb,B.A.,Nat.Rev.Cancer 2011,11,671;Zhang,X.,J.Nucl. Med.2010,51,1167.)相对于正常组织环境(7.4)的差异。此外,对于小分子染料来说,同时控制pH转变点和发射波长(特别是在近IR的范围内)是困难的。最近对开发pH敏感性荧光纳米颗粒的尝试主要采用与小分子pH敏感性染料缀合的聚合物(Srikun,D.,J.Chem.Sci. 2011,2,1156;Benjaminsen,R.V.,ACS Nano 2011,5,5864;Albertazzi,L.,J.Am.Chem.Soc.2010,132,18158;Urano,Y.,Nat.Med. 2009,15,104),或者使用pH敏感性接头与pH不敏感的染料缀合(Li,C.,Adv.Funct.Mater.2010,20,2222;Almutairi,A.,J.Am.Chem.Soc.2007,130,444.)。这些纳米探针设计也产生了宽的pH响应并且缺乏微调pH转变点的能力。
发明内容
本发明的多个实施方案提供了pH可调的、可高度激活的多色荧光纳米平台,以及在多个应用中使用所述纳米平台的方法,所述应用包括但不限于,研究基本的细胞生理学过程,例如胞吞小泡中的pH调节、内体/溶酶体成熟,以及pH对受体循环和亚细胞器运输的影响。
在一个实施方案中,本发明提供了pH响应系统,其包含:第一纳米颗粒群,其中所述第一纳米颗粒包含(i)含有亲水聚合物区段和疏水聚合物区段的第一嵌段共聚物以及(ii)第一荧光染料,并且,其中所述第一纳米颗粒具有第一pH转变点和第一发射光谱。在一些实施方案中,所述pH响应系统还包含第二纳米颗粒群,其中所述第二纳米颗粒包含(i)含有亲水聚合物区段和疏水聚合物区段的第二嵌段共聚物以及(ii)第二荧光染料,并且,其中所述第二纳米颗粒具有与所述第一纳米颗粒的第一pH转变点不同的第二pH转变点,以及与所述第一纳米颗粒的第一发射光谱不同的第二发射光谱。在本发明的某些方面中,所述pH响应系统还包含至少第三纳米颗粒群,其中第三纳米颗粒包含(i)含有亲水聚合物区段和疏水聚合物区段的第三嵌段共聚物以及(ii)第三荧光染料,并且,其中所述第三纳米颗粒具有与所述第一纳米颗粒和所述第二纳米颗粒的pH转变点不同的第三pH转变点,以及与所述第一纳米颗粒和所述第二纳米颗粒的发射光谱不同的第三发射光谱。在一些实施方案中,所述pH响应的系统还包含至少第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多纳米颗粒群。这些第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多纳米颗粒各自将具有与所述系统中其他纳米颗粒群的pH转变点不同的pH转变点,以及与所述系统中其他纳米颗粒群的发射光谱不同的发射光谱。
嵌段共聚物的亲水聚合物区段可为任意合适的亲水聚合物。这样的亲水聚合物的实例包括但不限于:聚(氧化乙烯)(PEO)、聚(甲基丙烯酸磷脂酰胆碱)(MPC)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
嵌段共聚物的疏水聚合物区段可为任意合适的疏水聚合物。这样的疏水聚合物的实例包含聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(PDPA)、聚(2-(二丁基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(PDBA)、聚(2-(六亚甲基亚氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(PC7A)、聚(2-(五亚甲基亚氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(PC6A),以及PCT/US2011/00148或PCT/US2011/047497中公开的亲水聚合物。
如上所述,所述纳米颗粒包含嵌段共聚物和荧光染料。在本发明的某些方面中,所述纳米颗粒通过使前体共聚物(precursor copolymer)与疏水单体(例如,DPA、DBA、C7A、C6A)以及包含伯氨基团的单体如2-氨基乙基甲基丙烯酸酯(AMA)反应来合成。前体共聚物的实例包括但不限于:PEO114-b-P(DPA75-co-AMA6)、MAL-PEO114-b-PDPA88、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA6)、PEO114-b-P(DPA74-co-AMA1)、PEO114-b-P(DPA77-co-AMA3)、PEO114-b-P(DPA80-co-AMA6)、PEO114-b-P(DBA65-co-AMA3)、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA3)和PEO114-b-P(C6A81-co-AMA3)。在某些实施方案中,AMA上的自由氨基可与荧光染料分子缀合。
本文采用的嵌段共聚物可为均聚物或杂聚物(heteropolymer)。均聚物可通过一种类型的单体亚单元聚合来制备。杂聚物可通过对至少两种不同的单体亚单元聚合来制备。如下文所示,使多种比例的具有不同疏水性的两种或更多种单体共聚使得其能够进一步微调本文所公开的系统、纳米颗粒和胶束的pH响应。
荧光染料的非限制性实例包括罗丹明、香豆素和花菁(cyanine)染料。荧光染料的另一些非限制性实例包括:红色荧光方酸菁染料(squarine dye)例如2,4-双[1,3,3-三甲基-2-亚二氢吲哚基甲基]环丁烯二基鎓-1,3-二氧代物、红外染料例如2,4-双[3,3-二甲基-2-(1H-苯并[e]亚二氢吲哚基甲基)]环丁烯二基鎓-1,3-二氧代物、或者橙色荧光方酸菁染料例如2,4-双[3,5-二甲基-2-吡咯基]环丁烯二基鎓-1,3-二氧代物、量子点、Alexa染料、AMCA、 CascadeCyDyeTM(包括但不限于Cy2TM、Cy3TM和Cy5TM)、6-FAMTM、荧光素、HEXTM、6-JOE、OregonOregonOregonPacific BlueTM、REG、藻胆蛋白(包括但不限于藻红蛋白和别藻蓝蛋白)、Rhodamine GreenTM、RhodamineRedTM、ROXTM、TAMRATM、TETTM、四甲基罗丹明或Texas
在本发明的某些方面中,荧光染料是pH不敏感的荧光染料。在一些实施方案中,荧光染料具有小的斯托克斯位移(Stokes shift)。在一些具体的实施方案中,斯托克斯位移为Δλ<40nm。
在一些实施方案中,纳米颗粒选自PDBA-BDY、PDPA-TMR、PDPA-C55、PC7A-C55、PC6A-C75和PDPA-CMN。如下文中更详细描述的,“BDY”是指染料,“TMR”是指罗丹明染料,“C55”和“C75”是指花菁染料,并且“CMN”是指香豆素染料。在一些特定的实施方案中,所述pH响应系统包含PDBA-BDY、PDPA-TMR、PC7A-C55、PC6A-C75和PDPA-CMN中的至少两种、三种或全部四种。如在下文中详细讨论的,所述纳米颗粒根据其环境的pH可为单体形式或胶束形式。
pH响应系统可包含具有处于任何期望pH范围中之pH转变点的纳米颗粒。在一些具体的实施方案中,所述系统包含两个或更多个纳米颗粒群,其中,每个纳米颗粒群的pH转变点为pH 2.0至pH 11.0、pH 4.0至pH 9.0、pH 4.8至pH 8.4、pH 5.0至pH 8.0、pH 5.0至pH 7.4、pH 5.2至pH 7.2、pH 5.7至pH 6.9、pH 5.7至pH 6.5或pH 6.4至pH 8.4。在一个实施方案中,所述系统包含至少四个纳米颗粒群,其pH转变点为约pH 5.2、6.4、6.9和7.2。在另一个实施方案中,所述系统包含至少四个纳米颗粒群,其pH转变点为约pH 5.7、5.94、6.18和6.42。在另一些实施方案中,所述系统包含至少两个纳米颗粒群,其pH转变点为约pH 6.21和pH 6.9。
pH响应系统是可高度激活的。在本发明的某些方面中,所述系统中纳米颗粒的pH响应(ΔpH10-90%)小于2个pH单位、小于1.5个pH单位、小于1个pH单位、小于0.75个pH单位、小于0.5个pH单位或小于0.25个pH单位。
pH响应系统可包含具有在任何期望范围内的荧光发射光谱的纳米颗粒。在本发明的某些方面中,所述纳米颗粒的荧光发射光谱为400nm至850nm、500nm至820nm或506nm至808nm。在一个实施方案中,所述系统包含至少四个纳米颗粒群,其发射光谱为506nm、580nm、707nm和808nm。
在一些实施方案中,纳米颗粒还包含靶向部分(targetng moiety)。在一些实施方案中,靶向部分是抗体或抗体片段。在一些实施方案中,抗体是西妥昔单抗。在另一些实施方案中,抗体片段是西妥昔单抗的Fab′片段。在另一些实施方案中,靶向部分结合细胞表面受体。在另一些实施方案中,靶向部分是信号肽。在一些实施方案中,信号肽是环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(cRGD)肽。在一些实施方案中,信号肽将纳米颗粒导引至细胞核、线粒体、内质网、叶绿体、质外体或过氧化物酶体。在另一些实施方案中,靶向部分是小分子。在一些实施方案中,小分子是叶酸。
在另一些实施方案中,本发明包括含有单一纳米颗粒的pH响应系统,所述单一纳米颗粒具有嵌段共聚物和荧光染料,并且,其中所述纳米颗粒群具有如上文所述的pH转变点和发射光谱。在一些实施方案中,单一纳米颗粒还包含靶向部分。
在某些实施方案中,纳米平台利用在生理学范围(pH 5.0至7.4)内具有可调pH转变之超pH响应的基于四甲基罗丹明(TMR)的纳米颗粒。pH响应纳米颗粒的pH诱导的胶束化可与荧光淬灭结合使用,从而提供pH响应的荧光纳米颗粒。例如,在一个实施方案中,一系列多色的pH可激活荧光纳米颗粒提供了对发射波长(500nm至820nm)和pH转变点(5.0至7.4)的独立控制。在特别的实施方案中,具有不同发射波长的纳米颗粒具有敏锐的pH响应(打开/关闭状态之间的ΔpH<0.25)。
在另一个实施方案中,本发明提供了包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个纳米颗粒群之系列的组合物,每个纳米颗粒群具有pH转变点和发射光谱,其中所述系列中每一纳米颗粒群的pH转变点和发射光谱与系列中其他纳米颗粒群的pH转变点和发射光谱不同。所述纳米颗粒包含嵌段共聚物和荧光染料。在一个实施方案中,所述系列中纳米颗粒群的至少一种包含PDBA-BDY、PDPA-TMR、PDPA-C55、PC7A-C55、PC6A-C75或PDPA-CMN。在另一个实施方案中,所述系列包含PDBA-BDY纳米颗粒群、PDPA-TMR纳米颗粒群和PC7A-C55纳米颗粒群。在一些实施方案中,纳米颗粒群包含含有约10%马来酰亚胺的共聚物。如下文中详细讨论的,纳米颗粒根据其环境的pH可为单体形式或胶束形式。
所述系列中的纳米颗粒包含嵌段共聚物和荧光染料。在本发明的某些方面中,所述纳米颗粒通过使前体共聚物与包含荧光染料的化合物反应来合成。前体共聚物的实例包括但不限于:PEO114-b-P(DPA75-co-AMA6)、MAL-PEO114-b-PDPA88、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA6)、PEO114-b-P(DPA74-co-AMA1)、PEO114-b-P(DPA77-co-AMA3)、PEO114-b-P(DPA80-co-AMA6)、PEO114-b-P(DBA65-co-AMA3)、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA3)和PEO114-b-P(C6A81-co-AMA3)。
在一些实施方案中,纳米颗粒由包含以下的共聚物或其可药用盐,及其立体异构体、同位素变体和互变异构体来合成:
a)根据下式的聚合物:
b)根据式A1的单体;以及
c)根据式A2的单体;
其中
A1和A2各自独立地选自
R1a各自独立地为H、经取代的或未经取代的烷基,或者
R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d和R5各自独立地为H或者经取代的或未经取代的烷基;
R6a和R6b各自独立地为经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的芳基或者经取代的或未经取代的杂芳基;或者R6a和R6b与其所连接的N原子一起形成杂环;
R7是包含染料的部分;
下标n为10至200的整数;
并且其中所述共聚物是无规共聚物(random copolymer)。
在一些实施方案中,A1具有式:在一些实施方案中,A2具有式:
在本发明的某些方面中,荧光染料是pH不敏感的荧光染料。在一些实施方案中,荧光染料具有小的斯托克斯位移。在一些特别的实施方案中,斯托克斯位移为Δλ<40nm。
纳米颗粒群系列可包含在任何期望pH范围中具有pH转变点的纳米颗粒。在一些特别的实施方案中,所述系列包含两个或更多个纳米颗粒群,其中,每一纳米颗粒群的pH转变点为pH 2.0至pH 11.0、pH 4.0至pH 9.0、pH 4.8至pH 8.4、pH 5.0至pH 8.0、pH 5.0至pH 7.4、pH 5.2至pH 7.2、pH 5.7至pH 6.9、pH 5.7至pH 6.5或pH 6.4至pH 8.4。在一个实施方案中,所述组合物包含至少四个纳米颗粒群,其pH转变点为约pH 5.2、6.4、6.9和7.2。在另一个实施方案中,所述组合物包含至少四个纳米颗粒群,其pH转变点为约pH 5.7、5.94、6.18和6.42。在另一个实施方案中,所述组合物包含至少两个纳米颗粒群,其pH转变点为约pH 6.21和pH 6.9。
在本发明的某些方面中,所述系列中纳米颗粒的pH响应(ΔpH10-90%)小于2个pH单位、小于1.5个pH单位、小于1个pH单位、小于0.75个pH单位、小于0.5个pH单位或小于0.25个pH单位。
纳米颗粒群系列可包含具有任何期望范围中之荧光发射光谱的纳米颗粒。在本发明的某些方面中,纳米颗粒的荧光发射光谱为400nm至850nm、500nm至820nm或506nm至808nm。在一个实施方案中,所述系统包含至少四个纳米颗粒群,其发射光谱为506nm、580nm、707nm和808nm。
在本发明的另一方面中,存在还包含单一纳米颗粒的组合物,所述单一纳米颗粒具有共聚物和荧光染料,并且,其中所述纳米颗粒群具有pH转变点和发射光谱。在一些实施方案中,所述单一纳米颗粒还包含靶向部分。
另一个实施方案提供了包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个胶束群的组合物,其中每个胶束都包含嵌段共聚物和荧光染料,并且,其中每一胶束群具有与其他胶束群的pH转变点和荧光染料不同的pH转变点和荧光染料。如在下文中详细讨论的,荧光染料被胶束淬灭。因此,胶束的解离(disassociation)导致荧光强度提高。在本发明的某些方面中,荧光染料是pH不敏感的荧光染料。在一些实施方案中,荧光染料具有小的斯托克斯位移。在一些特别的实施方案中,斯托克斯位移为Δλ<40nm。在一个实施方案中,至少一个胶束群包含PDBA-BDY、PDPA-TMR、PDPA-C55、PC7A-C55、PC6A-C75或PDPA-CMN。在另一个实施方案中,所述组合物包含PDBA-BDY胶束群、PDPA-TMR胶束群和PC7A-C55胶束群。在本发明的某些方面中,所述胶束群由选自以下的前体共聚物合成:PEO114-b-P(DPA75-co-AMA6)、MAL-PEO114-b-PDPA88、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA6)、PEO114-b-P(DPA74-co-AMA1)、PEO114-b-P(DPA77-co-AMA3)、PEO114-b-P(DPA80-co-AMA6)、PEO114-b-P(DBA65-co-AMA3)、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA3)和PEO114-b-P(C6A81-co-AMA3)。
胶束群可在任何期望的pH范围中具有pH转变点。在一些特别的实施方案中,所述组合物包含两个或更多个胶束群,其中,每个胶束群的pH转变点为pH 2.0至pH 11.0、pH 4.0至pH 9.0、pH 4.8至pH 8.4、pH5.0至pH 8.0、pH 5.0至pH 7.4、pH 5.2至pH 7.2、pH 5.7至pH 6.9、pH5.7至pH 6.5或pH 6.4至pH 8.4。在一个实施方案中,所述组合物包含至少四个胶束群,其pH转变点为约pH 5.2、6.4、6.9和7.2。在另一个实施方案中,所述组合物包含至少四个胶束群,其pH转变点为约pH 5.7、5.94、6.18和6.42。在本发明的某些方面中,所述组合物中胶束的pH响应(ΔpH10-90%)小于2个pH单位、小于1.5个pH单位、小于1个pH单位、小于0.75个pH单位、小于0.5个pH单位或小于0.25个pH单位。
本文所公开的任何纳米颗粒或胶束还可包含靶向部分。所述靶向部分可用于使纳米颗粒或胶束靶向或结合例如特定的细胞表面受体(例如,αvβ3整联蛋白、EGFR、Her2/neu)或细胞器(例如,细胞核、线粒体、内质网、叶绿体、质外体或过氧化物酶体)。所述靶向部分可为例如抗体或抗体片段、蛋白质、肽(例如信号肽)、拟肽配体(peptidomimetic ligand)、碳水化合物、适配体或小分子。在一些实施方案中,所述抗体是西妥昔单抗。在一些实施方案中,所述抗体片段是西妥昔单抗的Fab′片段。在一些实施方案中,所述信号肽是cRGD肽。在一些实施方案中,信号肽将纳米颗粒导引至细胞核、线粒体、内质网、叶绿体、质外体或过氧化物酶体。在一些实施方案中,所述小分子是叶酸。
在一些实施方案中,胶束群还包含杂合胶束群(hybrid micellepopulation),其中所述胶束包含多于一种的嵌段共聚物和多于一种的荧光染料,并且,其中所述胶束群具有多于一个的pH转变点和对每个pH转变点不同的发射光谱。
在一些方面中,本发明提供了含有共聚物和荧光染料的单一胶束,并且,其中所述胶束群具有pH转变点和发射光谱。在一些实施方案中,所述单一胶束还包含靶向部分。
在一个实施方案中,本发明提供了监测细胞内pH的方法,其包括:(a)使细胞与如上所讨论的pH响应系统或组合物接触;以及(b)检测所述细胞中的一种或更多种荧光信号,其中检测到荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离。在某些实施方案中,所述方法还包括:(c)使所述细胞与目的化合物接触;(d)检测所述细胞中的一种或更多种荧光信号以及(e)确定在所述细胞与目的化合物接触之后,细胞中的一种或更多种荧光信号是否发生变化。目的化合物可为目的可在于能够影响细胞pH的任何化合物。所述目的化合物可为例如药物、肽、蛋白质、核酸或小分子。
另一个实施方案提供了监测小泡运输(vesicular trafficking)的方法,其包括:(a)使细胞与包含至少第一胶束群和第二胶束群的组合物在使所述细胞通过胞吞摄取所述组合物的条件下接触,其中所述第一胶束群具有第一pH转变点和第一荧光染料,并且所述第二胶束群具有第二pH转变点和第二荧光染料,并且,其中所述第一pH转变点和所述第二pH转变点不同并且所述第一荧光染料和所述第二荧光染料不同;(b)检测所述细胞中与所述第一和/或第二荧光染料的荧光发射光谱相对应的第一和/或第二荧光信号,其中检测到所述第一荧光信号指示第一胶束群到达了其pH转变点并解离,并且检测到所述第二荧光信号指示第二胶束群已达到其pH转变点并解离;以及(c)确定当胞吞的胶束群基于胶束的pH转变点解离时其处于哪个区室中。在某些实施方案中,所述方法还包括确定细胞中荧光信号的分布。
另一个实施方案提供了监测小泡运输的方法,其包括:(a)使细胞与包含至少第一、第二和第三胶束群的组合物在使所述细胞通过胞吞摄取所述组合物的条件下接触,其中每一胶束包含嵌段共聚物和荧光染料,并且,其中所述第一胶束群具有约pH6.3至7.4的pH转变点和第一荧光发射光谱,所述第二胶束群具有约pH 5.9至6.2的pH转变点和第二荧光发射光谱,并且所述第三胶束群具有约pH 5.0至5.8的pH转变点和第三荧光发射光谱;(b)检测对应于所述第一、第二和第三荧光发射光谱的第一、第二和第三荧光信号,其中检测到所述第一、第二和第三荧光信号指示包含对应荧光染料的胶束已到达其pH转变点并解离;以及(c)确定当检测到所述第一荧光信号时小泡(vesicle)是早期内体,确定当检测到所述第二荧光信号时小泡是晚期内体/溶酶体,并且确定当检测到所述第三荧光信号时小泡是溶酶体。在某些实施方案中,所述方法还包括确定细胞中荧光信号的空间分布。
在另一个实施方案中,本发明提供了监测细胞受体循环(receptorcycling)的方法,其包括:(a)使细胞与包含至少第一和第二胶束群的组合物接触,其中每个胶束均包含嵌段共聚物、荧光染料和受体结合部分,并且,其中所述第一胶束群具有第一pH转变点和第一荧光发射光谱,并且所述第二胶束群具有与所述第一pH转变点和所述第一发射光谱不同的第二pH转变点和第二荧光发射光谱;(b)检测所述细胞中或其表面上的对应于至少第一和/或第二荧光发射光谱的至少第一和/或第二荧光信号,其中检测到所述第一和/或第二荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离;以及(c)确定所述至少第一和/或第二荧光信号在细胞中或细胞表面上的分布。在一些实施方案中,所述方法还包括具有与第一和第二pH转变点和发射光谱不同之第三pH转变点和第三荧光发射光谱的第三胶束群。
另一个实施方案提供了监测内体pH的方法,其包括:(a)使内体与包含至少第一和第二胶束群的组合物在使所述内体摄取所述组合物的条件下接触,其中每个胶束均包含嵌段共聚物和荧光染料,并且,其中所述第一胶束群具有约pH 5.7至6.3的pH转变点和第一荧光发射光谱,所述第二胶束群具有约pH 5.7至6.3的pH转变点和第二荧光发射光谱,其中所述第一和第二胶束群具有不同的pH转变点和不同的荧光发射光谱;(b)检测所述内体中对应于所述第一和第二荧光发射光谱的第一和第二荧光信号中的至少一种,其中检测到所述第一和/或第二荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离;以及(c)确定所述内体的pH或pH范围。在一些实施方案中,所述方法还包括使内体与至少第三和第四胶束群接触。在某些方面中,所述第一胶束群具有约pH 5.7的pH转变点,所述第二胶束群具有约pH 5.94的pH转变点,所述第三胶束具有约pH6.18的pH转变点,并且所述第四胶束群具有约pH6.42的pH转变点。
另一些实施方案提供了测量胞外pH的方法,其包括:(a)使一组细胞或其胞外环境与上述pH响应系统或组合物接触;以及(b)检测所述细胞组中的荧光信号,其中检测到荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离。在一些实施方案中,所述方法还包括检测细胞组或其胞外环境中荧光信号的空间取向。在一些实施方案中,所述方法还包括:(a)使细胞或其胞外环境与目的化合物接触;(b)检测所述细胞中和所述细胞周围的一种或更多种荧光信号;以及(c)确定在所述细胞与目的化合物接触后细胞中及细胞周围的所述一种或更多种荧光信号是否发生变化。在一些实施方案中,目的化合物是药物。在另一些实施方案中,目的化合物是抗体、肽、蛋白质、核酸或小分子。在一些实施方案中,细胞或细胞组或其胞外环境是癌细胞或癌细胞组或其胞外环境、具有溶酶体贮积缺陷的细胞或细胞组或其胞外环境、缺陷的神经细胞或神经细胞组或其胞外环境、涉及炎症的细胞或细胞组或其胞外环境、涉及感染的细胞或细胞组或其胞外环境、涉及伤口愈合的细胞或细胞组或其胞外环境、涉及缺氧的细胞或细胞组或其胞外环境、涉及辐射损伤的细胞或细胞组或其胞外环境、涉及创伤的细胞或细胞组或其胞外环境或者涉及低氧血症的细胞或细胞组或其胞外环境。
另一个实施方案提供了对血管生成性肿瘤血管系统(angiogenictumor vasculature)进行成像的方法,其包括:(a)使肿瘤血管系统与上述包含至少两个上述胶束群的组合物接触,其中每个胶束均包含嵌段共聚物和荧光染料,并且,其中所述第一胶束群具有约pH 6.5至7.4的pH转变点和第一荧光发射光谱,所述第二胶束群具有约pH 5.9至6.4的pH转变点和第二荧光发射光谱,以及(b)检测所述肿瘤血管系统中对应于所述第一和第二荧光发射光谱的第一和第二荧光信号,其中检测到所述第一和第二荧光信号指示所述包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离。在一些实施方案中,所述方法还包括确定肿瘤血管系统中荧光信号的空间取向和分布。在一些实施方案中,所述方法还包括具有靶向部分的胶束。在一些实施方案中,所述靶向部分是cRGD肽。
另一个实施方案是对循环肿瘤细胞进行成像的方法,其包括:(a)使淋巴管(lymphatic channel)或血流中的循环肿瘤细胞与包含上述pH响应系统或组合物的组合物接触,其中胶束包含嵌段共聚物和荧光染料,并且具有约pH 5.9至6.4的pH转变点,以及(b)检测所述循环肿瘤细胞中的荧光信号,其中检测到荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离。在一些实施方案中,所述方法还包括确定淋巴系统或血流中循环肿瘤细胞荧光信号的空间取向和分布。在一些实施方案中,所述方法还包括具有靶向部分的胶束。在一些实施方案中,所述靶向部分是抗体片段。在一些实施方案中,所述抗体片段是西妥昔单抗的片段。
另一些实施方案提供了对肿瘤进行成像的方法,其包括:(a)使肿瘤与上述包含至少两个胶束群的组合物接触,其中每个胶束均包含嵌段共聚物和荧光染料,并且,其中第一胶束群具有约pH 6.5至7.4的pH转变点和第一荧光发射光谱,第二胶束群具有约pH 5.9至6.4的pH转变点和第二荧光发射光谱,以及(b)检测所述肿瘤中对应于所述第一和第二荧光发射光谱的第一和第二荧光信号,其中检测到所述第一和第二荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离。在一些实施方案中,所述方法还包括确定肿瘤中荧光信号的空间取向和分布。在一些实施方案中,所述方法还包括具有靶向部分的胶束。在一些实施方案中,所述靶向部分是抗体片段。在一些实施方案中,所述抗体片段是西妥昔单抗的片段。在另一些实施方案中,所述靶向部分是小分子。在一些实施方案中,所述小分子是叶酸。
另一个实施方案提供了对转移至原发性肿瘤局部区域中的淋巴结的肿瘤进行成像的方法,其包括:(a)使肿瘤与上述包含至少两个胶束群的组合物接触,其中每个胶束均包含嵌段共聚物和荧光染料,并且,其中第一胶束群具有约pH 6.5至7.4的pH转变点和第一荧光发射光谱,第二胶束群具有约pH 5.9至6.4的pH转变点和第二荧光发射光谱,以及(b)检测所述肿瘤中对应于所述第一和第二荧光发射光谱的第一和第二荧光信号,其中检测到所述第一和第二荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离。在一些实施方案中,所述方法还包括确定肿瘤中荧光信号的空间取向和分布。在一些实施方案中,所述方法还包括具有靶向部分的胶束。在一些实施方案中,所述靶向部分是抗体片段。在一些实施方案中,所述抗体片段是西妥昔单抗的片段。在另一些实施方案中,所述靶向部分是小分子。在一些实施方案中,所述小分子是叶酸。
另一个实施方案提供了对肿瘤的前哨淋巴结(sentinel node)进行成像的方法,其包括:(a)使肿瘤与上述包含至少两个胶束群的组合物接触,其中每个胶束均包含嵌段共聚物和荧光染料,并且,其中第一胶束群具有约pH 6.5至7.4的pH转变点和第一荧光发射光谱,第二胶束群具有约pH 5.9至6.4的pH转变点和第二荧光发射光谱,以及(b)检测所述肿瘤中对应于所述第一和第二荧光发射光谱的第一和第二荧光信号,其中检测到所述第一和第二荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离。(c)使包含荧光信号的所述胶束的解离部分进入流出肿瘤的淋巴脉管系统(lymphatic vasculature)中,并沿着淋巴脉管系统运动穿过淋巴脉管系统至淋巴结。(d)沿着所述淋巴脉管系统检测淋巴淋巴脉管系统和淋巴结中对应于所述第一和第二荧光发射光谱的第一和第二荧光信号,其中检测到所述第一和第二荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并在原发性肿瘤中解离,并且已沿着淋巴脉管系统运动至淋巴脉管系统和淋巴结。在一些实施方案中,所述方法还包括确定肿瘤中荧光信号的空间取向和分布。在一些实施方案中,所述方法还包括具有靶向部分的胶束。在一些实施方案中,所述靶向部分是抗体片段。在一些实施方案中,所述抗体片段是西妥昔单抗的片段。在另一些实施方案中,所述靶向部分是小分子。在一些实施方案中,所述小分子是叶酸。
在本文所述的任意方法中,荧光信号可在某一时间段中检测一次或多于一次。此外,荧光信号的分布可在某一时间段中确定一次或多于一次。所述时间段可为数分钟、数小时或数天。在一些实施方案中,在0至12小时或1小时至12小时的时间段中检测荧光信号。在一些实施方案中,在0至12小时或1小时至12小时的时间段中确定荧光信号的分布。荧光信号的检测可为连续的或间歇的。
在本文所述的任意方法中,检测一种或更多种荧光信号的步骤可重复两次或更多次。在本发明的某些方面中,检测步骤重复至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20或更多次。
除监测细胞内或细胞器内的pH之外,本文公开的方法和组合物还可用于检测和/或监测胞外pH或流体中的pH。例如,已知肿瘤具有比健康组织的胞外环境酸性更大的胞外环境。因此,本文公开的方法和组合物可用于例如鉴定肿瘤边缘而用于病理学、诊断性或图像引导(image-guided)的外科应用。在某些方面中,添加靶向部分还可增强对相关细胞或组织的标记。此外,通过使用pH响应胶束系列可实现健康组织与病变组织之间的更大对比,因为所述pH响应胶束系列将根据pH和/或靶向部分差异化地标记这些组织。另外,pH响应胶束系列可用于将不同的化合物(例如药物)递送至健康组织和病变组织,因为所述pH响应胶束系列将根据pH和/或靶向部分在健康组织相对于病变组织中差异化地解离。因此,例如,胶束系列可用于将化学治疗药物或放射增敏药物递送至癌细胞,而将抢救药物(rescue drug)递送至健康细胞。胶束系列的荧光标记可用于指示药物于何时及何处从所述胶束中释放。
在另一个实施方案中,本发明提供了包含以下的共聚物或其可药用盐,及其立体异构体、同位素变体和互变异构体:
a)根据下式的聚合物,
b)根据式A1的单体;以及
c)根据式A2的单体;
其中
A1和A2各自独立地选自
R1a各自独立地为H、经取代的或未经取代的烷基,或者
R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d和R5各自独立地为H或者经取代的或未经取代的烷基;
R6a和R6b各自独立地为经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的芳基或者经取代的或未经取代的杂芳基;或者R6a和R6b与其所连接的N原子一起形成杂环;
R7是包含染料的部分;
下标n为10至200的整数;
并且其中共聚物是无规共聚物,前提是明确地排除Zhou,K.,Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,6109-6114、PCT/US2011/00148以及PCT/US2011/047497中公开的共聚物。
在另一个实施方案中,本发明提供了根据式I的共聚物或其可药用盐,及其立体异构体、同位素变体和互变异构体:
其中
A1和A2各自独立地选自
前提是A1和A2二者在同一时刻是不同的;
R1a各自独立地为H、经取代的或未经取代的烷基,或者
R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d和R5各自独立地为H或者经取代的或未经取代的烷基;
R1b为H、经取代的或未经取代的烷基、Br或S-R;
R6a和R6b各自独立地为经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的芳基或者经取代的或未经取代的杂芳基;或者R6a和R6b与其所连接的N原子一起形成杂环;
R7是包含染料的部分;
下标n是10至200的整数;下标x是1至200的整数;并且下标y是1至200的整数;
并且其中r代表共聚物是无规共聚物的形式,前提条件是明确地排除Zhou,K.,Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,6109-6114、PCT/US2011/00148以及PCT/US2011/047497中公开的共聚物。
本文公开的方法可用于任何目的细胞。在某些实施方案中,所述细胞是癌细胞、溶酶体贮积缺陷的细胞或有缺陷的神经细胞。在一些实施方案中,所述细胞可为组织样品中的细胞。例如,纳米平台可用于划分肿瘤组织和正常组织的边界而用于进行图像引导的外科切除和/或外科切除后肿瘤边缘的分析。在一些实施方案中,可采用靶向部分将胶束导引至肿瘤细胞或正常细胞。或者,细胞内或细胞外基质的pH差异可用来使用本文公开的pH响应纳米平台区分肿瘤组织与正常组织。
在本发明的一些实施方案中,设想pH响应系统、组合物或方法可使用所设想的纳米颗粒或胶束中的仅一种而非所述的两种或更多种纳米颗粒或胶束来实现。在一些实施方案中,还设想纳米颗粒或胶束中的每一种可用作如实施例中所述的杂合纳米颗粒或胶束。在一些实施方案中,还设想纳米颗粒中的每一种可为按顺序的(sequentially)。
本文所用的“pH响应胶束”、“pH敏感胶束”、“pH可激活胶束”和“pH可激活胶束(pHAM)纳米颗粒”在本文中可互换使用,以表示包含一种或更多种嵌段共聚物的胶束,其根据pH(例如高于或低于某一pH)而解离。作为一种非限制性实例,在某一pH下,所述嵌段共聚物基本处于胶束形式。随着pH变化(例如降低),胶束开始解离,并且随着pH进一步变化(例如进一步降低),嵌段共聚物基本以解离(非胶束)的形式存在。
本文所用的“pH转变范围”表示胶束解离的pH范围。
本文所用的“pH转变值”(pHt)表示一半胶束发生解离时的pH。
预期本文描述的任何方法或组合物可对于本文描述的任何其他方法或组合物进行实施。
术语“包含(comprise)”(以及其任意形式,例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”)、“具有(have)”(以及其任意形式,例如“具有(has)”和“具有(having)”)、“含有(contain)”(以及其任意形式,例如“含有(contains)”和“含有(containing)”)和“包括(include)”(以及其任意形式,例如“包括(includes)”和“包括(including)”)是开放式连接动词。因此,“包含”、“具有”、“含有”或“包括”一个或更多个所列举步骤或要素的方法、组合物、试剂盒或系统拥有这些所列举步骤或要素,但不限于仅拥有这些步骤或要素;其可拥有(即,涵盖)未列举的要素或步骤。同样地,“包含”、“具有”、“含有”或“包括”一个或更多个所列举特征的方法、组合物、试剂盒或系统拥有这些特征,但不限于仅拥有这些特征;其可拥有未列举的特征。
本发明任何方法、组合物、试剂盒和系统中的任意实施方案可由所述步骤和/或特征组成或本质上由其组成(consist essentially of),而非包含/包括/含有/具有所述步骤和/或特征。因此,在任何权利要求中,术语“由......组成”或“本质上由......组成”可替换为上文中列举的任何开放式连接动词,以改变本应使用开放式连接动词的给定权利要求的范围。
除非明确表明仅指替代方案或者替代方案是互斥的,否则权利要求中所用的术语“或”用来意指“和/或”,但是本公开内容支持仅指替代方案和“和/或”的定义。
贯穿本申请,术语“约”用来表示值包括用于确定该值的装置或方法的误差的标准差。
根据长期实行(long-standing)的专利法,当在权利要求书或说明书中无数量词修饰的词语与词语“包含/包括”结合使用时,除非另有注明,否则表示一个/种或更多个/种。
通过以下的详细描述,本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而,应理解,该详细描述和具体实施例(表示本发明的一些具体实施方案)仅通过举例说明的方式给出,因为通过该详细描述,本发明精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得明显。
附图说明
以下附图构成了本说明书的一部分,并且包括在内以进一步证明本发明的某些方面。通过参照这些附图中的一幅或更多幅并结合本文示出之具体实施方案的详细描述,可更好地理解本发明。
图1.用于开发pH可激活纳米颗粒的三种可能的光化学机制的示意图:H-二聚体形成、homo共振能量转移(homo-FRET)以及光诱导的电子转移(PeT)。
图2A至2D.(图2A)PDPA-TMR纳米探针(200μg/mL)的超pH响应性质,其中在6.2至6.6的pH范围中观察到荧光激活。在545nm处激发样品,并从550nm至750nm收集发射光谱。(图2B)对于PDPA-TMR的pH的归一化荧光强度函数。在Maestro仪器上采集在pH 5.5和pH 7.4下PDPA-TMR水溶液(100μg/mL)的嵌入(inset)荧光图像。使用0.02M NaOH水溶液通过对PDPA-TMR进行pH滴定获得数目加权的流体动力学半径<Rh>的pH依赖性。(图2C)PDPA-TMR中叔氨基的摩尔分数与pH的函数。指示了来自图2B的荧光转变点(pHt)以及PDPA-TMR共聚物的表观pKa。(图2D)在不同的聚合物浓度下,不同pH的PDPA-TMR样品相对于pH 7.4的荧光强度比。
图3.PDPA-TMR1、PDPA-TMR3、PDPA-TMR6、PDPA-CMN、PDPA-BDY、PDPA-PPO的化学结构及其相应的荧光性质。
图4A至4D.(图4A)不同pH的PDPA-TMR1水溶液、PDPA-TMR3水溶液和PDPA-TMR6水溶液相对于pH 7.4的荧光强度比的pH依赖性。共聚物浓度为200μg/mL并且在580nm处测量到最大发射强度。(图4B)pH 7.4和pH 5.5的水溶液中PDPA-TMR1、PDPA-TMR3和PDPA-TMR6归一化至单体峰值强度的UV-Vis吸收光谱。共聚物浓度为200μg/mL并且游离TMR染料浓度为1.0μg/mL。(图4C)pH 5.5与pH 7.4的荧光强度比分别与PDPA-TMR1、PDPA-TMR3和PDPA-TMR6相对于其无染料前体(PDPA-AMAn=1,3,6)之重量百分比的函数。(图4D)PDPA-CMN、PDPA-BDY及其1∶1重量比的分子混合物在pH 7.4下的荧光发射光谱。在CMN波长(λex=408nm)下激发样品。将各共聚物的浓度控制为200μg/mL。
图5A至5B.(图5A)对于PDPA-PPO共聚物溶液(浓度=500μg/mL),不同pH相对于pH 7.4的荧光强度比。(图5B)在PDPA-PPO及其无染料合成前体的分子混合物中PDPA-PPO的重量百分比与pH 5.5相对于7.4之荧光强度比的函数。
图6.PBDA-BDY、PDPA-TMR、PC7A-C55和PC6A-C75的化学结构及其相应的荧光数据。示出了其水溶液在相同聚合物浓度(100μg/mL)下但是在不同pH值下的代表性荧光图像。
图7.对于PBDA-BDY、PDPA-TMR、PC7A-C55和PC6A-C75pH与归一化荧光强度的函数。图6中示出了各纳米颗粒的激发和发射条件。
图8.具有不同pH转变的多色纳米颗粒随时间的有续激活。由共焦图像分析定量数据。将各细胞内的荧光强度归一化为12小时的荧光强度。估算各纳米颗粒达到最大强度一半的时间(t1/2)。
图9A至9B.(图9A)用0.02M NaOH水溶液进行的PEO-(PDPA-TMR)的pH滴定曲线。(图9B)在滴定实验期间,pH 5.8和6.8的PEO-(PDPA-TMR)水溶液的数目加权流体力学半径分布。
图10.PEO114-b-(PDPA77-co-AMA3)共聚物的临界胶束浓度(CMC)的测量。将芘的I1/I3荧光比绘制成PEO114-b-(PDPA77-co-AMA3)浓度的函数。CMC由0.9μg/mL处的虚线表示。
图11.pH 7.4和5.5水溶液中的游离TMR染料和PEO-(PDPA-TMR)的荧光强度衰减。
图12.在pH 5.5(单聚物状态)下PDPA-CMN、PDPA-BDY及其分子混合物的荧光发射光谱。将各聚合物浓度控制在200μg/mL。在408nm处激发样品并在420nm至700nm收集发射光谱。
图13A至13B.(图13A)PDPA-BDY、PDPA-TMR及其1:1重量比的分子混合物在pH 7.4下的荧光发射光谱。每个单个聚合物浓度为200μg/mL。在498nm处激发样品并从505nm至750nm收集发射光谱。(图13B)这些溶液在pH 5.5下的荧光发射光谱。
图14A至14E.游离香豆素水溶液在pH 7.4和pH 5.5下的荧光(图14A)和UV-Vis(图14B)吸收光谱(香豆素浓度为1μg/mL)。PDPA-CMN水溶液在pH 7.4和pH 5.5下的荧光发射光谱(图14C)和UV-Vis吸收光谱(图14D),其中聚合物浓度为200μg/mL。(图14E)PDPA-CMN及其相应合成前体的分子混合物中PDPA-CMN的重量百分比与pH 5.5相对于pH 7.4的荧光强度比之变化的函数(总聚合物浓度为200μg/mL)。为了测量荧光发射,在408nm处激发样品并从420nm至700nm收集发射光谱。
图15A至15B.(图15A)pH 7.4和pH 5.5下水溶液中游离PPO染料的荧光发射光谱(PPO浓度为15μg/mL)。(图15B)水溶液中PEO-(PDPA-PPO)共聚物的pH依赖性荧光发射光谱,其中所述共聚物浓度为500μg/mL。为了进行荧光发射实验,在408nm处激发该样品。
图16A至16D.水溶液中pH与PC7A-C55的pH依赖性荧光发射光谱(图16A)和荧光强度比(图16B)的函数(共聚物浓度为200μg/mL)。在690nm处激发样品,并从700nm至780nm收集发射光谱。(图16C)pH 7.6和pH 6.2下水溶液中归一化至PC7A-C55的单体峰值强度的吸收光谱。(图16D)PC7A-C55及其相应不含染料的合成前体分子混合物中PC7A-C55的重量百分比与荧光强度比之变化的函数。
图17A至17D.水溶液中pH与PC6A-C75的pH依赖性荧光发射光谱(图17A)和荧光强度比(图17B)的函数(共聚物浓度为200μg/mL)。在790nm处激发样品,并从800nm至900nm收集发射光谱。(图17C)pH 8.0和pH 6.4下水溶液中归一化至PC6A-C75的单体峰值强度的吸收光谱。(图17D)PC6A-C75及其相应不含染料的合成前体分子混合物中PC6A-C75的重量百分比与荧光强度比之变化的函数。
图18A至18D.水溶液中PDBA-BDY的pH依赖性荧光发射光谱(图18A)和荧光最大强度比(图18B)(共聚物浓度为200μg/mL)。在498nm处激发样品,并从505nm至650nm收集发射光谱。(图18C)pH 6.2和pH 4.2下水溶液中归一化至PDBA-BDY的单体峰值强度的吸收光谱。(图18D)PDBA-BDY及其相应不合染料的合成前体分子混合物中PDBA-BDY的重量百分比与荧光最大强度比之变化的函数。
图19.H2009细胞中的纳米颗粒细胞毒性对不同剂量的纳米颗粒组合物的依赖性。将H2009细胞与浓度逐渐增加的PEG-PDBA、PEG-PDPA或PEG-PC7A纳米颗粒溶液在37℃下孵育1小时。12小时后在细胞培养基中用MTT生存测定(MTT viability assay)评估其细胞毒性。误差条表示六个重复样品的标准差。
图20.合成PEO-(PR-染料)嵌段共聚物的方案。
图21A至21C.(图21A)pH可激活之胶束纳米探针的合成。(图21B)对于不同纳米探针,pH与归一化荧光强度的函数。纳米探针浓度为200μg/mL,Fmax/Fmin高至63倍。(图21C)共聚物组分中PDBA的百分比与pH转变值的函数。
图22.通过超pH灵敏(UPS)纳米探针对肿瘤微环境进行成像的示意图。UPS纳米探针在血液循环期间于pH 7.4下保持“关闭”。当到达肿瘤后,肿瘤环境中的酸性胞外pHe(6.5-6.8),或者在受体介导的、胞吞作用后肿瘤内皮细胞中的胞吞细胞器(pHi,5.0-6.0)使UPS纳米探针打开。
图23A至23E.UPS纳米探针的合成和表征。23A两种纳米探针UPSe和UPSi的结构组成,其pH转变点分别为6.9和6.2。UPSe特别地设计成在酸性肿瘤胞外流体(pHe=6.5至6.8)中激活。UPSi可在酸性胞吞细胞器(例如pHi=5.0至6.0)内激活。在大多数动物研究中将Cy5.5用作NIR荧光团。23B对于UPSe纳米探针和UPSi纳米探针,pH相对于归一化荧光强度的函数。在高pH(例如7.4)下,两个探针都处于沉默(silent)状态。在低于其转变点(即,6.9和6.2)的pH下,纳米探针可因胶束解离而被激活。虚线基于Henderson-Hasselbach方程模拟pKa为6.9的小分子pH传感器的pH响应。对于所述纳米探针,pH响应(ΔpH10-90%)极其敏锐(打开/关闭状态之间<0.25个pH单位),信号放大>100倍。相比之下,小分子pH传感器对于相当的信号变化需要3个pH单位。23C不同pH缓冲剂中UPSe-Cy5.5纳米探针溶液的荧光照片(λex=675nm,λem=710nm)。23D pH 7.4和pH 6.7下UPSe纳米探针的透射电子显微图像(聚合物浓度=1mg/mL,比例尺=100nm)。23E UPSe纳米探针在新鲜小鼠血清中于37℃下经24小时仍然保持稳定。
图24A至24E.cRGD-UPSi纳米探针的表征。24A cRGD-UPSi纳米探针的pH依赖性荧光光谱。在675nm处激发每个样品,并从690nm至780nm收集发射光谱。聚合物浓度为0.1mg/mL。24B对于cRGD-UPSi纳米探针,pH与荧光比的函数。pH响应(ΔpH10-90%)为0.21个pH单位,并且信号放大为128倍。24C cRGD-UPSi纳米探针的荧光信号放大与pH的函数。使用“橙色”滤镜(640nm至820nm)在Maestro体内成像系统(CRI)上采集荧光图像。24D在pH 7.4的缓冲剂和pH 6.0的缓冲剂中cRGD-UPSi纳米探针的透射电子显微图像,聚合物浓度为1mg/mL。比例尺为100nm。24E cRGD-UPSi纳米探针在新鲜小鼠血清中于37℃下经24小时仍然保持稳定。
图25A至25G. UPSe纳米探针可特异性地对酸性肿瘤pHe进行成像。25A由癌细胞进行的葡萄糖有氧糖酵解和乳酸生成。2-DG和CHC分别是葡萄糖摄取和乳酸分泌的代谢抑制剂。25B 2-DG或CHC对A549细胞中葡萄糖摄取和乳酸分泌的作用。25C在2-DG或CHC存在下孵育24小时后A549细胞培养基的酸化。25D具有A549肿瘤的小鼠在注射UPSe纳米探针(10mg/kg)后24小时时的重叠荧光图像。在对照组中,在施用UPSe纳米探针之前12小时注射2-DG(250mg/kg)或CHC(250mg/kg)。在合成图像中分别示出了Cy5.5(灰色)和自身荧光(浅灰色)。25E UPSe注射后时间与肿瘤组织与正常组织之间的NIR荧光强度比(T/N比)的函数。数据以平均值±s.d.(n=4)示出。25F UPSe注射后24小时时器官荧光强度与肌肉荧光强度的比。数据以平均值±s.d.(n=4)示出。与其他器官相比,**P<0.01。25G缺氧带(hypoxia band)与A549肿瘤异种移植物中UPSe的激活类型相关。染色的肿瘤切片的整体封装(wholemount)图像,缺氧(浅灰)和肿瘤血管(CD31,浅灰)。所有图像均得自浴相邻切片,放大率为×200。比例尺为2mm。
图26.注射后24小时时处死的具有A549肿瘤的小鼠之经解剖的肿瘤和器官的代表性离体荧光图像。以10mg/kg的剂量向具有A549肿瘤的小鼠静脉内施用UPSe纳米探针,并在24小时后,收集器官用于NIR成像。在对照组中,在施用UPSe纳米探针之前12小时注射2-DG(250mg/kg)或CHC(250mg/kg)。
图27A至27G. UPSe纳米探针图像与组织学染色的整体封装冷冻切片的代表相关性。上排(从左至右):27A UPSe纳米探针信号,27B用于进行缺氧染色的哌莫硝唑(pimonidazole),27C经CD31抗体染色的肿瘤血管系统,27D用于进行细胞增殖染色的Ki-67。下排,合并图像(从左至右):27E UPSe纳米探针(灰色)和哌莫硝唑(浅灰色);27F UPSe纳米探针(灰色)和CD31(浅灰色);27G UPSe纳米探针(灰色)和Ki-67(浅灰色)。所有的图像得自于相邻切片,放大率为×200。比例尺为2mm。
图28A至28I.cRGD-UPSi纳米探针可特异性地对血管生成性肿瘤血管系统进行成像。28A cRGD-UPSi纳米探针的设计。28B在肿瘤内皮细胞中经αvβ3-介导的胞吞作用后cRGD-UPSi的内在化和激活的示意图。纳米探针在内体和溶酶体中累积,其中酸性pH激活所述纳米探针。28C注射cRGD-UPSi纳米探针或UPSi纳米探针(10mg/kg)后6小时时具有A549肿瘤之小鼠的叠加荧光图像。在竞争组中,在施用cRGD-UPSi前30分钟注射阻断剂量的cRGD肽(25mg/kg)。在合成图像中分别示出了Cy5.5(灰色)和自身荧光(浅灰色)。28D注射纳米探针后的T/N比与时间的函数。数据以平均值±s.d.(n=4)示出。28E注射纳米探针后6小时时器官荧光强度与肌肉荧光强度的比。数据以平均值±s.d.(n=4)示出。与经UPSi或cRGD阻断基团处理的肿瘤相比,**P<0.01。28F注射纳米探针后6小时时离体肿瘤、肌肉和血液的代表性图像。28G cRGD-UPSi纳米探针和UPSi纳米探针的血浆浓度相对于时间的曲线(n=4)。28H静脉内注射后6小时cRGD-UPSi纳米探针和UPSi纳米探针的生物分布谱(n=4)。281纳米探针激活与肿瘤血管系统(抗CD31)的相关性。合并图像中由白色来表示纳米探针和肿瘤血管系统之间的共定位(浅灰色:血管;灰色:纳米探针;暗灰色:细胞核,比例尺=100μm)。
图29A至29C.HUVEC细胞中cRGD-UPSi纳米探针的荧光激活。29AHUVEC细胞中“激活的”cRGD-UPSi纳米探针的代表性共焦图像。UPSi和游离的cRGD阻断用作对照。29B用不同纳米探针(每组N>100)和细胞培养基处理的HUVEC细胞的荧光强度。29C用cRGD-UPSi处理的HUVEC细胞相对于用UPSi和游离cRGD+cRGD-UPSi对照处理的HUVEC细胞的对比噪声比(CNR)。与其他两组相比,**P<0.01。
图30A至30B.HUVEC中cRGD-UPSi纳米探针的亚细胞激活和分布。在cRGD-UPSi存在下将HUVEC孵育3小时。采集经30A LysoTrackerDND-26(浅灰色)或30B MitoTracker Green FM(浅灰色)染色之细胞的共焦图像,并将图像叠加。灰色表示纳米探针信号。白色指示纳米探针与溶酶体的共定位。
图31.对于体内A549肿瘤成像的cRGD-UPSi纳米探针的特异性信号放大。以10mg/kg的剂量向具有A549肿瘤的无胸腺(nu/nu)小鼠注射纳米探针,并且在所选时间点采集NIR荧光图像。将小鼠自身荧光颜色编码为浅灰色,而未混合的纳米探针信号编码为灰色。
图32.注射后6小时时处死的具有A549肿瘤的小鼠中经解剖之肿瘤和器官的代表性离体荧光图像。以10mg/kg的剂量向具有A549肿瘤的小鼠静脉内注射cRGD-UPSi或UPSi,并且在6小时后,收集肿瘤和器官用于NIR成像。在竞争组中,在施用cRGD-UPSi纳米探针前30分钟注射阻断剂量的cRGDfK肽(25mg/kg)。
图33A至D.用于A549肿瘤体内成像和离体成像的800CW-cRGD光学探针。33A以2nmol/小鼠的剂量向具有A549肿瘤的无胸腺(nu/nu)小鼠注射800CW RGD探针,并且在所选时间点采集NIR荧光图像。将小鼠自身荧光颜色编码为浅灰色,而未混合的探针信号编码为灰色。33B注射探针后肿瘤组织与正常组织之间的时间依赖的体内平均荧光强度比。33C注射后24小时时,处死小鼠,并使收集的器官可视化。33D具有A549肿瘤的小鼠中对于800CW RGD探针的器官与肌肉比。将器官的荧光信号归一化为肌肉中的荧光信号。数据以平均值±s.d.(n=3)示出。
图34.在肿瘤血管系统中cRGD-UPSi纳米探针的归巢(homing)和激活的组织病理学分析。对来自UPSi组和cRGD-UPSi组(6小时)的肿瘤组织切片进行CD31染色。肿瘤血管系统染色(抗CD31)以浅灰色示出。纳米探针信号以灰色示出。细胞核以暗灰色示出。比例尺为100μm。
图35.具有A549肿瘤的小鼠中经3H标记的UPS纳米探针的体内药代动力学研究。获得了UPSe纳米探针、cRGD-UPSi纳米探针和UPSi纳米探针(n=4至5/组)之血浆浓度相对于时间的曲线。
图36.静脉内施用iUPS纳米探针(10mg/kg)或PBS之无胸腺裸鼠的血液测试参数。结果示出在处理后的7天中肝功能和肾功能无异常。数据以平均值±s.d.(n=5)示出。缩写:ALT,天冬氨酸转氨酶;GOT,谷草转氨酶;BUN,血尿素氮;CRE,肌酸酐。
图37A和37B.iUPS纳米探针靶向酸性pHe和肿瘤血管系统二者,具有宽的肿瘤特异性。37A活体荧光图像分别示出cRGD-UPSi-RhoG(10mg/kg,浅灰色)和UPSe-TMR(10mg/kg,灰色)在肿瘤血管系统和实质(parenchyma)内空间激活的互补模式。经静脉内共注射该双探针并在注射后6小时时采集图像。37B iUPS纳米探针示出在不同癌症类型(乳腺癌、前列腺癌、头颈癌、肺癌、脑癌和胰腺癌)以及器官部位的10个不同肿瘤模型中宽的肿瘤成像特异性和功效。在各模型中,观察到高T/N比,证实靶向肿瘤微环境信号能够成功作为实现宽的肿瘤特异性的通用策略。
图38Aa至d.iUPS纳米探针可清楚地照亮(illuminate)多病灶的MMTV-PyMT转基因乳腺肿瘤(mammary tumor),并且背景信号最小。38Aa以10mg/kg的剂量向具有多发性乳腺肿瘤的MMTV-PyMT转基因小鼠注射iUPS纳米探针,并且在24小时的时候使用Maestro CRI成像系统采集NIR荧光图像。将小鼠自身荧光颜色编码为浅灰色,而未混合的纳米探针信号编码为暗灰色。38Ab注射后24小时时,处死小鼠并使收集的器官可视化。38Ac多发性乳腺肿瘤结节的荧光成像。38Ad注射纳米探针后24小时时器官荧光强度与肌肉荧光强度的比。将器官的荧光信号归一化为肌肉中的荧光信号。数据以平均值±s.d.(n=4)示出。与除肝之外的其他器官相比,**P<0.01。
图38Ba至c.iUPS纳米探针以高T/N比照亮了MDA-MB-231肿瘤异种移植物。38Ba以10mg/kg的剂量向具有人MDA-MB-231肿瘤异种移植物的裸鼠注射iUPS纳米探针,并且在24小时的时候使用Maestro CRI成像系统采集NIR荧光图像。将小鼠自身荧光颜色编码为浅灰色,而未混合的纳米探针信号编码为暗灰色。38Bb注射后24小时时,处死小鼠并使收集的器官可视化。38Bc注射纳米探针后24小时时器官荧光强度与肌肉荧光强度的比。将器官的荧光信号归一化为肌肉中的荧光信号。数据以平均值±s.d.(n=4)示出。与除肝之外的其他器官相比,**P<0.01。
图38Ca至c.iUPS纳米探针以高T/N比照亮了原位PC-3前列腺癌。38Ca以10mg/kg的剂量向具有原位PC-3前列腺肿瘤的裸鼠注射iUPS纳米探针,并且在24小时的时候使用Maestro CRI成像系统采集NIR荧光图像。将小鼠自身荧光颜色编码为浅灰色,而未混合的纳米探针信号编码为灰色。38Cb注射后24小时时,处死小鼠并使收集的器官可视化。38Cc注射纳米探针后24小时时器官荧光强度与肌肉荧光强度的比。将器官的荧光信号归一化为肌肉中的荧光信号。数据以平均值±s.d.(n=4)示出。与除肝之外的其他器官相比,**P<0.01。
图38Da至c.iUPS纳米探针以高成像对比照亮了原位HCC4034头颈肿瘤。38Da以10mg/kg的剂量向具有原位HCC4034头颈肿瘤的裸鼠注射iUPS纳米探针,并且在24小时的时候使用Maestro CRI成像系统采集NIR荧光图像。将小鼠自身荧光颜色编码为浅灰色,而未混合的纳米探针信号编码为暗灰色。38Db注射后24小时时,处死小鼠并使收集的器官可视化。38Dc注射纳米探针后24小时时器官荧光强度与肌肉荧光强度的比。将器官的荧光信号归一化为肌肉中的荧光信号。数据以平均值±s.d.(n=4)示出。与除肝之外的其他器官相比,**P<0.01。
图38Ea至c.iUPS纳米探针以高成像对比照亮了原位HN5头颈肿瘤。38Ea以10mg/kg的剂量向具有原位HN5头颈癌的裸鼠注射iUPS纳米探针,并且在24小时的时候使用Maestro CRI成像系统采集NIR荧光图像。将小鼠自身荧光颜色编码为浅灰色,而未混合的纳米探针信号编码为暗灰色。38Eb注射后24小时时,处死小鼠并使收集的器官可视化。38Ec注射纳米探针后24小时时器官荧光强度与肌肉荧光强度的比。将器官的荧光信号归一化为肌肉中的荧光信号。数据以平均值±s.d.(n=4)示出。与除肝之外的其他器官相比,**P<0.01。
图38F.iUPS纳米探针照亮了多个3LL Lewis肺癌病灶,并且背景信号最小。以10mg/kg的剂量向具有原位3LL Lewis肺癌的裸鼠注射cRGD-UPSe纳米探针,并且在24小时的时候使用Maestro CRI成像系统采集切除的肺的NIR荧光图像。将自身荧光颜色编码为浅灰色,而未混合的纳米探针信号编码为灰色。比例尺为5mm。可视化多发性肿瘤结节的高分辨NIR图像(~1mm)。
图38Ga至c.iUPS纳米探针以高成像对比照亮了A549肺癌异种移植物。38Ga以10mg/kg的剂量向具有人A549肺肿瘤的裸鼠注射iUPS纳米探针,并且在24小时的时候使用Maestro CRI成像系统采集NIR荧光图像。将小鼠自身荧光颜色编码为浅灰色,而未混合的纳米探针信号编码为暗灰色。38Gb注射后24小时时,处死小鼠并使收集的器官可视化。38Gc注射纳米探针后24小时时器官荧光强度与肌肉荧光强度的比。将器官的荧光信号归一化为肌肉中的荧光信号。数据以平均值±s.d.(n=4)示出。与除肝之外的其他器官相比,**P<0.01。
图38Ha至c.iUPS纳米探针以高成像对比照亮了SF-188脑癌异种移植物。38Ha以10mg/kg的剂量向具有人SF-188神经胶质瘤的裸鼠注射iUPS纳米探针,并且在24小时的时候使用Maestro CRI成像系统采集NIR荧光图像。将小鼠自身荧光颜色编码为浅灰色,而未混合的纳米探针信号编码为灰色。38Hb注射后24小时时,处死小鼠并使收集的器官可视化。38Hc注射纳米探针后24小时时器官荧光强度与肌肉荧光强度的比。将器官的荧光信号归一化为肌肉中的荧光信号。数据以平均值±s.d.(n=4)示出。与除肝之外的其他器官相比,**P<0.01。
图38Ia至c.iUPS纳米探针以高成像对比照亮了LN-229脑癌异种移植物。38Ia以10mg/kg的剂量向具有人LN-229神经胶质瘤的裸鼠注射iUPS纳米探针,并且在24小时的时候使用Maestro CRI成像系统采集NIR荧光图像。将小鼠自身荧光颜色编码为浅灰色,而未混合的纳米探针信号编码为暗灰色。38Ib注射后24小时时,处死小鼠并使收集的器官可视化。38Ic注射纳米探针后24小时时器官荧光强度与肌肉荧光强度的比。将器官的荧光信号归一化为肌肉中的荧光信号。数据以平均值±s.d.(n=4)示出。与除肝之外的其他器官相比,**P<0.01。
图38Ja至c.iUPS纳米探针以高成像对比照亮了MiaPaca-2胰腺癌异种移植物。38Ja以10mg/kg的剂量向具有人MiaPaca-2胰腺肿瘤的裸鼠注射iUPS纳米探针,并且在24小时的时候使用Maestro CRI成像系统采集NIR荧光图像。将小鼠自身荧光颜色编码为浅灰色,而未混合的纳米探针信号编码为暗灰色。38Jb注射后24小时时,处死小鼠并使收集的器官可视化。38Jc注射纳米探针后24小时时器官荧光强度与肌肉荧光强度的比。将器官的荧光信号归一化为肌肉中的荧光信号。数据以平均值±s.d.(n=4)示出。与除肝之外的其他器官相比,**P<0.01。
图39A和39B.iUPS纳米探针激活与叶酸(folate)-FITC缀合物在头颈原位肿瘤中的比较。39A向具有原位HN5头颈癌的裸鼠静脉内共注射iUPS纳米探针和叶酸-FITC(I期临床试验中的小分子探针)。注射后24小时时,通过手术暴露肿瘤以对肿瘤血管系统和酸性肿瘤环境进行荧光术中成像。39B注射后24小时时,处死小鼠并使切除的肿瘤和淋巴结可视化。纳米探针比叶酸-FITC对整个肿瘤和淋巴结的成像更有效。将小鼠自身荧光颜色编码为黑色,而未混合的叶酸-FITC和纳米探针信号分别编码为浅灰色和灰色。
图40A和40B.使用Fab′-UPSi-TMR纳米探针在全血中检测罕见循环肿瘤细胞的离体实验。40A血清在600X放大率下的显微图像。40B血清在2400X放大率下的显微图像。
图41.人HNC患者在600X放大率下的显微图像示出循环肿瘤细胞。
图42.在暴露于含Fab′的纳米探针后30分钟、60分钟、90分钟和120分钟对A549细胞进行的染色。顶行示出暴露于没有缀合Fab′片段之纳米探针的细胞,并且中间行示出暴露于包含缀合的Fab′片段之纳米探针的细胞。底行示出暴露于Erbitux抗体和含Fab′片段之纳米探针的混合物的细胞。
图43.在暴露于含Fab′的纳米探针后30分钟、60分钟、90分钟和120分钟对H2009细胞进行的染色。顶行示出暴露于没有缀合Fab′片段之纳米探针的细胞,并且中间行示出暴露于包含缀合的Fab′片段之纳米探针的细胞。底行示出暴露于Erbitux抗体和含Fab′片段之纳米探针的混合物的细胞。
图44.在暴露于含Fab′的纳米探针后30分钟、60分钟、90分钟和120分钟对HCT116细胞进行的染色。顶行示出暴露于没有缀合Fab′片段之纳米探针的细胞,并且中间行示出暴露于包含缀合的Fab′片段之纳米探针的细胞。底行示出暴露于Erbitux抗体和含Fab′片段之纳米探针的混合物的细胞。
图45.在暴露于含Fab′的纳米探针后30分钟、60分钟、90分钟和120分钟对HN5细胞进行的染色。顶行示出暴露于没有缀合Fab′片段之纳米探针的细胞,并且中间行示出暴露于包含缀合的Fab′片段之纳米探针的细胞。底行示出暴露于Erbitux抗体和含Fab′片段之纳米探针的混合物的细胞。
图46.在暴露于含Fab′的纳米探针后30分钟、60分钟、90分钟和120分钟对FaDu细胞进行的染色。顶行示出暴露于没有缀合Fab′片段之纳米探针的细胞,并且中间行示出暴露于包含缀合的Fab′片段之纳米探针的细胞。底行示出暴露于Erbitux抗体和含Fab′片段之纳米探针的混合物的细胞。
图47.在暴露于含Fab′的纳米探针后30分钟、60分钟、90分钟和120分钟对HCC4034细胞进行的染色。顶行示出暴露于没有缀合Fab′片段之纳米探针的细胞,并且中间行示出暴露于包含缀合的Fab′片段之纳米探针的细胞。底行示出暴露于Erbitux抗体和含Fab′片段之纳米探针的混合物的细胞。
图48.在暴露于含Fab′的纳米探针后30分钟、60分钟、90分钟和120分钟对HSC3细胞进行的染色。顶行示出暴露于没有缀合Fab′片段之纳米探针的细胞,并且中间行示出暴露于包含缀合的Fab′片段之纳米探针的细胞。底行示出暴露于Erbitux抗体和含Fab′片段之纳米探针的混合物的细胞。
图49.用包含三种不同荧光团的纳米探针对HN5细胞进行的染色。左栏包含用Rhodamine Green合成的探针,中间栏包含用TMR合成的探针,并且右栏包含用Cy 5合成的探针。顶行示出仅暴露于PDPA的细胞,中间行示出包含Fab′片段的纳米探针,并且底行示出暴露于Erbitux抗体和含Fab′片段之纳米探针的混合物的细胞。
图50.PDPA-TMR-Fab′纳米探针在具有HN5肿瘤之小鼠中的体内成像示出该探针选择性地优先突出肿瘤。
图51.在暴露于含FA的纳米探针后30分钟、60分钟和120分钟对A549细胞进行的染色。上两行示出两种不同成像,顶行是微分干涉差通道,中间行示出PDPA-TMR-FA通道。底行是两个通道的组合图像。
图52.PDPA-TMR-FA纳米探针在具有HN5肿瘤之小鼠中的体内成像示出该探针选择性地优先突出肿瘤。
图53A至53C.多色杂合纳米探针的顺序激活。53a杂合探针的平均计数率(kcps)与pH的函数作图。53b pH 7.4下并且由490nm激发的杂合纳米探针(100μg/mL)的荧光光谱。53c不同pH值下杂合纳米探针(100μg/mL)的代表性荧光图像。
具体实施方案
本发明的多个实施方案提供了使用荧光染料的pH可调的、可高度激活的多色荧光纳米颗粒。在某些实施方案中,该多色纳米平台利用在生理学范围(5.0至7.4)中具有可调pH转变之基于超pH响应的四甲基罗丹明(TMR)的纳米颗粒。制备基于四甲基罗丹明(TMR)之纳米颗粒的方法在Zhou,K.,Chem.Int.Ed.2011,50,6109;PCT/US201I/00148和PCT/US201I/047497中进行了描述。pH响应纳米颗粒的pH诱导胶束化与荧光淬灭结合使用,以提供pH响应的荧光纳米颗粒(参见图1)。例如,在一个实施方案中,多色的pH可激活荧光纳米颗粒系列具备发射波长(500nm至820nm)和pH转变点(5.0至7.4)的独立控制。具有不同发射波长的纳米颗粒实现了敏锐的pH响应(打开/关闭状态之间的ΔpH<0.25)。将若干多色纳米颗粒的混合物与癌细胞一起孵育示出了顺序激活模式,所述模式与其pH转变值直接相关。所述多色纳米平台提供了有用的纳米技术工具组(toolset)来研究基本的细胞生理学过程,例如胞吞小泡中的pH调节、内体/溶酶体的成熟以及pH对受体循环和亚细胞细胞器运输的影响。虽然多个实施方案描述了使用多个不同的纳米颗粒或胶束,但是可设想仅使用单一纳米颗粒也可得到相似结果。
A.嵌段共聚物和荧光染料
本文公开的pH响应胶束和纳米颗粒包含嵌段共聚物和荧光染料。嵌段共聚物包含亲水聚合物区段和疏水聚合物区段。疏水聚合物区段是pH敏感的。例如,疏水聚合物区段可包含可离子化的胺基以提供pH敏感性。嵌段共聚物基于这些可离子化嵌段共聚物的超分子自组装形成pH可激活的(pHAM)纳米颗粒。在较高pH下,所述嵌段共聚物组装成胶束,而在较低pH下,疏水聚合物区段中胺基团的离子化导致胶束解离。可离子化基团在不同pH值下可充当可调的亲水/疏水嵌段,从而可直接影响胶束的动力学自组装。
对于诊断或pH监测应用,可使标记部分与嵌段共聚物缀合。在一些实施方案中,当pH有助于胶束形成时,标记(例如荧光标记)隐蔽在胶束内。隐蔽在胶束内导致标记信号降低(例如,通过荧光淬灭)。特定的pH条件可导致胶束迅速质子化并解离成单聚体,从而暴露标记,并使标记信号增加(例如,增加荧光发射)。本发明的胶束在诊断应用中可提供一个或更多个优点,例如:(1)相对于之前胶束组合物的几小时或几天,在某些pH环境(例如酸性环境)下胶束在短时间内(例如数分钟内)解离(并且标记信号迅速升高);(2)成像有效载荷(imaging payload)增加;(3)使标记选择性靶向期望部位(例如肿瘤或特定的胞吞区室);(4)血液循环时间延长;(5)在特定的窄pH范围内具有响应性(例如用于靶向特定细胞器);以及(6)高的对比灵敏度和特异性。例如,在正常生理学条件(例如血液循环、细胞培养条件)下,胶束可保持沉默(或处于关闭状态),并且背景信号最小,但是当胶束到达其意图的分子靶标(例如胞外肿瘤环境或细胞的细胞器)时,成像信号可大幅放大。
多种荧光染料在本领域中是已知的。在本发明的某些方面中,荧光染料是pH不敏感的荧光染料。在一些实施方案中,荧光染料具有小的斯托克斯位移。在一些特别的实施方案中,斯托克斯位移为Δλ<40nm。荧光染料可与共聚物直接缀合或通过接头部分缀合。可使用本领域已知的方法来使荧光染料与例如疏水聚合物缀合。
嵌段共聚物以及与荧光染料缀合的嵌段共聚物的实例包括:
包含以下的共聚物或其可药用盐,及其立体异构体、同位素变体和互变异构体:
a)根据下式的聚合物:
b)根据式A1的单体;以及
c)根据式A2的单体;
其中
A1和A2各自独立地选自:
R1a各自独立地为H、经取代的或未经取代的烷基,或者
R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d和R5各自独立地为H或者经取代的或未经取代的烷基;
R6a和R6b各自独立地为经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的芳基或者经取代的或未经取代的杂芳基;或者R6a和R6b与其所连接的N原子一起形成杂环;
R7是包含染料的部分;
下标n为10至200的整数;
并且其中所述共聚物是无规共聚物。
根据式I的共聚物或其可药用盐,及其立体异构体、同位素变体和互变异构体:
其中
A1和A2各自独立地选自:
前提是A1和A2二者在同一时刻是不同的;
R1a各自独立地为H、经取代的或未经取代的烷基,或者
R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d和R5各自独立地为H或者经取代的或未经取代的烷基;
R1b是H、经取代的或未经取代的烷基、Br或S-R;
R6a和R6b各自独立地为经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的芳基或者经取代的或未经取代的杂芳基;或者R6a和R6b与其所连接的N原子一起形成杂环;
R7是包含染料的部分;
下标n是10至200的整数;下标x是1至200的整数;并且下标y是1至200的整数;
并且其中r表示所述共聚物是无规共聚物的形式。
根据式II的共聚物或其可药用盐,及其立体异构体、同位素变体和互变异构体:
前提是所述结构右末端的Me可为Me或Br;
其中A1、A2、n、x和y如权利要求1;
并且其中r表示所述共聚物是无规共聚物的形式。
根据式III的共聚物或其可药用盐,及其立体异构体、同位素变体和互变异构体:
前提是所述结构右末端的Me可为Me或Br;
其中
R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d和R5各自独立地为H或者经取代的或未经取代的烷基;
R6a和R6b各自独立地为经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的芳基或者经取代的或未经取代的杂芳基;或者R6a和R6b与其所连接的N原子一起形成杂环;
R7是包含染料的部分;
下标n是10至200的整数;下标x是1至200的整数;下标y是1至200的整数;
并且其中r表示所述共聚物是无规共聚物的形式。
根据式IV的共聚物或其可药用盐,及其立体异构体、同位素变体和互变异构体:
前提是所述结构右末端的Me可为Me或Br;
其中
R6a和R6b各自独立地为经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的芳基或者经取代的或未经取代的杂芳基;或者R6a和R6b与其所连接的N原子一起形成杂环;
R7是包含染料的部分;
下标n是10至200的整数;下标x是1至200的整数;下标y是1至200的整数;
并且其中r表示所述共聚物是无规共聚物的形式。
在某些实施方案中,R7选自香豆素(或CMN)、DODPY(或BDY)、PyPMO(或PPO)、TMR、Cy5,5和Cy7,5;并且香豆素(或CMN)、DODPY(或BDY)、PyPMO(或PPO)、TMR、Cy5,5和Cy7,5依据下式:
然而,注意到,香豆素(CMN)在本文所述研究中不导致荧光激活,因此其用途可以是作为阴性对照,或者在一些实施方案中可将其从R7的定义中明确排除。
在某些实施方案中,下标n为80至200、100至140或110至120的整数。在一些实施方案中,下标n为114。
在某些实施方案中,下标x为10至110、40至80、50至80、60至80或70至80的整数。在一些实施方案中,下标x为71、72、77或80。
在某些实施方案中,下标y为1至20、1至15或1至10的整数。在一些实施方案中,下标y为1、3、5或6。
共聚物为根据式V的共聚物或其可药用盐,及其立体异构体、同位素变体和互变异构体:
前提是所述结构右末端的Me可为Me或Br;
其中
R7是CMN、BDY、PPO、TMR、C55或C75:
下标n为110至120的整数;下标x为70至81的整数;下标y为1至10的整数;
并且其中r表示所述共聚物是无规共聚物的形式。
根据式V的共聚物;其中
R7为TMR;
下标n为114;
下标x为71;并且
下标y为1。
根据式V的共聚物;其中
R7为TMR;
下标n为114;
下标x为77;并且
下标y为3。
根据式V的共聚物;其中
R7为TMR;
下标n为114;
下标x为80;并且
下标y为6。
根据式V的共聚物;其中
R7为CMN;
下标n为114;
下标x为77;并且
下标y为3。
根据式V的共聚物;其中
R7为BDY;
下标n为114;
下标x为77;并且
下标y为3。
根据式V的共聚物;其中
R7为PPO;
下标n为114;
下标x为77;并且
下标y为3。
根据式VI的共聚物或其可药用盐,及其立体异构体、同位素变体和互变异构体:
前提是所述结构右末端的Me可为Me或Br;
其中
R7为CMN、BDY、PPO、TMR、C55或C75:
下标n为110至120的整数;下标x为70至81的整数;下标y为1至10的整数;
并且其中r表示所述共聚物是无规共聚物的形式。
根据式VI的共聚物;其中
R7为C75;
下标n为114;
下标x为81;并且
下标y为3。
根据式VI的共聚物;其中
R7为C55;
下标n为114;
下标x为65;并且
下标y为3。
根据式VII的共聚物或其可药用盐,及其立体异构体、同位素变体和互变异构体:
前提是所述结构右末端的Me可为Me或Br;
其中
R7为CMN、BDY、PPO、TMR、C55或C75:
下标n为110至120的整数;下标x为70至81的整数;下标y为1至10的整数;
并且其中r表示所述共聚物是无规共聚物的形式。
根据式VII的共聚物;其中
R7为C75;
下标n为114;
下标x为81;并且
下标y为3。
根据式VII的共聚物;其中
R7为C55;
下标n为114;
下标x为65;并且
下标y为3。
根据式VIII的共聚物或其可药用盐,及其立体异构体、同位素变体和互变异构体:
其中
R7为CMN、BDY、PPO、TMR、C55或C75:
下标n为110至120的整数;下标x为70至81的整数;下标y为1至10的整数;
并且其中r表示所述共聚物是无规共聚物的形式。
根据权利要求1至68中任一项所述的共聚物,其中所述共聚物是PDBA-BDY;并且其中
根据式VIII的共聚物;其中
R7为BDY;
下标n为114;
下标x为77;并且
下标y为3。
嵌段共聚物的另一些实例在Zhou,K.,Chem.Int.Ed.2011,50,6109;PCT/US2011/00148和PCT/US2011/047497中进行描述,其每一篇都通过引用并入本文。
B.胶束系统和组合物
本文公开的系统和组合物利用单一胶束或调至不同pH水平的胶束系列。此外,所述胶束具有窄的pH转变范围。在一些实施方案中,所述胶束具有小于约1个pH单位的pH转变范围。在多个实施方案中,所述胶束具有小于约0.9个、小于约0.8个、小于约0.7个、小于约0.6个、小于约0.5个、小于约0.4个、小于约0.3个、小于约0.25个、小于约0.2个或小于约0.1个pH单位的pH转变范围。所述窄的pH转变范围有利地提供了更敏锐的pH响应,这可导致在pH的细微变化下荧光团的完全打开。
因此,单一或系列的pH可调的多色荧光纳米颗粒(具有pH诱导的胶束化以及在胶束核(core)中的荧光淬灭)为独立控制pH转变(经聚合物)和荧光发射(具有小斯托克斯位移的染料)提供了机制。荧光波长可在例如绿光至近IR发射范围(500nm至820nm)内进行微调。其荧光打开/关闭激活可在0.25个pH单位内实现,这比小分子pH传感器窄得多。这种多色的、pH可调且可激活的荧光纳米平台为研究与癌症、溶酶体贮积疾病和神经病症有关的基本细胞生理学过程(例如胞吞细胞器中的pH调节、受体循环和胞吞运输)提供了有价值的工具。
胶束的大小通常为纳米级(即,直径约1nm至1μm)。在一些实施方案中,胶束的大小为约10nm至约200nm。在一些实施方案中,胶束的大小为约20nm至约100nm。在一些实施方案中,胶束的大小为约30nm至约50nm。
C.靶向部分
胶束和纳米颗粒还可包含靶向部分。所述靶向部分可用于使纳米颗粒或胶束靶向例如特定的细胞表面受体、细胞表面标志物或细胞器(例如细胞核、线粒体、内质网、叶绿体、质外体或过氧化物酶体)。这样的靶向部分将在受体再循环(receptor recycling)、标志物再循环(markerrecycling)、细胞内pH调节、胞吞运输的研究中是有利的。
靶向部分可例如是抗体或抗体片段(例如,Fab′片段)、蛋白质、肽(例如,信号肽)、适配体或小分子(例如,叶酸)。靶向部分可通过本领域已知的方法与嵌段共聚物缀合(例如,与亲水聚合物区段缀合)。靶向部分的选择将取决于特定靶标。例如,抗体、抗体片段、小分子或结合伴侣(binding partner)可能更适于靶向细胞表面受体和细胞表面标志物,而肽特别是信号肽可能更适于靶向细胞器。
D.荧光检测
本发明的多个方面涉及通过检测荧光信号增加来直接或间接地检测胶束解离。用于检测来自荧光染料之荧光信号的技术是本领域技术人员已知的。例如,下文实施例中描述的荧光共焦显微术就是一种这样的技术。
例如,流式细胞术是可用于检测荧光信号的另一种技术。流式细胞术涉及分离液体样品中的细胞或其他颗粒(例如微球)。流式细胞术的基本步骤包括导引流体样品通过装置使得液体流通过传感区。颗粒应每次一个地通过传感器,并且可根据大小、折射度、光散射、不透明度、粗糙度、形状、荧光等进行分类。
本文所述的测量可包括用于分析细胞的一个或更多个图像的图像处理,从而确定细胞的一种或更多种特征,例如表示在多个检测波长处和/或多个时间点的荧光发射级别的数值。
E.试剂盒
本发明还提供了试剂盒。本文所公开的任何组分都可组合在试剂盒中。在某些实施方案中,试剂盒包含如上文所述的pH响应系统或组合物。
所述试剂盒一般包含至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器,可向其中放置组分并优选适当地等分。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下,所述试剂盒一般还包含可分别装有其他组分的第二、第三或其他额外的容器。然而,组分的多种组合可包含在一个容器中。在一些实施方案中,一个系列中的所有胶束群都组合在单个容器中。在另一些实施方案中,一个系列中的一些或所有胶束群在分开的容器中提供。
本发明的试剂盒通常还包含进行商业销售的处于密闭状态的用于容纳多个容器的包装。这样的包装可包括纸板或注射用包装或吹塑塑料包装,期望的容器可保持在其中。试剂盒还可包含用于使用所述试剂盒组分的说明。说明可包含可实施的变化。
F.实施例
包括以下实施例以阐述本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解,以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明实践中发挥良好作用的技术,并因此可认为构成了用于其实施的优选方式。但是,本领域技术人员应理解,依据本公开内容,可对所公开的具体实施方案中做出多种变化,并仍然获得相同或相似的结果,而不脱离本发明的精神和范围。
1.pH诱导的胶束化与荧光激活之间的关系。
使用原子转移自由基聚合法合成了嵌段共聚物聚(氧化乙烯)-b聚[2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯-co-甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐],PEO-b-P(DPA-co-AMA)(PDPA-AMA,表1)。
表1.PEO-b-(PR-co-AMA)二嵌段共聚物的特征
a数均分子量(Mn)通过1H NMR确定。b数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)和多分散指数(PDI=Mw/Mn)通过使用THF作为洗脱剂的GPC确定。
使用5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯使染料与伯氨基缀合以产生PDPA-TMR共聚物(Zhou,K.,Chem.Int.Ed.2011,50,6109)。图2A中示出了PDPA-TMR水溶液的pH依赖性荧光性质。为了定量评估pH响应性质,将归一化的荧光强度(NFI=[F-Fmin]/[Fmax-Fmin])绘制成pH的函数,其中F是在任意给定pH下纳米颗粒的荧光强度,并且Fmax和Fmin分别是处于打开/关闭状态下的最大和最小荧光强度。为了量化pH响应的敏锐度,测量了ΔpH10-90%(NFI值从10%至90%变化的pH范围)。对于PDPA-TMR(图2B),ΔpH10-90%为0.20个pH单位,表示质子浓度([H+])变化<2倍。对于pH敏感的小分子染料(Urano,Y.,Nat.Med.2009,15,104)来说,ΔpH10-90%通常为2个pH单元,对应于[H+]变化100倍(Atkins,P.,Physical Chemistry;Oxford University Press,2009)。
氨基之前已被引入聚合物中作为可离子化基团以提供pH敏感性(Dai,S.,Soft Matter 2008,4,435;Gil,E.S.,Prog.Polym.Sci.2004,29,1173)。在纳米颗粒设计(图3)中,引入具有疏水成分的叔胺作为可离子化的疏水嵌段并引入聚(乙二醇)作为亲水嵌段。在该系统中,胶束形成是由两个精巧的平衡以热力学方式驱动的:第一个是带正电的叔铵基(即,-NHR2 +)与中性疏水叔胺(-NR2)之间的pH依赖性离子化平衡;第二个是在叔胺区段中到达高疏水性水的临界阈值后胶束的自组装过程(Zhou,K.,Macromolecules 2008,41,8927;Riess,G.,Prog.Polym.Sci.2003,28,1107;Lee,E.S.,Controlled Release 2003,90,363)。
为了从机械学方面理解pH-依赖的荧光激活与pH诱导的胶束化之间的关系,将荧光激活曲线与来自动态光散射(DLS)实验的胶束形成进行比较。使用流体动力学半径<Rh>作为指示单聚体(3nm)向胶束(24nm)转变的主要参数(图2B,图9B)。图2B示出了胶束化pH与荧光激活pH相符合,其中两条曲线在pH 6.36下在50%点处相交。有趣地是,荧光pH转变值在PDPA-TMR共聚物的表观pKa(6.64,其中50%的铵基发生去质子化)之前出现(图2C)。这些数据表明,在pH滴定早期发生了荧光淬灭,其中当相对小部分(~10mol%)的铵基去质子化使PDPA区段达到足以形成胶束的疏水性时,胶束形成。这进一步得到透射电子显微术分析的支持,其示出在pH 5.8下为单聚体状态,而在pH 6.8下形成胶束。
使叔胺的离子化状态从10%变化为90%需要约0.5个pH单位(pH6.4至pH 6.9),说明了与可离子化小分子相比的胶束诱导的协同去质子化过程。Nie和同事用经羧酸包被的Au纳米颗粒观察到相似的协同响应(Kairdolf,B.A.,J.Am.Chem.Soc.2011,133,7268)。为了进一步确证胶束诱导的荧光激活机制,研究了在高于和低于临界胶束浓度(CMC)的共聚物浓度下的pH依赖性荧光强度(参见Ananthapadmanabhan,K.P.,Langmuir 1985,1,352;Ruckenstein,E.,J.Phys.Chem.1975,79,2622)。在该研究中,使用PDPAAMA合成前体而不是PDPATMR来测量CMC,以避免TMR染料的可能干扰。数据示出,在pH 7.4的0.2M磷酸缓冲剂中,CMC为约0.9μg/mL(图10)。图2D中的结果示出在较低的共聚物浓度下荧光激活降低的程度。当共聚物浓度为0.2μg/mL(即,<CMC)时,几乎观察不到pH响应(游离TMR染料在该pH范围内也是pH不敏感的)。这些数据表明,这些荧光纳米颗粒的超pH响应(ΔpH10-90%<0.25个pH单位)是一个独特的纳米级现象,其中pH诱导的胶束化直接导致了观察到的荧光激活。除了成像应用外,这些超pH响应纳米颗粒还可用作纳米级的“质子海绵(proton sponge)”,其可帮助siRNA分子或DNA分子的内体逃逸(endosomal escape),从而实现更有效的药物递送(参见YezhelyeV,M.V.,J.Am.Chem.Soc.2008,130,9006;Yu,H.,J.4CS Nano2011,5,9246)。
2.胶束诱导之荧光淬灭的光化学机制研究。
在胶束纳米环境中,三种常见的光化学机制可对观察到的荧光淬灭有贡献(图1):(1)在胶束核中的染料分子之间形成H-型二聚体(H-二聚体);(2)染料分子之间的共振能量转移(homoFRET),其通过使激子更快地扩散至具有快速衰减之部位中的荧光团来促进荧光衰减;以及(3)胶束核(例如供给电子的叔胺)与荧光团之间的光诱导的电子传递(PeT)(de Silva,A.P.,Chem.Rev.1997,97,1515;Kobayashi,H.,Acc.Chem.Res.2010,44,83;Kobayashi,H.,Chem.Rev.2010,110,2620;Valeur,B.,Molecular fluorescence:principles and applications,Wiley-VCH,2002;Lakowicz,J.R.,Principles of Fluorescence Spectroscopy;第3版,Springer:New York City,2006;Demchenko,A.P.,Introduction toFluorescence Sensing,Springer Science:New York,2008;Lee,S.,Curr.Top.Med. Chem.2010,10,1135)。可激活荧光分子染料的设计中已对这些机制进行了综述(de Silva,A.P.,Chem.Rev.1997,97,1515;Kobayashi,H.,Chem.Rev.2010,110,2620)。对于小分子的pH敏感染料,PeT已经是主要机制,据报道,其中对于打开/关闭激活来说存在2个pH单位的窗口。
为了研究以上三种机制的相对贡献,系统地合成了具有不同密度和不同染料分子类型的一系列二嵌段共聚物(图3)。一些类型的荧光团(例如罗丹明、BODIPY和花菁衍生物)在相对高的局部浓度下可容易地形成具有淬灭荧光信号的H型二聚体(West,W.,Phys.Chem.1965,69,1894;López Arbeloa,I.,Chem.Phys.Lett.1982,87,556;Valdes-Aguilera,O.,Acc.Chem.Res.1989,22,171;Packard,B.Z.,Phys.Chem.B 1997,101,5070;Ogawa,M.,ACS chem.biol. 2009,4,535)。H-二聚体是基态复合物,其中两个染料分子处于三明治型(sandwich-type)排列中(Valeur,B.,Molecular fiuorescen ce:prin ciples an d applications,Wiley-VCH,2002;Johansson,M.K.,Chem.Eur.J.2003,9,3466;Scheibe,G. Z.,Angew.Chem.1936,49,563;Jelley,E. E. Nature 1936,138,1009)。在H型二聚体中,禁止了向更低能量激发态的转变,这导致其相对于单体发生了吸收蓝移和荧光削弱(West,W.,Phys.Chem.1965,69,1894;Jelley,E.E.Nature1936,138,1009)。
首先,确定了H-二聚体的形成对PDPA-TMR共聚物的pH可激活荧光的贡献。合成了一系列的PDPA-TMR共聚物,其中每条聚合物链的TMR分子数目从1增加至3再增加至6(表1)。TMR数目的增加导致荧光激活比RF(RF=Fmax/Fmin)分别从10倍增加至28倍再增加至40倍(图4A)。所有三种共聚物的UV-Vis光谱检查示出,在较低的pH(即,pH=5.5,单聚体状态)下比在较高的pH(即,pH=7.4,胶束状态)下形成更高百分比的H-二聚体,如通过520nm处较高的吸收峰强度所示的(图4B)。该结果表明,H-二聚体形成不是导致胶束状态下荧光淬灭的主要机制。H-二聚体在pH 5.5下的轻微增加可能是在单聚体状态下聚合物链的移动性增加的结果,从而有助于TMR二聚化。因为H-型二聚体是基态复合物,所以其形成不会影响荧光寿命(Lakowicz,J.R.,Principlesof Fluorescence Spectroscopy;第三版,Springer:New York City,2006;Berezin,M.Y.,Chem.Rev.2010,110,2641)。在pH 7.4下PDPA-TMR3与游离染料(τ~2ns,图11)相比短的荧光寿命(τ~0.4ns)进一步支持了H-二聚体形成不是导致胶束状态下荧光淬灭的主要原因。
接着,研究了PeT和homo-FRET机制对胶束诱导的荧光淬灭的贡献。当电子供体(例如,来自胶束核区段的叔胺)的HOMO能级处于荧光受体的LUMO能级与HOMO能级之间并且当其非常接近时,发生PeT(de Silva,A.P.,Chem.Rev.1997,97,1515;Wellef,A.Pure Appl.Chem.1968,16,115;Wasielewski,M.R.Chem.Rev.1992,92,435)。为了使FRET发生,必须满足三个特定条件(Lakowicz,J.R.,Principles of FluorescenceSpectroscopy;第3版,Springer:New York City,2006;Vogel,S.S.,Sci.STKE 2006,2006,re2.):(i)供体荧光团的发射光谱必须与接纳体(acceptor)的吸收光谱重叠(对于homo-FRET,供体和接纳体相同并因此染料必须具有小的斯托克斯位移);(ii)供体和接纳体必须处于适当的物理取向;(iii)染料对必须彼此接近。FRET效率与分离距离具有六次幂相关性(sixth power dependence),这在其于荧光成像研究的实施中是最常见的操作参数。应注意,homoFRET本身不直接导致荧光团的非放射性衰减。然而,该过程可增加激子在染料分子中的扩散。当荧光团部分陷于快速衰减环境中时,homoFRET可通过交换过程促进总荧光团群的荧光衰减。
已知氨基通过PeT机制淬灭荧光(de Silva,A.P.,Chem.Commun.1996,2399;Dale,T.J.,J.Am.Chem.Soc.2006,128,4500;Diaz-Fernandez,Y.,Chem.Eur.J.2006,12,921;Tal,S.,Chem.Eur.J.2006,12,4858;Petsalakis,I.D.,J.Mol. Struct.:THEOCHEM 2008,867,64)。在较高pH下的PDPA-TMR溶液中,其弱荧光信号可通过PDPA-TMR共聚物中的这些富电子叔胺基团由PeT机制引起。为了区分PeT和homo-FRET在荧光淬灭中的相对贡献,系统地改变了TMR染料之间的距离(或胶束核中的TMR密度)并同时保持核纳米环境恒定。更具体地,以不同的重量分数将PDPA-TMRn=1,3,6共聚物与其不含染料的前体共聚物(PDPA-AMAn=1,3,6)混合。我们绘制了pH 7.4和pH 5.5下荧光强度的比减1,(RF-1)与重量分数的函数。对于PeT占优势的机制,预计(RF-1)独立于混合百分比并且Y-截距反映出PeT淬灭效率。对于homoFRET占优势的机制,预计(RF-1)依赖于混合百分比并且Y-截距接近于0。图4C清楚地示出无论PDPA嵌段中的TMR数目是多少,当混合重量百分比降低至0时,(RF-1)接近于0。胶束核中增加的TMR浓度(通过增加每条聚合物链的TMR,或与TMR缀合共聚物的较高摩尔分数)导致了荧光淬灭显著升高(即,较高的RF值)。这些结果表明,在PDPA-TMR系统中homo-FRET是优势的荧光淬灭机制,而PeT贡献可以忽略。
为了进一步证实homo-FRET机制,用两组已建立的hetero-FRET染料检查了共聚物的荧光转移效果:(a)PDPA-CMN和PDPA-BDY,(b)PDPA-BDY和PDPA-TMR(参见图3中它们的结构和荧光性质)。将每对共聚物溶解于其良好的溶剂THF中,以使其分子混合,然后将其逐滴添加至水中,以形成胶束的分子混合物。在PDPA-CMN和PDPABDY对中,对于hetero-FRET作用,香豆素染料的荧光光谱与BODIPY染料的吸收光谱重叠。与单独的PDPA-CMN胶束溶液相比,混合胶束溶液中香豆素发射波长(即,468nm)处的荧光强度降低了超过8倍(图4D)。此外,在BODIPY发射波长(506nm)处,混合胶束溶液的荧光强度比单独的PDPA-BDY胶束溶液增加超过53倍。这些结果清楚地证实,在pH 7.4下的PDPA-CMN和PDPA-BDY混合胶束中,存在从香豆素到BODIPY染料的强荧光能量转移。在pH 5.5下没有观察到它们之间的荧光能量转移(图12)。在PDPA-BDY和PDPA-TMR对中得到了相似的观察结果(图13)。
如上文所提到的,homo-FRET仅发生于具有小斯托克斯位移的两种相同染料之间。当在PDPA-AMA共聚物中引入具有大斯托克斯位移的染料分子时,将观察不到homo-FRET作用,因为其吸收光谱与发射光谱不重叠。如图14所示,在λex=408nm,λem=468nm并且Δλ=60nm的情况下,PDPA-CMN几乎不存在pH响应的荧光行为。对于PDPA-PPO(λex=415nm,λem=570nm并且Δλ=155nm),观察到RF响应增加了14倍(图5A)。进一步的实验(图5B)示出,(RF-1)与染料浓度不相关,并因此与胶束核中的距离不相关。这些数据证实,homo-FRET对ph诱导的PDPA-PPO荧光响应没有贡献。相反地,胶束状态下的荧光淬灭主要是由于PeT机制,如大的Y截距所示(RF=14)。
3.多色的pH可调荧光纳米平台的开发。
虽然PeT机制可导致如在PDPA-PPO中所示的纳米颗粒的pH响应激活,但是PeT效率高度依赖于供给电子的氨基的HOMO与荧光团的LUMO的匹配。该相互依赖关系可限制对染料分子以及具有不同叔胺之聚合物的选择,这将使得难以独立地控制纳米颗粒的发射波长及其pH转变。最后,氨基的质子化/去质子化状态也将影响PeT效率(Dale,T.J.,J.Am.Chem.Soc.2006,128,4500;Tal,S.,Chem.Eur.J.2006,12,4858;Petsalakis,I.D.,J.Mol.Struct.:THEOCHEM 2008,867,64),并且将导致如PDPA-PPO纳米颗粒所示的加宽的pH响应(图5A)。
由于以上原因,提出了与pH诱导的胶束化组合的homo-FRET,以提供更容易且更稳健(robust)的策略用于创造多色的pH可调荧光纳米平台。具有小斯托克斯位移(Δλ<40nm)的荧光团可选自多种通常可得到的具有宽发射范围的染料分子。该策略在聚合物与荧光团之间没有直接的能量/电子转移的情况下具有独立控制pH灵敏度和发射波长的额外优点。基于该原理,建立了一系列具有从绿光至近IR范围发射波长的pH可调纳米颗粒。图6示出了一系列多色纳米颗粒溶液在不同pH下的荧光图像,说明了各纳米颗粒的敏锐荧光转变。定量数据分析示出,PDBA-BDY、PDPATMR、PC7A-C55和PC6A-C75的ΔpH10-90%值分别为0.22、0.20、0.23和0.24,并且其pH转变点分别为5.2、6.4、6.9和7.2(图7)。对于PDPA-TMR、PC7A-C55和PC6A-C75(图4C;图16D;图17D),仅homo-FRET对荧光淬灭机制有贡献。对于PC7A-C55和PC6AC75,分别实现了33倍和34倍的荧光激活比。对于PDBA-BDY,PeT贡献了2.5倍的荧光激活,并且homo-FRET贡献了5.2倍(图18D)。
所提出的策略应用于若干类通常可得到的荧光团,包括BODIPY、罗丹明以及花菁家族衍生物,用于微调发射波长。所述策略具有将不同荧光团与pH敏感的聚合物区段进行混合匹配以创造出具有期望颜色和pH转变点的纳米颗粒而用于生物学研究的额外优点。此外,通过MTT测定进行的细胞细胞毒性研究已经示出,这些纳米颗粒组合物对于在200μg/mL下进行成像研究是安全的(细胞存活>90%,图19)。
4.在胞吞小泡内具有不同pH转变点的多色纳米颗粒的顺序激活。
小泡运输是真核细胞中在细胞内区室之间递送膜蛋白或可溶性货物(cargo)必不可少的过程(Maxfield,F.R.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004,5,121)。小泡pH是直接影响膜再循环、内体/溶酶体成熟和胞吞小泡之细胞内转运的关键参数(Izumi,H.,Cancer Treat.Rev.2003,29,541;Casey,J.R.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2010,11,50)。小泡pH通过多个膜泵或转运蛋白例如液泡(H+)-ATP酶、Na+/H+交换体(exchanger)和Cl-通道来进行精确调控(Nishi,T.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2002,3,94.;Ohgaki,R.,Biochemistry 2010,50,443)。
在该研究中,同时施加具有不同pH转变的多色纳米颗粒,并研究其在人H2009肺癌细胞内激活的空间-时间模式。纳米颗粒组由PDBA-BDY(pHt=5.2)、PDPA-TMR(pHt=6.4)和PC7A-C55(pHt=6.9)的混合纳米颗粒溶液组成。将每种纳米颗粒在相同培养基中控制在相同浓度(200μg/mL)下,并使用三个发射波长通过共焦激光扫描显微术进行活细胞成像。在一小时孵育后,移出混合的纳米颗粒溶液,并用新鲜培养基替换。因为每个纳米颗粒在pH 7.4下的外部细胞培养基中均是“沉默”的,所以可通过共焦显微术随时间监测H2009细胞内的纳米颗粒摄取和激活的动力学。在PDPA-TMR(pHt=6.4)荧光在第一小时开始出现且在3小时内稳定增加后,PC7A-C55(pHt=6.9)纳米颗粒首先被激活,并且其荧光强度增加并达到平台。对于PDPA-TMR(pHt=6.4)观察到的大多数点状荧光点与PC7A-C55(pHt=6.9)荧光点亚群共定位。最后,PDBA-BDY(pHt=5.2)纳米颗粒最后被激活。在孵育的前三小时内观察到很少的来自PDBA-BDY(pHt=5.2)的荧光,但是5小时后,PDBA-BDY(pHt=5.2)的激活荧光是完全可见的,并且有趣地是,其荧光定位是PDPA-TMR荧光定位的另一个亚群。为了进一步量化这些纳米颗粒的细胞内激活的时程,将各纳米颗粒随时间的荧光强度归一化为12小时时的荧光强度(图8),此时我们预计所有纳米颗粒都被完全激活。PC7A-C55、PDPA-TMR和PDBA-BDY荧光激活的一半时间分别被确定为0.6小时、1小时和4小时,表明了这些纳米颗粒的顺序激活。
多色纳米颗粒的顺序激活模式与其pH转变直接相关,其中具有较高pH转变的纳米颗粒比具有较低pH转变的那些纳米颗粒更早地被激活。该数据与沿胞吞运输通路的pH值变化趋势一致,其中小泡pH逐渐从pH7.4(细胞周边)降低为5.9至6.2(早期内体),然后降低为5.0至5.5(晚期内体/溶酶体)(Maxfield,F.R.,Nat.Rev.Mol. Cell Biol. 2004,5,121;Casey,J.R.,Nat.Rev.Mol. Cell Biol. 2010,11,50;Modi,S.,Nat.Nanotech.2009,4,325)。此外,在溶酶体中特异性激活的PDBA-BDY(pHt=5.2)之纳米颗粒激活的细胞内位置(Zhou,K.,Angem Chem.Int.Ed.2011,50,6109)与溶酶体的核周分布一致。这些数据证实,超pH响应的多色纳米平台在检测不同胞吞细胞器之间的小pH差异中有强的潜力。
总之,开发了通过使用通常可得到的pH不敏感染料创造了pH可调的多色荧光纳米颗粒系列之稳健和通用的系统。pH诱导的胶束化以及胶束核中荧光团的homo-FRET淬灭为独立控制pH转变(经聚合物)和荧光发射(具有小斯托克斯位移的染料)提供了机制。荧光波长可在例如绿光至近IR的发射范围(500nm至820nm)内进行微调。其荧光打开/关闭激活可在0.25个pH单位内实现,这比小分子pH传感器窄得多。这种多色的、pH可调的并且可激活的荧光纳米平台为研究与癌症、溶酶体贮积疾病和神经病症有关的基本细胞生理学过程,例如胞吞细胞器中的pH调节、受体循环和胞吞运输提供了有价值的工具。
5.材料和方法
2-(五亚甲基亚氨基)乙醇(C6A)和N,N,N′,N",N"-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)购自Sigma-Aldrich。2-(六亚甲基亚氨基)乙醇(C7A)和2-(二丁基氨基)乙醇(DBA)分别购自Alfa Aesar Company和TCIAmerica Inc.。4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-苯并二茚-8-丙酸、琥珀酰亚胺酯(BDIPY-NHS)、7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸琥珀酰亚胺酯(香豆素-NHS)、1-(3-(琥珀酰亚胺氧代羰基)苄基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)唑-2-基)吡啶鎓溴化物(PyPMO-NHS)和四甲基罗丹明NHS酯(NHS-TMR)购自Invitrogen Company。Cy5.5和Cy7.5NHS酯购自Lumiprobe Company。2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯(DPA)和2-氨基乙基甲基丙烯酸酯(AMA)购自Polyscience Company。用异丙醇和乙酸乙酯(3∶7)重结晶AMA两次。单体2-(二丁基氨基)乙基甲基丙烯酸酯(DBA)、2-(六亚甲基亚氨基)乙基甲基丙烯酸酯(C7A)、2-(五亚甲基亚氨基)乙基甲基丙烯酸酯(C6A)和PEG大分子引发剂(MeO-PEG114-Br)根据文献(Zhou,K.,Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,6109-6114)中的程序制备。其他溶剂和试剂来自Sigma-Aldrich或FisherScientific Inc,原样使用。
PEO-(PR-染料)嵌段共聚物的合成。首先通过原子转移自由基聚合(ATRP)法合成PEO-b-(PR-co-AMA)共聚物(图20中的方案1)。通过控制AMA单体与引发剂的进料比(比=1、3或6)将伯氨基引入每条聚合物链中。使用不含染料的共聚物进行聚合物表征(表1)。以PEO-b-P(DPA-co-AMA)为例来阐述该程序。首先,将DPA(1.7g,8mmol)、AMA(51mg,0.31mmol)、PMDETA(25μL,0.12mmol)和MeO-PEG114-Br(500mg,0.1mmol)装入聚合管中。然后,添加2-丙醇(2mL)和DMF(2mL)的混合物以溶解单体和引发剂。在经过三个冷冻-泵抽-解冻(freeze-pump-thaw)循环以移除氧之后,在氮气氛下将CuBr(16mg,0.11mmol)添加到反应管中并将所述管密封在真空中。在50℃下进行聚合8小时。聚合后,用10mL THF稀释反应混合物,并使其通过Al2O3柱以移除催化剂。通过旋转蒸发(rotovap)移除THF溶剂。将残余物在蒸馏水中透析并冻干以得到白色粉末。通过500MHz 1HNMR、凝胶渗透色谱(Viscotech GPCmax,Polymer Labs的PLgel 5μmMIXED-D柱,THF为洗脱液,1mL/分钟)表征所得的PEO-b-PR共聚物。表1列出了各共聚物的分子量(Mn和Mw)以及多分散指数(PDI)。
根据以下描述的代表性程序合成染料缀合的共聚物。对于TMR缀合,首先将PEO-b-(PR-co-AMA)(50mg)溶解于2mL DMF中。然后添加NHS-TMR酯(伯氨基之摩尔量的1.5当量)。在室温下将反应混合物搅拌两天。通过制备型凝胶渗透色谱(Varian的PLgel Prep 10μm300×25mm柱,THF为洗脱液,5mL/分钟)纯化共聚物以移除游离的染料分子。将产生的PEO-(PR-TMR)共聚物冻干并保持在-20℃下储存。
胶束纳米颗粒的制备。根据之前公开的溶剂蒸发法来制备胶束(Nasongkla,N.,Nano.Lett.2006,6,2427-24)。以PDPA-TMR胶束溶液为例,首先将10mg共聚物溶解于0.5mL THF中,然后在超声下逐滴添加到4mL蒸馏水中。通过用(100kD)膜超滤数次移除THF。然后添加蒸馏水以将聚合物浓度调节至5mg/mL或10mg/mL,作为原液。胶束形成后,通过透射电子显微术(TEM,JEOL 1200EX模式)表征纳米颗粒的胶束大小和形态学,并且通过动态光散射(DLS,Malvern MicroV模式,He-Ne激光,λ=632nm)表征其流体动力学半径(hydrodynamicradius,Rh)。
为了制备分子混合胶束,以1∶1重量比的PDPA-TMR和PEO-b-P(DPA-co-AMA)混合物为例。首先将PDPA-TMR共聚物(5mg)PEO-b-P(DPA-co-AMA)(5mg)溶解于0.5mL THF中,然后在超声下逐滴添加到4mL蒸馏水中。通过用(100kD)膜超滤数次来移除THF。然后添加蒸馏水以将聚合物浓度调节至5mg/mL或10mg/mL,作为原液用于后续研究。
PEO-(PDPA-AMA)的CMC测量。在pH 7.4下的0.2M磷酸钠缓冲剂中测量PEO-(PDPA-AMA)共聚物的临界胶束浓度(CMC)。首先,用相同的缓冲剂将共聚物原液(5mg/mL)稀释至不同浓度。在各溶液中,向2mL聚合物溶液添加5μL芘的THF溶液(2×10-4mol/L)以使最终芘浓度为5×10-7mol/L。以339nm的激发波长并且激发狭缝和发射狭缝分别为10.0nm和1.0nm,在Hitachi荧光光度计(型号为F-7500)上记录荧光光谱。I1值和I3值分别测量为大约372nm和382nm处的最大发射强度。不同pH值下绘制了I1/I3比值与聚合物浓度的函数。I1/I3比值反映出芘环境的极性,其中疏水胶束核中的芘部分导致I1/I3值降低。3,4CMC值测量为在溶液中形成胶束时的阈值聚合物浓度(Kalyanasundaram,K.,J.Am.Chem.Soc.1977,99,2039-2044;Winnik,F.M.,Chem.Rev.1993,93,587-614)。为了避免TMR干扰,在这些研究中使用没有TMR缀合的PEO-b-PR共聚物。
PDPA-TMR的pH滴定。首先将PDPA-TMR共聚物(80mg)溶解于5mL 0.1M HCl中,并用DI水稀释至2mg/mL。通过在搅拌下添加小体积(0.05mL至0.1mL增量)的0.02M NaOH溶液进行pH滴定。监测在2至11范围中的pH升高是NaOH之总添加体积(VNaOH)的函数。使用具有微电极的Mettler Toledo pH计来测量pH值。在滴定实验实验期间,取一系列pH点的~1mL溶液,并用0.45μm尼龙过滤器(Nylonfilter)进行过滤。然后通过DLS测量其流体动力学半径。在pH 5.8和pH 6.8下,通过TEM来表征溶液。
荧光和UV-Vis表征。在Hitachi荧光光度计(型号为F-7500)上得到荧光发射光谱。在Shimadzu UV-Vis分光光度计(型号为UV-1800)上进行UV-Vis光谱学研究。对于各共聚物,首先以6mg/mL的浓度在MilliQ水中制备样品。然后用具有不同pH值的0.2M柠檬酸-磷酸缓冲剂稀释原液。将聚合物终浓度控制为0.2mg/mL或0.5mg/mL。对于荧光寿命测量,在磷酸钠/柠檬酸缓冲剂中于pH=7.4和5.5(分别高于或低于pHt)下测量0.1mg/mL的PDPA-TMR的荧光衰减。还在pH=7.4和5.5下测量了游离TMR染料(5μg/mL)的荧光衰减。这些研究在由与染料激光器(GL302)连接的氮激光器(GL-3300)和频闪观测探测器组成的LaserStrobe荧光寿命仪表(Photon Technology International,Inc.,Birmingham,NJ)上进行。使用C-540A(Exciton,Inc.,Dayton,OH)染料溶液产生540nm的激发波长。在580nm的波长处分析衰减曲线。发射单色仪狭缝为4nm。所有测量均在室温下进行。通过测量来自糖原溶液的散射光来确定IRF(仪器响应函数)。通过使用PTI仪器提供的软件分析荧光强度衰减数据。
对于不同pH值下PDBA-BDY、PDPA-TMR、C7A-C55和C6A-C75溶液(每种样品100μg/mL)的荧光图像,根据仪器手册通过选择合适的带通激发过滤器以及合适的长通发射过滤器来使用Maestro成像系统(CRI,Inc.,Woburn,MA)。
细胞培养和胶束摄取的共焦成像研究。在补充有5%胎牛血清(FBS)、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基(Invitrogen,CA)中,在5%CO2气氛下于37℃培养人肺癌H2009细胞。
进行共焦成像研究之前,将H2009细胞铺板在玻璃底细胞培养皿(MatTek,MA)中的2mL完全RPMI培养基中,并与PDBA-BDY、PDPA-TMR和C7A-C55的混合纳米颗粒一起孵育,其中每种纳米颗粒浓度在不含酚的RPMI 1640培养基中为0.2mg/mL。孵育一小时后更换培养基。在不同时间点采集共焦图像。通过Image-J软件在相同条件下处理并分析所述图像。分析五次独立的测量并平均化为平均值±标准差。在指定的时间点用Nikon ECLIPSETE2000-E共焦显微镜以100×物镜采集图像。分别在488nm、543nm和623nm处激发PDBA-BDY、PDPA-TMR和C7A-C55。对于PDBA-BDY、PDPA-TMR和C7A-C55成像,分别使用FITC、TRITC和Cy5滤镜。
胶束纳米颗粒的体外细胞毒性评价。通过在补充有5%FBS的完全RPMI 1640培养基中将H2009细胞(在实验前12小时以10,000细胞/孔接种在96孔板中)与20μg/mL、0.2mg/mL或2mg/mL的不同胶束纳米颗粒孵育1小时来评估不同胶束纳米颗粒(PEG-PDBA、PEG-PDPA、PEG-PC7A)的细胞毒性。在用培养基洗涤以移除胞外颗粒后,再将细胞在完全培养基中培养12小时。然后在终点时向每个孔中添加MTT原液以得到0.5mg/mL的最终浓度,并继续培养4小时。在用100μL DMSO进行细胞处理后,使用微板阅读器测量490nm处的吸光度。细胞生存测量为经处理细胞相对于未处理细胞的UV吸光度之比。由六个重复样品来计算标准差。
6.微调的超-pH响应纳米颗粒用于高通量筛选内体pH的小分子调节剂。
pH在与多种人类疾病和代谢病症高度相关的胞吞运输和细胞表面受体(例如LDL受体)再循环中起着至关重要的作用。可调节亚细胞细胞器内pH的小分子是治疗内体功能缺陷之有前景的药物候选物。高通量筛选(HTS)是从化合物文库中鉴定先导分子的有力方法。为了进行HTS,有效的基于细胞的测定是必不可少的。本研究报道了一系列微调的超pH响应纳米颗粒的合成,其荧光信号可根据早期内体范围中的微小pH变化(pH 5.7至pH 6.3)而“打开”和“关闭”。该数据证实了这些纳米颗粒在通过共焦激光扫描显微术来检测早期内体pH变化中的可行性。这些结果还证实了这些纳米颗粒用于可调节内体pH之小分子的HTS的可行性。
方法:通过原子转移游离基聚合由聚(氧化乙烯)(PEO)和包含叔胺的单体合成了具有不同pH转变的一系列共聚物。通过控制2-(二丁基氨基)乙基甲基丙烯酸酯(DBA)与2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯(DPA)之比来精细调节共聚物的pH转变。使用四甲基罗丹明(TMR)作为荧光团并使其与共聚物缀合。使用制备型凝胶渗透色谱(Varian的PLgel Prep 10μm300×25mm柱,THF为洗脱液,5mL/分钟)来纯化聚合物样品。在Varian 1H 500MHz NMR上得到聚合物的1HNMR谱。用Hitachi荧光光度计(型号为F7000)得到荧光强度。
结果:合成了一系列具有敏锐pH转变(打开状态/关闭状态之间的ΔpH<0.25)的超pH响应纳米颗粒(纳米探针1至4)。图21A中示出了一种合成方案。通过改变DBA与DPA的单体比,精细地将pH转变点控制为pH 6.42(1)、pH 6.18(2)、pH 5.94(3)和pH 5.70(4)(图21B;表2)。这些细微差异揭示了共聚物组分中DBA的百分比与pH转变点之间的线性关系,从而可通过改变起始材料的比使用其来将pH转变精细地调节为特定值(图21C)。通过共焦激光扫描显微术,与没有小分子调节剂的孵育相比,将纳米探针和内体pH的小分子调节剂(例如尼日利亚菌素(nigericin))与HeLa细胞系一起孵育显示出更早的激活时间。对于在小pH调节剂存在下的内体pH检测,pH转变为5.94的纳米探针(3)比其他纳米探针示出特异性更大的激活。这些数据示出了该纳米颗粒在可调节内体pH之小分子的高通量筛选中的可行性。
表2.通过使用不同单体比得到的纳米探针的pH转变点
总之,证实了使用微调的超pH响应纳米颗粒来检测早期内体中之小pH变化的可行性。pH转变点可通过改变具有不同疏水性的两种单体的摩尔分数来进行微调。通过不同纳米探针建立了不同的激活时间窗口,从而可进一步用于筛选对胞吞细胞器具有酸化作用或酸化抑制的分子。
7.用于特定pHe和phi成像的UPS纳米探针
肿瘤微环境相对于常规癌细胞中心策略作为用于癌症诊断和治疗干预的新模式出现(Hanahan&Weinberg,2011)。肿瘤微环境在分子水平、细胞水平和组织水平上具有令人吃惊的复杂性和异质性(Gatenby&Gillies,2008,Swartz,等,2012,Joyce,2005)。在多种微环境信号中,无论哪种癌症类型,两种已识别的特征——肿瘤血管生成(Weis&Cheresh,2011,Folkman,2007)和低的胞外pH(pHe)(Webb,等,2011)——在实体瘤中都是普遍存在的。在该研究中,将对以下假设进行测试,即,靶向酸性肿瘤pHe和血管生成性血管系统的纳米探针可产生拓宽肿瘤检测特异性的稳健策略(图22)。
为了区分酸性肿瘤pHe(6.5至6.8)(Webb,等,2011)与血液(7.4)之间的小pH差异,必须建立可在此pH范围中可最大限度打开荧光信号的超pH响应纳米探针。为了这个目的,由聚(乙二醇)-b-聚(2-(六亚甲基亚氨基)乙基甲基丙烯酸酯)共聚物合成了UPSe纳米探针(图23a,表3)。使近红外染料Cy5.5(λex=675nm,λem=710nm)与共聚物的可离子化嵌段缀合。
表3.二嵌段共聚物的特征
a使用THF作为洗脱液通过GPC来确定数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)和多分散指数(PDI=Mw/Mn);
b通过1H-NMR确定。
UPSe纳米探针具有6.9的pH转变,以及极其敏锐的pH响应(ΔpH10-90%,10%荧光激活与90%荧光激活的pH差值为0.23)。在pH 6.7与pH 7.4之间,UPSe纳米探针的荧光激活比为102倍。相比之下,基于Henderson-Hasselbach方程对小分子pH传感器(pKa=6.9)进行的理论计算在该pH范围内仅产生2.6倍的荧光增加(图23b)。在血液pH下,UPSe纳米探针作为自组装胶束存在,直径为25.3±1.5nm,并且呈球形(图23d左图)。HomoFRET诱导的荧光淬灭导致胶束状态下的荧光团完全沉默(图23c)(Zhou,等,2012)。酸性pHe下的胶束解离(图23d右图)导致荧光信号大大升高(图23c、23e)。
为了在细胞的酸性胞吞细胞器(例如内体和溶酶体,phi=5.0-6.0)中实现特异性激活,由聚(乙二醇)-b-聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)共聚物产生了UPSi纳米探针(图23a)。UPSi纳米探针具有6.2的pH转变,并且ΔpH10-90%值为0.21。荧光的打开/关闭激活比为128倍(图24b和表4)。
表4.UPS纳米探针的特征
a由TEM测量,平均值±s.d.;b通过Cy5.5荧光发射强度确定。
为了对表达αvβ3的血管生成性肿瘤内皮细胞进行成像,用10%cRGDfK(cRGD)肽通过巯基-马来酰亚胺键合使UPSi表面官能化,示于以下方案中。
虽然cRGD编码的UPSi纳米探针(24.5±1.1nm)在血液pH和酸性肿瘤pHe下是稳定的,但是其可在受体介导的胞吞作用后在肿瘤内皮细胞的溶酶体内被选择性地激活(参见以下数据)。如经24小时孵育后荧光强度的可忽略变化所标明的,UPSe纳米探针和UPSi纳米探针在新鲜制备的小鼠血清中均是稳定的(图23e和图24e)。
a.在具有肿瘤的小鼠中通过UPSe纳米探针对酸性pHe进行成像
为了研究UPSe纳米探针对pHe成像的特异性,评价了两种肿瘤糖酵解抑制剂,并检查了其对细胞培养物中之胞外pH的作用。第一种试剂是2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG),其竞争性地抑制通过细胞表面葡萄糖转运蛋白(GLUT)进行的葡萄糖摄取并随后抑制通过己糖激酶进行的磷酸化;第二种试剂是α-氰基-4-羟基肉桂酸酯/盐(CHC),其是防止乳酸从癌细胞中分泌的单羧酸转运蛋白(MCT)的自杀抑制剂(图25a)(Sonveaux,等,2008)。体外细胞培养实验示出两种试剂均使A549肺癌细胞中的葡萄糖摄取和乳酸分泌显著降低(图25b)。此外,2-DG和CHC的处理减缓了细胞培养基的酸化(对于2-DG,ΔpH为0.15对0.10,对于CHC,ΔpH为0.19对0.10,图25c)。
为了进行体内肿瘤成像研究,将UPSe纳米探针(10mg/kg)静脉内注射到具有至皮下A549肺癌异种移植物的小鼠中(每组n=4)。对于对照组,在UPSe施用前12小时注射2-DG(250mg/kg)或CHC(250mg/kg)。对具有肿瘤的小鼠进行的近IR成像(λex=675nm,λem=710nm)示出,在UPSe注射后24小时内肿瘤中的荧光信号稳定升高,而正常组织中为背景抑制(图25d、25e)。从5分钟至24小时,肿瘤中的NIR荧光强度增加了10.9±1.7倍(图25d、图25e)。相比之下,用代谢抑制剂进行的预处理导致与单独使用UPSe相比显著的信号降低(例如,对于2-DG,2.3±0.7倍(P=0.004),并且对于CHC,3.2±0.6倍(P=0.007))。
24小时后,处死小鼠并对切除的器官进行成像。对离体图像的量化示出单独使用UPSe的T/N比(肿瘤相对于正常肌肉的荧光强度)为12.9(图25f)。脑、心脏、皮肤、肌肉、脂肪和胰腺中的荧光强度与肌肉中是相当的。2-DG和CHC对照组在离体器官中显示出相似的低荧光强度(图26),而肿瘤强度分别比单独UPSe注射的小鼠低4倍和3倍,这与体内成像结果一致(图25e)。这些数据极大地支持了这样的假设:UPSe纳米探针可特异性地检测酸性肿瘤pHe,并且所述探针可在起始治疗后24小时内感知代谢变化。
对整体封装肿瘤切片的免疫染色(图25g)示出了纳米探针信号(灰色)与通过哌莫硝唑进行的缺氧染色之间的良好相关性,这与肿瘤缺氧区酸性更大的先前报道(Gatenby&Gillies,2004)一致。有趣地是,纳米探针的激活谱与肿瘤血管密度(在肿瘤周边高)(CD31染色)不相关(图27)。此外,纳米探针激活图谱延伸到了由哌莫硝唑检测的缺氧区之外,这可能是由于低的pH,特别是<6.8的pH,显著地降低了哌莫硝唑与癌细胞的结合(Kleiter,等,2006)。
b.通过cRGD-UPSi纳米探针对血管生成性肿瘤血管系统进行的特异性成像
构建cRGD编码的UPSi纳米探针(cRGD-UPSi,图28a)以通过αvβ3整联蛋白(已确定的肿瘤内皮细胞的血管生成性生物标志物)的非线性信号放大来特异性地对血管生成性肿瘤血管系统进行成像。cRGD肽与αvβ3整联蛋白结合,导致了受体介导的胞吞cRGD-UPSi到酸性胞吞细胞器中用于荧光激活(图28b)。用cRGD-UPSi、不含cRGD的UPSi(UPSi)和50倍摩尔过量的游离cRGD肽处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC),然后用cRGD-UPSi纳米探针处理以证实概念验证。因为纳米探针在细胞培养基中是“沉默”的,所以可能直接测量纳米探针内在化和激活的动力学,而无需移除培养基。在cRGD-UPSi孵育三十分钟后,在HUVEC细胞内观察到点状荧光激活。在3小时时,相对于UPSi对照组和无cRGD对照组,观察到cRGD-UPSi组的荧光增加了11倍(图29)。在用cRGD-UPSi处理的细胞中,几乎所有的荧光点都与LysoTracker染料共定位(图30),证实了cRGD-UPSi纳米探针在晚期内体和溶酶体中被激活。
为了进行体内肿瘤成像研究,将cRGD-UPSi或UPSi(10mg/kg)静脉内注射至具有A549肿瘤的小鼠中(每组n=4)。作为对照,在cRGD-UPSi纳米探针施用前30分钟,注射阻断剂量的cRGD肽(25mg/kg)。注射后30分钟时相对于两个对照组,cRGD-UPSi组在肿瘤中产生了显著更高的荧光信号。注射后5分钟至6小时中,肿瘤中的NIR荧光强度提高了12.3±1.8倍(图28c)。与cRGD-UPSi相比,UPSi和游离cRGD预处理对照在6小时范围内具有肿瘤中最小的荧光增加(分别为1.4±0.2倍,P=0.002,和1.8±0.4倍,P=0.003)。图28d示出在肿瘤相对于正常组织中纳米探针荧光激活的体内动力学。cRGD-UPSi的T/N比稳定升高,并在6小时处达到峰值13.8±1.4(图31),而UPSi在3小时处达到其峰值1.4±0.2。离体成像示出,尽管肿瘤累积百分比相当(例如,在注射后6小时时分别为2.49±0.44%ID/g相对于2.11±0.59%ID/g,图28h),但是cRGD-UPSi的T/N比为16.1,而UPSi对照产生<2倍的荧光增强(图28e、图28f和图32)。当与市售的“始终打开”的cRGD-NIR染料800CW缀合物相比时,其中在24小时范围内观察到最大2倍的T/N比并且具有强的背景荧光信号,更明显地说明了通过在血管生成性肿瘤血管系统中cRGD-UPSi的信号放大策略(图33)。
对肿瘤切片进行免疫染色(图28i和图34)以验证cRGD-UPSi激活的定位。用经Alexa 488标记的抗CD31来对肿瘤血管进行染色。对于cRGD-UPSi,发现大部分纳米探针激活与肿瘤血管系统共定位(图28i中的浅色)。相比之下,在UPSi对照组和游离cRGD阻断对照组中,观察到低水平的纳米探针激活。在这些肿瘤切片中,在肿瘤血管系统的外侧发现了纳米探针激活的零星斑点,说明非血管细胞通过不依赖于αvβ3的通路也可摄取小的纳米探针群。
c.UPSe纳米探针和UPSi纳米探针的药代动力学、生物分布和安全性的评价
为了表征UPSe/UPSi纳米探针的药代动力学和生物分布,通过对相应共聚物中的游离氨基进行乙酰化(-COCT3)合成了3H-标记的纳米探针(表4)。以相同剂量(10mg/kg,或2.0mCi/kg)注射3H-标记的UPSe纳米探针、3H-标记的cRGD-UPSi纳米探针和3H-标记的UPSi纳米探针用于成像研究(每组n=5)。对于所有的三种组合物,血浆浓度-时间曲线示出了24小时内的两相行为(图28g和图35)。UPSe、cRGD-UPSi和UPSi的α-相半衰期(t1/2,α)分别为1.0±0.2小时、2.3±0.5小时和4.3±0.7小时。UPSe、cRGD-UPSi和UPSi的β-相半衰期(t1/2,β)分别为7.5±0.3小时、17.0±1.8小时和19.6±2.1小时。对于UPSi,cRGD表面官能化导致血液半衰期降低,与其他cRGD编码的纳米颗粒系统一致(Huang等,2010)。
生物分布研究示出,UPSe/UPSi纳米颗粒的肿瘤摄取(2%ID/g组织至3%ID/g组织)比大多数正常组织(心脏、肺、肾和肌肉,图28h和表5至表7)高。在三种纳米探针组合物中,没有观察到肿瘤分布的统计学显著差异(例如,在注射后24小时时,UPSe、cRGD-UPSi和UPSi分别为2.4±0.7%、3.4±1.1%、3.0±1.3%ID/g。对于每对对比,P>0.05)。RES系统(即,肝和脾)是大部分纳米探针摄取(20%ID/g至50%ID/g)的原因。当于3H-标记实验的UPS浓度使肿瘤和血液NIR荧光荧光强度归一化时,在肿瘤与血液之间的UPSe纳米探针和cRGD-UPSi纳米探针发现差异超过300倍(表5至7)。
表5.UPSe纳米探针在24小时时的生物分布和组织荧光(n=4)
a将肿瘤和器官的NIRF信号(%ID/g)比值归一化至血液。
表6.UPSi纳米探针在6小时和24小时之时的生物分布和组织荧光(n=4)
a将肿瘤和器官的NIRF信号(%ID/g)比值归一化至6小时时的血液。
表7.cRGD-UPSi纳米探针在6小时和24小时之时的生物分布和组织荧光(n=4)
a将肿瘤和器官的NIRF信号(%ID/g)比值归一化至6小时时的血液。
为了评价纳米探针的毒性,在注射纳米探针(10mg/kg)后24小时和7天系统地研究动物体重、肝肾功能和RES的组织学变化。结果示出没有重量损失,肝肾功能(例如天冬氨酸转氨酶和谷草转氨酶,图36)没有统计学显著性变化并且RES组织学正常(数据未示出),证实了这些纳米颗粒的安全性。
d.用于组合的酸性pHe和肿瘤血管系统成像的整合纳米探针(iUPS)
在建立了UPSe激活和cRGD-UPSi激活的机制后,研究肿瘤微环境中UPSe激活和cRGD-UPSi激活的空间模式。利用活体显微术和小鼠中的皮下A549肺肿瘤异种移植物作为我们的模型系统。为了区分两种纳米探针,分别用四甲基罗丹明(TMR,λex/λem=550/580nm)和罗丹明G(RhoG,λex/λem=502/527nm)标记UPSe和cRGD-UPSi。静脉内共注射该双探针,并随时间进行成像。图37a示出了注射后6小时时互补的空间激活模式:cRGD-UPSi-RhoG激活主要限制于肿瘤血管中,而证明UPSe-TMR在肿瘤实质的间质空间中激活。两种纳米探针都未在肿瘤血管系统内示出可观察到的荧光,证实它们在血液中保持“沉默”。
为了利用pHe和肿瘤血管系统激活的协同作用,构建了整合的cRGD-UPSe-Cy 5.5纳米探针(iUPS),并在10种不同的肿瘤模型中研究了其肿瘤成像功效。这些模型包括转基因MMTV-PyMT乳腺癌、几种原位癌(肺癌、头颈癌、前列腺癌)以及多种皮下癌症模型(脑癌、胰腺癌)。在所有的10种肿瘤模型中,相对于周围的正常组织/器官,在肿瘤微环境中观察到了普遍的纳米探针激活(图37b和图38a-图38j)。在许多模型中,由于组合pHe和肿瘤血管系统信号二者的累加效应,得到了更高的T/N比值(~20)。
最后,比较了小分子叶酸-FITC缀合物与iUPS纳米探针(I期临床试验)在具有原位HN5头颈癌的小鼠中的成像功效。将iUPS纳米探针和叶酸-FITC静脉内共注射于具有肿瘤的小鼠中。在注射后24小时,通过叶酸-FITC仅观察到小区域的原位HN5肿瘤,而iUPS纳米探针显示出整个肿瘤以及局部的结节转移(图39)。叶酸-FITC结果与许多头颈癌细胞不表达叶酸受体的事实相一致。这些数据突出了使靶向肿瘤微环境作为实现宽肿瘤特异性之更稳健且更通用策略的成功。
e.材料和方法
材料.环RGDfK(cRGDfK)肽购自Peptides International Inc.(Kentucky,美国)。Hoechest33342、胎牛血清、青霉素链霉素和细胞培养基得自于InvitrogenInc.(OR,美国)。Amicon超-15离心过滤管(MWCO=100K)来自Millipore。Cy5.5NHS酯得自于Lumiprobe Company。单体2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯(DPA-MA)和2-氨基乙基甲基丙烯酸酯(AMA)来自于Polyscience Company。2-(六亚甲基亚氨基)乙基甲基丙烯酸酯(C7A-MA)和PEG大分子引发剂(MeO-PEG5k-Br)根据Zhou等,2011描述的方法制备,其通过引用并入本文。其他有机溶剂是来自Sigma-Aldrich或Fisher Scientific Inc的分析级。
染料缀合的嵌段共聚物的合成。通过原子转移自由基聚合(ATRP)法合成两种不同的嵌段共聚物(即,PEG-b-(PR-co-AMA))(在下面的方案中示出)。不含染料的共聚物用于进行聚合物表征(表8)。为了近红外荧光染料(Cy5.5)或氚(3H或T)标记的缀合,在共聚物合成中使用氨基乙基甲基丙烯酸酯(AMA)。通过控制AMA单体与引发剂的进料比(摩尔比=6)向每条聚合物侧链中引入六个伯氨基。
以PEG-b-P(DPA-co-AMA)为例来阐述该程序。首先,将异二丙基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DPA,1.71g,8mmol)、AMA(100mg,0.6mmol)、PMDETA(21μL,0.1mmol)和MeO-PEG114-Br(0.5g,0.1mmol)装入聚合管中。然后,添加2-丙醇(2mL)和DMF(2mL)的混合物以溶解单体和引发剂。经过三个冷冻-泵抽-解冻循环以移除氧后,在氮气氛下向反应管中添加CuBr(14.4mg,0.1mmol),并且将该管密封在真空中。在40℃下进行聚合12小时。在聚合后,用10mL THF稀释反应混合物并使其通过Al2O3柱以移除催化剂。通过旋转蒸发移除THF溶剂。将残余物在蒸馏水中透析并冻干以得到白色粉末。通过1H 500MHz NMR、凝胶渗透色谱(Viscotech GPCmax,Polymer Labs的PLgel 5μmMIXED-D柱,THF为洗脱液,1mL/分钟)来表征所得的PEO-b-P(DPA-co-AMA)共聚物。表8列出了各共聚物的产率、分子量(Mn和Mw)和多分散指数(PDI)。
表8.二嵌段共聚物的特征
a使用THF作为洗脱液通过GPC来确定数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)和多分散指数(PDI=Mw/Mn);
b通过1H NMR确定。
对于Cy5.5缀合,首先将50mg PEG-b-P(DPA-co-AMA6)或PEG-b-(PC7A-co-AMA6)溶解于2mL无水DMF中。然后,添加Cy5.5NHS酯(伯氨基摩尔量的1.5当量)。在室温下将反应混合物搅拌两天。通过制备型凝胶渗透色谱(Varian的PLgel Prep 10μm300×25mm柱,THF为洗脱液,5mL/分钟)纯化聚合物缀合物,以移除游离的染料分子。将所得的聚合物缀合物冻干并储存于-20℃下。
马来酰亚胺封端的聚(乙二醇)-b-聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(MAL-PEG-b-PDPA)的合成。首先,将N-马来酰基-β-丙氨酸1(250mg,1.5mmol)和呋喃(2.2mL,30mmol)溶解于10mL苯中。将溶液回流过夜。反应后,浓缩所述溶液,然后通过快速色谱纯化以得到化合物2。
1H NMR(TMS,CDCl3,ppm):6.52(2H,=CHCH(O-))-),5.28(2H,=CHCH(O-))-),3.66(2H,-NCH2CH2-),2.87(2H,-(-O)CHCH(CH)-),2.55(2H,-NCH2CH2-)
产率:65%。然后将化合物2(48mg,0.20mmol)和N-羟基马来酰亚胺(25mg,0.22mmol)溶解于5mL二氯甲烷(DCM)中。向上述溶液添加N,N′-二环己基碳二亚胺(50mg,0.24mmol)。将溶液在室温下搅拌2小时后,添加HO-PEG5K-NH2(500mg,0.1mmol),并将反应溶液持续搅拌过夜。过滤反应溶液,然后将滤液倒入50mL冷乙醚中。收集沉淀并干燥用于下一步反应。将以上产物溶解于5mL DCM中并添加三乙胺(70μL,0.5mmol)。然后添加α-溴异丁酰溴化物(65μL,0.5mmol)并将溶液搅拌过夜。将反应溶液倒入50mL冷乙醚中并收集沉淀。通过两次溶解-和-沉淀循环进一步纯化产物,然后干燥。
1H NMR(TMS,
CDCl3,ppm):6.52(2H,=CHCH(O-))-),5.26(2H,=CHCH(O-))-),4.33(2H,-CH2OC(O)2-),3.93~3.30(460H,-NCH2CH2O(CH2CH2O)114-),2.87(2H,-(-O)CHCH(CH)-),2.55(2H,-NCH2CH2-),1.92(6H,-C(O)C(CH3)2Br)
产率:59%。将DPA(479mg,2.24mmol)、PMDETA(7.0μL,0.034mmol)和前(pro)MAL-PEG114-Br(150mg,0.028mmol)装入聚合管中。然后,添加2-丙醇(0.50mL)和DMF(0.50mL)的混合物以溶解单体和引发剂。经过三个冷冻-泵抽-解冻循环以移除氧后,在氮气氛下向反应管中添加CuBr(4.5mg,0.031mmol),并且将该管密封在真空中。在50℃下进行聚合8小时。聚合后,用10mL THF稀释反应混合物并使其通过Al2O3柱以移除催化剂。通过旋转蒸发移除THF溶剂。将残余物在蒸馏水中透析并冻干以得到白色粉末,产率为65%。通过1H NMR(500MHz)、凝胶渗透色谱(Viscotech GPCmax,Polymer Labs的PLgel 5μmMIXED-D柱,THF为洗脱液,1mL/分钟)来表征前MAL-PEG-b-PDPA共聚物。共聚物的分子量(Mn和Mw)和多分散指数(PDI)在表8中示出。最后,将200mg前MAL-PEG-b-PDPA共聚物溶解于10mL甲苯中。将反应溶液回流过夜。移除甲苯。将残余物在蒸馏水中透析并冻干以得到白色粉末,产率为95%。
UPS纳米探针的合成和特征。通过原子转移自由基聚合(ATRP)法(上文已描述)合成了染料缀合的MeO-PEG-b-PDPA和MeO-PEG-b-PC7A以及马来酰亚胺封端的嵌段共聚物。根据先前公开的程序(Nasongkla,等,2006,其通过引用并入本文)制备了cRGD-UPSi纳米探针。在典型程序中,将2mg MAL-PEG-b-PDPA和18mgMeO-PEG-b-PDPA-Cy5.5溶解于1mL THF中。然后,在超声下缓慢地将混合物添加至4mL Milli-Q水中。使用微超滤系统将混合物过滤4次以移除THF。在胶束形成后,向胶束溶液添加过量的cRGDfK和0.05MHEPES/0.01M EDTA水溶液中的0.05M羟胺。使缀合进行4小时,然后通过过滤移除胶束溶液中的任何沉淀。过滤cRGD-UPSi纳米探针6次以移除游离的cRGDfK肽。为了制备UPSi纳米探针或UPSe纳米探针,将20mg的MeO-PEG-b-PDPA-Cy5.5或MeO-PEG-b-PC7A-Cy5.5溶解于1mL THF中。缓慢地将溶液添加至4mL的Milli-Q水。然后,过滤混合物4次以移除THF,随后过滤以移除溶液中的沉淀。使用1H-NMR来确认核-壳结构的形成以及cRGD肽与胶束表面的缀合。通过cRGD的苯基质子在7.4ppm下的外观来验证cRGD在胶束表面的成功缀合。用1%磷钨酸负染色进行透射电子显微术检查,并在JEOL 1200EX电子显微镜(JEOL 1200EX)上观察。
UPS纳米探针的荧光激活。在Hitachi荧光光度计(型号为F-7500)上得到不同pH缓冲溶液中UPS纳米探针的荧光发射光谱。对于每种UPS纳米探针,在Milli-Q水中制备样品(5mg/mL)。然后在具有不同pH值的50mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释溶液。将聚合物终浓度控制为0.1mg/mL。在675nm处激发纳米探针,并从690nm至770nm收集发射光谱。使用710nm处的发射强度来量化UPS纳米探针的信号放大。使用“橙色”滤镜(645nm至820nm)在Maestro体内成像系统(CRI.Inc.Woburn,MA)上采集不同pH下UPSi纳米探针溶液和UPSe纳米探针溶液(0.1mg/mL)的荧光图像。
体外血清稳定性.收集新鲜小鼠血清并通过0.22μm注射过滤器进行过滤。然后,向2mL血清中添加0.2mL cRGD-UPSi纳米探针或UPSe纳米探针(2mg/mL)。在湿室中于37℃下孵育混合物。在每一指定的时间点收集血清混合物的100μL等分试样,并通过Maestro体内成像系统在相同设定下立即成像以量化荧光强度。
细胞培养。用于体内移植的肿瘤细胞系包括A549肺癌细胞、MDA-MB-231乳腺癌细胞、HN5和HCC4034头颈癌细胞、SF-188神经胶质瘤细胞、LN-229神经胶质瘤细胞、3LL肺癌细胞、Mia Paca-2胰腺癌细胞和PC-3前列腺癌细胞。在具有10%胎牛血清和抗生素的DMEM中培养细胞。
动物模型。雌性无胸腺nu/nu小鼠(18g至22g)购自Charles River(Wilmington,MA)。将A549细胞(5×106/小鼠)经皮下接种于小鼠的右胁。移植后三周至四周,将具有200mm3至300mm3肿瘤大小的动物用于药代动力学、生物分布和成像研究。为了证实整合纳米探针的通用成像应用,建立了原位肿瘤模型,包括HN5和HCC4034头颈癌、PC-3前列腺癌和3LL Lewis肺癌。具有多病灶乳腺肿瘤的MMTV-PyMT转基因小鼠由DeBerardinis博士的实验室建立。建立了皮下肿瘤模型,包括MDA-MB-231乳腺癌、SF-188神经胶质瘤、LN-229神经胶质瘤和MiaPaca-2胰腺癌。
药代动力学和生物分布的研究。由90%MeO-PEG-b-PDPA-C(O)CT3和10%MAL-PEG-b-PDPA制备了3H-标记的cRGD-UPSi。分别由MeO-PEG-b-PDPA-C(O)CT3和MeO-PEG-b-PC7A-C(O)CT3制备了UPSi和UPSe。对于药代动力学实验,将具有A549肿瘤的小鼠随机分成cRGD-UPSi、UPSi和UPSe三组(每组n=4至5)。向小鼠静脉内注射胶束溶液。在注射后2分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时、12小时和24小时收集血液。通过以5,000g离心10分钟分离血浆(20μL)。随后将血浆与组织增溶剂溶液(1mL,BTS-450;Beckman)在室温下混合12小时,接着添加液体闪烁混合物(10mL,Ready Organic,Beckman),保持24小时。通过液体闪烁计数器(Beckman LS 6000IC)测量放射性同位素的量。在具有A549肿瘤的小鼠的不同组(每组n=4)中进行cRGD-UPSi纳米探针、UPSi纳米探针和UPSe纳米探针在肿瘤和其他器官中的生物分布。在预先指定的时间点(6小时和24小时)用PBS缓冲剂(30mL)灌注小鼠。对切除的器官进行称重,均质化,并用闪烁混合物处理。不同器官/组织中的纳米探针分布计算为每克组织的注射剂量百分比(%ID/g)。
体内和离体NIR荧光成像。为了进行肿瘤血管系统成像,将cRGD-UPSi或UPSi(10mg/kg)静脉内施用于具有A549肿瘤的小鼠(每组n=4)。使用“橙色”滤镜在Maestro体内成像系统上采集时程荧光图像。为了说明αvβ3-介导之胞吞的作用,在cRGD-UPSi注射前30分钟向小鼠组注射cRGDfK(25mg/kg)。
为了进行pHe成像,将UPSe(10mg/kg)注射至具有A549肿瘤的小鼠中(每组n=4)。使用“橙色”滤镜在Maestro系统上采集时间推移的NIR图像。作为对照,在UPSe纳米探针施用前12小时注射2-DG(250mg/kg)或CHC(250mg/kg)。然后,在预先指定的时间点监测小鼠。
使用上述的十种肿瘤模型来证实cRGD-UPSe-Cy5.5整合纳米探针在肿瘤微环境成像中的普遍适用性。将整合纳米探针(10mg/kg)静脉内施用于具有肿瘤的小鼠中(每种肿瘤模型n=4)。在注射后24小时时,使用“橙色”滤镜在Maestro系统上采集荧光图像。
通过比较肿瘤中与除肿瘤部位外整个身体的平均荧光强度来确定肿瘤/正常组织(T/N)比。在成像结束时处死小鼠。切除肿瘤和所选器官,并通过Maestro系统成像。量化离体肿瘤的荧光强度,并归一化为肌肉和血液的值。
活体成像。用异氟烷麻醉具有A549肿瘤的小鼠,并用双通道法在Nikon ECLIPSE活体显微镜(Nikon,日本)下固定,其中一个通道用于对肿瘤血管系统中的cRGD-UPSi纳米探针的激活进行成像,并且另一个通道用于探测酸性肿瘤微环境中UPSe纳米探针的信号放大。将cRGD-UPSi-RhoG(10mg/kg,绿色)和UPSe-TMR(10mg/kg,红色)的混合物静脉内注射至具有肿瘤的小鼠中(n=4)。用具有1024×768像素分辨率的10x Nikon物镜采集图像。
免疫荧光染色。在肿瘤血管系统成像研究中,在注射后6小时时处死小鼠。将肿瘤急冻并切成8-μm切片。将切片在冷丙酮中固定并用PBS漂洗三次,并用10%BSA在室温下封闭1小时。随后,将切片与大鼠的抗小鼠CD31抗体(1:50,BD Biosciences)一起于4℃下孵育过夜。接着,添加Alexa染料缀合的二抗(1:100)以对切片进行染色。载用包含DAPI的培养基封装载片。用荧光显微镜(Nikon ECLIPSETE2000-E,日本)采集图像。
在pHe成像研究中,向具有肿瘤的小鼠静脉内注射UPSe(10mg/kg)。在注射后5小时时,向动物注射哌莫硝唑(60mg/kg)。一小时后,收集肿瘤,冷冻并切成8-μm切片。使相邻的肿瘤切片在室温下暴露于稀释在封闭溶液中的一抗,保持1小时。使用的一抗如下:以1∶50稀释的FITC缀合的鼠抗哌莫硝唑单克隆抗体(HPI Inc.);以1∶50稀释的大鼠抗小鼠CD31抗体以及兔抗小鼠Ki-67抗体(Millipore)。用PBS洗涤切片三次,并与合适的二抗孵育1小时。用Alexa缀合的二抗(1∶100)来检测CD31。用Cy2缀合的山羊抗兔抗体(1∶100)来检测Ki-67。使用具有数字照相机的计算机控制的机动台(motorized stage),用由Nikon荧光显微镜组成的图像分析系统来扫描切片。所有图像在×200放大率下进行扫描。从单独的显微图像通过软件生成了切片的合成图像。
统计学分析。数据以平均值±s.d.示出。使用配对的双侧学生t检验来评估组间的差异。将*P<0.05视为显著,并且**P<0.01视为高度显著。
体外代谢研究。使用分别溶解于DMSO缓冲剂和PBS缓冲剂中的α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHC,1M)原液和2-脱氧葡萄糖(2-DG,1M)原液。如先前描述地以最小修改2进行代谢研究。简言之,将A549细胞(1.2×106/孔)接种于6孔板中,并孵育24小时后进行抑制研究。在实验开始时移除培养基并替换为包含抑制剂或载剂对照的培养基。随后用自动电化学分析仪(BioProfile Basic-4分析仪,NOVA)测量培养基中的葡萄糖浓度和乳酸/盐/酯浓度。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒分析细胞沉淀中的蛋白质浓度。添加抑制剂6小时后进行代谢测定。抑制剂添加24小时后用pH计(Mettler-Toledo International Inc.,Columbus,OH)测量培养基的pH。
HUVEC细胞中UPSi纳米探针的荧光激活及其定位。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)得自于Lonza,并且保存于具有EGM singlequot的EBM中。使用处于指数生长期的HUVEC,并且所有实验都在通路(passage)<6下进行。使用共焦扫面显微术来研究HUVEC中cRGD-UPSi纳米探针的细胞摄取和细胞内分布。为此,将细胞铺于玻璃底培养皿(MatTek,MA)的2mL完全培养基中,并以0.2mg/mL的聚合物浓度在pH 7.4下与cRGD-UPSi或UPSi一起孵育。在添加胶束后3小时采集共焦图像。在竞争性实验中,用20倍摩尔过量的cRGDfK预处理HUVEC,随后使cRGD-UPSi与细胞孵育3小时。使用Image-J软件分析图像。将五次独立的测量表示为平均值±标准差。对于共定位实验,在溶酶体和线粒体标记的摄取研究结束时,使细胞分别与(50nM)或(100nM)孵育15分钟。然后将细胞用PBS洗涤三次。对于每个共焦研究通过Nikon ECLIPSE TE2000-E共焦显微镜用相同的设定对细胞进行成像。
急性毒性。将十五只无胸腺裸鼠(20g至24g,6周至8周)随机分成两组。对照组包含5只小鼠并且实验组包含10只小鼠。经尾静脉将iUPS整合纳米探针(10mg/kg)静脉内施用于实验组小鼠。在暴露后,记录每组小鼠的生命体征(vital sign)和死亡率。在第一天处死实验组的一半小鼠并在第七天杀死剩下的一半。在5,000g下离心血液样品(~0.8mL/小鼠至~1mL/小鼠)10分钟以分离血清。基于丙氨酸转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(GOT)的血清水平评价肝功能。通过血尿素氮(BUN)和肌酸酐(Cr)确定肾毒性。收集心脏、肝、脾、肺和肾的组织,并立即固定于10%福尔马林中用于进行组织病理学检查。
8.使用超pH敏感性纳米探针进行淋巴管和血流中的肿瘤细胞运输的
实时成像
肿瘤转移导致癌细胞从身体的一个部位迁移至身体的另一个部位,常常导致形成新的转移瘤或转移。癌症患者的主要病因是肿瘤转移。肿瘤可迁移并扩散至身体的其他部位或不同器官存在三种原理方式:通过循环(血液)系统,称为血源性的;通过淋巴系统;以及通过身体壁进入腹腔和胸腔,称为种植性的(trnascoelomic)。淋巴迁移和循环迁移都似乎是主要的迁移模式,而种植性迁移相对不常见。对于骨组织肿瘤和软组织肿瘤(例如肉瘤),循环系统通常是常见模式,而对于黑素瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤和胃肠肿瘤,淋巴系统是常见的转移方法。因为肿瘤转移在癌症的临床进展中至关重要,所以UPS纳米探针可用于血流和淋巴管中肿瘤细胞运输的实时荧光成像。
为了研究使UPS纳米探针用于该目的,使用以不同浓度掺入全血的A549细胞(EGFR++)进行离体研究。本研究尝试在小鼠的血液中是否可鉴定出稀有的循环肿瘤细胞。使用F比≥100并且纳米探针浓度为200μg/mL的Fab′-UPSi-TMR纳米探针测试血液中细胞的不同浓度(10CTC/mL血液、100CTC/mL血液和1000CTC/mL血液)。将掺杂后的全血与纳米探针一起孵育3小时,并使用Nikon共焦显微镜对细胞进行观察。
在600X和2,400X放大率下,癌细胞在全血中均是可见的(图40)。对人HNC患者进行的相似研究允许在600X放大率下使细胞可视化(图41)。
9.使用官能化的PDPA-TMR-Fab′纳米探针和PDPA-TMR-FA纳米探
针对不同癌细胞系进行的体外成像、体内成像和离体(In Intro)成像
此外,可使用调节探针对不同细胞类型之选择性的不同靶向部分官能化在部分7中描述的纳米探针。还已经合成了两种不同的官能化纳米探针以帮助更特异地靶向不同细胞类型。已经使用Erbitux单克隆抗体合成了Fab′纳米颗粒。在胃蛋白酶的酸性溶液中切割Erbitux抗体。在37℃下加热反应1小时,然后通过添加1M Tris直至溶液pH达到pH 6进行淬灭,然后使用FPLC对其纯化以得到经纯化的F(ab′)2。将F(ab′)2添加至10mM EDTA和8当量的1mg/mL水性DTT。将反应加热至37℃保持4小时,然后使用PD-10柱纯化以得到经纯化的Fab′抗体片段。将所述片段添加至包含10%PEG-PDPA-马来酰亚胺的溶液并使其搅拌过夜。纯化反应混合物,并通过微超滤浓缩至5mg/mL。
为了鉴定添加额外靶向部分的作用,在pH 7.4下将纳米探针与7种不同细胞系一起孵育,聚合物浓度为0.1mg/mL。然后使用共焦显微术监测细胞。如图42至48所示,相对于未官能化的纳米探针,包含Fab′片段的纳米探针示出靶细胞的可视化增加。PDPA-TMR示出很少的细胞可视化至没有细胞可视化,而在90分钟至120分钟后,所有的7种细胞系都在一些细胞内示出一些荧光,其中细胞系H2009和HN5(图42和44)在120分钟后示出最亮的荧光。此外,使用Erbitux抗体进行了竞争性实验。将20倍摩尔过量的Erbitux和PDPA-TMR-Fab′与细胞一起孵育2小时。在所述竞争性实验中,纳米探针不再示出细胞的任何可视化,因为抗体已经从测试的所有细胞系的细胞中取代了纳米探针(图42至48)。
相对于不含抗体片段的纳米探针,使用PDPA-Fab′探针上的不同荧光团仍然允许选择性的细胞可视化(图49)。此外,探针在体内发挥作用使得在具有肿瘤的小鼠中对HN5肿瘤进行成像。将PDPA-TMR-Fab′静脉内施用于小鼠。在注射后12小时在Maestro体内成像系统上采集图50示出的图像。
与Fab′纳米探针相似,通过将10当量的含叶酸衍生物的硫醇用包含10%PEG-PC7A-马来酰亚胺和1mM EDTA的胶束溶解合成了包含叶酸的纳米探针。将反应搅拌过夜,然后纯化并通过微超滤浓缩至5mg/mL。使用与针对PDPA-TMR-Fab′纳米探针所描述的相同细胞培养和体内条件,使PDPF-TMR-FA纳米探针暴露于HSC3细胞。如图51所示,当暴露于叶酸衍生化探针时,细胞清楚地发出荧光。此外,在体内添加探针的情况下,本研究小鼠中存在的肿瘤是清楚可见的(图52)。
10.杂合胶束用于pH测定
a.方法:
染料缀合:为了染料缀合,首先将50mg PEG-b-P(DPA-co-AMA3)或PEG-b-(PC7A-co-AMA3)溶解于2mL无水DMF中。然后添加RhoG-NHS酯或TMR-NHS酯(伯氨基摩尔量的1.5当量)。在室温下将反应混合物搅拌两天。通过制备型凝胶渗透色谱(Varian的PLgel Prep 10μm300×25mm柱,THF为洗脱液,5mL/分钟)来纯化聚合物缀合物以移除游离的染料分子。将所得的聚合物缀合物冻干并储存于-20℃下。
纳米探针制备:将10毫克PEG-b-PC7A-RhoG和10mgPEG-b-PDPA-TMR溶解于1mL THF中。然后,在超声下将混合物添加至4mL的milli-Q水中。使用微超滤系统将混合物过滤4次以移除THF。
杂合纳米探针的表征:通过动态光散射分析来得到不同pH缓冲剂溶液中杂合纳米探针的平均计数率(kcps)。将聚合物终浓度控制为1mg/mL。通过Hitachi荧光光度计(型号为F-7500)评价杂合纳米探针的荧光光谱。将纳米探针稀释于50mM PBS缓冲剂(pH 7.4)中,在490nm处激发,并从500nm至650nm收集发射光谱。使用“蓝色”和“绿色”滤镜在Maestro成像系统(CRI Inc)上采集不同pH下杂合纳米探针溶液(0.1mg/mL)的荧光图像。
b.结果:
图53a示出了杂合纳米探针的平均计数率相对pH绘制的函数。杂合纳米探针在不同pH下示出顺序解离。杂合纳米探针在pH 6.8和pH 6.2下显示出两个敏锐的pH转变点。如图53b所示,光谱示出了RhodamineGreen与TMR染料之间的FRET效应,说明了杂合纳米探针的形成。图53c中的荧光图像证实了染料缀合的聚合物可在不同pH值下被顺序激活,说明每种共聚物仍然保持其自身的pH激活特征。
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依据本公开内容,可制备/进行本文所公开和要求保护的所有组合物和方法并且无需进行过度实验。虽然根据某些实施方案已经描述了本发明的组合物和方法,但是对于本领域技术人员明显的是,可对本文描述的组合物和方法以及方法的步骤或步骤顺序进行改变而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地,明显地是,化学和生理学相关的某些物质可替代本文描述的物质并且实现相同或相似的结果。对本领域技术人员明显的所有这样的相似替换和修改都被视为在如所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
以下参考文献通过引用特别地并入本文,某种程度上它们为本文所阐述内容提供了示例性程序或其他细节的补充。
Tsien,R.Y.Nat.Rev.Mol. Cell Biol.2003,4,SS16.
Weissleder,R.;Pittet,M.J.Nature 2008,452,580.
Fernandez-Suarez,M.;Ting,A.Y.Nat.Rev.Mol.CellBiol.2008,9,929.
Giepmans,B.N.G.;Adams,S.R.;Ellisman,M.H.;Tsien,R.Y.Science 2006,312,217.
Gross,S.;Piwnica-Worms,D.Cancer Cell 2005,7,5.
de Silva,A.P.;Gunaratne,H.Q.N.;Gunnlaugsson,T.;Huxley,A.J.M.;McCoy,C.;P.;Rademacher,J.T.;Rice,T.E.Chem.Rev.1997,97,1515.
Zhang,J.;Campbell,R.E.;Ting,A.Y.;Tsien,R.Y.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2002,3,906.
Lee,S.;Park,K.;Kim,K.;Choi,K.;Kwon,I.C.Chem.Commun.2008,4250.
Kobayashi,H.;Choyke,P.L.Acc.Chem.Res.2010,44,83.
Lovell,J.F.;Liu,T.W.B.;Chen,J.;Zheng,G.Chem.Rev.2010,110,2839.
Ueno,T.;Nagano,T.Nat.Methods 2011,8,642.
Alberts,B.;Johnson,A.;Lewis,J.;Raff,M.;Roberts,K.;Walter,P.MolecularBiology of the Cell;5th ed.;Garland Science:New York,2008.
Maxfield,F.R.;McGraw,T.E.Nat.Rev.Mol.CellBiol.2004,5,121.
Izumi,H.;Torigoe,T.;Ishiguchi,H.;Uramoto,H.;Yoshida,Y.;Tanabe,M.;Ise,T.;Murakami,T.;Yoshida,T.;Nomoto,M.;Kohno,K.Cancer Treat.Rev.2003,29,541.
Nishi,T.;Forgac,M.Nat.Rev.Mol.CellBiol.2002,3,94.
Webb,B.A.;Chimenti,M.;Jacobson,M.P.;Barber,D.L.Nat.Rev.Cancer 2011,11,671.
Kobayashi,H.;Ogawa,M.;Alford,R.;Choyke,P.L.;Urano,Y.Chem.Rev.2010,110,2620.
Han,J.Y.;Burgess,K.Chem.Rev.2010,110,2709.
Atkins,P.;De Paula,J.Physical Chemistry;Oxford University Press,2009.
Casey,J.R.;Grinstein,S.;Orlowski,J.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2010,11,50.
Zhang,X.;Lin,Y.;Gillies,R.J.J.Nucl. Med.2010,51,1167.
Srikun,D.;Albers,A.E.;Chang,C.J.Chem.Sci.2011,2,1156.
Benjaminsen,R.V.;Sun,H.H.;Henriksen,J.R.;Christensen,N.M.;Almdal,K.;Andresen,T.L.ACS Nano 2011,5,5864.
Albertazzi,L.;Storti,B.;Marchetti,L.;Beltram,F.J.Am.Chem.Soc.2010,132,18158.
Urano,Y.;Asanuma,D.;Hama,Y.;Koyama,Y.;Barrett,T.;Kamiya,M.;Nagano,T.;Watanabe,T.;Hasegawa,A.;Choyke,P.L.;Kobayashi,H.Nat.Med.2009,15,104.
Li,C.;Xia,J.A.;Wei,X.B.;Yah,H.H.;Si,Z.;Ju,S.H.Adv.Funct.Mater.2010,20,2222.
Almutairi,A.;Guillaudeu,S.J.;Berezin,M.Y.;Achilefu,S.;Fréchet,J.M.J.J.Am.Chem.Soc.2007,130,444.
Zhou,K.;Wang,Y.;Huang,X.;Luby-Phelps,K.;Sumer,B.D.;Gao,J.Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,6109-6114.
Dai,S.;Ravi,P.;Tam,K.C.Soft Matter 2008,4,435.
Gil,E.S.;Hudson,S.M.Prog.Polym.Sci.2004,29,1173.
Zhou,K.;Lu,Y.;Li,J.;Shen,L.;Zhang,G.;Xie,Z.;Wu,C.Macromolecules 2008,41,8927.
Riess,G.Prog.Polym.Sci.2003,28,1107.
Lee,E.S.;Shin,H.J.;Na,K.;Bae,Y.H.J.Controlled Release 2003,90,363.
Kairdolf,B.A.;Nie,S.J.Am.Chem.Soc.2011,133,7268.
Ananthapadmanabhan,K.P.;Goddard,E.D.;Turro,N.J.;Kuo,P.L.Langmuir 1985,1,352.
Ruckenstein,E.;Nagarajan,R.J.Phys.Chem.1975,79,2622.
Yezhelyev,M.V.;Qi,L.;O′Regan,R.M.;Nie,S.;Gao,X.J.Am.Chem.Soc.2008,130,9006.
Yu,H.;Zou,Y.;Wang,Y.;Huang,X.;Huang,G.;Sumer,B.D.;Boothman,D.A.;Gao,J.ACSNano 2011,5,9246.
Valeur,B.Molecular fiuorescence:principles and applications;Wiley-VCH,2002.
Lakowicz,J.R.Principles of Fluorescence Spectroscopy;3rd ed.;Springer:NewYork City,2006.
Demchenko,A.P.Introduction to Fluorescence Sensing;Springer Science:NewYork,2008.
Lee,S.;Xie,J.;Chen,X.Y.Curr.Top.Med.Chem.2010,10,1135.
West,W.;Pearce,S.J.Phys.Chem.1965,69,1894.
López Arbeloa,I.;Ruiz Ojeda,P.Chem.Phys.Lett.1982,87,556.
Valdes-Aguilera,O.;Neckers,D.C.Acc.Chem.Res.1989,22,171.
Packard,B.Z.;Komoriya,A.;Toptygin,D.D.;Brand,L.J..Phys.Chem.B 1997,101,5070.
Ogawa,M.;Kosaka,N.;Choyke,P.L.;Kobayashi,H.ACS Chem.Biol.2009,4,535.Johansson,M.K.;Cook,R.M.Chem.Eur.J.2003,9,3466.
Scheibe,G.Z.Angew.Chem.1936,49,563.
Jelley,E.E.Nature 1936,138,1009.
Berezin,M.Y.;Achilefu,S.Chem.Rev.2010,110,2641.
Weller,A.Pure Appl.Chem.1968,16,115.
Wasielewski,M.R.Chem.Rev.1992,92,435.
Vogel,S.S.;Thaler,C.;Koushik,S.V.Sci.STKE 2006,2006,re2.
de Silva,A.P.;Gunaratne,H.Q.N.;McCoy,C.P.Chem.Commun.1996,2399.
Dale,T.J.;Rebek,J.J.Am.Chem.Soc.2006,128,4500.
Diaz-Fernandez,Y.;Foti,F.;Mangano,C.;Pallavicini,P.;Patroni,S.;Perez-Gramatges,A.;Rodriguez-Calvo,S.Chem.Eur.J.2006,12,921.
Tal,S.;Salman,H.;Abraham,Y.;Botoshansky,M.;Eichen,Y.Chem.Eur.J.2006,12,4858.
Petsalakis,I.D.;Lathiotakis,N.N.;Theodorakopoulos,G.J.Mol.Struct.:THEOCHEM 2008,867,64.
Ohgaki,R.;van Ijzendoorn,S.C.D.;Matsushita,M.;Hoekstra,D.;Kanazawa,H.Biochemistry 2010,50,443.
Modi,S.;Swetha,M.G.;Goswami,D.;Gupta,G.D.;Mayor,S.;Krishnan,Y.Nat.Nanotech.2009,4,325.
Nasongkla,N.;Bey,E.;Ren,J.M.;Ai,H.;Khemtong,C.;Guthi,J.S.;Chin,S.F.;Sherry,A.D.;Boothman,D.A.;Gao,J.M.,Nano.Lett.2006,6,2427-2430.
Kalyanasundaram,K.;Thomas,J.K.,J.Am.Chem.Soc.1977,99,2039-2044.
Winnik,F.M.,Chem.Rev.1993,93,587-614.
Demaurex,N.News Physiol.Sci.2002,17,1-5.
Hanahan,D.;Weinberg,R.A.,Cell,2011,144,646-674.
Gatenby,R.A.;Gillies,R.J.,Nat.Rev.Cancer,2008,8,56-61.
Swartz,M.A.;et.al.;Cancer Res.,2012,72,2473-2480.
Joyce,J.A.,Cancer Cell,2005,7,513-520.
Weis,S.M.,Cheresh,D.A.,Nat.Med.,2011,17,1359-1370.
Folkman,J.,Nat.Rev.Drug Discovery,2007,6,273-286.
Webb,B.A.;Chimenti,M.;Jacobson,M.P.; Barber,D.L.,Nat.Rev.Cancer,2011,11,671-677.
Zhou,K.et.al.,J.Am.Chem.Soc.,2012,134,7803-7811.
Sonveaux,P.,et.al.,J.Clin.Invest.,2008,118,3930-3942.
Gatenby,R.A.;Gillies,R.J.,Nat.Rev.Cancer,2004,4,891-899.
Kleiter,M.M.et.al.,Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.,2006,64,592-602.
Huang,X.et.al.,ACS Nano,2010,4,5887-5896.
Zhou,K.et.al.,.Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,6109-6114
Yang C.et.al.,Cancer Res.2009,69,7986-93.
Claims (187)
1.一种pH响应系统,其包含:
第一纳米颗粒群,其中所述第一纳米颗粒包含(i)含有亲水聚合物区段和疏水聚合物区段的第一嵌段共聚物以及(ii)第一荧光染料,并且,其中所述第一纳米颗粒具有第一pH转变点和第一发射光谱;以及
第二纳米颗粒群,其中所述第二纳米颗粒包含(i)含有亲水聚合物区段和疏水聚合物区段的第二嵌段共聚物以及(ii)第二荧光染料,并且,其中所述第二纳米颗粒具有与所述第一纳米颗粒的第一pH转变点不同的第二pH转变点和与所述第一纳米颗粒的第一发射光谱不同的第二发射光谱。
2.根据权利要求1所述的pH响应系统,其还包含至少第三纳米颗粒群,其中所述第三纳米颗粒包含(i)含有亲水聚合物区段和疏水聚合物区段的第三嵌段共聚物以及(ii)第三荧光染料,并且,其中所述第三纳米颗粒具有与所述第一纳米颗粒和所述第二纳米颗粒的pH转变点不同的第三pH转变点以及与所述第一纳米颗粒和所述第二纳米颗粒的发射光谱不同的第三发射光谱。
3.根据权利要求2所述的pH响应系统,其还包含至少第四纳米颗粒群,其中所述第四纳米颗粒包含(i)含有亲水聚合物区段和疏水聚合物区段的第四嵌段共聚物以及(ii)第四荧光染料,并且,其中所述第四纳米颗粒具有与所述第一、第二和第三纳米颗粒的pH转变点不同的第四pH转变点以及与所述第一、第二和第三纳米颗粒的发射光谱不同的第四发射光谱。
4.根据权利要求1所述的pH响应系统,其中所述亲水聚合物区段选自聚(氧化乙烯)(PEO)、聚(甲基丙烯酸磷脂酰胆碱)(MPC)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
5.根据权利要求1所述的pH响应系统,其中所述疏水聚合物区段选自:聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(PDPA)、聚(2-(二丁基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(PDBA)、聚(2-(六亚甲基亚氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(PC7A)和聚(2-(五亚甲基亚氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(PC6A)。
6.根据权利要求1所述的pH响应系统,其中所述第一和第二纳米颗粒由选自以下的前体共聚物合成:PEO114-b-P(DPA75-co-AMA6)、MAL-PEO114-b-PDPA88、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA6)、PEO114-b-P(DPA74-co-AMA1)、PEO114-b-P(DPA77-co-AMA3)、PEO114-b-P(DPA80-co-AMA6)、PEO114-b-P(DBA65-co-AMA3)、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA3)和PEO114-b-P(C6A81-co-AMA3)。
7.根据权利要求1所述的pH响应系统,其中所述第一或第二纳米颗粒中至少一种的所述嵌段共聚物包含至少两种具有不同疏水性的单体。
8.根据权利要求1所述的pH响应系统,其中所述第一和第二纳米颗粒的所述嵌段共聚物包含不同摩尔分数的至少两种具有不同疏水性的单体。
9.根据权利要求1所述的pH响应系统,其中所述第一和第二荧光染料是pH不敏感的荧光染料。
10.根据权利要求1所述的pH响应系统,其中所述第一和第二荧光染料具有Δλ<40nm的斯托克斯位移。
11.根据权利要求1所述的pH响应系统,其中所述第一和第二荧光染料选自罗丹明、BODIPY、香豆素和花菁染料。
12.根据权利要求1所述的pH响应系统,其中所述第一和第二纳米颗粒选自PDBA-BDY、PDPA-TMR、PDPA-C55、PC7A-C55、PC6A-C75和PDPA-CMN。
13.根据权利要求3所述的pH响应系统,其中所述第一、第二、第三和第四纳米颗粒是PDBA-BDY、PDPA-TMR、PC7A-C55和PC6A-C75。
14.根据权利要求1所述的pH响应系统,其中所述第一和第二纳米颗粒的pH转变点为pH 5.0至pH 8.0。
15.根据权利要求1所述的pH响应系统,其中所述第一和第二纳米颗粒的pH转变点为pH 5.7至pH 6.9。
16.根据权利要求14所述的pH响应系统,其中所述第一和第二纳米颗粒的pH转变点选自pH 5.2、pH 6.4、pH 6.9和pH 7.2。
17.根据权利要求14所述的pH响应系统,其中所述第一和第二纳米颗粒的pH转变点选自pH 6.42、pH 6.18、pH 5.94和pH 5.7。
18.根据权利要求14所述的pH响应系统,其中第一纳米颗粒群具有约pH 6.21的pH转变点,并且第二纳米颗粒群具有约pH 6.9的pH转变点。
19.根据权利要求1所述的pH响应系统,其中所述第一和第二纳米颗粒的发射光谱为500nm至820nm。
20.根据权利要求1所述的pH响应系统,其中所述第一和第二纳米颗粒的pH响应(ΔpH10-90%)小于1个pH单位。
21.根据权利要求1所述的pH响应系统,其中所述第一和第二纳米颗粒的pH响应(ΔpH10-90%)小于0.25个pH单位。
22.根据权利要求1所述的pH响应系统,其中所述第一和第二纳米颗粒的至少一种还包含靶向部分。
23.根据权利要求22所述的pH响应系统,其中所述靶向部分是抗体或抗体片段。
24.根据权利要求23所述的pH响应系统,其中所述抗体是西妥昔单抗。
25.根据权利要求23所述的pH响应系统,其中所述抗体片段是西妥昔单抗的Fab′片段。
26.根据权利要求22所述的pH响应系统,其中所述靶向部分结合细胞表面受体。
27.根据权利要求22所述的pH响应系统,其中所述靶向部分是信号肽。
28.根据权利要求27所述的pH响应系统,其中所述信号肽是环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(cRGD)肽。
29.根据权利要求27所述的pH响应系统,其中所述信号肽将所述纳米颗粒导引至细胞核、线粒体、内质网、叶绿体、质外体或过氧化物酶体。
30.根据权利要求22所述的pH响应系统,其中所述靶向部分是小分子。
31.根据权利要求30所述的pH响应系统,其中所述小分子是叶酸。
32.一种pH响应系统,其包含具有嵌段共聚物和荧光染料的单一纳米颗粒,并且,其中所述纳米颗粒群表现出pH转变点和发射光谱。
33.根据权利要求32所述的pH响应系统,其还包含靶向部分。
34.一种组合物,其包含至少两个或三个纳米颗粒群的系列,每个纳米颗粒群都具有pH转变点和发射光谱,其中所述系列中每一纳米颗粒群的pH转变点和发射光谱与所述系列中其他纳米颗粒群的pH转变点和发射光谱不同。
35.根据权利要求34所述的组合物,其中所述至少两个或三个纳米颗粒群由包含以下的共聚物或其可药用盐,及其立体异构体、同位素变体和互变异构体合成:
a)根据下式的聚合物:
b)根据式A1的单体;以及
c)根据式A2的单体;
其中
A1和A2各自独立地选自
R1a各自独立地为H、经取代的或未经取代的烷基,或者
R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d和R5各自独立地为H或者经取代的或未经取代的烷基;
R6a和R6b各自独立地为经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的芳基或者经取代的或未经取代的杂芳基;或者R6a和R6b与其所连接的N原子一起形成杂环;
R7是包含染料的部分;
下标n为10至200的整数;
并且其中所述共聚物是无规共聚物。
36.根据权利要求35所述的组合物,其中A1具有下式:
37.根据权利要求35所述的组合物,其中A2具有下式:
38.根据权利要求34所述的组合物,其中所述至少两个或三个纳米颗粒群由选自以下的前体共聚物合成:PEO114-b-P(DPA75-co-AMA6)、MAL-PEO114-b-PDPA88、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA6)、PEO114-b-P(DPA74-co-AMA1)、PEO114-b-P(DPA77-co-AMA3)、PEO114-b-P(DPA80-co-AMA6)、PEO114-b-P(DBA65-co-AMA3)、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA3)和PEO114-b-P(C6A81-co-AMA3)。
39.根据权利要求34所述的组合物,其中所述至少两个或三个纳米颗粒群包含含有不同摩尔分数的至少两种具有不同疏水性之单体的嵌段共聚物。
40.根据权利要求34所述的组合物,其中所述纳米颗粒群包含约10%的含马来酰亚胺的共聚物。
41.根据权利要求34所述的组合物,其中所述至少两个或三个纳米颗粒群包含具有Δλ<40nm之斯托克斯位移的pH不敏感的荧光染料。
42.根据权利要求34所述的组合物,其中所述至少两个或三个纳米颗粒群包含PDBA-BDY、PDPA-TMR、PDPA-C55、PC7A-C55、PC6A-C75或PDPA-CMN。
43.根据权利要求34所述的组合物,其包含PDBA-BDY纳米颗粒群、PDPA-TMR纳米颗粒群和PC7A-C55纳米颗粒群。
44.根据权利要求34所述的组合物,其中所述系列的pH转变点为pH 5.0至pH 8.0。
45.根据权利要求34所述的组合物,其中所述系列的pH转变点为pH 5.7至pH 6.9。
46.根据权利要求34所述的组合物,其中第一纳米颗粒群具有约pH5.2的pH转变点,第二纳米颗粒群具有约pH 6.4的pH转变点,并且第三纳米颗粒群具有约pH 6.9的pH转变点。
47.根据权利要求34所述的组合物,其中第一纳米颗粒群具有约pH5.7的pH转变点,第二纳米颗粒群具有约pH 5.94的pH转变点,第三纳米颗粒群具有约pH 6.18的pH转变点,并且第四纳米颗粒群具有约pH6.42的pH转变点。
48.根据权利要求34所述的组合物,其中第一纳米颗粒群具有约pH6.21的pH转变点,并且第二纳米颗粒群具有约pH 6.9的pH转变点。
49.根据权利要求34所述的组合物,其中所述系列的发射光谱为500nm至820nm。
50.根据权利要求34所述的组合物,其中所述系列的pH响应(ΔpH10-90%)小于1个pH单位。
51.根据权利要求34所述的组合物,其中所述系列的pH响应(ΔpH10-90%)小于0.25个pH单位。
52.根据权利要求34所述的组合物,其中所述纳米颗粒的至少一种还包含靶向部分。
53.根据权利要求52所述的组合物,其中所述靶向部分是抗体或抗体片段。
54.根据权利要求53所述的组合物,其中所述抗体是西妥昔单抗。
55.根据权利要求53所述的组合物,其中所述抗体片段是西妥昔单抗的Fab′片段。
56.根据权利要求52所述的组合物,其中所述靶向部分结合细胞表面受体。
57.根据权利要求52所述的组合物,其中所述靶向部分是信号肽。
58.根据权利要求57所述的组合物,其中所述信号肽是cRGD肽。
59.根据权利要求57所述的组合物,其中所述信号肽将所述纳米颗粒导引至细胞核、线粒体、内质网、叶绿体、质外体或过氧化物酶体。
60.根据权利要求52所述的组合物,其中所述靶向部分是小分子。
61.根据权利要求60所述的组合物,其中所述小分子是叶酸。
62.一种组合物,其还包含具有共聚物和荧光染料的单一纳米颗粒,并且,其中纳米颗粒群表现出pH转变点和发射光谱。
63.根据权利要求62所述的组合物,其还包含靶向部分。
64.一种组合物,其包含至少两个或三个胶束群,其中每一胶束包含嵌段共聚物和荧光染料,并且,其中每一胶束群具有与其他胶束群的pH转变点和发射光谱不同的转变点和发射光谱。
65.根据权利要求64所述的组合物,其中所述至少两个或三个胶束群由包含以下的共聚物或其可药用盐,及其立体异构体、同位素变体和互变异构体合成:
a)根据下式的聚合物:
b)根据式A1的单体;以及
c)根据式A2的单体;
其中
A1和A2各自独立地选自
R1a各自独立地为H、经取代的或未经取代的烷基,或者
R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R4c、R4d和R5各自独立地为H或者经取代的或未经取代的烷基;
R6a和R6b各自独立地为经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的芳基或者经取代的或未经取代的杂芳基;或者R6a和R6b与其所连接的N原子一起形成杂环;
R7是包含染料的部分;
下标n为10至200的整数;
并且其中所述共聚物是无规共聚物。
66.根据权利要求65所述的组合物,其中A1具有下式:
67.根据权利要求65所述的组合物,其中A2具有下式:
68.根据权利要求64所述的组合物,其中所述至少两个或三个胶束群由选自以下的前体共聚物合成:PEO114-b-P(DPA75-co-AMA6)、MAL-PEO114-b-PDPA88、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA6)、PEO114-b-P(DPA74-co-AMA1)、PEO114-b-P(DPA77-co-AMA3)、PEO114-b-P(DPA80-co-AMA6)、PEO114-b-P(DBA65-co-AMA3)、PEO114-b-P(C7A65-co-AMA3)和PEO114-b-P(C6A81-co-AMA3)。
69.根据权利要求64所述的组合物,其中所述至少两个或三个胶束群中至少一个的嵌段共聚物包含至少两种具有不同疏水性的单体。
70.根据权利要求64所述的组合物,其中所述至少两个或三个胶束群的嵌段共聚物包含不同摩尔分数的至少两种具有不同疏水性的单体。
71.根据权利要求64所述的组合物,其中所述纳米颗粒群包含约10%的含马来酰亚胺的共聚物。
72.根据权利要求64所述的组合物,其中所述荧光染料是具有Δλ<40nm之斯托克斯位移的pH不敏感的荧光染料。
73.根据权利要求64所述的组合物,其中所述荧光染料具有Δλ<40nm的斯托克斯位移。
74.根据权利要求64所述的组合物,其中所述至少两个或三个胶束群包含PDBA-BDY、PDPA-TMR、PDPA-C55、PC7A-C55、PC6A-C75或PDPA-CMN。
75.根据权利要求64所述的组合物,其包含PDBA-BDY胶束群、PDPA-TMR胶束群和PC7A-C55胶束群。
76.根据权利要求64所述的组合物,其中所述至少两个或三个胶束群的pH转变点为pH 5.0至pH 8.0。
77.根据权利要求64所述的组合物,其中所述至少两个或三个胶束群的pH转变点为pH 5.7至pH 6.9。
78.根据权利要求64所述的组合物,其中第一胶束群具有约pH 5.2的pH转变点,第二胶束群具有约pH 6.4的pH转变点,并且第三胶束群具有约pH 6.9的pH转变点。
79.根据权利要求64所述的组合物,其中第一胶束群具有约pH 5.7的pH转变点,第二胶束群具有约pH 5.94的pH转变点,第三胶束群具有约pH 6.18的pH转变点,并且第四胶束群具有约pH 6.42的pH转变点。
80.根据权利要求64所述的组合物,其中第一胶束群具有约pH 6.21的pH转变点,并且第二胶束群具有约pH 6.9的pH转变点。
81.根据权利要求64所述的组合物,其中所述至少两个或三个胶束群的发射光谱为500nm至820nm。
82.根据权利要求64所述的组合物,其中所述至少两个或三个胶束群的pH响应(ΔpH10-90%)小于1个pH单位。
83.根据权利要求64所述的组合物,其中所述至少两个或三个胶束群的pH响应(ΔpH10-90%)小于0.25个pH单位。
84.根据权利要求64所述的组合物,其中所述至少一个胶束群中的胶束还包含靶向部分。
85.根据权利要求84所述的组合物,其中所述靶向部分是抗体或抗体片段。
86.根据权利要求85所述的组合物,其中所述抗体是西妥昔单抗。
87.根据权利要求85所述的组合物,其中所述抗体片段是西妥昔单抗的Fab′片段。
88.根据权利要求84所述的组合物,其中所述靶向部分结合细胞表面受体。
89.根据权利要求84所述的组合物,其中所述靶向部分是信号肽。
90.根据权利要求89所述的组合物,其中所述信号肽是cRGD肽。
91.根据权利要求89所述的组合物,其中所述信号肽将所述纳米颗粒导引至细胞核、线粒体、内质网、叶绿体、质外体或过氧化物酶体。
92.根据权利要求84所述的组合物,其中所述靶向部分是小分子。
93.根据权利要求92所述的组合物,其中所述小分子是叶酸。
94.根据权利要求64所述的组合物,其还包含杂合胶束群,其中所述胶束包含多于一种的嵌段共聚物和多于一种的荧光染料,并且,其中所述胶束群表现出多于一个的pH转变点以及对每个pH转变点不同的发射光谱。
95.一种组合物,其包含具有共聚物和荧光染料的单一胶束,并且,其中胶束群具有pH转变点和发射光谱。
96.根据权利要求95所述的组合物,其还包含靶向部分。
97.一种监测细胞内pH的方法,其包括:
(a)使细胞与根据权利要求64至94中任一项所述的组合物接触;以及
(b)检测所述细胞中的一种或更多种荧光信号,其中检测到荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离。
98.根据权利要求97所述的方法,其还包括确定所述细胞中荧光信号的分布。
99.根据权利要求98所述的方法,其中随时间确定所述荧光信号的分布。
100.根据权利要求99所述的方法,其中在至少一个小时至多至12个小时的时间中确定所述荧光信号的分布。
101.根据权利要求97所述的方法,其中所述检测步骤重复至少两次。
102.根据权利要求97所述的方法,其中所述检测步骤重复至少五次。
103.根据权利要求97所述的方法,其中所述荧光信号的发射波长为500nm至820nm。
104.根据权利要求97所述的方法,其中所述细胞是癌细胞、存在溶酶体贮积缺陷的细胞或有缺陷的神经细胞。
105.根据权利要求97所述的方法,其还包括:
(a)使所述细胞与目的化合物接触;
(b)检测所述细胞中的一种或更多种荧光信号;以及
(c)在所述细胞与所述目的化合物接触后确定所述细胞中的一种或更多种荧光信号是否发生变化。
106.根据权利要求105所述的方法,其中所述目的化合物是药物。
107.根据权利要求105所述的方法,其中所述目的化合物是抗体、肽、蛋白质、核酸或者小分子。
108.一种监测小泡运输的方法,其包括:
(a)使细胞与包含至少第一、第二和第三胶束群的组合物在使所述细胞通过胞吞摄取所述组合物的条件下接触,其中每一胶束包含嵌段共聚物和荧光染料,并且,其中所述第一胶束群具有约pH 6.3至7.4的pH转变点和第一荧光发射光谱,所述第二胶束群具有约pH 5.9至6.2的pH转变点和第二荧光发射光谱,并且所述第三胶束群具有约pH 5.0至5.8的pH转变点和第三荧光发射光谱;
(b)检测所述细胞中与所述第一、第二和第三荧光发射光谱对应的第一荧光信号、第二荧光信号和第三荧光信号,其中检测到所述第一荧光信号、第二荧光信号和第三荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离;以及
(c)当检测到所述第一荧光信号时确定小泡是早期内体,当检测到所述第二荧光信号时确定小泡是晚期内体/溶酶体,并且当检测到所述第三荧光信号时确定小泡是溶酶体。
109.根据权利要求108所述的方法,其还包括确定所述细胞中所述第一、第二和第三荧光信号的分布。
110.根据权利要求108所述的方法,其中在至少一个小时至多至12个小时的时间中确定所述第一、第二和第三荧光信号的分布。
111.根据权利要求108所述的方法,其中所述检测步骤重复至少两次。
112.根据权利要求108所述的方法,其中所述检测步骤重复至少五次。
113.根据权利要求108所述的方法,其中所述第一、第二和第三荧光信的发射波长为500nm至820nm。
114.一种监测细胞受体循环的方法,其包括:
(a)使细胞与包含至少第一和第二胶束群的组合物接触,其中每一胶束包含嵌段共聚物、荧光染料和受体结合部分,并且,其中所述第一胶束群具有第一pH转变点和第一荧光发射光谱,并且所述第二胶束群具有与所述第一pH转变点和所述第一发射光谱不同的第二pH转变点和第二荧光发射光谱;
(b)检测所述细胞中或其表面上与所述至少第一和第二荧光发射光谱对应的至少第一和第二荧光信号,其中检测到所述第一和第二荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离;以及
(c)确定所述细胞中或所述细胞表面上至少第一和第二荧光信号的分布。
115.根据权利要求114所述的方法,其中所述组合物包含至少第三胶束群,所述胶束群具有与所述第一和第二pH转变点以及所述第一和第二发射光谱不同的第三pH转变点和第三荧光发射光谱。
116.根据权利要求114所述的方法,其中在至少一个小时至多至12个小时的时间中确定所述至少第一和第二荧光信号的分布。
117.根据权利要求114所述的方法,其中所述检测步骤重复至少两次。
118.根据权利要求114所述的方法,其中所述检测步骤重复至少五次。
119.根据权利要求114所述的方法,其中所述至少第一和第二荧光信号的发射波长为500nm至820nm。
120.一种监测内体pH的方法,其包括:
(a)使内体与包含至少第一和第二胶束群的组合物在使所述内体摄取所述组合物的条件下接触,其中每一胶束包含嵌段共聚物和荧光染料,并且,其中所述第一胶束群具有约pH 5.7至6.3的pH转变点和第一荧光发射光谱,所述第二胶束群具有约pH 5.7至6.3的pH转变点和第二荧光发射光谱,其中所述第一和第二胶束群具有不同的pH转变点和不同的荧光发射光谱;
(b)检测所述内体中与所述第一和第二荧光发射光谱对应的第一荧光信号和第二荧光信号中的至少一个,其中检测到所述第一和/或第二荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离;以及
(c)确定所述内体的pH或pH范围。
121.根据权利要求120所述的方法,其中在至少一个小时至多至12个小时的时间中确定所述第一和第二荧光信号的分布。
122.根据权利要求120所述的方法,其中所述检测步骤重复至少两次。
123.根据权利要求120所述的方法,其中所述检测步骤重复至少五次。
124.根据权利要求120所述的方法,其中所述第一和第二荧光信号的发射波长为500nm至820nm。
125.根据权利要求120所述的方法,其还包括使所述内体与至少第三和第四胶束群接触。
126.根据权利要求125所述的方法,其中所述第一胶束群具有约pH5.7的pH转变点,所述第二胶束群具有约pH 5.94的pH转变点,所述第三胶束具有约pH 6.18的pH转变点,并且所述第四胶束群具有约pH 6.42的pH转变点。
127.一种测量胞外pH的方法,其包括:
(a)使一组细胞或其胞外环境与根据权利要求64至87.01中任一项所述的pH响应系统或组合物接触;以及
(b)检测细胞组中的荧光信号,其中检测到荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离。
128.根据权利要求127所述的方法,其还包括确定细胞组中或其胞外环境中所述荧光信号的分布。
129.根据权利要求128所述的方法,其中随时间确定所述荧光信号的分布。
130.根据权利要求129所述的方法,其中在至少一个小时至多至12个小时的时间中确定所述荧光信号的分布。
131.根据权利要求127所述的方法,其中所述检测步骤重复至少两次。
132.根据权利要求127所述的方法,其中所述检测步骤重复至少五次。
133.根据权利要求127所述的方法,其中所述荧光信号的发射波长为500nm至820nm。
134.根据权利要求127所述的方法,其中所述细胞或细胞组或其胞外环境是癌细胞或癌细胞组或其胞外环境、具有溶酶体贮积缺陷的细胞或细胞组或其胞外环境、有缺陷的神经细胞或神经细胞组或其胞外环境、涉及炎症的细胞或细胞组或其胞外环境、涉及感染的细胞或细胞组或其胞外环境、涉及伤口愈合的细胞或细胞组或其胞外环境、涉及缺氧的细胞或细胞组或其胞外环境、涉及辐射损伤的细胞或细胞组或其胞外环境、涉及创伤的细胞或细胞组或其胞外环境或者涉及低氧血症的细胞或细胞组或其胞外环境。
135.根据权利要求127所述的方法,其还包括:
(a)使所述细胞或其胞外环境与目的化合物接触;
(b)检测所述细胞中及其周围的一种或更多种荧光信号;以及
(c)确定在使所述细胞与所述目的化合物接触后所述细胞中及其周围的一种或更多种荧光信号是否发生变化。
136.根据权利要求135所述的方法,其中所述目的化合物是药物。
137.根据权利要求135所述的方法,其中所述目的化合物是抗体、肽、蛋白质、核酸或者小分子。
138.一种对血管生成性肿瘤血管系统进行成像的方法,其包括:
(a)使肿瘤血管系统与根据权利要求64至94中任一项所述的包含至少两个胶束群的组合物接触,其中每一胶束包含嵌段共聚物和荧光染料,并且,其中所述第一胶束群具有约pH 6.5至7.4的pH转变点和第一荧光发射光谱,所述第二胶束群具有约pH 5.9至6.4的pH转变点和第二荧光发射光谱,以及;
(b)检测所述肿瘤血管系统中与所述第一荧光发射光谱和第二荧光发射光谱对应的第一荧光信号和第二荧光信号,其中检测到所述第一荧光信号和第二荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离。
139.根据权利要求138所述的方法,其还包括确定所述肿瘤血管系统中所述第一荧光信号和第二荧光信号的分布。
140.根据权利要求138所述的方法,其还包含具有靶向部分的胶束。
141.根据权利要求140所述的方法,其中所述靶向部分是cRGD肽。
142.根据权利要求138所述的方法,其中在至少一个小时至多至12个小时的时间中确定所述第一荧光信号和第二荧光信号的分布。
143.根据权利要求138所述的方法,其中所述检测步骤重复至少两次。
144.根据权利要求138所述的方法,其中所述检测步骤重复至少五次。
145.根据权利要求138所述的方法,其中所述第一荧光信号和第二荧光信号的发射波长为500nm至820nm。
146.一种对循环肿瘤细胞进行成像的方法,其包括:
(a)使淋巴管或血流中的循环肿瘤细胞与根据权利要求64至94中任一项所述的包含pH响应系统的组合物接触,其中所述胶束包含嵌段共聚物和荧光染料,并且具有约pH 5.9至6.4的pH转变点,以及;
(b)检测所述循环肿瘤细胞中的荧光信号,其中检测到荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离。
147.根据权利要求146所述的方法,其还包括确定所述淋巴系统或血流中循环肿瘤细胞中所述第一荧光信号和第二荧光信号的分布。
148.根据权利要求146所述的方法,其还包含具有靶向部分的胶束。
149.根据权利要求148所述的方法,其中所述靶向部分是抗体片段。
150.根据权利要求149所述的方法,其中所述抗体片段是西妥昔单抗的片段。
151.根据权利要求146所述的方法,其中在至少一个小时至多至12个小时的时间中确定所述第一荧光信号和第二荧光信号的分布。
152.根据权利要求146所述的方法,其中所述检测步骤重复至少两次。
153.根据权利要求146所述的方法,其中所述检测步骤重复至少五次。
154.根据权利要求146所述的方法,其中所述第一荧光信号和第二荧光信号的发射波长为500nm至820nm。
155.一种对肿瘤进行成像的方法,其包括:
(a)使所述肿瘤与根据权利要求64至94中任一项所述的包含至少两个胶束群的组合物接触,其中每一胶束包含嵌段共聚物和荧光染料,并且,其中所述第一胶束群具有约pH 6.5至7.4的pH转变点和第一荧光发射光谱,所述第二胶束群具有约pH 5.9至6.4的pH转变点和第二荧光发射光谱,以及;
(b)检测所述肿瘤中与所述第一荧光发射光谱和第二荧光发射光谱对应的第一荧光信号和第二荧光信号,其中检测到所述第一荧光信号和第二荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离。
156.根据权利要求155所述的方法,其还包括确定所述肿瘤中所述第一荧光信号和第二荧光信号的分布。
157.根据权利要求155所述的方法,其还包含具有靶向部分的胶束。
158.根据权利要求157所述的方法,其中所述靶向部分是抗体片段。
159.根据权利要求158所述的方法,其中所述抗体片段是西妥昔单抗。
160.根据权利要求157所述的方法,其中所述靶向部分是小分子。
161.根据权利要求160所述的方法,其中所述小分子是叶酸。
162.根据权利要求155所述的方法,其中在至少一个小时至多至12个小时的时间中确定所述第一荧光信号和第二荧光信号的分布。
163.根据权利要求155所述的方法,其中所述检测步骤重复至少两次。
164.根据权利要求155所述的方法,其中所述检测步骤重复至少五次。
165.根据权利要求155所述的方法,其中所述第一荧光信号和第二荧光信号的发射波长为500nm至820nm。
166.一种对转移至原发性肿瘤局部区域中之淋巴结的肿瘤进行成像的方法,其包括:
(a)使所述肿瘤与根据权利要求64至94中任一项所述的包含至少两个胶束群的组合物接触,其中每一胶束包含嵌段共聚物和荧光染料,并且,其中所述第一胶束群具有约pH 6.5至7.4的pH转变点和第一荧光发射光谱,所述第二胶束群具有约pH 5.9至6.4的pH转变点和第二荧光发射光谱,以及;
(b)检测所述肿瘤中与所述第一荧光发射光谱和第二荧光发射光谱对应的第一荧光信号和第二荧光信号,其中检测到所述第一荧光信号和第二荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离。
167.根据权利要求166所述的方法,其还包括确定所述肿瘤中所述第一荧光信号和第二荧光信号的分布。
168.根据权利要求166所述的方法,其还包含具有靶向部分的胶束。
169.根据权利要求168所述的方法,其中所述靶向部分是抗体片段。
170.根据权利要求169所述的方法,其中所述抗体片段是西妥昔单抗。
171.根据权利要求168所述的方法,其中所述靶向部分是小分子。
172.根据权利要求171所述的方法,其中所述小分子是叶酸。
173.根据权利要求166所述的方法,其中在至少一个小时至多至12个小时的时间中确定所述第一荧光信号和第二荧光信号的分布。
174.根据权利要求166所述的方法,其中所述检测步骤重复至少两次。
175.根据权利要求166所述的方法,其中所述检测步骤重复至少五次。
176.根据权利要求166所述的方法,其中所述第一荧光信号和第二荧光信号的发射波长为500nm至820nm。
177.一种对肿瘤的前哨淋巴结进行成像的方法,其包括:
(a)使所述肿瘤与根据权利要求64至94中任一项所述的包含至少两个胶束群的组合物接触,其中每一胶束包含嵌段共聚物和荧光染料,并且,其中所述第一胶束群具有约pH 6.5至7.4的pH转变点和第一荧光发射光谱,所述第二胶束群具有约pH 5.9至6.4的pH转变点和第二荧光发射光谱,以及;
(b)检测所述肿瘤中与所述第一荧光发射光谱和第二荧光发射光谱对应的第一荧光信号和第二荧光信号,其中检测到所述第一荧光信号和第二荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束已达到其pH转变点并解离;
(c)使包含所述荧光信号的胶束的解离部分进入流出所述肿瘤的淋巴脉管系统中,并沿着所述淋巴脉管系统运动通过所述淋巴脉管系统至淋巴结;
(d)沿着所述淋巴脉管系统检测所述淋巴脉管系统和所述淋巴结中与所述第一和第二荧光发射光谱对应的第一和第二荧光信号,其中检测到所述第一和第二荧光信号指示包含相应荧光染料的胶束在所述原发性肿瘤中已达到其pH转变点并解离,并沿着所述淋巴脉管系统运动至所述淋巴脉管系统和所述淋巴结。
178.根据权利要求177所述的方法,其还包括确定所述肿瘤中所述第一荧光信号和第二荧光信号的分布。
179.根据权利要求177所述的方法,其还包含具有靶向部分的胶束。
180.根据权利要求179所述的方法,其中所述靶向部分是抗体片段。
181.根据权利要求180所述的方法,其中所述抗体片段是西妥昔单抗。
182.根据权利要求179所述的方法,其中所述靶向部分是小分子。
183.根据权利要求182所述的方法,其中所述小分子是叶酸。
184.根据权利要求177所述的方法,其中在至少一个小时至多至12个小时的时间中确定所述第一荧光信号和第二荧光信号的分布。
185.根据权利要求177所述的方法,其中所述检测步骤重复至少两次。
186.根据权利要求177所述的方法,其中所述检测步骤重复至少五次。
187.根据权利要求177所述的方法,其中所述第一荧光信号和第二荧光信号的发射波长为500nm至820nm。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108794709A (zh) * | 2017-04-27 | 2018-11-13 | 西南大学 | 一种超高pH刺激响应的两亲性星形嵌段聚合物制备方法 |
CN109069440A (zh) * | 2016-03-02 | 2018-12-21 | 得克萨斯州大学系统董事会 | 用于免疫治疗的激活sting的纳米疫苗 |
CN109195590A (zh) * | 2015-11-03 | 2019-01-11 | 纳米珀特伊根公司 | 聚合纳米颗粒 |
CN111318718A (zh) * | 2020-02-24 | 2020-06-23 | 中国科学技术大学 | 一种具有增敏肿瘤放疗的金纳米组装体及其制备方法和应用 |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20140023590A1 (en) | 2010-09-22 | 2014-01-23 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Novel block copolymer and micelle compositions and methods of use thereof |
US9709556B2 (en) | 2013-12-11 | 2017-07-18 | Analiza, Inc. | Devices and methods for determining and/or isolating circulating cancer cells |
US20150160246A1 (en) | 2013-12-11 | 2015-06-11 | Analiza, Inc. | Devices and methods for determining and/or isolating cells such as circulating cancer or fetal cells |
WO2015188157A1 (en) * | 2014-06-06 | 2015-12-10 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Library of ph responsive polymers and nanoprobes thereof |
US11111288B2 (en) | 2014-08-28 | 2021-09-07 | Bioatla, Inc. | Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells |
KR102615681B1 (ko) | 2014-08-28 | 2023-12-18 | 바이오아트라, 인코퍼레이티드 | 변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체 |
EP4343331A3 (en) | 2015-03-23 | 2024-06-19 | Astellas Institute for Regenerative Medicine | Improved assays for potency of human retinal pigment epithelium (rpe) cells and photoreceptor progenitors |
WO2017173453A1 (en) * | 2016-04-01 | 2017-10-05 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Stimuli-responsive nanoparticles for biomedical applications |
IL262404B2 (en) | 2016-05-13 | 2024-04-01 | Bioatla Llc | Antibodies, Antibody Fragments and Their Immunomodules Against ROR2 and Their Uses |
US20190321496A1 (en) * | 2016-06-16 | 2019-10-24 | Baker Idi Heart And Diabetes Institute Holdings Limited | Agents and methods for the diagnosis and treatment of diseases associated with extracellular matrix turnover |
JP2019528258A (ja) * | 2016-08-04 | 2019-10-10 | ユニバーシティ オブ ワシントンUniversity of Washington | 膜溶解性ブロック共重合体 |
US20190261897A1 (en) | 2017-11-28 | 2019-08-29 | Alan D. Kersey | Apparatus and method for assessment of cancer margin |
EP3811054A1 (en) * | 2018-06-21 | 2021-04-28 | Codiak BioSciences, Inc. | Methods of measuring extracellular vesicles and nanoparticles in complex matrices by light scattering |
RS64992B1 (sr) * | 2018-12-17 | 2024-01-31 | Gi Cell Inc | Blok kopolimer koji sadrži hidrofilni prvi blok, hidrofobni drugi blok i funkcionalnu grupu sposobnu da se specifično vezuje za tiol |
KR20220149906A (ko) * | 2019-11-18 | 2022-11-09 | 온코나노 메디신, 인크. | pH 반응성 조성물, 제제, 및 종양을 영상화하는 방법 |
WO2021217111A1 (en) | 2020-04-24 | 2021-10-28 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Ph responsive block copolymer compositions and micelles that inhibit mct 1 and related proteins |
KR102650195B1 (ko) * | 2020-11-11 | 2024-04-09 | 주식회사 제론메드 | 유리 메티오닌r설폭사이드를 정량적으로 측정할 수 있는 형광단백질 센서 및 이의 용도 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060229235A1 (en) * | 2004-10-06 | 2006-10-12 | The Penn State Research Foundation | Synthetic mimics of mammalian cell surface receptors: method and compositions |
WO2009061473A2 (en) * | 2007-11-07 | 2009-05-14 | Mallinckrodt Inc. | Photonic shell-core cross linked and functionalized nanostructures for biological applications |
US20090317802A1 (en) * | 2005-12-09 | 2009-12-24 | Bhatia Sangeeta N | Compositions and Methods to Monitor RNA Delivery to Cells |
US20100069726A1 (en) * | 2008-06-04 | 2010-03-18 | Seventh Sense Biosystems, Inc. | Compositions and methods for rapid one-step diagnosis |
US20100303731A1 (en) * | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Searete Llc | Systems, devices, methods, and compositions including selectively accessible ferromagnetic structures |
WO2011097374A1 (en) * | 2010-02-05 | 2011-08-11 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Flexible endoscopic ultrasound guided biopsy device |
WO2012039741A1 (en) * | 2010-09-22 | 2012-03-29 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Novel block copolymer and micelle compositions and methods of use thereof |
WO2012040513A1 (en) * | 2010-09-22 | 2012-03-29 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Compositions and methods for the delivery of beta lapachone |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002095663A (ja) * | 2000-09-26 | 2002-04-02 | Fuji Photo Film Co Ltd | センチネルリンパ節光断層画像取得方法および装置 |
EP1480619B1 (en) | 2002-03-07 | 2013-08-07 | Biocompatibles UK Limited | Drug carriers comprising amphiphilic block copolymers |
CA2484730A1 (en) * | 2002-05-03 | 2003-11-13 | Immunivest Corporation | Device and method for analytical cell imaging |
US7812051B2 (en) | 2004-08-11 | 2010-10-12 | Arqule, Inc. | Pharmaceutical compositions of β-lapachone and β-lapachone analogs with improved tumor targeting potential |
PT2428519E (pt) * | 2004-08-24 | 2015-04-29 | Btg Int Ltd | Processo para preparação de 17-o-vinil-triflatos como intermediários |
JP5548890B2 (ja) * | 2006-09-05 | 2014-07-16 | ジャンセン ダイアグノスティックス,エルエルシー | 細胞の画像を格付けするための方法 |
US20080081075A1 (en) | 2006-10-02 | 2008-04-03 | National Tsing Hua University | Multifunctional mixed micelle of graft and block copolymers and preparation thereof |
WO2009138473A2 (en) | 2008-05-15 | 2009-11-19 | Biocompatibles Uk Limited | Intracellular antibody delivery |
US20120309691A1 (en) | 2010-02-04 | 2012-12-06 | Dapeng Zhou | Tumor targeted delivery of immunomodulators by nanopolymers |
JP5682124B2 (ja) * | 2010-03-12 | 2015-03-11 | セイコーエプソン株式会社 | 生体物質測定装置、生体物質測定方法および生体内循環腫瘍細胞測定方法 |
WO2011113616A1 (en) | 2010-03-19 | 2011-09-22 | King Saud University | A nanoparticle comprising a micelle formed by an amphiphilic block- copolymer and encapsulating a gadolinium complex |
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Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060229235A1 (en) * | 2004-10-06 | 2006-10-12 | The Penn State Research Foundation | Synthetic mimics of mammalian cell surface receptors: method and compositions |
US20090317802A1 (en) * | 2005-12-09 | 2009-12-24 | Bhatia Sangeeta N | Compositions and Methods to Monitor RNA Delivery to Cells |
WO2009061473A2 (en) * | 2007-11-07 | 2009-05-14 | Mallinckrodt Inc. | Photonic shell-core cross linked and functionalized nanostructures for biological applications |
US20100069726A1 (en) * | 2008-06-04 | 2010-03-18 | Seventh Sense Biosystems, Inc. | Compositions and methods for rapid one-step diagnosis |
US20100303731A1 (en) * | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Searete Llc | Systems, devices, methods, and compositions including selectively accessible ferromagnetic structures |
WO2011097374A1 (en) * | 2010-02-05 | 2011-08-11 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Flexible endoscopic ultrasound guided biopsy device |
WO2012039741A1 (en) * | 2010-09-22 | 2012-03-29 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Novel block copolymer and micelle compositions and methods of use thereof |
WO2012040513A1 (en) * | 2010-09-22 | 2012-03-29 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Compositions and methods for the delivery of beta lapachone |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KEJIN ZHOU ET AL.: "Tunable, Ultrasensitive pH-Responsive Nanoparticles Targeting Specific Endocytic Organelles in Living Cells", 《ANGEW. CHEM. INT. ED.》, vol. 50, 31 December 2011 (2011-12-31), pages 6109 - 6114, XP 055169265, DOI: doi:10.1002/anie.201100884 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109195590A (zh) * | 2015-11-03 | 2019-01-11 | 纳米珀特伊根公司 | 聚合纳米颗粒 |
CN109069440A (zh) * | 2016-03-02 | 2018-12-21 | 得克萨斯州大学系统董事会 | 用于免疫治疗的激活sting的纳米疫苗 |
CN108794709A (zh) * | 2017-04-27 | 2018-11-13 | 西南大学 | 一种超高pH刺激响应的两亲性星形嵌段聚合物制备方法 |
CN111318718A (zh) * | 2020-02-24 | 2020-06-23 | 中国科学技术大学 | 一种具有增敏肿瘤放疗的金纳米组装体及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20170049911A1 (en) | 2017-02-23 |
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EP2833870A4 (en) | 2015-11-11 |
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