CN116173006A - 一种多酚自聚纳米粒及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种多酚自聚纳米粒及其制备方法与应用，该纳米粒由表没食子儿茶素没食子酸酯在pH 7.4‑8.5的弱碱性环境中通过二价金属锰离子的催化氧化自聚而成。其制备方法简单，将表没食子儿茶素没食子酸酯溶于弱碱性缓冲溶液中，常温下搅拌均匀，然后将金属锰离子溶液滴加入表没食子儿茶素没食子酸酯缓冲混合液中，恒温水浴下剧烈搅拌，再经过离心、清洗即制得多酚自聚纳米粒。本发明提供的多酚自聚纳米粒具有广谱的自由基清除能力，同时还能显著抑制细胞焦亡，可推广应用于制备脓毒症治疗药物中，同时该多酚纳米粒还能作为其他药物的载体，具有广阔的应用前景。

Description

一种多酚自聚纳米粒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及纳米材料和纳米生物医药领域，具体涉及一种多酚自聚纳米粒及其制备方法与应用。

背景技术

表没食子儿茶素没食子酸酯(以下简称EGCG)，是绿茶中主要的水溶性成份，也称为茶多酚，具有抗炎、抗氧化等多重药理活性。EGCG是一个两亲性化合物，既是水溶性又有脂溶的特性，因在其结构中含有多个苯环从而影响EGCG水溶性。然而，EGCG的稳定性较差，一些外界因素会致使其失活，包括高温、高氧、碱性环境以及金属离子的络合作用，为了提高其稳定性，保持其药理活性，一般通过EGCG改性来解决了这一难题。例如专利CN113577101A公开了一种茶多酚-金属纳米粒及其制备方法，该专利技术主要是将铁与EGCG络合后共同形成纳米粒子来达到改性EGCG和杀伤肿瘤细胞的效果，且该纳米粒子在进入人体后，主要通过释放纳米粒子中结合的铁离子来达到杀伤肿瘤细胞的目的。

脓毒症是一种是由感染所致的不可控免疫反应引起的严重威胁生命的器官功能障碍性疾病，是重症监护病房(ICU)的主要死因之一，每年影响数百万患者，其病理特征为全身炎症反应和多器官衰竭，主要是由于感染时免疫和氧化应激失调引起的。脓毒症病理表现复杂，目前尚无理想的防治策略。数百项脓毒症治疗候选药物的临床试验失败，启示脓毒症症作为一种非常复杂的综合征，仅限于一个目标的治疗可能会被另外因素所代偿，导致治疗失败。因此，迫切需要开发一种多通路多靶点的新型药物治疗方法，以实现有效的脓毒症治疗。

最新研究表明，脓毒症相关器官损伤与自由基(RONS)的过度产生和细胞焦亡程序的过度激活密切相关。RONS主要由线粒体呼吸传递链产生，在机体的病原体防御和细胞信号传导等过程中发挥重要作用。然而，过量的RONS可通过氧化损伤、启动炎症级联反应引起组织损伤，且RONS的产生和清除之间的失衡与脓毒症患者的预后不良有关。另一方面，脓毒症的另一发病机理是细胞焦亡过度激活。细胞焦亡是一种由炎症小体介导的剧烈的程序性裂解炎症细胞的死亡方式。在焦亡过程中，免疫细胞炎性Caspase活化，细胞发生肿胀与裂解，通过破坏质膜释放大量细胞因子，导致多器官损伤和脓毒症死亡。无论经典炎症小体，如NLRP3炎症小体，还是非经典炎症小体，一旦被激活，它们诱导细胞焦亡的最后一步是在N端结构域(GSDMD-NT)和自身抑制性C端结构域(GSDMD-CT)之间的连接处裂解GSDMD。裂解的GSDMD-NT与质膜结合，寡聚形成膜孔，导致裂解细胞死亡和促炎细胞因子的释放。因此，GSDMD是治疗脓毒症的潜在药物靶点。鉴于RONS和GSDMD在脓毒症发病机制中的关键作用，开发一种可同时抑制这两个靶标的新型药物极具研究价值。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出了一种多酚自聚纳米粒及其制备方法与应用，其目的是通过特定催化剂在弱碱性环境中将EGCG催化氧化自聚形成多酚自聚纳米粒，该纳米粒子可同时清除自由基和抑制炎症小体诱导的细胞凋亡程序，可以用于脓毒症药物的制备，且该多酚自聚纳米粒制备方法简单可控，纳米粒子结构稳定，生物安全性高，具有广阔的市场应用前景。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种多酚自聚纳米粒，所述多酚自聚纳米粒由表没食子儿茶素没食子酸酯pH 7.4-8.5的弱碱性环境中通过二价金属锰离子的催化氧化自聚而成。

作为优选，所述表没食子儿茶素没食子酸酯与金属锰离子摩尔比为1:5～5:1。

基于一个总的发明构思，本发明还提供了所述多酚自聚纳米粒的制备方法，包括以下步骤:

S1、将表没食子儿茶素没食子酸酯溶于pH 7.4-8.5的缓冲液中，水浴常温搅拌，得到表没食子儿茶素没食子酸酯混合液；

S2、将二价金属锰离子溶液滴入至步骤S1中所述表没食子儿茶素没食子酸酯混合液中，恒温水浴，剧烈搅拌；

S3、将步骤S2中所得反应液离心收集沉淀，将所述沉淀用缓冲液清洗，即得多酚自聚纳米粒。

作为优选，所述步骤S1中缓冲液为HEPES缓冲液，所述HEPES缓冲液pH值为弱碱性，所述HEPES缓冲液终浓度为10～15mM。

作为优选，所述步骤S2中金属锰离子溶液为MnCl₂溶液，所述金属锰离子滴加后终浓度为0.5～4mM，所述步骤S2中水浴温度为25℃～35℃，所述搅拌反应时间为0.5～12h。

基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种多酚自聚纳米粒在制备抗脓毒症药物中的应用。

作为优选，所述多酚自聚纳米粒可以为外用制剂、口服制剂或注射制剂。

作为优选，所述多酚自聚纳米粒可以同时负载其他治疗药物。

基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种多酚自聚纳米粒在制备抑制细胞铁死亡药物中的应用。

基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种多酚自聚纳米粒在制备抑制细胞坏死性凋亡药物中的应用。

本发明中的多酚自聚纳米粒，是由锰离子在弱碱性环境中催化EGCG迅速氧化，邻苯二酚和邻苯三酚单元转化为相应的高活性半醌和醌，通过一系列醌与半醌的亲核加成反应，或者过半醌自由基的偶联反应，EGCG分子实现氧化偶联聚合的连锁反应，形成一系列低聚物；随着反应推进，低聚物产生增多，逐渐聚集，并遵循最小表面能原理，通过非共价相互作用自组装形成多酚自聚纳米球。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的多酚自聚纳米粒，是由EGCG在弱碱性环境下由二价锰离子催化氧化自聚形成，其中锰离子仅催化EGCG氧化自聚，不会与EGCG络合进入纳米粒子结构中，这样通过氧化自聚形成的纳米粒子粒径在150～200nm，分散性和水溶性均良好，结构简单稳定，生物相容性高。

2、本发明提供了一种多酚自聚纳米粒的制备方法，其制备过程简单可控，试剂简单，金属锰离子也仅起催化作用，纳米粒子的成分可控，该自聚纳米粒具有价廉易得、制备简单、条件温和，可大批量制备的优良特性，便于推广应用。

3、本发明创造性的发现该多酚自聚纳米粒具有光谱清除活性氧与活性氮的优异活性，可用于各种炎症性疾病药物的制备。

4、本发明提供了一种多酚自聚纳米粒在制备抗脓毒症药物中的创新应用，该多酚自聚纳米粒可通过阻断GSDMD-NT寡聚化来有效抑制炎症细胞焦亡，该活性与自由基清除能力相辅相成，有效抑制炎症风暴，是用于脓毒症的潜在的多靶点高效纳米药物。

5、本发明提供的多酚自聚纳米粒除自身可以清除自由基和阻断细胞焦亡程序外，还能作为其他药物的载体，可以通过同时负载其他药物来共同作用，加强制备药物的治疗效果，在脓毒症疾病治疗药物制备方面显示出了巨大的潜力。

6、本发明提供的多酚自聚纳米粒可显著抑制RSL3及Erastin引起的NRK-52E细胞铁死亡，对细胞有保护作用，可以用于抑制细胞铁死亡药物的制备。

7、本发明提供的多酚自聚纳米粒可显著抑制LPS+zVAD引起的巨噬细胞坏死性凋亡，对细胞有保护作用，可以用于抑制细胞坏死性凋亡药物的制备。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中TPNs的合成过程示意图。

图2(A)本发明实验例1中TPNs透射电镜图；图2(B)为本发明实验例1中TPNs扫描电镜图。

图3为本发明实验例1中TPNs的DLS粒径分布图。

图4为本发明实验例1中TPNs的平均DLS粒径与zeta电位。

图5为本发明实验例1中TPNs的元素分析扫描图。

图6为本发明实验例1中TPNs的红外吸收光谱图。

图7为本发明实验例1中TPNs的X射线光电子能谱图，图7(A)为XPS全谱、图7(B)为C1s谱，图7(C)为O1s谱。

图8为本发明实验例1中TPNs在HEPES、PBS、H2O、生理盐水与完全培基中的粒径变化图。

图9为本发明实验例2中TPNs与ABTS^+·溶液孵育的UV吸收光谱。

图10为本发明实验例2中TPNs清除ABTS^+·自由基动力学曲线图。

图11为本发明实验例2中TPNs对·OH清除率结果。

图12为本发明实验例2中TPNs对·O₂ ^-清除率结果。

图13为本发明实验例2中TPNs对·NO清除率结果。

图14为本发明实验例2中TPNs清除胞内RONS结果。具体为control、PENs、LPS、LPS+PENs处理组的荧光成像图。图14中A、B、C、D、E分别指ROS-ID、DCFH-DA、DHE、DAF-FM DA和HPF荧光探针装载不同处理的细胞荧光图，代表细胞内总RONS、H₂O₂、·O₂ ^-、·NO和·OH/ONOO^-水平，标尺＝100μm。

图15为本发明实验例3中TPNs对NLRP3炎性小体及非经典炎性小体引起小鼠腹腔原代巨噬细胞焦亡结果。

图16为本发明实验例3中TPNs对NLRP3炎性小体及非经典炎性小体引起小鼠腹腔原代巨噬细胞IL-1β结果。

图17为本发明实验例4中TPNs对NLRP3炎性小体及非经典炎性小体引起小鼠腹腔原代巨噬细胞GSDMD寡聚体及剪切体结果。图17(A)代表NLRP3炎性小体活化后GSDMD寡聚体及剪切体结果，图17(B)代表非经典炎性小体活化后GSDMD寡聚体及剪切体结果。

图18为本发明实验例5中TPNs对致死性脓毒症模型小鼠生存率结果。

图19为本发明实验例5中TPNs对脓毒症模型小鼠丙二醛、炎症因子、脏器功能影响结果。图19中a～g分别指丙二醛、IL-1α、IL-1β、IL-6、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血肌酐水平。

图20为本发明实验例5中TPNs对脓毒症模型小鼠肺、肝H&E染色病理结果，标尺＝100μm。

图21为本发明实验例6中多酚自聚纳米粒体内安全性评价结果。图21(A)为各组小鼠体重变化曲线图；21(B)为ALT和AST水平(肝功能)；21(C)为CRE和BUM水平(肾功能)；21(D)为不同处理组小鼠心、肝、脾、肺、肾的组织学分析H&E染色，标尺＝100μm。

图22(A)实验例7为多酚自聚纳米粒对RSL3及Erastin(图22B)引起的NRK-52E细胞铁死亡的LDH检测结果，图22(B)为多酚自聚纳米粒对Erastin引起的NRK-52E细胞铁死亡的LDH检测结果。

图23为本发明实验例8中TPNs对小鼠腹腔原代巨噬细胞坏死性凋亡的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

本发明涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。

以下实施例中，所采用的仪器及生产厂家的详细信息参见表1：

表1主要仪器名称及生产厂家

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以下实施例中，所采用的主要试剂名称及生产厂家参见表2：

表2主要试剂名称及生产厂家

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实施例1

制备多酚自聚纳米粒(TPNs)

(1)取3mL浓度为100mM、pH 7.4的HEPES缓冲液至100mL烧杯中，加入25.65mL超纯水，加入750μL 100mM EGCG溶液，水浴常温搅拌1min得到混合溶液。

(2)取600μL 100mM MnCl₂溶液，滴入上述步骤(1)的混合溶液中，25℃恒温水浴并剧烈搅拌1h，取反应液以16,000rpm离心20min收集纳米粒，用HEPES缓冲液(10mM，pH 7.4)清洗两次，将沉淀超声复溶，即得多酚自聚纳米粒(TPNs)。

以上多酚自聚纳米粒的合成过程示意图如图1所示。

实验例1

一、形态：观察TPNs的形态，形态的检测方法：样品滴加在覆盖碳膜的400目铜网上，置于干燥器中，待其烘干后置于扫描电镜(SEM)透射电镜(TEM)下观察样品的微观形态。图2(A)为TPNs的透射电镜图，图2(B)为TPNs的扫描电镜图。从图中可知：本发明的TPNs在电子显微镜下的单一粒子呈不规则球型或类球形，分散性良好。

二、粒径与ζ电位：检测TPNs的粒径，测量方法为：取样品溶液置于Marlven NanoZS仪器，采用动态光激光散射法检测粒径，测定池温度设定为25℃，每个样品平行操作3份。图3为TPNs的粒径分布图，图4为TPNs的平均DLS粒径与zeta电位图。从图的结果可知：多酚自聚纳米粒的平均DLS粒径为173.4±2.69nm，PDI为0.173±0.007，ζ电位为-29.0±3.53mV。

三、元素分析：对TPNs进行元素分析扫描，测定方法为：滴加于铜网上，置于50℃烘箱中烘干，重复操作3～5次，通过场发射透射电镜的元素分析扫描，分析TPNs的元素组成。图5为TPNs的元素分析图。从图中可知：显示了C、O元素在整个TPNs结构上的均匀分布。元素分析图中发现，TPNs中含有极少量的Mn元素，约为0.26At％(原子比)，这可能是EGCG中少量未反应的羟基吸附Mn²⁺造成的。

四、红外光谱：分别对EGCG和TPNs进行红外光谱扫描。图6为EGCG、TPNs的红外吸收光谱图。从图中可知TPNs相比于EGCG图谱，各种特征峰减弱或消失，推测是由于EGCG发生氧化自聚和自组装所致。

五、X射线光电子能谱：对TPNs进行X射线光电子能谱扫描，图7为TPNs的X射线光电子能谱。如图所示，TPNs具有C、O元素的吸收峰和极弱的Mn元素的吸收峰。此外，EGCG中含O键中，C＝O键仅占0.83％，由图7(C)可知，TPNs结构中C＝O键比例显著增多，表明EGCG发生氧化聚合。

六、胶体稳定性检测：将TPNs分别分散于HEPES(10mM,pH 7.4)、PBS(10mM，pH7.4)、H2O、生理盐水与1640完全培养基(含10％FBS)中，室温下孵育，于0、1、2、4、8、12、24、48h取样品测定粒径大小以考察纳米制剂的胶体稳定性。图8为TPNs在HEPES、PBS、H2O、生理盐水与完全培基中的粒径变化图，从图中可知：TPNs粒径均无显著性变化，说明TPNs在在HEPES(10mM，pH 7.4)、PBS(10mM，pH 7.4)、H2O、生理盐水与1640完全培养基中稳定性良好。

实验例2

考察实施例1制备的多酚自聚纳米粒对RONS的清除活性：

一、自由基清除能力考查。采用ABTS法，具体步骤为：

1.1将7.4mM ABTS与2.6mM(NH₄)₂S₂O₈(1:1,v/v)混合制成ABTS^+·溶液，在黑暗环境中4℃保存过夜。用PBS(10mM，pH 7.4)将ABTS^+·溶液稀释至734nm处吸光度为0.70±0.02，得ABTS^+·工作液。

1.2精密量取800μL ABTS^+·工作液，加入200μL 50～500μg/mL的TPNs。使用酶标仪每5min测定734nm处吸光度，直至反应30min，并在30min时测定400～850nm的紫外-可见吸收光谱。图9为系列浓度TPNs与ABTS^+·溶液孵育的UV吸收光谱；图10为不同浓度TPNs清除ABTS^+·自由基动力学曲线。结果表明：表现出快速有效、浓度依赖的ABTS^+·清除活性。

二、·OH、·O₂ ^-、·NO清除活性考察。

(1)羟基自由基(·OH)清除能力。采用羟基自由基测定试剂盒测定TPNs对·OH的清除活性，具体步骤明书。图11为系列浓度TPNs对·OH的清除率。如图所示，TPNs对表现出·OH高灵敏度，在较低的TPNs浓度(25μg/mL)下成功清除了90.56％的·OH。此外，随着TPNs浓度的增加，其对·OH的清除行为呈现浓度依赖性。

(2)超氧阴离子(·O₂ ^-)清除能力。采用抑制和产生超氧阴离子测定试剂盒测定不同浓度(5～200μg/mL)TPNs对超氧自由基(·O₂ ^-)的清除能力。图12为系列浓度TPNs对·O₂ ^-的清除率。如图所示，TPNs可浓度依赖性的清除·O₂ ^-，TPNs对·O₂ ^-有较强的清除能力。

(3)一氧化氮自由基(·NO)清除能力。采用以硝普钠为·NO供体，用一氧化氮测定试剂盒测定TPNs对·NO的清除活性。图13为系列浓度TPNs对·NO的清除率。如图所示，TPNs表现出浓度依赖的·NO消除效应，表明其独特的·NO清除活性。

以上结果证实了TPNs在试管水平具有广谱RONS清除活性。

三、清除RAW264.7细胞胞内RONS活性

(1)选择小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞为模型细胞，用LPS诱导高RONS水平细胞模型，通过对不同RONS选择性响应的RONS探针来考察TPNs对胞内不同种类RONS的清除活性。

(2)RONS探针选择。ROS-ID氧化应激探针反映整体氧化应激水平，代表总自由基水平；DCFH-DA、二氢乙锭(DHE)、羟苯基荧光素(HPF)及DAF-FM DA分别为特异性的H₂O₂、·O₂ ^-、·OH/ONOO^-及·NO的荧光探针。

(3)TPNs清除胞内RONS清除活性研究，具体步骤如下：将RAW264.7细胞(每孔5×10⁴个细胞)接种于24孔板，孵育过夜。LPS(10μg/mL)刺激24h后，弃去培基用TPNs(50μg/mL)处理24h。吸弃培养液，PBS洗1～2次，加0.5mL氧化还原敏感的荧光探针(荧光探针浓度分别为1:1000用无酚红1640培基稀释的ROS-ID探针、30μM DCFH-DA、5μM DHE、20μM HPF、5μMDAF-FM DA)，避光置于培养箱30-45min，弃去培养液，PBS洗2～3次，置于荧光显微镜下观察。图14为TPNs清除RAW264.7胞内RONS：control、TPNs、LPS、LPS+TPNs处理组的荧光图像，A、B、C、D、E分别指ROS-ID、DCFH-DA、DHE、DAF-FM DA和HPF荧光探针装载不同处理的细胞荧光图，代表细胞内总RONS、H₂O₂、·O₂ ^-、·NO和·OH/ONOO^-水平，标尺＝100μm。

由图可见，TPNs处理可显著消除细胞中过量自由基，对胞内总RONS、H₂O₂、·O₂ ^-、·NO、·OH、ONOO^-均有良好的清除效果。综合试管水平与细胞水平自由基清除实验结果，TPNs具有体外广谱自由基清除能力。

实验例3

考察实施例1制备的多酚自聚纳米粒对小鼠腹腔巨噬细胞焦亡及炎症因子释放的影响：

一、制备及提取小鼠腹腔原代巨噬细胞

(1)天平秤取适量的巯基乙酸盐，倒入玻璃瓶中，向瓶加入适量的超纯水，混匀后配置成3％巯基乙酸盐肉汤。肉汤高温高压灭菌后，常温放置3天，置于4℃冰箱储存。

(2)选取6-8周C57小鼠，腹腔注射3mL(1)中的肉汤。72h后，颈椎脱臼法处死小鼠，75％乙醇浸泡5分钟。将小鼠尸体放入超净台内，使用镊子夹起小鼠腹部皮肤，剪刀剪开皮肤，用20mL注射器吸取15mL 1640培养基，针头穿透腹膜，进入腹腔，反复抽吸5-6次，待抽出的培基变成浑浊后打入无菌50mL离心管，800转/分钟，离心5分钟后弃去上清，使用加入了10％血清，1％双抗的1640培基重悬细胞，待细胞吹散计数后接种于24孔板(每孔4×10⁴个细胞)。

二、NLRP3炎性小体及非经典炎性小体激动剂诱导小鼠腹腔原代巨噬细胞焦亡及炎症因子释放

(1)铺板后第二天，使用NLRP3炎性小体刺激方法，即超纯脂多糖(100ng/mL)处理巨噬细胞3小时，加入相应剂量的多酚自聚纳米粒30分钟，用尼日利亚菌素(10μM，1小时)进行刺激，收集培养上清。将收集的培养按照试剂盒的说明进行LDH和ELISA检测。

(2)非经典炎症炎性小体的刺激方法，即三酰脂肽(1μg/mL)处理巨噬细胞3小时，然后加入相应剂量的多酚自聚纳米粒30分钟，再用霍乱毒素B转染超纯脂多糖(2μg/mL)16小时，收集培养上清。将收集的培养按照试剂盒的说明进行LDH和ELISA检测。

图15、16分别为加入相应浓度多酚自聚纳米粒后NLRP3炎性小体(图15)及非经典炎性小体激动剂(图16)引起小鼠腹腔原代巨噬细胞焦亡(通过乳酸脱氢酶指标反应)及炎症因子IL-1β的结果，数据显示多酚自聚纳米粒呈现剂量依赖性抑制NLRP3炎性小体及非经典炎性小体活化后引起的巨噬细胞焦亡和炎症因子释放。

由图可见，多酚自聚纳米粒处理后可显著抑制NLRP3炎性小体及非经典炎性小体活化引起的小鼠腹腔原代巨噬细胞焦亡。

实验例4

考察实施例1制备的多酚自聚纳米粒对GSDMD的影响

(1)制备及提取小鼠腹腔原代巨噬细胞方法同实施例3，细胞吹散后接种于6孔板(每孔2×10⁶个细胞)。

(2)第二天，使用NLRP3炎性小体及非经典炎症炎性小体的刺激方法刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞，方法同实例4。吸弃培养液，PBS洗1～2次，加入细胞裂解液，使用细胞刮铲刮取细胞，冰上裂解10分钟，12000转/分钟离心5分钟，吸取上清，即蛋白样品，测定蛋白样品的蛋白浓度。将样品分为2等份，1份加入5*SDS上样缓冲液，放入水浴锅中，95摄氏度，10分钟，即变性还原蛋白样本。1份加入2*非还原上样缓冲液，即非变性非还原样本。

(3)配制SDS-PAGE凝胶，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内进行电泳，溴酚蓝到达胶的底端处附近停止电泳。

(4)选用0.22μm PVDF膜进行转膜，使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，转膜完毕后，加入5％脱脂牛奶室温封闭1h。

(5)加入稀释好的一抗，4℃孵育过夜。加入TBST，洗涤3次。

(6)按照适当比例用5％脱脂牛奶稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。吸尽洗涤液，加入稀释好的二抗，室温孵育1h。TBST洗涤3次。

(7)最后使用ECL类试剂检测蛋白。

图17为加入相应浓度多酚自聚纳米粒后NLRP3炎性小体及非经典炎性小体活化引起细胞焦亡执行分子GSDMD(GSDMD)的蛋白质印迹法结果，数据显示多酚自聚纳米粒呈现剂量依赖性抑制NLRP3炎性小体及非经典炎性小体活化后引起的GSDMD的寡聚体形成而不影响剪切体形成。

由图可见，多酚自聚纳米粒处理可显著抑制NLRP3炎性小体及非经典炎性小体刺激引起的小鼠腹腔原代巨噬细胞焦亡。

实验例5

考察实施例1制备的多酚自聚纳米粒对LPS诱导的脓毒症小鼠的治疗效果

一、考察多酚自聚纳米粒对致死性脓毒症小鼠模型生存率的影响

(1)选取6-8周C57小鼠，随机分组，包括生理盐水组，生理盐水+多酚自聚纳米粒组，脂多糖组，脂多糖+多酚自聚纳米粒组，称量体重。

(2)腹腔注射生理盐水或多酚自聚纳米粒(25mg/kg)，3小时后，腹腔注射生理盐水或脂多糖(50mg/kg)，每8小时1次观察各组小鼠生存情况并记录。

图18为腹腔注射生理盐水或致死剂量脂多糖(50mg/kg LPS)后，各组小鼠生存率的结果，数据显示生理盐水组，生理盐水+多酚自聚纳米粒组小鼠在观察期96小时内均未死亡，脂多糖组小鼠24小时内全部死亡，脂多糖+多酚自聚纳米粒组小鼠存活时间，96小时存活率均明显高于脂多糖组。

由图可见，多酚自聚纳米粒对致死性脓毒症模型小鼠有保护作用。

二、考察多酚自聚纳米粒对脓毒症小鼠模型的影响

(1)选取6-8周C57小鼠，随机分组，包括生理盐水组，生理盐水+多酚自聚纳米粒组，脂多糖组，脂多糖+多酚自聚纳米粒组，称量体重。

(2)腹腔注射生理盐水或多酚自聚纳米粒(25mg/kg)，3小时后，腹腔注射生理盐水或脂多糖(30mg/kg)。14小时后，将小鼠处死，收集血样，使用血清进行氧化应激指标(丙二醛)、炎症因子(IL-1α、IL-1β、IL-6)、肝功能(ALT、AST)和肾功能(CRE)测定，同时收集小鼠的肝、肺，生理盐水洗涤，滤纸吸干水分，4％多聚甲醛固定24h。将组织石蜡包埋、切片、HE染色，利用光学显微镜观察病理改变。

图19为多酚自聚纳米粒对脓毒症模型小鼠血清丙二醛、炎症因子(IL-1α、IL-1β、IL-6)及肝肾功能检测结果。数据显示，多酚自聚纳米粒可降低脓毒症引起的炎症因子(IL-1α、IL-1β、IL-6)、丙二醛升高，减少肝肾功能损害。

图20为多酚自聚纳米粒对脓毒症模型小鼠肺部、肝脏HE染色结果。结果提示，多酚自聚纳米粒可缓解脓毒症模型小鼠肺部及肝脏炎症细胞浸润，对脓毒症模型小鼠脏器功能有保护作用。

实验例6

考察实施例1制备的多酚自聚纳米粒在体内生物安全性

将6-8周C57小鼠随机分为2组(n＝3)，分别腹腔注射生理盐水或25mg/kg TPNs。给药后每天记录小鼠体重。给药8天后，将小鼠处死，收集血样，得血清进行血液生化分析，检测血清中ALT、AST、BUN、CRE的含量，评价制剂的肝肾毒性。同时收集小鼠的主要器官包括心、肝、脾、肺、肾，生理盐水洗涤，滤纸吸干水分，4％多聚甲醛固定24h。将组织石蜡包埋、切片、HE染色，利用光学显微镜观察病理改变。

图21A为各组小鼠体重变化曲线。与生理盐水组相比，TPNs组均无体重下降现象

图21B为小鼠血清中ALT、AST含量(肝功能指标)

图21C为小鼠血清中BUN、CRE含量(肾功能指标)

图21D各组小鼠心、肝、脾、肺、肾病理切片分析。标尺＝100μm。与Control组相比，TPNs组各器官无明显病理改变。以上结果说明纳米多酚自聚纳米粒体内安全性良好。

实验例7

考察实施例1制备的多酚自聚纳米粒对肾小管上皮细胞铁死亡的影响

(1)选择NRK-52E(大鼠肾小管上皮细胞系)为模型细胞，使用公认的两种铁死亡激动剂RSL3或Erastin诱导细胞铁死亡，通过检测NRK-52E细胞系在受到铁死亡激动剂刺激后的上清乳酸脱氢酶值来反应细胞死亡情况，考察TPNs对NRK-52E细胞系铁死亡的影响。

(2)TPNs对NRK-52E细胞系铁死亡的研究，具体步骤如下：将NRK-52E细胞(每孔2×10⁵个细胞)接种于48孔板，孵育过夜。用相应浓度的TPNs处理30分钟，弃去培基，分别用RSL3(0.5μM)处理16小时或Erastin(1μM)处理24小时，收集上清，将收集的上清按照试剂盒的说明进行LDH检测。

图22(A)为多酚自聚纳米粒对RSL3及Erastin(图22B)引起的NRK-52E细胞铁死亡的LDH检测结果，图22(B)为多酚自聚纳米粒对Erastin引起的NRK-52E细胞铁死亡的LDH检测结果。数据显示，TPNs处理可显著抑制RSL3及Erastin引起的NRK-52E细胞铁死亡，对细胞有保护作用。

实验例8

考察实施例1制备的多酚自聚纳米粒对小鼠腹腔巨噬细胞坏死性凋亡的影响

(1)选择小鼠腹腔巨噬细胞为模型细胞，使用脂多糖+zVAD引起小鼠腹腔巨噬细胞坏死性凋亡，通过检测刺激后的乳酸脱氢酶值来反应细胞死亡情况，考察TPNs对巨噬细胞坏死性凋亡的影响。

(2)TPNs对鼠腹腔巨噬细胞坏死性凋亡的研究，具体步骤如下：制备及提取小鼠腹腔原代巨噬细胞方法同实例4，将巨噬细胞(每孔3×10⁵个细胞)接种于48孔板，孵育过夜。用相应浓度的TPNs处理30分钟，弃去培基，分别用脂多糖(100ng/mL)+zVAD(2μmol/mL)刺激6小时，收集上清，将收集的上清按照试剂盒的说明进行LDH检测。

图23为多酚自聚纳米粒对脂多糖+zVAD引起的坏死性凋亡的LDH检测结果。数据显示，TPNs处理可显著抑制脂多糖+zVAD引起的巨噬细胞坏死性凋亡，对细胞有保护作用。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种多酚自聚纳米粒，其特征在于，所述多酚自聚纳米粒由表没食子儿茶素没食子酸酯在pH 7.4-8.5的弱碱性环境中通过二价金属锰离子的催化氧化自聚而成。

2.根据权利要求1所述的多酚自聚纳米粒，其特征在于，所述表没食子儿茶素没食子酸酯与二价金属锰离子摩尔比为1:5～5:1。

3.一种如权利要求1-2任一项所述多酚自聚纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将表没食子儿茶素没食子酸酯溶于pH 7.4-8.5的缓冲液中，水浴常温搅拌，得到表没食子儿茶素没食子酸酯混合液；

S2、将二价金属锰离子溶液滴入至步骤S1中所述表没食子儿茶素没食子酸酯混合液中，恒温水浴，剧烈搅拌；

S3、将步骤S2中所得反应液离心收集沉淀，将所述沉淀用缓冲液清洗，即得多酚自聚纳米粒。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在在于，所述步骤S1中缓冲液为HEPES缓冲液，所述HEPES缓冲液终浓度为10～15mM。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在在于，所述步骤S2中金属锰离子溶液为MnCl₂溶液，所述金属锰离子滴加后终浓度为0.5～12.5mM，所述步骤S2中水浴温度为25℃～35℃，所述搅拌反应时间为0.5～12h。

6.一种如权利要求1-2任一项所述的多酚自聚纳米粒或由权利要求3-6任一项所述制备方法制得的多酚自聚纳米粒在制备抗脓毒症药物中的应用。

7.根据权利要求7所述的多酚自聚纳米粒在制备抗脓毒症药物中的应用，其特征在于，所述多酚自聚纳米粒可以为外用制剂、口服制剂或注射制剂。

8.根据权利要求7所述的多酚自聚纳米粒在制备抗脓毒症药物中的应用，其特征在于，所述多酚自聚纳米粒可以同时负载其他治疗药物。

9.一种如权利要求1-2任一项所述的多酚自聚纳米粒或由权利要求3-6任一项所述制备方法制得的多酚自聚纳米粒在制备抑制细胞铁死亡药物中的应用。

10.一种如权利要求1-2任一项所述的多酚自聚纳米粒或由权利要求3-6任一项所述制备方法制得的多酚自聚纳米粒在制备抑制细胞坏死性凋亡药物中的应用。

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