CN109069528A - 通过DBait分子的全身性给药治疗癌症 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及DBait分子的用途，其不与任何内涵体裂解剂相组合，通过全身性途径使用。

Description

通过DBait分子的全身性给药治疗癌症
技术领域
本发明涉及肿瘤学领域。
背景技术
乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤，在全世界每年有超过一百七十万新诊断病例(Torre,Siegel,Ward,&Jemal,2015)。分子分类将乳腺癌分成3个主要亚型：Luminal A/B，HER2+和基底样/三阴性乳腺癌(TNBC)(Vuong,Simpson,Green,Cummings,&Lakhani,2014)。三阴性乳腺癌(TNBC)是一种攻击性组织学亚型，具有有限的治疗选项，并在标准的化疗方案后具有非常不良的进展后预后。对当前的标准疗法例如蒽环霉素类或紫杉烷类的耐药性将先前治疗过的具有转移性TNBC的患者的可用选项限制到少数非交叉耐药性方案，并且目前不存在优选的标准化疗。基于铂的方案对于患有具有BRCA1突变的TNBC的患者来说是一种新兴选项。
化疗耐药性对癌症治疗的功效构成主要障碍。DNA修复通过消除染色体上由化疗剂引起的损伤而在化疗耐药性中发挥关键作用，并且DNA修复途径的抑制剂可以为恢复肿瘤对这些治疗的敏感性提供新的机会。
Dbait分子是一类新的DNA修复抑制剂，在癌细胞中触发假的DNA损伤信号转导。这些分子是具有游离双链钝末端的短的双链DNA，其靶向关键的损伤信号转导物例如DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)和Poly-ADP-Ribo-聚合酶，触发它们的激活并放大假的损伤信号转导。因此，下游DNA修复酶的召集受损，抑制了几种DNA修复途径例如同源重组、非同源末端接合、碱基切除修复和单链断裂修复，导致未被修复的损伤积累，造成细胞死亡。
已显示，Dbait分子与放疗相组合在体外和体内两种情况下对几种耐放疗肿瘤是有效的。为了提高细胞摄入的效率，通过将胆固醇组成部分共价连接到5’-末端，对Dbait分子进行修饰(DT01)(WO2011/161075；Berthault等，2011,Cancer gene therapy,18,695-706)。已证实，DT01通过肿瘤内注射的局部给药与放疗相联合，提高了异种移植的人类黑素瘤模型的存活率(Biau等，2014,Neoplasia,16,835-844)。然而到目前为止，单独或与化疗相联合的DT01的全身性给药的功效尚未被调查。
然而，已显示DT01作为辅助治疗在兔VX2肝肿瘤模型中提高经动脉化疗栓塞(TACE)的治疗功效(Devun等，Journal of Vascular and Interventional Radiology,2013,24,1080)，但TACE通过两种主要机制衍生出它的有益效果。首先，肝脏内的大多数肿瘤由适合的肝动脉供养，因此动脉栓塞优先中断肿瘤的血液供应并拖延生长，直至新血管形成。其次并且最重要的是，化疗的集中给药允许将较高剂量递送到组织并在同时降低全身性暴露，而所述全身性暴露通常是限制剂量的因素。
此外，分子DT01被设计成与内涵体裂解剂例如氯喹相组合使用。氯喹促进coDbait从内涵体释放到胞质溶胶中，并被描述成是必需的。因此显示了coDbait在氯喹存在下通过皮下和肿瘤内注射给药，并且向所述方案添加伴随的氯喹治疗以提高coDbait摄入和功效，导致通过coDbait提高了异种移植的肿瘤的放疗敏感性(Schlegel等，2012,MolecularTherapy–Nucleic Acids,1,e33)。
还应该指出，某些癌症、特别是耐放疗或耐化疗癌症例如三阴性乳腺癌(TNBC)仍然难以治疗，它们的治疗的任何改进都是重要的。
发明内容
令人吃惊的是，本发明人观察到DBait分子，特别是被称为coDBait的与胆固醇偶联的DBait分子，可以在没有任何喹啉内涵体裂解剂、特别是氯喹的情况下，通过全身性给药、特别是腹膜内和静脉内给药，高效用于治疗癌症，甚至是耐药性癌症。事实上，通过这些给药途径，使用仅仅高2-5倍的剂量即可获得相同的功效，并且偶联的DBait没有毒性。已使用耐药性癌症显示了所述偶联的DBait在腹膜内和静脉内给药的情况下的功效。
因此，本发明涉及一种用于治疗癌症的核酸分子，其中所述核酸分子具有下式之一：
其中N是脱氧核苷酸，n是15至195的整数，带下划线的N是指具有或不具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸，L’是连接物，C是促进胞吞的分子，所述促进胞吞的分子选自亲脂性分子或靶向细胞受体使实现受体介导的胞吞的配体，L是连接物，m是0或1的整数，并且p是1；
其中所述核酸在不与内涵体裂解剂组合给药的情况下使用；
其中所述核酸通过选自腹膜内和静脉内途径的肠胃外全身性途径来给药。
优选地，式(I)的核酸具有一个或几个下述特征：
-N是脱氧核苷酸，其选自A(腺嘌呤)、C(胞嘧啶)、T(胸腺嘧啶)和G(鸟嘌呤)，并被选择成避免出现CpG二核苷酸并且与人类基因组中的任何基因具有低于80％的序列同一性；和/或
-连接的L’选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)和1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；和/或
-m是1并且L是甲酰胺基聚乙二醇，更优选为甲酰胺基三乙二醇或甲酰胺基四乙二醇；和/或
-C选自胆固醇，单链脂肪酸或双链脂肪酸例如十八烷酸、油酸、二油酸或硬脂酸，或靶向细胞受体的配体(包括肽、蛋白质、适体)例如叶酸、生育酚，糖例如半乳糖和甘露糖以及它们的寡糖，肽例如RGD和铃蟾肽，以及蛋白质例如转铁蛋白和整合蛋白，优选为胆固醇或生育酚，更优选为胆固醇。
更优选地，所述核酸分子具有下式之一：：
其中带下划线的核苷酸是指具有或不具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架的核苷酸，连接的L’选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)和1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；m是1并且L是甲酰胺基寡聚乙二醇，C选自二油酸、十八烷酸、叶酸、生育酚和胆固醇；
其中所述核酸在不与任何内涵体裂解剂、特别是氯喹组合给药的情况下使用；并且
其中所述核酸通过选自腹膜内和静脉内途径的肠胃外全身性途径来给药。
更优选地，所述核酸是
其中带下划线的核苷酸是指具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸。
优选地，所述核酸通过静脉内途径来给药，例如通过注射、静脉内滴注、推注或泵来给药。
优选地，所述癌症是耐放疗或耐化疗癌症。更优选地，它选自三阴性乳腺癌(TNBC)、耐化疗肝细胞癌(HCC)、耐化疗卵巢癌、耐化疗肺癌和转移性肝癌。在特定实施方式中，所述癌症选自多柔比星耐药肝癌(HCC)、铂耐药卵巢癌、铂耐药三阴性乳腺癌和结肠直肠的肝转移肿瘤。
优选地，所述核酸与放疗和/或化疗相组合使用。在一个实施方式中，所述核酸与DNA损伤剂相组合使用。优选地，所述DNA损伤剂选自拓扑异构酶I或II的抑制剂、DNA交联剂、DNA烷化剂、抗代谢剂和有丝分裂纺锤体的抑制剂。更优选地，所述核酸与选自多柔比星、奥沙利铂、卡铂、顺铂和5-FU的化疗相组合使用。
发明详述
本发明涉及一种用于治疗癌症的核酸分子(coDBait)，其中所述核酸分子具有下式之一：
其中N是脱氧核苷酸，n是1至195的整数，带下划线的N是指具有或不具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸，L’是连接物，C是促进胞吞的分子，所述促进胞吞的分子选自亲脂性分子或靶向细胞受体使实现受体介导的胞吞的配体，L是连接物，m是0或1的整数，并且p是1；
其中所述核酸在不与内涵体裂解剂组合给药的情况下使用；
其中所述核酸通过选自腹膜内和静脉内途径的肠胃外全身性途径来给药。
当本文中提到不存在喹啉内涵体裂解剂时，它是指如WO2011/161075(通过参考并入本文)的第26-28页中所定义的内涵体裂解剂。具体来说，所述喹啉内涵体裂解剂是氯喹。具体来说，它意味着本文中所描述的核酸不与任何内涵体裂解剂同时、分开或顺序使用。
本发明涉及
-本文中所定义的核酸分子或包含它和任选的可药用载体的药物组合物，特别是用于在不与喹啉内涵体裂解剂组合给药的情况下治疗癌症，并且其中所述药物组合物通过选自腹膜内和静脉内途径的肠胃外全身性途径来给药，任选地与放疗和/或DNA损伤性抗肿瘤剂相组合；
-本文中所定义的核酸分子或包含它的药物组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述药物不与任何喹啉内涵体裂解剂相组合使用，并通过选自腹膜内和静脉内途径的肠胃外全身性途径来给药，任选地与放疗和/或DNA损伤性抗肿瘤剂相组合；
-一种用于在对象中治疗癌症的方法，所述方法包括在不给药任何喹啉内体裂解剂的情况下通过选自腹膜内和静脉内途径的肠胃外全身性途径来给药治疗有效量的本文中所定义的核酸分子或包含它的药物组合物；
-一种药物组合物，其包含本文中所定义的核酸分子、DNA损伤性抗肿瘤剂和可药用载体，特别是用于在不与喹啉内涵体裂解剂组合给药的情况下治疗癌症，并且其中所述药物组合物通过选自腹膜内和静脉内途径的肠胃外全身性途径来给药；
-一种药物组合物，其包含本文中所定义的核酸分子和DNA损伤性抗肿瘤剂，用于制造治疗癌症的药物，其中所述药物不与任何喹啉内涵体裂解剂相组合使用，并通过选自腹膜内和静脉内途径的肠胃外全身性途径来给药；
-一种用于在对象中治疗癌症的方法，所述方法包括在不给药任何喹啉内体裂解剂的情况下通过选自腹膜内和静脉内途径的肠胃外全身性途径来给药治疗有效量的包含本文中所定义的核酸分子和DNA损伤性抗肿瘤剂的药物组合物，并任选地与放疗和/或DNA损伤性抗肿瘤剂相组合；
-一种产品或试剂盒，其含有(a)本文中所定义的核酸分子和任选的(b)DNA损伤性抗肿瘤剂作为同时、分开或顺序使用的组合制剂，特别是用于在不与喹啉内涵体裂解剂组合给药的情况下治疗癌症，并且其中所述药物组合物通过选自腹膜内和静脉内途径的肠胃外全身性途径来给药；
-一种用于在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括在不给药任何喹啉内涵体裂解剂的情况下通过选自腹膜内和静脉内途径的肠胃外全身性途径来给药有效量的包含本文中所定义的核酸分子的药物组合物和有效量的包含DNA损伤性抗肿瘤剂的药物组合物。
当在本文中使用时，术语“试剂盒”、“产品”或“组合制剂”特别地在下述意义上定义了“分药剂试剂盒(kit of parts)”，即，如上所定义的组合配偶体可以独立地或利用具有不同量的组合配偶体的不同固定组合来给药，即同时或在不同时间点给药。然后所述分药剂试剂盒的分药剂例如可以同时或在时间上错开地给药，后者是指对于所述分药剂试剂盒的任何分药剂来说，在不同时间点并且以相等或不同的时间间隔进行给药。所述组合制剂中待给药的组合配偶体的总量之比可以变化。所述组合配偶体可以通过相同途径或通过不同途径来给药。
在本发明的情形中，术语治疗表示治愈性、症状改善性和预防性治疗。本发明的药物组合物、试剂盒、产品和组合制剂可以在目前患有癌症或肿瘤、包括处于癌症进展的早期或晚期阶段的人类中使用。本发明的药物组合物、试剂盒、产品和组合制剂不必定治愈患有癌症的患者，但将延迟或减缓所述疾病的进展或阻止其进一步发展，由此改善患者的状况。具体来说，本发明的药物组合物、试剂盒、产品和组合制剂在哺乳动物宿主中减少肿瘤的发展，降低肿瘤负荷，产生肿瘤减退和/或阻止转移发生和癌症复发。在癌症的治疗中，本发明的药物组合物以治疗有效量给药。
“治疗有效量”是指本发明的药物组合物单独地或与所述药物组合物、试剂盒、产品或组合制剂的其他活性成分相组合，在哺乳动物、包括人类中阻止、消除或减轻癌症的有害效应的量。应该理解，对于所述组合物中的每种化合物来说，给药的剂量，即为单独或与其他治疗相组合使用的每种化合物所定义的“治疗有效量”，可能低于这里描述的组合。所述组合物的“治疗有效量”由本领域技术人员根据患者、疾病、给药方式等调整。
在这整个说明书中，无论何时针对本发明的药物组合物提到“癌症治疗”等时，意味着：a)用于治疗癌症的方法，所述方法包括向需要这种治疗的对象给药本发明的药物组合物；b)本发明的药物组合物在治疗癌症中的用途；c)本发明的药物组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途；和/或d)本发明的药物组合物，其用于治疗癌症。
除了活性成分之外，本文中设想的药物组合物可以包括可药用载体。术语“可药用载体”意味着涵盖不干扰活性成分的生物活性的有效性并且对被给药的宿主无毒性的任何载体(例如支持物、物质、溶剂等)。例如，对于肠胃外给药来说，可以将活性化合物在介质例如盐水、右旋糖溶液、血清白蛋白和林格溶液中配制成用于注射的单位剂型。
所述药物组合物可以以本领域中已知的方式在药物相容的溶剂中配制成溶液，或在适合的制药溶剂或介质中配制成乳液、悬液或分散体。适合于肠胃外给药的制剂方便地包含活性成分的无菌油性或水性制剂，其优选地与接受者的血液等渗。每种这样的制剂也可以含有其他药物相容且无毒的辅助剂，例如稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、染料、乳化剂或调味物质。因此，本发明的制剂包含与可药用载体相结合的活性成分，以及任选的其他治疗性成分。所述载体在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上必须是“可接受的”。有利情况下，所述药物组合物通过适合的无菌溶液的注射或静脉内输注来应用。大多数这些化疗剂的安全有效的给药方法对于本领域技术人员来说是已知的。此外，它们的给药被描述在标准文献中。
被称为coDBait的偶联的DBait分子
在本发明中使用的DBait分子可以由下式描述：
其中N是核苷酸，n是至少1的整数，带下划线的N是指具有或不具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸，L’是连接物，C是促进胞吞的分子，L是连接物，m是0或1的整数，并且p是1。优选地，带下划线的N是指具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸。
在优选实施方式中，式(I)的分子具有一个或几个下述特征：
-N是脱氧核苷酸，其优选地选自A(腺嘌呤)、C(胞嘧啶)、T(胸腺嘧啶)和G(鸟嘌呤)，并被选择成避免出现CpG二核苷酸并且与人类基因组中的任何基因具有低于80％或70％、甚至低于60％或50％的序列同一性；和/或
-n是15至195、15至95、19至95、21至95、27至95、15至45、19至45、21至45或27至45的整数。在特别优选的实施方式中，n是27；和/或
-带下划线的N是指具有或不具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架、更优选为硫代磷酸酯骨架的核苷酸；优选地，带下划线的N是指具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸；和/或
-连接的L’选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)和1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；和/或
-m是1并且L是甲酰胺基聚乙二醇，更优选为甲酰胺基三乙二醇或甲酰胺基四乙二醇；和/或
-C选自胆固醇，单链脂肪酸或双链脂肪酸例如十八烷酸、油酸、二油酸或硬脂酸，或靶向细胞受体的配体(包括肽、蛋白质、适体)例如叶酸、生育酚，糖例如半乳糖和甘露糖以及它们的寡糖，肽例如RGD和铃蟾肽，以及蛋白质例如转铁蛋白和整合蛋白，优选为胆固醇或生育酚，更优选为胆固醇。
优选地，C-Lm是三乙二醇连接物(10-O-[1-丙基-3-N-氨甲酰基胆固醇基]-三乙二醇游离基。可选地，C-Lm是四乙二醇连接物(10-O-[1-丙基-3-N-氨甲酰基胆固醇基]-四乙二醇游离基。
在特定实施方式中，所述核酸分子可以是Dbait分子，例如在PEC专利申请WO2005/040378、WO2008/034866和WO2008/084087中深入描述的那些Dbait分子，所述专利申请的公开内容通过参考并入本文。
Dbait分子可以由它们的治疗活性所必需的多种特性来定义，例如它们的最小长度、至少一个游离末端的存在和双链部分、优选为DNA双链部分的存在。正如下文讨论的，重要的是指出Dbait分子的具体核苷酸序列不影响它们的活性。此外，Dbait分子可以含有修饰和/或非天然骨架。
优选地，Dbait分子是非人类来源的(即它们的核苷酸序列和/或构象(例如发夹)本身不存在于人类细胞中)，最优选为合成来源的。由于Dbait分子的序列发挥即使有也是很小的作用，因此Dbait分子优选地与已知基因、启动子、增强子、5’-或3’-上游序列、外显子、内含子等不具有显著程度的序列同源性或同一性。换句话说，Dbait分子与人类基因组中的任何基因具有低于80％或70％、甚至低于60％或50％的序列同一性。确定序列同一性的方法在本领域中是公知的，并包括例如Blast。Dbait分子在严紧条件下不与人类基因组DNA杂交。典型的严紧条件是允许区分完全互补的核酸与部分互补的核酸的条件。
此外，Dbait分子的序列优选地不含CpG，以便避免公知的toll样受体介导的免疫反应。
Dbait分子的长度可以是可变的，只要它足以允许包含Ku和DNA-PKcs蛋白的Ku蛋白复合体的适合的结合即可。已显示，Dbait分子的长度必须大于20bp，优选为约32bp，以确保结合到这种Ku复合体并允许DNA-PKcs活化。优选地，Dbait分子包含20-200bp，更优选地24-100bp，更优选地26-100bp，最优选地24-200、25-200、26-200、27-200、28-200、30-200、32-200、24-100、25-100、26-100、27-100、28-100、30-100、32-200或32-100bp。例如，Dbait分子包含24-160、26-150、28-140、28-200、30-120、32-200或32-100bp。“bp”意指所述分子包含所指明的长度的双链部分。
在特定实施方式中，具有至少32pb或约32bp的双链部分的Dbait分子包含与Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)相同的核苷酸序列。任选地，所述Dbait分子具有与Dbait32、Dbait32Ha、Dbait32Hb、Dbait32Hc或Dbait32Hd相同的核苷酸组成，但它们的核苷酸序列不同。因此，所述Dbait分子的双链部分的一条链包含3个A、6个C、12个G和11个T。优选地，所述Dbait分子的序列不含任何CpG二核苷酸。
可选地，所述双链部分包含Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的至少16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸。在更特定实施方式中，所述双链部分由Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸构成。
本文中所公开的核酸必须具有至少一个游离末端作为DSB的模拟物。
在特定实施方式中，它们只含有一个游离末端。优选地，Dbait分子由具有双链DNA茎和环的发夹核酸制成。所述环可以是核酸或专业技术人员已知的其他化学基团或其混合物。核苷酸连接物可以包含2至10个核苷酸，优选为3、4或5个核苷酸。非核苷酸连接物非穷举地包括脱碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、糖类、脂质、聚烃或其他聚合化合物(例如寡聚乙二醇，例如具有2至10个乙二醇单元，优选地4、5、6、7或8个乙二醇单元的寡聚乙二醇)。优选的连接物选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)和其他连接物例如1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。因此，在特定实施方式中，所述Dbait分子可以是具有双链部分或茎和环的发夹分子，所述双链部分或茎包含Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ IDNo 5)的至少16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸，并且环是六乙二醇连接物、四脱氧胸苷酸连接物(T4)或1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。在更特定实施方式中，那些Dbait分子可以具有由Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸构成的双链部分。
Dbait分子优选地包含2'-脱氧核苷酸骨架，并任选地包含一个或几个(2、3、4、5或6个)修饰的核苷酸和/或除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶之外的碱基。因此，所述Dbait分子本质上是DNA结构。具体来说，所述Dbait分子的双链部分或茎由脱氧核糖核苷酸制成。
优选的Dbait分子在一条或每条链的末端处包含一个或几个化学修饰的核苷酸或基团，以便特别是保护它们免于降解。在具体的优选实施方式中，所述Dbait分子的游离末端在一条或每条链的末端处被1、2或3个修饰的磷酸二酯骨架保护。优选的化学基团、特别是修饰的磷酸二酯骨架，包含硫代磷酸酯。或者，优选的Dbait具有3'-3'核苷酸连接键或具有甲基膦酸酯骨架的核苷酸。其他修饰的骨架在本领域中是公知的，并包括氨基磷酸酯、吗啉代核酸、2'-0,4'-C亚甲基/亚乙基桥接的锁核酸、肽核酸(PNA)和可变长度的短链烷基或环烷基糖间连接键或短链杂原子或杂环基糖内连接键，或专业技术人员已知的任何修饰的核苷酸。在第一个优选实施方式中，所述Dbait分子具有在一条或每条链的末端处被1、2或3个修饰的磷酸二酯骨架保护，更优选地至少在3'末端处、更优选地在5'和3'末端两者处被3个修饰的磷酸二酯骨架(特别是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯)保护的游离末端。
在最优选的实施方式中，所述Dbait分子是发夹核酸分子，其包含32bp的DNA双链部分或茎(例如具有选自SEQ ID No 1-5、特别是SEQ ID No 4的序列)以及连接所述DNA双链部分或茎的两条链的环，所述环包含选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)和1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷的连接物或由所述连接物构成，所述DNA双链部分或茎的游离末端(即在所述环的相反末端处)具有3个修饰的磷酸二酯骨架(特别是硫代磷酸酯核苷间连接键)。
所述核酸分子通过化学合成、半生物合成或生物合成、任何扩增方法来制造，然后进行任何提取和制备方法和任何化学修饰。提供连接物以便可以通过标准的核酸化学合成来掺入。
更优选地，核酸分子通过特殊设计的汇集合成(convergent synthesis)来制造：通过标准的核酸化学合成来制备两条互补链并掺入适合的连接物前体，在将它们纯化后，将它们共价偶联在一起。
所述促进胞吞的分子优选地通过连接物被偶联到Dbait分子。本领域中已知的任何连接物可用于将所述促进胞吞的分子共价附连到Dbait分子。例如，WO09/126933在第38-45页提供了方便的连接物的广泛综述。非穷举地，所述连接物可以是脂族链、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、糖类、脂质、聚烃或其他聚合化合物(例如寡聚乙二醇，例如具有2至10个乙二醇单元，优选地3、4、5、6、7或8个乙二醇单元、更优选地6个乙二醇单元的寡聚乙二醇)，并且掺入可以通过化学或酶方式打断的任何键，例如二硫键、受保护的二硫键、酸不稳定键(例如腙键)、酯键、原酸酯键、膦酰胺键、可生物切割的肽键、偶氮键或醛键。在WO2007/040469的第12-14页、WO2008/022309的第22-28页中详述了这些可切割的连接物。
在特定实施方式中，所述核酸分子可以连接到一个促进胞吞的分子。可选地，可以将几个促进胞吞的分子(例如2、3或4个)附连到1个核酸分子。
在特定实施方式中，所述促进胞吞的分子、特别是胆固醇与核酸分子之间的连接物是CO-NH-(CH2-CH2-O)n，其中n是1至10的整数，优选地n选自3、4、5和6。在非常特定的实施方式中，所述连接物是CO-NH-(CH2-CH2-O)4(甲酰胺基四乙二醇)或CO-NH-(CH2-CH2-O)3(甲酰胺基三乙二醇)。所述连接物可以在不改变所述核酸分子的活性的任何方便的位置处连接到核酸分子。具体来说，所述连接物可以连接在5’末端处。因此，在优选实施方式中，所设想的偶联的Dbait分子是具有发夹结构并在其5'末端处优选地通过连接物偶联到促进胞吞的分子的Dbait分子。
在另一个特定实施方式中，所述促进胞吞的分子、特别是胆固醇与核酸分子之间的连接物是二烷基-二硫化物{例如(CH2)r-S-S-(CH2)s，其中r和s是1至10、优选地3至8的整数，例如6}。
在最优选的实施方式中，所述偶联的Dbait分子是发夹核酸分子，其包含32bp的DNA双链部分或茎(例如具有选自SEQ ID No 1-5、特别是SEQ ID No 4的序列)以及连接所述DNA双链部分或茎的两条链的环，所述环包含选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)和1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷的连接物或由所述连接物构成，所述DNA双链部分或茎的游离末端(即在所述环的相反末端处)具有3个修饰的磷酸二酯骨架(特别是硫代磷酸酯核苷间连接键)，并且所述Dbait分子在其5'末端处，优选地通过连接物(例如甲酰胺基寡聚乙二醇，优选为甲酰胺基三乙二醇或甲酰胺基四乙二醇)偶联到胆固醇。
在优选实施方式中，NNNN-(N)n-N包含Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ IDNo 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的至少6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸，或由Dbait32(SEQ IDNo 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸构成。在特定实施方式中，NNNN-(N)n-N包含Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)，更优选为Dbait32Hc(SEQID No 4)，或由其构成。
因此，所述偶联的Dbait分子或发夹核酸分子可以选自：
其中NNNN-(N)n-N是SEQ ID No 1
其中NNNN-(N)n-N是SEQ ID No 2
其中NNNN-(N)n-N是SEQ ID No 3
其中NNNN-(N)n-N是SEQ ID No 4
其中NNNN-(N)n-N是SEQ ID No 5
其中对于L、L’、C、p和m来说，与式(I)的定义相同。
在优选实施方式中，式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)和(Ie)的分子具有一个或几个下述特征：
-带下划线的核苷酸是指具有或不具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架、更优选地硫代磷酸酯骨架的核苷酸；优选地，带下划线的核苷酸是指具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架、更优选地硫代磷酸酯骨架的核苷酸，和/或
-连接的L’选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)和1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；和/或
-m是1并且L是甲酰胺基聚乙二醇，更优选为甲酰胺基三乙二醇或甲酰胺基四乙二醇；和/或
-p是1；和/或
-C选自胆固醇，单链脂肪酸或双链脂肪酸例如十八烷酸、油酸、二油酸或硬脂酸，或靶向细胞受体的配体(包括肽、蛋白质、适体)例如叶酸、生育酚，糖例如半乳糖和甘露糖以及它们的寡糖，肽例如RGD和铃蟾肽，以及蛋白质例如转铁蛋白和整合蛋白，优选为胆固醇。
优选地，C-Lm是三乙二醇连接物(10-O-[1-丙基-3-N-氨甲酰基胆固醇基]-三乙二醇游离基)或四乙二醇连接物(10-O-[1-丙基-3-N-氨甲酰基胆固醇基]-四乙二醇游离基)。
在式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)和(Ie)的Dbait分子或发夹核酸分子的特定实施方式中，L’优选地选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)和1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。
在其中C是胆固醇的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)和(Ie)的Dbait分子或发夹核酸分子的特定实施方式中，C-Lm是游离基
在优选实施方式中，所述偶联的Dbait分子或发夹核酸分子选自(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)和(Ie)，其中C-Lm是游离基
并且其中L’优选地选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)和1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷，更优选为1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。
在非常特定的实施方式中，所述Dbait分子或发夹核酸分子具有下式
其中C-Lm是四乙二醇连接物(10-O-[1-丙基-3-N-氨甲酰基胆固醇基]-四乙二醇游离基)，并且L’是1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷，并且其中带下划线的核苷酸具有硫代磷酸酯骨架。
因此，所述分子具有下述结构，并且它在实施例部分中被称为“coDbait”或“DT01”。
这个分子的另一种表示如下所示：
可选的分子如下：
在另一个优选实施方式中，所述核酸分子具有下式之一
其中N是脱氧核苷酸，n是1至195的整数，带下划线的N是指具有或不具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸，L’是连接物，C是胆固醇，L是连接物，m是0或1的整数，并且p是1。优选地，带下划线的N是指具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸。
DNA损伤性治疗
除了所述偶联的Dbait分子之外，所述治疗也可以进一步包含抗肿瘤治疗，优选为通过DNA损伤剂或放疗进行的治疗。所述DNA损伤性治疗可以是放疗或使用DNA损伤性抗肿瘤剂的化疗或其组合。
DNA链断裂可以通过电离辐射(放疗)来实现。放疗包括但不限于γ-射线、X-射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。其他放疗包括微波和UV辐射。本发明中还设想了放射疗法的其他方法。
所述DNA损伤性抗肿瘤剂优选地选自拓扑异构酶I或II的抑制剂、DNA交联剂、DNA烷化剂、抗代谢剂和有丝分裂纺锤体的抑制剂。
拓扑异构酶I和/或II的抑制剂包括但不限于依托泊苷、拓扑替康、喜树碱、伊立替康、安吖啶、茚托利辛、蒽环霉素类例如多柔比星、表柔比星、道诺霉素、伊达比星和米托蒽醌。拓扑异构酶I和II的抑制剂包括但不限于茚托利辛。在优选实施方式中，所述DNA损伤性抗肿瘤剂是多柔比星。
DNA交联剂包括但不限于顺铂、卡铂和奥沙利铂。在优选实施方式中，所述DNA损伤性抗肿瘤剂选自卡铂和奥沙利铂。
抗代谢剂阻断负责核酸合成的酶或变得掺入到DNA中，这产生不正确的遗传密码并引起凋亡。其非穷举的实例包括但不限于叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，更具体来说是甲氨蝶呤、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷司他丁、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨和卡培他滨。
所述DNA损伤性抗肿瘤剂可以是烷化剂，包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲、金属盐和三氮烯。其非穷举的实例包括尿嘧啶氮芥、甲川氯、环磷酰胺(CYTOXAN(R))、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、曲他胺、三亚乙基硫代磷酸胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、福莫司汀、顺铂、卡铂、奥沙利铂、噻替哌、链脲佐菌素、达卡巴嗪和替莫唑胺。
有丝分裂纺锤体抑制剂包括但不限于紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、拉洛他赛(也被称为XRP9881；Sanofi-Aventis)、XRP6258(Sanofi-Aventis)、BMS-184476(Bristol-Meyer-Squibb)、BMS-188797(Bristol-Meyer-Squibb)、BMS-275183(Bristol-Meyer-Squibb)、奥他赛(也被称为IDN 5109、BAY 59-8862或SB-T-101131；Bristol-Meyer-Squibb)、RPR 109881A(Bristol-Meyer-Squibb)、RPR116258(Bristol-Meyer-Squibb)、NBT-287(TAPESTRY)、PG-紫杉醇(也被称为CT-2103、PPX、聚谷氨酸紫杉醇、多聚谷氨酸紫杉醇或XyotaxTM)、(也被称为Nab-Paclitaxel；ABRAXIS BIOSCIENCE)、Tesetaxel(也被称为DJ-927)、IDN 5390(INDENA)、Taxoprexin(也被称为二十二碳六稀酸-紫杉醇；PROTARGA)、DHA-紫杉醇(也被称为)和MAC-321(WYETH)。也参见Hennenfent&Govindan(2006,Annals of Oncology,17,735-749)的综述。
优选地，所述DNA损伤性抗肿瘤剂是拓扑异构酶I和/或II的抑制剂、DNA交联剂、抗代谢剂或其组合。在优选实施方式中，所述DNA损伤性抗肿瘤剂选自多柔比星、5-FU、卡铂和奥沙利铂或其组合。在最优选的实施方式中，所述偶联的DBait是DT01，并且所述DNA损伤性抗肿瘤剂选自多柔比星、卡铂、5-FU和奥沙利铂。
待治疗的癌症或肿瘤
本发明中描述的药物组合物和产品、试剂盒或组合制剂可用于在对象中治疗癌症。
术语“癌症”、“癌性”或“恶性”是指或描述了哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括例如白细胞、淋巴瘤、母细胞瘤、上皮癌和肉瘤。这些癌症的更具体的实例包括慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、费城染色体阳性急性成淋巴细胞性白血病(Ph+ALL)、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈部癌、胃癌、生殖细胞肿瘤、儿童肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞瘤、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病、肥大细胞增多症和与肥大细胞增多症相关的任何症状。
“白血病”是指形成血液的器官的进展性、恶性疾病，并且通常以血液和骨髓中白细胞和它们的前体的扭曲的增殖和发育为特征。白血病在临床上通常在下述基础上分类：(1)疾病的持续时间和特点——急性或慢性；(2)涉及的细胞的类型；髓性(髓系)，淋巴性(淋巴系)或单核细胞性；以及(3)血液中异常细胞的数目增加或不增加——白血性或非白血性(亚白血性)。白血病包括例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白细胞增多性白血病(leucocythemic leukemia)、嗜碱性白血病、胚细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜曙红细胞性白血病、格罗斯白血病、毛细胞白血病、成血细胞白血病、血胚细胞白血病(hemocytoblasticleukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、成淋巴白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞性白血病、巨核细胞性白血病、小成髓细胞性白血病、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、髓性粒细胞性白血病、髓性单核细胞性白血病、Naegeli白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、里德尔细胞白血病、希林白血病、干细胞白血病、亚白血性白血病和未分化细胞白血病。在某些情况下，本发明为慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病和/或费城染色体阳性急性成淋巴细胞性白血病(Ph+ALL)提供了治疗。
各种不同的癌症也被本发明的范围涵盖，包括但不限于下述癌症：上皮癌，包括膀胱(包括加速和转移性膀胱癌)、乳腺、结肠(包括结肠直肠癌)、肾、肝、肺(包括小细胞和非小细胞肺癌和肺腺癌)、卵巢、前列腺、睾丸、生殖泌尿道、淋巴系统、直肠、喉、胰腺(包括外分泌胰腺癌)、食道、胃、胆囊、子宫颈、甲状腺和皮肤(包括鳞状细胞癌)的上皮癌；淋巴谱系的造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；髓系谱系的造血系统肿瘤，包括急性和慢性髓系白血病、骨髓增生异常综合征、髓性白血病和早幼粒细胞性白血病；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质细胞瘤和神经鞘瘤；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌；黑素瘤，不可切除的III或IV期恶性黑素瘤，鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈部癌、成视网膜细胞瘤、胃癌、生殖细胞肿瘤、骨癌、骨肿瘤、成人骨骼恶性纤维组织细胞瘤；儿童骨骼恶性纤维组织细胞瘤、肉瘤、儿童肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞瘤、赘生物、浆细胞赘生物；脊髓增生异常综合征；成神经细胞瘤；睾丸生殖细胞肿瘤、眼内黑素瘤、脊髓增生异常综合征；脊髓增生异常/骨髓增生性疾病、滑膜肉瘤。此外，障碍包括着色性荨麻疹、肥大细胞增多症例如弥漫性皮肤肥大细胞增多症、人类中的孤立性肥大细胞瘤以及狗肥大细胞瘤和某些稀有亚型如大疱性、红皮性和毛细血管扩张性肥大细胞增多症、与血液障碍例如骨髓增生或脊髓增生异常综合征或急性白血病相关的肥大细胞增多症、与肥大细胞增多症相关的骨髓增殖性障碍、肥大细胞性白血病，以及其他癌症。其他癌症也包含在障碍的范围之内，包括但不限于下述：上皮癌，包括膀胱、尿路上皮癌、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、子宫颈、甲状腺、睾丸特别是睾丸精原细胞瘤和皮肤的上皮癌，包括鳞状细胞癌；胃肠基质肿瘤(“GIST”)；淋巴谱系的造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；髓系谱系的造血系统肿瘤，包括急性和慢性髓系白血病和早幼粒细胞性白血病；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤和胶质细胞瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质细胞瘤和神经鞘瘤；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌、畸胎癌、耐化疗非精原细胞性生殖细胞肿瘤和卡波斯肉瘤，以及它们的任何转移肿瘤。
在本发明的优选实施方式中，所述癌症是实体肿瘤。术语“实体肿瘤”特别是指乳腺癌、卵巢癌、结肠和总体GI(胃肠)道的癌症、宫颈癌、肺癌特别是小细胞肺癌和非小细胞细胞肺癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺的癌症或卡波斯肉瘤。
本发明中描述的药物组合物和产品、试剂盒或组合制剂可用于抑制实体肿瘤的生长，减小肿瘤体积，阻止肿瘤的转移扩散和微型转移肿瘤的生长或发展。本发明中描述的药物组合物和产品、试剂盒或组合制剂特别适用于预后不良的患者或耐放疗或耐化疗肿瘤的治疗。
在一个实施方式中，所述癌症可以选自黑素瘤、成胶质细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃肠癌、肝癌和头颈癌。
在优选实施方式中，所述癌症是耐放疗或耐化疗癌症。更具体来说，所述癌症选自耐放疗黑素瘤、三阴性乳腺癌(TNBC)、耐化疗肝细胞癌(HCC)、耐化疗肺癌、耐化疗卵巢癌和转移性肝癌。更具体来说，所述癌症选自多柔比星耐药肝癌(HCC)、铂耐药三阴性乳腺癌、铂耐药卵巢癌和结肠直肠的肝转移肿瘤。
在特定实施方式中，本发明涉及偶联的DBait分子的用途，其与奥沙利铂和5-FU组合用于结肠直肠癌的治疗。优选地，所述结肠直肠癌是转移性的，更优选地在肝脏和/或腹膜中具有转移。
在非常特定实施方式中，本发明涉及偶联的DBait分子的用途，其用于不位于腹腔中的耐放疗或耐化疗癌症的治疗。因此，这些癌症不涵盖结肠直肠癌(例如肝脏和腹膜的CRC转移肿瘤)。更具体来说，所述癌症选自TNBC和耐化疗卵巢癌。更具体来说，所述癌症选自铂耐药TNBC和铂耐药卵巢癌。
在另一个实施方式中，本发明涉及偶联的DBait分子的用途，其用于治疗三阴性乳腺癌。更具体来说，所述偶联的DBait分子与含铂抗癌药、特别是选自顺铂、奥沙利铂和卡铂的含铂抗癌药组合使用。在特定实施方式中，本发明涉及偶联的DBait分子的用途，其与卡铂相组合用于三阴性乳腺癌(TNBC)的治疗。任选地，所述治疗可以与放疗组合。
方案、剂量和给药途径
在本发明的组合制剂中使用的每种组合配偶体的有效剂量可以根据所使用的具体化合物或药物组合物、给药方式、待治疗的病症、待治疗的病症的严重性而变。因此，本发明的组合制剂的给药方案根据包括给药途径和患者状态在内的各种不同因素进行选择。具有普通技术的内科医生、临床医生或兽医可以容易地确定和开出阻止、对抗或停止所述病症的进展所需的单一活性成分的有效量。在获得在产生功效而没有毒性的范围之内的活性成分浓度方面的最佳精度，需要基于所述活性成分在靶位点的利用度的动力学的方案。
当DNA损伤性抗肿瘤剂与所述偶联的Dbait分子组合使用时，所述DNA损伤性抗肿瘤剂和偶联的Dbait分子可以通过相同途径或不同途径来给药。所述DNA损伤性抗肿瘤剂的给药途径可以是口服、肠胃外、静脉内、肿瘤内、皮下、颅内、动脉内、局部、直肠、透皮、真皮内、鼻、肌肉内、骨内等。
所述偶联的Dbait分子在辐射和/或所述DNA损伤性抗肿瘤剂给药之前和/或同时和/或之后给药，更优选地在辐射和/或所述DNA损伤性抗肿瘤剂给药之前和/或同时给药。所述辐射和/或所述DNA损伤性抗肿瘤剂的给药的进行使得当所述辐射被施加时或当所述DNA损伤性抗肿瘤剂到达肿瘤细胞时，所述偶联的Dbait分子存在于所述肿瘤细胞中。具有普通技术的内科医生、临床医生或兽医可以基于活性成分、它们在靶位点的利用度的动力学或它们在血浆中的药代动力学情况来确定所述方案。初步结果表明，偶联的Dbait分子在一天内保持活性。在第一个优选实施方式中，在使用偶联的Dbait分子的治疗开始时或在使用偶联的Dbait分子的治疗之后，施加所述辐射或给药所述DNA损伤性抗肿瘤剂。例如，在使用偶联的Dbait分子的治疗开始后3-24h，施加所述辐射或给药所述DNA损伤性抗肿瘤剂。所述DNA损伤性抗肿瘤剂和偶联的Dbait分子也可以同时给药。
一旦通过放疗或使用所述DNA损伤性抗肿瘤剂的治疗开始后，使用所述偶联的Dbait分子的治疗可以继续，只要通过放疗或使用所述DNA损伤性抗肿瘤剂的治疗被施加或给药即可。可选地，使用所述偶联的Dbait分子的治疗也可以结束。
对于偶联的Dbait分子来说，在本发明的组合制剂、试剂盒或产品中使用的DNA损伤性抗肿瘤剂的有效剂量可以随着给药方式、待治疗的病症、待治疗病症的严重性而变。因此，所述偶联的Dbait分子的给药方案根据包括给药途径和患者状态在内的各种不同因素来选择。具有普通技术的内科医生、临床医生或兽医可以容易地确定和开出阻止、对抗或停止所述癌症的进展所需的偶联的Dbait分子的有效量，特别是与所选的DNA损伤性治疗相组合。
本领域技术人员可以调整所述量以便获得所述偶联的Dbait分子在所述肿瘤中的有效量为至少0.01mg/1cm3肿瘤、优选地0.1-40mg/1cm3肿瘤、最优选地1-20mg/1cm3肿瘤，特别是在每日治疗方案或每周治疗方案中。例如，对于静脉内或腹膜内途径来说，所述偶联的Dbait分子的有效量或单位剂量可以是0.1至100mg，优选为4至40mg。因此，所述偶联的Dbait分子的有效量或单位剂量可以是0.06至0.6mg/kg患者。当然，所述剂量和方案可以由本领域技术人员考虑到化疗和/或放疗方案而调整。
对于放疗来说，可以使用本领域中已知的任何放疗方案，特别是立体定向辐射(例如15Gy)或分次辐射。分次辐射的使用可能是特别高效的，例如辐射可以每天或每2-5天、优选地每3-4天施加，为期1、2、3、4、5或6周。所述辐射可以是1至10Gy，优选为2至5Gy，特别是2、3、4或5Gy。例如，可以设想在6周内15x2Gy的分次辐射或在2周内4至6x5Gy的分次辐射。在优选实施方式中，所设想的放疗是在2周内4次辐射5Gy的方案。已测试了癌症与辐射和Dbait分子的组合治疗的不同方案或条件，并允许证实Dbait分子对肿瘤的放疗增敏依赖于Dbait分子的剂量但不依赖于辐射剂量。
对于化疗来说，在本发明的组合制剂、试剂盒或产品中或与本发明的组合物相组合使用的DNA损伤性抗肿瘤剂的有效剂量可以随着使用的具体DNA损伤性抗肿瘤剂、给药方式、待治疗的病症、待治疗病症的严重性而变。因此，所述DNA损伤性抗肿瘤剂的给药方案根据包括给药途径和患者状态在内的各种不同因素来选择。具有普通技术的内科医生、临床医生或兽医可以容易地确定和开出阻止、对抗或停止所述癌症的进展所需的DNA损伤性抗肿瘤剂的有效量。
所述治疗可以包括一个或几个循环，例如2至10个循环，特别是2、3、4或5个循环。所述循环可以是连续的或分隔的。例如，每个循环被1至8周、优选地3至4周的时间段分隔开。
本发明的其他方面和优点将在下面的实验部分中公开，所述实验部分应该被视为说明性的而不限制本申请的范围。在本说明书中引用了许多参考文献，每个这些引用的参考文献通过参考并入本文。
附图说明
图1：DT01在CRC(HT29)肝转移模型中显著提高对CT的敏感性
将带有肝内肿瘤的NMRINU/NU小鼠如材料和方法中所述进行治疗，并在治疗后22天处死。对肝脏取样用于肉眼和显微镜检查。(A)DT01和CT疗法的顺序。CT在DT01治疗后2或4小时给药。(B)每个治疗组中的平均肝肿瘤体积(mm3)。(C)每个组中的肝肿瘤的代表性肉眼和HES切片。(D)通过HES染色评估的肿瘤坏死组分。坏死被表示为所分析的组织切片的总肿瘤表面的比例(％)。(E-F)免疫组织化学。活肿瘤组分的增殖和平均微血管密度分别通过Ki67(D)和CD31(E)染色来确定。结果被表示为平均值±SEM。
图2：DT01与CT的联合显著减小腹膜肿瘤体积
将带有肝内肿瘤的NMRINU/NU小鼠如图4中所述进行治疗，并在治疗后22天处死。在治疗期间目测监测腹膜转移肿瘤的存在，并在处死时测量。(A)每个治疗组中的平均腹膜肿瘤体积(mm3)。(B)每个组中的腹膜肿瘤的代表性肉眼图像。结果被表示为平均值±SEM。
图3：在两个TNBC异种移植模型中全身性和局部给药的比较。将在脂肪垫中移植有TNBC细胞系的NMRINU/NU小鼠通过Dbait的SC或IP注射，进行为期连续5天的一个循环(左图)或各自被没有治疗的两周隔开的三个循环(右图)的治疗。每次Dbait注射的剂量在图例中注明。数据表示在治疗开始后不同时间的平均相对肿瘤体积(Vt/Vi)。
图4：DT01与卡铂的联合在TNBC模型中显著降低肿瘤生长。每个治疗组的肿瘤体积中位数(DT01治疗组和DT01+卡铂组中的误差条指示平均值的标准误差，SEM)。
图5：DT01与卡铂的联合在TNBC模型中显著提高存活率。在MDA-MB-231模型中动物存活率的Kaplan-Meier表示。
图6：图4和5中的治疗流程图。
实施例
实施例1：DT01作为用于结肠直肠的肝转移肿瘤的化疗增敏的新治疗策略
来自于结肠直肠癌(CRC)的转移性肝病是重要的临床难题。这主要归因于不可切除的转移肿瘤，其常常显示出对可用化疗的低敏感性，并部分地通过某些DNA修复功能的过度活化而发展出耐药性。组合疗法显示出一定的疾病控制，然而，对更高效的化疗以实现CRC的肝转移肿瘤的根除，仍存在需求。
本发明人调查了与常规化疗联合的Dbait的耐受性和功效。在体外，Dbait治疗提高HT29和HCT116CRC细胞系的敏感性。在体内，评估了与Dbait的胆固醇偶联的临床形式DT01的药代动力学、生物分布和功效。在用作CRC肝转移肿瘤的模型的肝内HT29异种移植小鼠中，与奥沙利铂和5-氟尿嘧啶相结合评估了DT01的化学增敏能力。DT01的高摄入表明肝脏是特异性靶。本发明人证实了与单独的化疗相比，DT01治疗与奥沙利铂和5-氟尿嘧啶的组合(平均值：501相比于872mm2，p＝0.02)在肝转移肿瘤模型中的显著抗肿瘤功效。肿瘤体积的减小进一步伴有坏死、增殖、血管发生和凋亡方面的显著组织学变化。DT01的重复循环不增加化疗毒性。可以证明，将DT01与常规化疗组合是转移性肝癌治疗中的安全有效的治疗策略。
本研究的目的首先是在体外证实DT01的功效，其次是评估DT01在肝脏中的药代动力学和分布，第三是证实全身性DT01给药与常规化疗(奥沙利铂和5′-氟尿嘧啶)的组合在CRC转移性肝肿瘤模型中的伴随影响。
结果
Dbait治疗提高结肠癌细胞系对化疗的敏感性
本发明人以前显示Dbait通过激活DNA-PK激酶起作用，所述激酶将包括组蛋白变体H2AX在内的大量靶磷酸化。他们首先通过监测H2AX的泛核磷酸化，确认了Dbait在两种CRC细胞系(HCT116和HT29)中的活性。
为了首先调查Dbait对化疗的细胞存活率的影响，本发明人在使用Dbait或奥沙利铂(OXA)和5-氟尿嘧啶(5-FU)或者Dbait与化疗(CT)的组合治疗后的不同时间点确定了活细胞数目(图1B)。正如在成纤维细胞中已经观察到的(Quanz,2009,PloS one,4,e6298)，单独的Dbait在两种细胞系中显得对细胞增殖没有影响。使用OXA和5-FU的治疗引起细胞增殖的降低。然而，在HCT116和HT29细胞系两者中，在化疗治疗之前用Dbait转染的细胞中，与单独的化疗相比，到第9天时增殖的水平显著降低(分别为p<0.001和p<0.02)。这些差异在更晚的时间点(>治疗后5天)变得特别明显，表明使用Dbait时功效的提高可能是缓慢的过程。
为了确认Dbait与OXA和5-FU相组合的化学增敏效果，对HCT116和HT29进行了产克隆存活测定。在单独的Dbait治疗后，HCT116细胞显示出大约30％(p<0.01)的致死率，揭示出它们的存活依赖于修复活性，而在HT29中没有注意到显著效果。由于在增殖的前8天中没有检测到HCT116对Dbait的敏感性，因此这个结果表明使用Dbait生长的细胞在晚些时候积累损害它们的存活的致死性病变。单独使用化疗(OXA/5-FU)的治疗导致HCT116存活率的显著降低(p<0.001)，而使用HT29细胞系仅仅观察到趋势(p＝0.08)。然而，Dbait与化疗的组合在两种细胞系中均引起存活率的显著降低(p＝0.05)。HCT116和HT29有许多参数不同，包括它们的P53状态(HCT116是胜任的，而HT29是突变的)。在这种情况下，尽管它们对单独的Dbait治疗的敏感性存在一些差异，但两种细胞系对CT与Dbait的组合具有同等的敏感性。
DT01的腹膜内与静脉内给药的药代动力学和生物分布分析的比较
为了避免转染佐剂毒性，所有体内研究都使用DT01这种促进这些分子的细胞摄入而不添加毒性的Dbait-胆固醇偶联物来进行。为了确定用于DT01的全身性给药的最佳途径，将小鼠用5mg DT01的单剂腹膜内(IP)或静脉内(IV)药剂治疗。IP给药产生578μg/ml的Cmax，1小时的Tmax和799的AUC0-6，而IV产生1,917μg/ml的Cmax，0.08小时的Tmax和799的AUC0-6。药代动力学分析揭示出在IP注射后，DT01的血浆暴露比IV推注的更长，其中AUC对应于使用IV给药时的AUC的大约70％。
本发明人使用荧光标记的cy5-DT01分子来监测在切除的全器官中的生物分布。cy5-DT01和DT01两者在药代动力学和DNA-PK激活方面具有相似性质。通过两种途径，在肝脏、肠和肾脏中观察到最大DT01荧光，其中最高的强度在IP给药后在肝脏和肠中观察到。在小鼠中观察到的由肾脏和尿液发出的高荧光表明，DT01优先通过肾脏消除。尽管在注射后6小时在血液中没有可测量到的DT01，但在肝脏中仍可检测到显著量的DT01，指示了在该器官中的特异性滞留。
正如在体外已经证实的，DT01对组织中DNA-PK的激活可以由组蛋白H2AX的磷酸化来揭示。本发明人通过分析在带有HT29移植肿瘤的肝脏中H2AX磷酸化的分布来监测DT01活性。有趣的是，高水平的γ-H2AX在肿瘤中被特异性观察到，但在周围的健康组织中没有观察到，指示了DT01分子在肝脏的肿瘤细胞中的优先摄入或活性。
DT01在体内显著提高对OXA和5-FU的敏感性
为了探索DT01与转移性CRC的一线治疗相联合的利益，本发明人使用了HT29异种移植的肝肿瘤模型，因为以前的报道和体外数据证实了这种细胞系主要由于V600E BRAF突变而是高度耐化疗的。使用基于生物分布数据的两种不同时间表，使用OXA和5-FU治疗所述动物，这种治疗接近于用于患者的传统FOLFOX方案(图1A)。所述两种时间表由两次治疗之间的2或4小时的时间间隔构成，因为肝脏中的最高DT01水平在治疗后1和3小时被观察到。
正如以前在体外观察到的，所述肿瘤对单独的CT具有高度抗性，并且DT01在单独给药时仅具有中等效果(图1B、1C)。有趣的是，与单独的CT相比，在两个组合治疗组中，当在CT之前2小时(平均体积：525.80相比于872.01mm2，p＝0.03)和4小时(平均体积：501.05相比于872.01mm2，p＝0.02)给药时，DT01与OXA和5-FU的联合显著减小了肝脏肿瘤尺寸(图1B、1C)。当DT01与单一化疗剂OXA或5-FU联合时，没有观察到这种效果。在苏木精-曙红-藏红花(HES)染色的切片中，由有经验的病理学家评估了详细的盲式组织学分析，包括活肿瘤区域、坏死和凋亡的测量。使用DT01和CT组合治疗的两个组与接受单一治疗的组相比显示出更高的治疗功效，其中与单独的CT相比，在CT与DT01之间间隔4小时治疗的组中(p<0.0001)比在2小时组中(p<0.01)坏死明显增加(图1D)。此外，在用DT01和CT治疗的两个组中高的凋亡指数是明显的。与其他组织学参数相似，在用4小时延迟治疗的动物中凋亡程度升高(p<0.0001)。这些组织学发现在单独的DT01或化疗治疗组中不明显。
对于许多实体肿瘤来说，增殖和微血管化是肿瘤发育和转移的必不可少的先决条件。为了进一步调查这些参数，在活肿瘤组分中进行了Ki67和CD31的免疫染色(图1E、1F)，所述Ki67和CD31分别是细胞增殖和血管发生的标志物。Ki67免疫反应性表明单独用DT01或化疗治疗的肿瘤致密堆积，具有高度增殖。在DT01与CT之间有2小时时间间隔的治疗导致增殖细胞的适度减少(p＝0.02)(图1E)。引人注目的是，在DT01与CT之间间隔4小时治疗的组中Ki67的免疫反应性降低10倍(p<0.001)(图1E)。在这个组中，仅在肿瘤边缘中检测到免疫反应性，这是因为在肿瘤的中央核心区中观察到高度坏死。此外，在用DT01和CT的组合治疗的组中，与单独的CT相比，检测到肿瘤内血管密度降低(图1F)。然而，在用4小时间隔治疗的组中(p<0.001)、与2小时(p＝0.02)相比，平均微血管密度甚至更显著地降低。尽管在2小时和4小时两种治疗时间表处，对肿瘤生长的抗肿瘤效果相似，但在组织学上，就坏死、凋亡、增殖和血管发生而言，在4小时时间点处功效明显更加显著。
出人意料的是，用DT01与CT之间延迟4小时治疗并在治疗后22天取样的肿瘤表现出在肿瘤内存在一定比例的裂解肝细胞和相邻非恶性肝脏中的轻微水肿，不存在毒性的其他临床征兆例如体重减轻。组织学分析在其他组中没有揭示出毒性的形态学征兆(图1)。此外，肝酶测试没有揭示出对照与组合治疗组之间的显著差异。
有趣的是，当接受相同治疗的动物在30-65天之间处死时，没有观察到进一步水肿。这表明在第22天观察到的水肿随时间可逆。尽管在治疗后22天观察到显著的肿瘤功效，但在这个时间点后监测的肿瘤重新开始进展。组织学分析揭示出在治疗后30-45天时，增殖性组分达到～50％，仅仅略微低于在未治疗肿瘤中观察到的水平。
为了确认组合治疗不诱导对肝脏的另外毒性，本发明人分析了对长的治疗循环来说与OXA或5-FU相联合的DT01的耐受性。他们在50只小鼠的组群中，确定了逐渐升高剂量的DT01(总剂量为30、50或80mg)在与OXA或5-FU联合进行两个循环的全身性给药(每个治疗循环5xDT01给药)后的毒性。在治疗期间或之后，没有在动物中观察到体重减轻。类似地，在这些小鼠中没有注意到毒性的其他临床征兆例如腹泻或行为变化。在第二个治疗循环后6周尸检时，所有腹部器官、胸腔和内含物显得正常。在介质和组合治疗组之间没有观察到肝脏重量或组织学的重大变动。
这些结果表明，在带有肝肿瘤的动物中，在组合治疗后检测到的可逆水肿可能是对肿瘤对高效组合治疗的响应的急性反应。
腹膜转移肿瘤的治疗
CRC通常转移到肝脏和腹膜。有趣的是，90％的肝内异种移植有CRC肿瘤的小鼠发生腹膜转移肿瘤。这种性质允许本发明人不仅监测DT01对肝肿瘤的影响，而且监测其对腹膜转移肿瘤的影响。当与单独的化疗相比时，接受DT01和化疗的组合的动物在2小时(平均体积：分别为300.31相比于867.20mm2，p<0.01)和4小时时间间隔(平均体积：分别为259.51相比于867.20mm2，p<0.01)两者时表现出显著减小的腹膜肿瘤体积(图2A、2B)。尽管在DT01单独治疗的组中观察到肿瘤体积的略微减小，但这没有达到统计学显著。
讨论
大约50％的患有CRC的患者在他们疾病的整个过程中表现出肝脏和/或腹膜转移肿瘤或发生所述转移肿瘤。大多数具有CRC肝转移肿瘤的患者表现出不可切除的疾病，并且全身性化疗代表了如果不是唯一也是主要的疗法形式。然而，由于肿瘤耐药性和对非靶组织的高毒性，化疗的治疗窗口受限。在这些临床形势下，单独的攻击性化疗方案可能不仅不能提高存活率，而且可能不利地影响生活质量。结果，这些患者的死亡率仍然高。因此，特异性靶向DNA修复以克服化疗耐药性并留下健康组织的新药剂的开发在这些癌症的治疗中是势在必行的。基于DT01在DNA修复中的中心作用，DT01是有吸引力的药物候选物。
在本研究中，本发明人通过体外和体内测定法第一次显示了全身性DT01治疗使CRC细胞对常规化疗敏感。在CRC转移模型中，他们证实了与OXA和5-FU相组合使用DT01治疗，在肝脏和腹膜中获得了显著的抗肿瘤功效(被视为终端条件)。有趣的是注意到，显著的抗肿瘤效果限于DT01与OXA和5-FU两者的联合而不是与单一药剂化疗的联合。这证实了与临床常规背景相一致，在CRC转移肿瘤的治疗中，与DT01的组合必须联合双重化疗而不是单一药剂化疗。本研究进一步强调了接受与DT01组合的双重化疗的肿瘤在较晚时间点(22天后)重新开始增殖并重新生长。因此，与当前的常规化疗方案相似，为了实现长期疾病控制，重复的治疗循环是必需的。这是可行的，因为使用单独的或与OXA或5-FU组合的DT01时，没有观察到附加的毒性。
DT01在全身性注射后优先积累在肝脏和肠中。尽管在Cy5-DT01注射后整个肝脏显得均匀发射荧光，但由H2AX的磷酸化所揭示的DNA-PK的活化，只在肿瘤细胞中而不在围绕肿瘤的健康组织中观察到。这项观察表明DT01不进入非肿瘤细胞，和/或DT01在健康肝组织中无活性。DT01通过胆固醇偶联进行特别设计，以便首先提高生物利用度，其次利用癌细胞与正常细胞之间底物摄入的差异。低密度脂蛋白(LDL)是胆固醇途径的主要组分。在许多类型的癌细胞中已显示出恶性细胞对LDL的高度需求以及因此随之发生的LDL受体的过表达，这使得肿瘤细胞成为DT01的特异性靶。此外，通过免疫组织化学进行的正常和癌性人类组织的深入分析揭示，DNA-PKcs或Ku80在肝脏和乳腺上皮中始终不存在，这是在其他组织和大多数肿瘤中没有发现的特异性转录后调控。合在一起，这些数据强调了DT01可能是用于肝癌治疗的高效药物。
总的来说，对于靶向继发性肝恶性肿瘤这种具有不良预后和使人惊恐的死亡率的快速进展性疾病的新的治疗选项，存在着迫切需求。本研究证实了将DT01的全身性给药与常规化疗相组合，在肝脏和腹膜的CRC转移肿瘤的治疗中可能是安全有效的治疗策略。
材料和方法
细胞培养物、构建物、Dbait分子、免疫荧光和western印迹
CRC细胞系：HT29(突变的p53，ATCC：HTB-38)和HCT116(野生型p53，ATCC：CCL-247)直接购自ATCC。这些细胞由ATCC通过使用Promega Systems同时扩增多个STR基因座和釉原蛋白(用于性别确定)以产生人类短串联重复序列分布图，得到验证。在进行本研究时，从购买之日起，将这些细胞在实验室中，在增补有10％胎牛血清、1％丙酮酸钠、100mg/ml链霉素和100mg/ml青霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)的DMEM培养基中培养少于6个月。使用pGL4.5萤光素酶受体载体(luc2/CMV/Hygro)(Promega)在实验室内部建立稳定表达萤光素酶的HT29细胞系。HT29萤光素酶细胞增补有200μg/ml潮霉素B。所有细胞系另外进行实验室内部的支原体测试，并且不含支原体污染(Biovalley,France)。
将细胞用2.5μg Dbait(5’-GCTGTGCCCACAACCCAGCAAACA AGCCTAGA-(H)TCTAGGCTTGTTTGCTGGGTTGTGGGCACAGC-3’SEQ ID No 9)(Eurogentec,Belgium)转染，其中H是六乙二醇连接物，并且带下划线的核苷酸是硫代磷酸酯。将所述细胞如以前所述用与11kDa聚乙烯亚胺(PEI)复合的8bp寡核苷酸对照(8H)假转染(Quantz等，2009,PloS one,4,e6298)。
如前所述使用单克隆抗磷酸组蛋白H2A.X(Ser139)抗体克隆JBW301(1:500稀释；05-636，Millipore,USA)，进行γH2AX免疫荧光(9)。
体外增殖测定法
将细胞以3×104个细胞/60mm培养皿的密度接种并用Dbait转染。在处理后，将细胞洗涤并留置不处理或用5μM奥沙利铂(OXA,Sigma)与2.5μM 5-氟尿嘧啶(5-FU,Sigma)的组合处理，并在第1、3、5、7和9天进行活细胞计数。
产克隆测定法
将细胞用Dbait转染，并留置不处理或用5μM OXA和2.5μM 5-FU处理1hr。将细胞稀释，允许其生长14天，用结晶紫对克隆进行染色并计数。
体内实验
本研究严格按照欧盟动物护理指南(European Union guidelines for animalcare)进行。所有动物实验得到法国居里学院和法国政府部门的伦理委员会批准。手术程序在使用局部镇痛的麻醉下进行，以将痛苦最小化。
动物
将体重为20-22g的6周龄雌性NMRINU/NU小鼠(Janvier,France)在12h光和12h暗的日程安排下饲养在无特定病原体环境中，食物和水随意取用。每笼饲养不超过6只动物，并且在开始体内研究之前使它们适应新环境至少一周。
肝内HT29L移植
HT29萤光素酶(HT29L)细胞通过将细胞悬液(1x106/10μL PBS)直接注射在左叶的上表面上来移植。通过生物发光分析(IVIS，Caliper sciences)来监测肿瘤生长。
DT01分子
对于体内研究来说，使用DT01(在5'-末端处掺入有胆固醇四乙二醇的Dbait)(Agilent technologies，Boulder,CO)。
DT01的药代动力学
将HT29L移植的小鼠用5mg DT01的单次腹膜内(IP，n＝4)或静脉内(IV，n＝3)注射进行处理。在处理之前和处理后1、5、10、30min、1hr、2hr、4hr和6hr收获血液样品。通过离心回收血浆并通过ELISA进行测定。
器官的荧光测量
由于ELISA技术不能在组织中产生可靠的定量，因此我们使用荧光成像这项用于评估分子分布的可靠技术(15)。将NMRINU/NU小鼠通过IP(n＝3)或IV(n＝3)给药用1mg DT01荧光分子(DT01-Cy5)注射。所述荧光DT01(DT01-Cy5)在紧接连接物之后位置的胸腺嘧啶处掺入花青素5。在注射后6小时，使用Typhoon扫描仪(GE Helathcare)进行荧光成像。
DT01和化疗治疗
将HT29L移植的动物(n＝49)分派在治疗组中并提供一个治疗循环。从第0天(D0)开始连续5天，将DT01以5mg/天的剂量通过IP注射全身性给药。OXA(6mg/kg，每个循环1x，第1天)和5-FU(25mg/kg，每个循环3x，第1-3天)在DT01治疗后2或4小时给药。这些小鼠在治疗后22天处死。
另一个用间隔4小时的DT01和OXA/5-FU治疗的组(n＝10)在治疗后保持到满足终止准则，以评估治疗功效的持续时间。
肝功能评估
在治疗后第0、4和18天，通过下颌下取血在肝素锂管(Sarstedt)中获得血液样品。使用MS-Scan II(Melet Schloesing Laboratories,France)测量血浆丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(ASAT)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转肽酶(GGT)、淀粉酶(AMYL)和总胆红素(TBIL)。
毒性测定法
将NMRINU/NU小鼠(n＝50)用3mg/天(总共30mg)、5mg/天(总共50mg)或8mg/天(总共80mg)的剂量逐渐提高的DT01通过IP注射的两个循环并与OXA或5′-FU组合进行治疗。OXA和5′-FU在DT01治疗后4小时，分别以1x6mg/kg或3x25mg/kg的剂量通过全身性IP注射进行给药。定期观察动物的任何不利效应。
组织学
苏木精、曙红和藏红花(HES)染色的肿瘤切片由有经验的病理学家(Dr.Huerre,Institut Curie)以不知情的方式进行评估。活的和坏死的组分(由细胞尺寸增加、细胞边界不清、嗜曙红细胞性细胞质、核的丧失或聚缩或相关的炎症指示)被表示为总肿瘤面积的比例(％)。凋亡在高倍率下从代表性非坏死视野来估算(微弱-<5％，中度5-10％，显著10-20％，非常显著20-50％)。
使用全载片扫描系统(Philips digital pathology solutions)来进行数字化和图像捕获。
Ki67和CD31免疫组织化学
使用兔抗Ki67(ab28364，1/500，Abcam,UK)和兔抗CD31(ab15580，1/500；Abcam,UK)抗体来进行免疫组织化学。随后使用生物素化的山羊抗兔IgG第二抗体(BA-1000；Vector,USA)，并使用兔特异性HRP/DAB(ABC)检测试剂盒来揭示。使用荧光显微镜(Eclipse90i，Nikon)捕获图像。平均Ki67指数通过在每个切片5个随机选择的显微镜视野中确定Ki67+ve与-ve细胞之间的比率来评分。平均微血管密度通过CD31染色来确定。在每个切片5个随机选择的显微镜视野中计数CD31阳性血管。
统计分析
体外实验使用最少两个独立实验来进行。将双侧未配对t-检验用于细胞死亡率和存活率的比较。使用Kruskal-Wallis检验来比较肿瘤体积和组织学数据。除非具体指明，否则误差条指示平均值的标准误差(SEM)。所有统计分析使用StatEL软件(adScience,France)进行，并且≤0.05的P值被认为是统计学显著的。
实施例2：三阴性乳腺癌(TNBC)模型中的DT01及其在与卡铂的共同治疗中的增强效果
单独的DT01对TNBC模型的效果
本研究的目的是证实单独的DT01在乳腺癌、特别是三阴性乳腺癌模型中的全身性效果。所述动物模型是移植45天后的小鼠。将小鼠在乳腺脂肪垫中用MDA-MB-231肿瘤细胞进行皮下移植。
在以前的实验中，本发明人证实了在所有测试的三阴性乳腺癌模型(移植有BC227、BC173、MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞系的小鼠)中，DT01通过局部给药可以有效控制肿瘤生长。
如图3中所示，本发明人在两种TNBC异种移植模型中将腹膜内给药与局部给药(肿瘤内和肿瘤周皮下)进行了比较。他们令人吃惊地观察到，与局部给药相比，相近的功效需要多3-5倍的DT01。
所述给药途径是腹膜内给药，其在小鼠中模拟人类中的静脉内灌注给药。DT01的剂量水平为5mg/动物/天。所述DT01腹膜内给药进行3个连续5天的疗程，在每个循环之间间隔一周不治疗。包含了13只小鼠，其中7只接受DT01。对照组只接受介质0.9％NaCl。
没有观察到毒性。腹膜内DT01给药耐受良好。
与对照组相比，DT01治疗显示出显著更好的肿瘤生长控制和动物存活率。
选择所述MDA-MB-231三阴性乳腺癌模型是因为它在以前使用肿瘤内和肿瘤周皮下给药的实验中对DT01治疗抗性最高。
这个实验证实，DT01的独立给药延迟乳腺癌肿瘤中的肿瘤生长。
DT01与卡铂的组合对TNBC模型的效果
如图6中所示，每个治疗循环包含连续5天以5mg/动物/天的剂量水平给药DT01。单独地或与卡铂联合提供3个循环的治疗，在循环之间存在2周间隙。每个DT01治疗循环只注射一剂卡铂(每个循环的第2天)。卡铂的剂量为每个循环50mg/kg。治疗进行共7周(3个治疗循环)。
在所述实验期间没有观察到毒性。在DT01治疗组中没有毒性的征兆例如体重减轻。在DT01+卡铂治疗组中没有观察到与卡铂组相比体重减轻或毒性的增加。
除了在单独的卡铂治疗组中的1例死亡之外，在实验的177天期间没有发生异常死亡。
腹膜内DT01给药是耐受良好的。
抗肿瘤活性通过在治疗期间和之后测量肿瘤体积来评估。DT01在3个治疗5天的疗程期间腹膜内给药，在每个疗程之间休息2周。卡铂每周一次，在每个DT01治疗循环的第二天给药。
与单独的DT01治疗相比，DT01+卡铂组合治疗显示出更好的肿瘤生长控制(图4)。在每个组中，曲线在第一例死亡的当天中断。此外，DT01+卡铂组合也提高存活率。
在这项研究中，DT01与卡铂相组合的治疗是高效的，并且与单一治疗相比产生更好的肿瘤生长延迟。
材料和方法
DT01分子
Dbait的并入有胆固醇四乙二醇的形式DT01，通过自动固相寡核苷酸合成(Agilent technologies,USA)来合成。
细胞和动物
MDA-MB231细胞系源自于人类乳腺腺癌，并且可以在ATCC订购。使用重悬浮在0.1ml无添加剂的DMEM中的10.106个细胞，将MDA-MB231细胞移植在乳腺脂肪垫中。所述无胸腺裸小鼠是免疫缺陷的，因此能够进行人类肿瘤的异种移植和生长。
序列表
<110> 欧恩科斯欧公司等
<120> 通过DBait分子的全身性给药治疗癌症
<130> B2196PC
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Dbait32
<400> 1
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct 32
<210> 2
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<220>
<223> Dbait32Ha
<400> 2
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<220>
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<400> 3
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<220>
<223> Dbait32Hc
<400> 4
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<210> 5
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<220>
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<211> 32
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<220>
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<220>
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<220>
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<222> (1)..(1)
<223> 在5'末端，Lm =甲酰胺基寡聚乙二醇+ C =单链脂肪酸或双链脂肪酸、胆固醇、糖、肽或蛋白质
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<223> 环L' =六乙二醇、四脱氧胸苷酸或1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷
<400> 10
gctaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子DT01
<220>
<221> misc_feature
<223> 注意="在互补链的3'末端，最后三个核苷酸具有硫代磷酸酯骨架"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 在5'末端，10-O-[1-丙基-3-N-氨甲酰基胆固醇基]-四乙二醇游离基
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> mod_base= 硫代磷酸酯骨架
<220>
<221> stem_loop
<222> (1)..(32)
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> 环L' = 2,19-双(磷酰)-8-肼-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷
<400> 11
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga 32

Claims (13)

1.一种用于治疗耐放疗或耐化疗癌症的核酸分子，其中所述核酸分子具有下式之一：
其中N是脱氧核苷酸，n是15至195的整数，带下划线的N是指具有或不具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸，L’是连接物，C是促进胞吞的分子，所述促进胞吞的分子选自亲脂性分子或靶向细胞受体使实现受体介导的胞吞的配体，L是连接物，m是0或1的整数，并且p是1；
其中所述核酸在不与任何喹啉内涵体裂解剂组合给药的情况下使用；
其中所述核酸通过选自腹膜内和静脉内途径的肠胃外全身性途径来给药。
2.权利要求1的供使用的核酸分子，其中式(I)的核酸具有一个或几个下述特征：
-N是脱氧核苷酸，其选自A(腺嘌呤)、C(胞嘧啶)、T(胸腺嘧啶)和G(鸟嘌呤)，并被选择成避免出现CpG二核苷酸并且与人类基因组中的任何基因具有低于80％的序列同一性；和/或
-连接的L’选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)和1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；和/或
-m是1并且L是甲酰胺基聚乙二醇，更优选为甲酰胺基三乙二醇或甲酰胺基四乙二醇；和/或
-C选自胆固醇，单链脂肪酸或双链脂肪酸例如十八烷酸、油酸、二油酸或硬脂酸，或靶向细胞受体的配体(包括肽、蛋白质、适体)例如叶酸、生育酚，糖例如半乳糖和甘露糖以及它们的寡糖，肽例如RGD和铃蟾肽，以及蛋白质例如转铁蛋白和整合蛋白，优选为胆固醇或生育酚，更优选为胆固醇。
3.权利要求1或2的供使用的核酸分子，其中所述核酸分子具有下式之一：
SEQ ID NO：6；
SEQ ID NO：7；
SEQ ID NO：8；
SEQ ID NO：9；以及
SEQ ID NO：10
其中带下划线的核苷酸是指具有或不具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架的核苷酸，连接的L’选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)和1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；m是1并且L是甲酰胺基寡聚乙二醇，C选自二油酸、十八烷酸、叶酸、生育酚和胆固醇。
4.权利要求1至3任一项的供使用的核酸，其中所述核酸是
SEQ ID NO：9；并且
其中带下划线的核苷酸是指具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸，连接的L’是1,19-双(磷酰)-8-肼-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷，m是1，L是甲酰胺基四乙二醇，并且C是胆固醇。
5.权利要求1至4任一项的供使用的核酸，其中所述核酸通过静脉内途径来给药。
6.权利要求1至5任一项的供使用的核酸，其中所述核酸通过注射、静脉内滴注、推注或泵来给药。
7.权利要求1至6任一项的供使用的核酸，其中所述癌症是耐放疗或耐化疗的不位于腹腔中的癌症。
8.权利要求1至7任一项的供使用的核酸，其中所述耐放疗或耐化疗的不位于腹腔中的癌症选自三阴性乳腺癌(TNBC)、耐化疗肺癌和耐化疗卵巢癌。
9.权利要求8的供使用的核酸，其中所述癌症选自铂耐药卵巢癌和铂耐药三阴性乳腺癌。
10.权利要求1至9任一项的供使用的核酸，其中所述核酸与放疗和/或化疗相组合使用。
11.权利要求1至10任一项的供使用的核酸，其中所述核酸与DNA损伤剂相组合使用。
12.权利要求11的供使用的核酸，其中所述DNA损伤剂选自拓扑异构酶I或II的抑制剂、DNA交联剂、DNA烷化剂、抗代谢剂和有丝分裂纺锤体的抑制剂。
13.权利要求1至12任一项的供使用的核酸，其中所述核酸与选自多柔比星、奥沙利铂、卡铂、顺铂和5-FU的化疗相组合使用。
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