CN102512683A

CN102512683A - 一种高分子基因药物载体及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN102512683A
Application number: CN2011104400993A
Authority: CN
Inventors: 毛宗万; 黎锦明; 黄华珍; 计亮年
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2012-06-27

Abstract

本发明涉及一种具有靶向癌细胞和复合载药功能的高分子材料，合成简单，载药效率高，可作为高效低毒的基因药物载体，运载能特异性沉默靶标癌基因的siRNA进入癌细胞，抑制癌细胞和肿瘤的生长。MTT数据表明该载体的细胞毒性非常小；流式细胞仪和激光共聚焦显微镜数据表明该材料运载抗癌的siRNA效率很高；WesternBlot和体内抗肿瘤的结果也表明，该载体在运载基因药物siRNA特异性沉默癌基因的体外和体内实验中都取得了非常好的抑制癌细胞和肿瘤的效果。此外，由于该药物载体的制备方法简单，原料便宜，合成成本低，在一般化学实验室均可完成，因此该药物载体可用作一种新型的药物载体。

Description

一种高分子基因药物载体及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种高分子基因药物载体及其制备方法，具体涉及具有靶向肿瘤的叶酸基团连接羟丙基环糊精-聚乙烯亚胺载体骨架形成高效低毒的基因药物载体的制备方法及其抑制裸鼠肿瘤生长的应用。

背景技术

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

然而，利用siRNA治疗疾病需要解决几个问题：（1）给药，也就是siRNA导入和定向的问题，如何使用高效载体定向传递siRNA到目标细胞而不影响其他无关细胞，甚至包括在释放时间上的控制；（2）siRNA稳定性，包括修饰或者用递送试剂包埋等方法提高或者控制siRNA稳定性；（3）安全问题。

高分子生物降解材料制备的纳米颗粒具有稳定、无毒、无抗原性、生物相容性好对所转运基因的表达有缓释作用及对基因有保护作用等优点，是良好的纳米基因转运载体材料。聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是最常用的阳离子多聚物非病毒载体，PEI可把核酸(DNA或RNA)缩合成数百纳米大小的颗粒，通过静电作用吸附到细胞表面上，被动内吞。PEI在吞噬泡内不会降解，同时保护核酸免受溶酶体降解；此外，PEI有渗透性肿胀效应，导致吞噬泡破裂，使具有治疗作用的核酸释放出来进入胞浆，产生疗效，治疗疾病。

本发明通过有机催化反应合成高效低毒的高分子基因药物载体，使其具有高效运载药物和靶向肿瘤的功能。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种高效低毒的高分子基因药物载体，其结构式如式（I）所示：

式（I）

式（I）中，羟丙基环糊精为载体基本骨架，聚乙烯亚胺为支链，叶酸为靶向癌细胞的功能基团。其中m₁的范围是1到10，m₂范围是1到5。

发明同时提供了该高分子基因药物载体的制备方法，是利用中间体羰基二咪唑将羟丙基环糊精和聚乙烯亚胺连接起来，得到所述的高分子载体主体结构，再与经活化的叶酸连接形成所述的叶酸-羟丙基环糊精-聚乙烯亚胺药物载体。所述的羟丙基环糊精是环糊精中的一种，也是唯一通过美国FDA认证的环糊精；所述的聚乙烯亚胺为毒性非常小，分子量为600的聚乙烯亚胺。

合成过程包括以下主要步骤：

（1）先将羟丙基环糊精及羰基二咪唑溶于DMSO，混合物在惰性气体环境中避光反应，产物沉淀后再溶解在DMSO中，形成羟丙基环糊精-羰基二咪唑DMSO溶液；

（2）再将分子量为600的聚乙烯亚胺溶于DMSO中，逐滴加入羟丙基环糊精-羰基二咪唑DMSO溶液，惰性气体环境中避光反应，形成羟丙基环糊精-聚乙烯亚胺；

（3）将叶酸溶于DMSO，水浴加热使其完全溶解，然后加入活化剂DCC和NHS及催化剂Et3N，在惰性气体环境中下50-60度避光反应3-6小时，以活化叶酸；

（4）将羟丙基环糊精-聚乙烯亚胺用DMSO完全溶解，将活化后的叶酸逐滴加入其中，惰性气体环境中50-60度避光反应10-12小时，形成叶酸-羟丙基环糊精-聚乙烯亚胺药物载体。

可优选以下方案进行：

高分子载体主体结构的合成：先将羟丙基环糊精及羰基二咪唑溶于DMSO（二甲基亚砜），混合物在氮气保护避光的容器中持续搅拌3-6小时，产物加入4度乙醚，产生沉淀，过滤，再溶解在DMSO中，形成羟丙基环糊精-羰基二咪唑DMSO溶液。再将分子量为600的聚乙烯亚胺溶于DMSO中，逐滴加入上述羟丙基环糊精-羰基二咪唑DMSO溶液，混合物在氮气保护避光的容器中持续搅拌3-6小时。所述反应后的清夜，置于分子量为2000的透析袋中，流动纯水透析两天，再将透析袋中的剩余液体冰冻干燥三天，最后生成白色絮状物。

高分子载体的制备方法，具体反应步骤为：先将叶酸溶于DMSO，然后加入活化剂DCC和NHS及催化剂Et3N，在氮气保护下50-60度避光反应3-6小时，以活化叶酸。所述活化后的叶酸，将其逐滴加入提纯后用DMSO完全溶解的羟丙基环糊精-聚乙烯亚胺，在氮气保护下50-60度避光反应10-12小时。所述反应后的清夜，置于分子量为5000的透析袋中，流动纯水透析两天，再将透析袋中的剩余液体冰冻干燥三天，最后生成淡黄色絮状物，为具有靶向肿瘤功能的叶酸-羟丙基环糊精-聚乙烯亚胺药物载体。

这个反应过程可以由以下反应式表示：

反应式 Ⅰ（羟丙基环糊精-聚乙烯亚胺的合成）

反应式 Ⅱ（叶酸-羟丙基环糊精-聚乙烯亚胺载体的合成）

本发明所提供的高分子基因药物载体，可用于运载具有抗肿瘤功能的基因药物进入肿瘤细胞。更具体的来说是用于运载能够抑制肿瘤血管内皮生长因子生成的siRNA进入肿瘤细胞，从而抑制肿瘤生长。所述的药物载体含有药学上可接受的载体的药物组合物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明使用唯一通过美国FDA认证的环糊精羟丙基环糊精作为载体骨架，低分子量聚乙烯亚胺作为载体支链，叶酸作为可以靶向肿瘤的功能基团，形成具有靶向肿瘤功能的高效低毒药物载体。MTT细胞毒性数据表明，该高分子药物载体其毒性非常小。同时Western Blot和体内抗肿瘤的结果也表明，该载体在运载基因药物（siRNA）特异性沉默癌基因的体外和体内实验中都取得了非常好的抑制癌细胞和肿瘤的效果。

附图说明

图1为合成的高分子聚合物基因载体在四种细胞中的细胞毒性，其在四种细胞中显示了非常低的细胞毒性，当浓度达到300mg/mL的时候，细胞存活率还在90%以上。

图2为不同给药组肿瘤增值生长曲线图。用HeLa细胞接种裸鼠致瘤，待肿瘤长到80mm2时开始给药，给药分三次进行，分别为8天，11天和14天给药。给药组为对照组（PBS），无相关序列siRNA组（FA-HP-CD-PEI），siVEGF组（HP-CD-PEI），siVEGF组（FA-HP-CD-PEI）。给药后观察肿瘤的增值和大小。其中siVEGF组（HP-CD-PEI）和siVEGF组（FA-HP-CD-PEI）抑制肿瘤的效果显著，特别是siVEGF组（FA-HP-CD-PEI），抑制肿瘤的效果非常好，肿瘤基本没有继续显著的增长。

图3为给药20天后不同给药组肿瘤大小示意图。给药20天后，对照组（PBS）和无相关序列siRNA组（FA-HP-CD-PEI）裸鼠均死亡，siVEGF组（HP-CD-PEI）和siVEGF组（FA-HP-CD-PEI）裸鼠没有死亡。处死裸鼠后收集肿瘤，测量大小，如图所示：其中siVEGF组（HP-CD-PEI）和siVEGF组（FA-HP-CD-PEI）抑制肿瘤的效果显著，特别是siVEGF组（FA-HP-CD-PEI），抑制肿瘤的效果非常好，肿瘤基本没有继续显著的增长。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

以羟丙基环糊精为骨架聚乙烯亚胺为支链叶酸靶向肿瘤的高分子基因药物载体的合成：

将0.51g羟丙基环糊精溶于6mlDMSO中，加入0.1ml三乙胺，再取0.42g羰基二咪唑溶于6ml，混合后在氮气保护下避光搅拌1-3小时。产物为羟丙基环糊精-羰基二咪唑。产物加入4度乙醚，产生沉淀，过滤，溶解在DMSO中，形成羟丙基环糊精-羰基二咪唑DMSO溶液。将0.89g分子量为600的聚乙烯亚胺（CAS号9002-98-6）溶于DMSO中，逐滴加入上述羟丙基环糊精-羰基二咪唑DMSO溶液，混合物在氮气保护避光的容器中持续搅拌3-6小时。反应后的产物，置于分子量为2000的透析袋中，流动纯水透析两天，再将透析袋中的剩余液体冰冻干燥三天，最后生成白色絮状物。再将10mg叶酸溶于DMSO，然后加入9mg活化剂DCC和5mgNHS及催化剂0.1ml三乙胺，在氮气保护下50-60度避光反应3-6小时，以活化叶酸。所述活化后的叶酸，将其逐滴加入提纯后用DMSO完全溶解的羟丙基环糊精-聚乙烯亚胺（135mg），控制在1-2小时内滴完，补加0.1ml三乙胺，在氮气保护下50-60度避光反应10-12小时，终产物置于分子量为5000的透析袋中，流动纯水透析两天，再将透析袋中的剩余液体冰冻干燥三天，最后生成淡黄色絮状物，为具有靶向肿瘤功能的叶酸-羟丙基环糊精-聚乙烯亚胺药物载体。其结构式为：

实施例2

实施例1所制的化合物的细胞毒性试验和结果。

细胞系以及培养条件: HepG2 (人肝癌细胞)、Hela (人宫颈癌细胞)、HLF (人肺成纤维样细胞)、A549 (人肺癌细胞)由中山大学实验与动物中心提供。细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，其中含有每毫升100单位青霉素和100 微克链霉素，细胞接种于直径为10 厘米的培养皿后，37度、5% CO₂环境中培养，细胞长满时用胰蛋白酶消化法进行传代。

细胞毒性测试: 细胞毒性采用MTT法测定。将细胞用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，采用血球计算版进行活细胞数，调整活细胞浓度为5 × 10⁴每毫升接种于96孔培养板，每孔160 微升，培养24小时之后，再分别加入不同浓度的四核铂配合物，置37度，在含5% CO₂的培养箱中孵育48小时，于结束前4小时加入MTT 20微升每孔，4小时后弃上清液，加入DMSO 100微升每孔，振荡10分钟左右，置酶标仪测定OD值，波长设置为570纳米和607纳米双波长。按下列公式计算存活率，评价药物的细胞毒性。

存活率% = 加药孔平均OD值/对照孔平均OD值×100%

实施例3

实施例1所制的高分子基因载体运载基因药物siRNA抑制肿瘤生长试验和结果。

先将裸鼠致瘤，为了获得肿瘤，50μl密度为10⁶HeLa细胞PBS溶液注射进6-7周龄的雌性裸鼠中。注射癌细胞后每天测量肿瘤大小，肿瘤大小用游标卡尺测量，长为（a），宽为（b），肿瘤体积计算公式为V=0.5a×b²。待肿瘤长到80mm³时开始给药，分四个给药组：（1）PBS为control；（2）无治疗作用siRNA/叶酸靶向载体组；（3）治疗siRNA/无叶酸靶向载体组；（4）治疗siRNA/叶酸靶向载体组。每三天给药一次，给药方式为尾静脉注射，每次每只裸鼠注射50μl纯PBS或药液（含5μg的siRNA)。每三天测量一次肿瘤大小，最后一次给药后一天处死裸鼠，取出肿瘤，测量大小，评估各给药组抑制肿瘤的效果。

结果如图1和图2所示。

其中各组表示：（1）Control组：注射PBS；（2）siLuc/FA-HP-CD-PEI组：无治疗作用siRNA/叶酸靶向载体组；（3）siVEGF/HP-CD-PEI组：有治疗作用siRNA/无叶酸靶向载体组；（4）siVEGF/FA-HP-CD-PEI组：有治疗作用siRNA/叶酸靶向载体组。

用HeLa细胞接种裸鼠致瘤，待肿瘤长到80mm³时开始给药，给药分三次进行，分别为8天，11天和14天给药。

图2：分四个给药组：（1）PBS为control；（2）无治疗作用siRNA/叶酸靶向载体组；（3）治疗siRNA/无叶酸靶向载体组；（4）治疗siRNA/叶酸靶向载体组，给药后观察肿瘤的增值和大小。其中siVEGF组（HP-CD-PEI）和siVEGF组（FA-HP-CD-PEI）抑制肿瘤的效果显著，特别是siVEGF组（FA-HP-CD-PEI），抑制肿瘤的效果非常好。

图3：给药20天后，处死裸鼠后收集肿瘤，测量大小，如2图所示：其中siVEGF组（HP-CD-PEI）和siVEGF组（FA-HP-CD-PEI）抑制肿瘤的效果显著，特别是siVEGF组（FA-HP-CD-PEI），抑制肿瘤的效果非常好，肿瘤基本没有继续显著的增长。

由上述结果可知，所合成的高分子基因药物载体表现细胞毒性低且十分高效的运载抗肿瘤基因药物的能力，很好的抑制了肿瘤的生长，是十分理想的基因药物载体。

Claims

1.一种高效低毒的高分子基因药物载体，应用于运载基因药物靶向及抑制活体肿瘤增值和生长，其特征在于结构通式如式（I）所示：

Figure 2011104400993100001DEST_PATH_IMAGE002

式（I）

式（I）中，羟丙基环糊精为载体基本骨架，聚乙烯亚胺为支链，叶酸为靶向癌细胞的功能基团，其中m₁的范围是1到10，m₂范围是1到5。

2.如权利要求1所述的高分子基因药物载体的制备方法，其特征在于利用中间体羟基二咪唑将聚乙烯亚胺和羟丙基环糊精连接起来，形成药物载体基本骨架，再与经活化的叶酸连接形成所述的叶酸-羟丙基环糊精-聚乙烯亚胺药物载体。

3.如权利要求2所述的高分子基因药物载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）先将羟丙基环糊精及羰基二咪唑溶于DMSO，混合物在惰性气体环境中避光反应，形成羟丙基环糊精-羰基二咪唑DMSO溶液；

（2）再将分子量为600的聚乙烯亚胺溶于DMSO中，逐滴加入羟丙基环糊精-羰基二咪唑DMSO溶液，惰性气体环境中避光反应，生成羟丙基环糊精-聚乙烯亚胺；

（3）将叶酸溶于DMSO，然后加入活化剂DCC（N,N-二环己基碳二亚胺）和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）及催化剂Et3N（三乙胺），在惰性气体环境中下50-60度避光反应3-6小时，以活化叶酸；

4.如权利要求3所述的高分子基因药物载体的制备方法，其特征在于在步骤（1）所述的避光反应时间为1-3小时，并持续搅拌；产物加入乙醚沉淀过滤，再溶解在DMSO中，形成羟丙基环糊精-羰基二咪唑DMSO溶液。

5.如权利要求3所述的高分子基因药物载体的制备方法，其特征在于在步骤（2）所述的聚乙烯亚胺为分子量为600的聚乙烯亚胺。

6.如权利要求3所述的高分子基因药物载体的制备方法，其特征在于在步骤（2）所述的避光反应时间为3-6小时，反应后的清液置于分子量为2000的透析袋中，用流动纯水透析，再将透析袋中的剩余液体冰冻干燥，最后生成淡黄色絮状物。

7.如权利要求1所述的高分子基因药物载体的应用，其特征在于用于制备抗肿瘤药物。

8.如权利要求 7所述的应用，其特征在于所述的药物载体含有药学上可接受的载体的药物组合物。