JP2019507763A - Ｄｂａｉｔ分子の全身投与によるガンの処置 - Google Patents

Abstract

本発明は、エンドソーム分解剤と何ら組み合わせることのない、全身経路によるＤＢａｉｔ分子の使用に関する。

Description

本発明は、腫瘍学の分野に関する。

乳ガンは、最も一般的な女性の悪性腫瘍であり、毎年世界中で１７０万人超の新たな症例が診断されている（Torre, Siegel, Ward, & Jemal, 2015）。分子分類から、乳ガンは、３つの主なサブグループ：ＬｕｍｉｎａｌＡ／Ｂ、ＨＥＲ２^＋及び基底細胞様／トリプルネガティブ乳ガン（ＴＮＢＣ）に分けられる（Vuong, Simpson, Green, Cummings, & Lakhani, 2014）。トリプルネガティブ乳ガン（ＴＮＢＣ）は、処置の選択肢が限られており、標準的な化学療法計画後の進行により非常に乏しい予後となる、侵襲性の組織学的亜型である。現在の標準的な治療、例えば、アントラサイクリン又はタキサンに対する抵抗性により、転移性ＴＮＢＣを有する先に処置された患者に利用できる選択肢は、少数の非交差抵抗性計画に限られ、現在、好ましい標準的な化学療法は存在していない。プラチナ系計画は、ＢＲＣＡ１変異を有するＴＮＢＣ患者についての新たな選択肢である。

化学療法抵抗性は、ガン処置の有効性に対する主な障害を引き起こす。ＤＮＡ修復が、化学療法剤により染色体上に引き起こされる傷害を除去することによる化学療法抵抗性において重要な役割を果たし、ＤＮＡ修復経路の阻害剤は、これらの処置に対する腫瘍感受性を回復させるための新たな機会を提供する可能性がある。

Ｄｂａｉｔ分子は、ガン細胞において誤ったＤＮＡ傷害シグナル伝達をトリガーする新たな分類のＤＮＡ修復阻害剤である。これらの分子は、遊離した二本鎖平滑末端を有する短い二本鎖ＤＮＡであり、重要な傷害シグナルトランスデューサー、例えば、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）及びポリ−ＡＤＰ−リボ−ポリメラーゼをターゲットにし、その活性化をトリガーし、誤った傷害シグナル伝達を増幅させる。その結果として、下流のＤＮＡ修復酵素のリクルートメントが損なわれ、複数のＤＮＡ修復経路、例えば、相同性組換え、非相同性末端結合、塩基除去修復及び一本鎖切断修復を阻害し、細胞死を引き起こす未修復障害の蓄積をもたらす。

Ｄｂａｉｔ分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方において、複数の放射線抵抗性腫瘍における放射線療法との組み合わせにおいて有効であることが示されてきた。細胞取込み効率を向上させるために、Ｄｂａｉｔ分子は、コレステロール部分を５’−端に共有結合させることにより改変された（ＤＴ０１）（ＷＯ第２０１１／１６１０７５号；Berthault et al, 2011, Cancer gene therapy, 18, 695-706）。放射線療法と関連付けられた腫瘍内投与によるＤＴ０１の局所投与により、異種移植されたヒトメラノーマモデルの生存が向上することが証明されている（Biau et al, 2014, Neoplasia, 16, 835-844）。しかしながら、今日、単独又は化学療法との組み合わせでのＤＴ０１の全身投与の有効性は調査されていない。

しかしながら、補助療法としてのＤＴ０１により、ウサギのＶＸ２肝臓腫瘍モデルにおいて、経動脈的化学塞栓療法（ＴＡＣＥ）の治療有効性が向上されることが示されている（Devun et al, Journal of Vascular and Interventional Radiology, 2013, 24, 1080）が、ＴＡＣＥにおけるその有益な効果は、２つの主なメカニズムによりもたらされる。第一に、肝臓内のほとんどの腫瘍は、適切な肝動脈により供給されるため、動脈塞栓療法は、優先的に、腫瘍への血液供給を中断させ、血管新生まで成長を停止させる。第二にかつ最も重要に、化学療法の集中投与により、組織へのより高用量の送達が可能となる一方で、同時に全身暴露を減少させることができる。同減少は、典型的には、用量制限要因である。

更に、ＤＴ０１分子は、エンドソーム分解剤、例えば、クロロキンとの組み合わせで使用されるのに設計された。クロロキンは、エンドソームから細胞質へのｃｏＤｂａｉｔの放出を促進し、必須であると記載されている。このため、ｃｏＤｂａｉｔがクロロキンの存在下で皮下及び腫瘍内注射により投与されたこと、及び、ｃｏＤｂａｉｔ取込み及び有効性を向上させ、ｃｏＤｂａｉｔによる異種移植された腫瘍の放射線感受性を向上させるために、同時クロロキン処置がプロトコールに加えられたことが示された（Schlegel et al, 2012, Molecular Therapy-Nucleic Acids, 1, e33）。

一部のガン、特に、放射線抵抗性又は化学療法抵抗性ガン、例えば、トリプルネガティブ乳ガン（ＴＮＢＣ）は、処置するのが困難なままであり、それらの処置における何らかの改善が重要であることが、更に注目されるべきである。

驚くべきことに、本発明者らは、Ｄｂａｉｔ分子、特に、コレステロールにコンジュゲートさせたｃｏＤＢａｉｔと呼ばれる分子を、全身投与、特に、腹腔内及び静脈内投与により、キノリンエンドソーム分解剤、特に、クロロキンを何ら使用することなく、ガン、抵抗性ガンをも処置するのに効率的に使用することができることを観察した。実際に、これらの投与経路によるのと同じ有効性は、２〜５倍高い用量でのみ得ることができ、コンジュゲートＤＢａｉｔは、毒性を有さない。コンジュゲートＤＢａｉｔの腹腔内及び静脈内投与による有効性は、抵抗性ガンについて示された。

したがって、本発明は、ガンを処置するのに使用するための核酸分子であって、
該核酸分子は、下記式：

［式中、
Ｎは、デオキシヌクレオチドであり、ｎは、１５〜１９５の整数であり、下線を引いたＮは、改変ホスホジエステル骨格を有し又は有さないヌクレオチドを意味し、Ｌ’は、リンカーであり、Ｃは、脂溶性分子又はレセプター媒介性エンドサイトーシスを可能にする細胞レセプターをターゲットにするリガンドから選択されるエンドサイトーシスを促進する分子であり、Ｌは、リンカーであり、ｍは、０又は１である整数であり、ｐは、１である］
で示されるものを有し、
ここで、該核酸は、エンドソーム分解剤の投与を何ら組み合わせることなく使用され、
ここで、該核酸は、腹腔内及び静脈内経路から選択される非経口全身経路により投与される、
核酸分子に関する。

好ましくは、式（Ｉ）で示される核酸は、１つ又は複数の下記特徴：
−Ｎが、Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）及びＧ（グアニン）からなる群より選択され、ＣｐＧジヌクレオチドの発生を避け、ヒトゲノムにおける任意の遺伝子に対する８０％未満の配列同一性を有するように選択されるデオキシヌクレオチドであり、及び／又は
−連結しているＬ’が、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジラート（Ｔ４）及び１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択され、及び／又は
−ｍが、１であり、Ｌが、カルボキサミドポリエチレングリコール、より好ましくは、カルボキサミドトリエチレン又はテトラエチレングリコールであり、及び／又は
−Ｃが、コレステロール、一本鎖もしくは二本鎖脂肪酸、例えば、オクタデシル、オレイン酸、ジオレイルもしくはステアリン酸、又は細胞レセプターをターゲットにするリガンド（ペプチド、タンパク質、アプタマーを含む）、例えば、葉酸、トコフェロール、糖、例えば、ガラクトース及びマンノース並びにそのオリゴ糖、ペプチド、例えば、ＲＧＤ及びボンベシン、並びにタンパク質、例えば、トランスフェリン及びインテグリンからなる群より選択され、好ましくは、コレステロール又はトコフェロール、更により好ましくは、コレステロールである
を有する。

より好ましくは、該核酸分子は、下記式：

［式中、
下線を引いたヌクレオチドが、ホスホロチオアート又はメチルホスホナート骨格を有し又は有さないヌクレオチドを意味し、連結しているＬ’が、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジラート（Ｔ４）及び１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択され、ｍが、１であり、Ｌが、カルボキサミドオリゴエチレングリコールであり、Ｃが、ジオレイル、オクタデシル、葉酸、トコフェロール及びコレステロールからなる群より選択される］
で示されるものを有し、
ここで、該核酸が、エンドソーム分解剤、特に、クロロキンの投与を何ら組み合わせることなく使用され、
ここで、該核酸が、腹腔内及び静脈内経路から選択される非経口全身経路により投与される。

更により好ましくは、該核酸は、

［式中、下線を引いたヌクレオチドは、ホスホロチオアート骨格を有するヌクレオチドを意味する］
である。

好ましくは、該核酸は、静脈内経路により投与され、例えば、注射、静脈点滴、ボーラス又はポンプにより投与される。

好ましくは、ガンは、放射線抵抗性又は化学療法抵抗性ガンである。より好ましくは、ガンは、トリプルネガティブ乳ガン（ＴＮＢＣ）、化学療法抵抗性肝細胞ガン（ＨＣＣ）、化学療法抵抗性卵巣ガン、化学療法抵抗性肺ガン及び転移性肝臓ガンからなる群より選択される。特定の実施態様では、ガンは、ドキソルビシン−抵抗性肝細胞ガン（ＨＣＣ）、プラチナ抵抗性卵巣ガン、プラチナ抵抗性トリプルネガティブ乳ガン及び直腸結腸肝臓転移からなる群より選択される。

好ましくは、該核酸は、放射線療法及び／又は化学療法との組み合わせで使用される。一実施態様において、該核酸は、ＤＮＡ傷害剤との組み合わせで使用される。好ましくは、ＤＮＡ傷害剤は、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤、ＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡアルキル化剤、代謝拮抗剤及び紡錘体阻害剤からなる群より選択される。より好ましくは、該核酸は、ドキソルビシン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン及び５−ＦＵからなる群より選択される化学療法との組み合わせで使用される。

発明の詳細な説明
本発明は、ガンを処置するのに使用するための核酸分子（ｃｏＤＢａｉｔ）であって、該核酸分子は、下記式：

［式中、
Ｎは、デオキシヌクレオチドであり、ｎは、１〜１９５の整数であり、下線を引いたＮは、改変ホスホジエステル骨格を有し又は有さないヌクレオチドを意味し、Ｌ’は、リンカーであり、Ｃは、脂溶性分子又はレセプター媒介性エンドサイトーシスを可能にする細胞レセプターをターゲットにするリガンドから選択されるエンドサイトーシスを促進する分子であり、Ｌは、リンカーであり、ｍは、０又は１である整数であり、ｐは、１である］
で示されるものを有し、
ここで、該核酸は、エンドソーム分解剤の投与を組み合わせることなく使用され、
ここで、該核酸は、腹腔内及び静脈内経路から選択される非経口全身経路により投与される、
核酸分子に関する。

キノリンエンドソーム分解剤の不存在が本明細書において言及される場合、キノリンエンドソーム分解剤は、ＷＯ第２０１１／１６１０７５号の第２６〜２８頁（参照により本明細書に組み入れられる）で定義されたエンドソーム分解剤を意味する。特に、キノリンエンドソーム分解剤は、クロロキンである。特に、本明細書に記載された核酸は、任意のエンドソーム分解剤との同時、別々又は連続的使用のためのもではない。

本発明は、
−特に、キノリンエンドソーム分解剤の投与を組み合わせることなく、ガン処置に使用するための、本明細書で定義された核酸分子又はそれと場合により薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物（ここで、該医薬組成物は、場合により、放射線療法及び／又はＤＮＡ傷害性抗腫瘍剤との組み合わせで、腹腔内及び静脈内経路から選択される非経口全身経路により投与される）、
−ガンを処置するための医薬を製造するための、本明細書で定義された核酸分子又はそれを含む医薬組成物の使用（ここで、該医薬は、任意のキノリンエンドソーム分解剤との組み合わせでは使用されず、場合により、放射線療法及び／又はＤＮＡ傷害性抗腫瘍剤との組み合わせで、腹腔内及び静脈内経路から選択される非経口全身経路により投与される）、
−対象におけるガンを処置するための方法であって、治療上有効量の本明細書で定義された核酸分子又はそれを含む医薬組成物を、キノリンエンドソーム分解剤を何ら投与することなく、腹腔内及び静脈内経路から選択される非経口全身経路により投与することを含む、方法、
−特に、キノリンエンドソーム分解剤の投与を組み合わせることなく、ガン処置に使用するための、本明細書で定義された核酸分子、ＤＮＡ傷害性抗腫瘍剤及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物（ここで、該医薬組成物は、腹腔内及び静脈内経路から選択される非経口全身経路により投与される）、
−ガンを処置するための医薬を製造するための、本明細書で定義された核酸分子及びＤＮＡ傷害性抗腫瘍剤を含む医薬組成物（ここで、該医薬は、任意のキノリンエンドソーム分解剤との組み合わせでは使用されず、腹腔内及び静脈内経路から選択される非経口全身経路により投与される）、
−対象におけるガンを処置するための方法であって、治療上有効量の、本明細書で定義された核酸分子及びＤＮＡ傷害性抗腫瘍剤を含む医薬組成物を、腹腔内及び静脈内経路から選択される非経口全身経路により、キノリンエンドソーム分解剤を何ら投与することなく、場合により、放射線療法及び／又はＤＮＡ傷害性抗腫瘍剤との組み合わせで投与することを含む、方法、
−特に、キノリンエンドソーム分解剤の投与と組み合わせることなく、ガン処置における同時、別々又は連続的な使用のための組み合わせ製剤としての、（ａ）本明細書で定義された核酸分子と、場合により、（ｂ）ＤＮＡ傷害性抗腫瘍剤とを含有する、製品又はキット（ここで、該医薬組成物は、腹腔内及び静脈内経路から選択される非経口全身経路により投与される）、
−ガンの処置を必要とする対象におけるガンを処置するための方法であって、腹腔内及び静脈内経路から選択される非経口全身経路により、キノリンエンドソーム分解剤を何ら投与することなく、有効量の、本明細書で定義された核酸分子を含む医薬組成物と、有効量の、ＤＮＡ傷害性抗腫瘍剤を含む医薬組成物とを投与することを含む、方法
に関する。

本明細書で使用する場合、「キット」、「製品」又は「組み合わせ製剤」という用語は、特に、上記定義された組み合わせパートナーを、独立して、又は、該組み合わせパートナーの区別された量との種々の固定された組み合わせの使用により、すなわち、同時又は異なる時点で投与することができるという意味での「部品キット」を定義する。ついで、該部品キットの部品は、例えば、該部品キットの任意の部品について、同時に又は経時的に重ねて、すなわち、異なる時点及び等しい又は異なる時間間隔で投与することができる。組み合わせ製剤において投与される組み合わせパートナーの総量の比は変動させることができる。組み合わせパートナーは、同じ経路又は異なる経路により投与することができる。

本発明の文脈内において、処置という用語は、治癒的、症候的及び予防的処置を指す。本発明の医薬組成物、キット、製品及び組み合わせ製剤は、既存のガン又は腫瘍（初期又は後期段階の進行のガンを含む）を有するヒトに使用することができる。本発明の医薬組成物、キット、製品及び組み合わせ製剤は、ガンを有する患者を必ずしも治癒する必要はないであろうが、疾患の進行を遅延させもしくは遅くし、又は、疾患の更なる進行を予防し、それにより、患者の症状を改善するであろう。特に、本発明の医薬組成物、キット、製品及び組み合わせ製剤は、腫瘍の進行を減少させ、腫瘍量を減少させ、哺乳類ホストにおける腫瘍退縮を生じさせ、及び／又は、転移の発生及びガンの再発を予防する。ガンの処置において、本発明の医薬組成物は、治療上有効量で投与される。

「治療上有効量」は、単独又は医薬組成物、キット、製品又は組み合わせ製剤の他の有効成分との組み合わせで、ヒトを含む哺乳類におけるガンの有害作用を予防し、除去し、又は減少させる本発明の医薬組成物の量を意味する。投与される用量は、単独又はここで記載された組み合わせ以外の他の処置との組み合わせにおいて使用される各化合物について定義する「治療上有効量」に対して、該組成物における各化合物について少なくすることができると理解される。該組成物の「治療上有効量」は、患者、病理、投与モード等に従って、当業者により採用されるであろう。

本明細書全体を通して、「ガンの処置」等は、本発明の医薬組成物を関して言及され、ａ）ガンを処置するための方法であって、前記方法は、このような処置を必要する対象に、本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法；ｂ）ガンを処置するための本発明の医薬組成物の使用；ｃ）ガンを処置するための医薬の製造のための本発明の医薬組成物の使用及び／又はｄ）ガンの処置に使用するための本発明の医薬組成物を意味する。

本明細書において企図される医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容し得る担体を含むことができる。「薬学的に許容し得る担体」という用語は、有効成分の生体活性の有効性と干渉せず、投与されるホストに対して毒性でない、任意の担体（例えば、支持体、物質、溶媒等）を包含するのを意味する。例えば、非経口投与のために、有効成分は、媒体、例えば、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンゲル液中に、注射用の単位投与形態に配合することができる。

該医薬組成物は、薬学的に適合し得る溶媒中の液剤として、又は、適切な薬学的溶媒もしくは媒体中の乳剤、懸濁剤もしくは分散剤として、当技術分野において公知の方法で配合することができる。非経口投与に適した製剤は、都合良く、好ましくは、レシピエントの血液と等張性の、有効成分の無菌の油性又は水性製剤を含む。このような製剤は全て、他の薬学的に適合し得る非毒性の補助剤、例えば、安定剤、酸化防止剤、バインダー、染料、乳化剤又は着香物質も含有することができる。本発明の製剤は、有効成分を薬学的に許容し得る担体、したがって、場合により、他の治療成分との関連付けにおいて含む。担体は、該製剤の他の成分と適合性であり、かつ、そのレシピエントに対して有害で無いという意味において「許容し得る」必要がある。該医薬組成物は、適切な無菌溶液の注射又は静脈内注入により有利に適用される。これらの化学療法剤のほとんどの安全で効果的に投与するための方法は、当業者に公知である。加えて、その投与は、標準的な文献に記載されている。

ｃｏＤＢａｉｔと呼ばれるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子
本発明に使用するためのＤｂａｉｔ分子は、下記式：

［式中、Ｎは、ヌクレオチドであり、ｎは、少なくとも１の整数であり、下線を引いたＮは、改変ホスホジエステル骨格を有し又は有さないヌクレオチドを意味し、Ｌ’は、リンカーであり、Ｃは、エンドサイトーシスを促進する分子であり、Ｌは、リンカーであり、ｍは、０又は１である整数であり、ｐは、１であり、好ましくは、下線を引いたＮは、改変ホスホジエステル骨格を有するヌクレオチドを意味する］
により記載することができる。

好ましい実施態様では、式（Ｉ）で示される分子は、１つ又は複数の下記特徴：
−Ｎは、好ましくは、Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）及びＧ（グアニン）からなる群より選択され、ＣｐＧジヌクレオチドの発生を避け、ヒトゲノムにおける任意の遺伝子に対する８０％又は７０％未満、更に６０％又は５０％未満の配列同一性を有するように選択されるデオキシヌクレオチドであり、及び／又は
−ｎは、１５〜１９５、１５〜９５、１９〜９５、２１〜９５、２７〜９５、１５〜４５、１９〜４５、２１〜４５又は２７〜４５の整数であり、特に好ましい実施態様では、ｎは、２７であり、及び／又は
−下線を引いたＮは、ホスホロチオアート又はメチルホスホナート骨格、より好ましくは、ホスホロチオアート骨格を有し又は有さないヌクレオチドを意味し、好ましくは、下線を引いたＮは、改変ホスホジエステル骨格を有するヌクレオチドを意味し、及び／又は
−連結しているＬ’は、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジラート（Ｔ４）及び１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択され、及び／又は
−ｍは、１であり、Ｌは、カルボキサミドポリエチレングリコール、より好ましくは、カルボキサミドトリエチレン又はテトラエチレングリコールであり、及び／又は
−Ｃは、コレステロール、一本鎖もしくは二本鎖脂肪酸、例えば、オクタデシル、オレイン酸、ジオレイルもしくはステアリン酸、又は細胞レセプターをターゲットにするリガンド（ペプチド、タンパク質、アプタマーを含む）、例えば、葉酸、トコフェロール、糖、例えば、ガラクトース及びマンノース並びにそのオリゴ糖、ペプチド、例えば、ＲＧＤ及びボンベシン、並びにタンパク質、例えば、トランスフェリン及びインテグリンからなる群より選択され、好ましくは、コレステロール又はトコフェロール、更により好ましくは、コレステロールである
を有する。

好ましくは、Ｃ−Ｌｍは、トリエチレングリコールリンカー（１０−Ｏ−［１−プロピル−３−Ｎ−カルバモイルコレステリル］−トリエチレングリコール基である。代替的に、Ｃ−Ｌｍは、テトラエチレングリコールリンカー（１０−Ｏ−［１−プロピル−３−Ｎ−カルバモイルコレステリル］−テトラエチレングリコール基である。

特定の実施態様では、該核酸分子は、Ｄｂａｉｔ分子、例えば、ＷＯ第２００５／０４０３７８号、同第２００８／０３４８６６号及び同第２００８／０８４０８７号に広く記載されたものであることができる。同文献の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。

Ｄｂａｉｔ分子は、その治療活性に必要な数多くの特徴、例えば、その最短長、少なくとも１つの遊離端の存在及び二本鎖部分、好ましくは、ＤＮＡ二本鎖部分の存在により定義することができる。以下で検討されるであろうように、同特徴は、Ｄｂａｉｔ分子の正確なヌクレオチド配列がその活性に影響を及ぼさないことに言及するのに重要である。更に、Ｄｂａｉｔ分子は、改変及び／又は非天然骨格を含有することができる。

好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子は、非ヒト起源のものであり（すなわち、そのヌクレオチド配列及び／又はコンホーメーション（例えば、ヘアピン）がヒト細胞には存在しない）、最も好ましくは、合成起源のものである。Ｄｂａｉｔ分子の配列がほとんど役割を果たさないとするなら、Ｄｂａｉｔ分子は、好ましくは、公知の遺伝子、プロモーター、エンハンサー、５’−又は３’−上流配列、エキソン、イントロン等に対する相当な度合いの配列相同性又は同一性を有さない。すなわち、Ｄｂａｉｔ分子は、ヒトゲノムにおける任意の遺伝子に対する８０％又は７０％未満、更に６０％又は５０％未満の配列同一性を有する。配列同一性を決定する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Blastを含む。Ｄｂａｉｔ分子は、ストリンジェントな条件下では、ヒトゲノムＤＮＡとハイブリダイズしない。典型的なストリンジェントな条件は、それらが、部分的に相補な核酸から、完全に相補な核酸の識別を可能にする。

加えて、Ｄｂａｉｔ分子の配列は、周知のＴｏｌｌ様レセプター媒介性免疫反応を避けるために、好ましくは、ＣｐＧを避ける。

Ｄｂａｉｔ分子の長さは、Ｋｕ及びＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質を含むＫｕタンパク質複合体の適切な結合を可能にするのに十分である限り変動させることができる。Ｄｂａｉｔ分子の長さは、このようなＫｕ複合体に結合し、ＤＮＡ−ＰＫｃｓを活性化させるのを確保するために、２０bp超、好ましくは、約３２bpであるべきであることが示されている。好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子は、２０〜２００bp、より好ましくは、２４〜１００bp、更により好ましくは、２６〜１００、及び最も好ましくは、２４〜２００、２５〜２００、２６〜２００、２７〜２００、２８〜２００、３０〜２００、３２〜２００、２４〜１００、２５〜１００、２６〜１００、２７〜１００、２８〜１００、３０〜１００、３２〜２００又は３２〜１００bpを含む。例えば、Ｄｂａｉｔ分子は、２４〜１６０、２６〜１５０、２８〜１４０、２８〜２００、３０〜１２０、３２〜２００又は３２〜１００bpを含む。「bp」は、分子が示された長さの二本鎖部分を含むことを意図している。

特定の実施態様では、少なくとも３２bp又は約３２bpの二本鎖部分を有するＤｂａｉｔ分子は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号：１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号：２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号：３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号：４）又はＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号：５）と同じヌクレオチド配列を含む。場合により、Ｄｂａｉｔ分子は、Ｄｂａｉｔ３２、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ又はＤｂａｉｔ３２Ｈｄと同じヌクレオチド組成を有するが、そのヌクレオチド配列は異なる。ついで、Ｄｂａｉｔ分子は、３Ａ、６Ｃ、１２Ｇ及び１１Ｔを有する二本鎖部分の一方の鎖を含む。好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子の配列は、ＣｐＧジヌクレオチドを何ら含有しない。

代替的には、二本鎖部分は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号：１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号：２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号：３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号：４）又はＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号：５）の少なくとも１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０又は３２個の連続的なヌクレオチドを含む。より特定の実施態様では、二本鎖部分は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号：１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号：２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号：３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号：４）又はＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号：５）の２０、２２、２４、２６、２８、３０又は３２個の連続的なヌクレオチドからなる。

本明細書で開示された核酸は、ＤＳＢの模倣として、少なくとも１つの遊離端を有する必要がある。

特定の実施態様では、それらは、１つのみの自由端を含有する。好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子は、二本鎖ＤＮＡステム及びループを有するヘアピン核酸で構成される。ループは、当業者に公知の核酸もしくは他の化学基又はそれらの混合物であり得る。ヌクレオチドリンカーは、２〜１０個のヌクレオチド、好ましくは、３、４又は５個のヌクレオチドを含むことができる。非ヌクレオチドリンカーは、非排他的に、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素又は他のポリマー化合物（例えば、オリゴエチレングリコール、例えば、２〜１０個のエチレングリコール単位、好ましくは、４、５、６、７又は８個のエチレングリコール単位を有するもの）を含む。好ましいリンカーは、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジラート（Ｔ４）及び他のリンカー、例えば、１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択される。したがって、特定の実施態様では、Ｄｂａｉｔ分子は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号：１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号：２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号：３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号：４）又はＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号：５）の少なくとも１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０又は３２個の連続的なヌクレオチドを含む二本鎖部分又はステムと、ヘキサエチレングリコールリンカー、テトラデオキシチミジラートリンカー（Ｔ４）又は１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンであるループとを有するヘアピン分子であることができる。より特定の実施態様では、そのようなＤｂａｉｔ分子は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号：１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号：２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号：３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号：４）又はＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号：５）の２０、２２、２４、２６、２８、３０又は３２個の連続的なヌクレオチドからなる二本鎖部分を有することができる。

Ｄｂａｉｔ分子は、好ましくは、２’−デオキシヌクレオチド骨格を含み、場合により、１つ又は複数の（２、３、４、５又は６個の）改変ヌクレオチド並びに／又はアデニン、シトシン、グアニン及びチミン以外の核酸塩基を含む。したがって、Ｄｂａｉｔ分子は、本質的に、ＤＮＡ構造である。特に、Ｄｂａｉｔ分子の二本鎖部分又はステムは、デオキシリボヌクレオチドで構成される。

好ましいＤｂａｉｔ分子は、特に、それらを分解から保護するために、１つ又は複数の化学改変ヌクレオチド又は基を、一方の鎖又は両鎖の端部に含む。特定の好ましい実施態様では、Ｄｂａｉｔ分子の遊離端は、一方の鎖又は両鎖の端部における１つ、２つ又は３つの改変ホスホジエステル骨格により保護される。好ましい化学基、特に、改変ホスホジエステル骨格は、ホスホロチオアートを含む。代替的に、好ましいＤｂａｉｔは、３’−３’ヌクレオチド結合又はメチルホスホナート骨格を有するヌクレオチドを有する。他の改変骨格は、当技術分野において周知であり、ホスホラミダート、モルホリノ核酸、２’−０，４’−Ｃ メチレン／エチレン架橋ロックド核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及び可変長の短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子もしくは複素環糖間結合、又は当業者に公知の任意の改変ヌクレオチドを含む。第１の好ましい実施態様では、Ｄｂａｉｔ分子は、一方の鎖又は両鎖の端部における１つ、２つ、又は３つの改変ホスホジエステル骨格により、より好ましくは、少なくとも３’端、更により好ましくは、５’端及び３’端の両方における３つの改変ホスホジエステル骨格（特に、ホスホロチオアート又はメチルホスホナート）により保護された遊離端を有する。

最も好ましい実施態様では、Ｄｂａｉｔ分子は、３２bpのＤＮＡ二本鎖部分又はステム（例えば、配列番号：１〜５、特に、配列番号：４からなる群より選択される配列を有する）と、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジラート（Ｔ４）及び１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択されるリンカーを含み又はからなる、ＤＮＡ二本鎖部分又はステムの２つの鎖を連結しているループと、３つの改変ホスホジエステル骨格（特に、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合）を有するＤＮＡ二本鎖部分又はステムの遊離端（すなわち、ループの反対側）とを含むヘアピン核酸分子である。

前記核酸分子は、化学合成、半生合成又は生合成、任意の増幅法、続けて、任意の抽出及び前調製法及び任意の化学改変により調製される。リンカーは、標準的な核酸化学合成により組み込み可能なように提供される。

より好ましくは、核酸分子は、特別に設計された収束合成により製造される。２つの相補鎖が適切なリンカー前駆体の組み込みを伴い、それらの精製後に、それらは互いに共有結合される標準的な核酸化学合成により調製される。

エンドサイトーシスを促進する分子は、Ｄｂａｉｔ分子に、好ましくは、リンカーを介してコンジュゲートされる。当技術分野において公知の任意のリンカーが、エンドサイトーシスを促進する分子をＤｂａｉｔ分子に共有結合させるのに使用することができる。例えば、ＷＯ第０９／１２６９３３号の第３８〜４５頁には、都合の良いリンカーの広いレビューが提供されている。リンカーは、非排他的に、脂肪族鎖、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素又は他のポリマー化合物（例えば、オリゴエチレングリコール、例えば、２〜１０個のエチレングリコール単位、好ましくは、３、４、５、６、７又は８個のエチレングリコール単位、更により好ましくは、６個のエチレングリコール単位を有するもの）であることができ、かつ、化学的又は酵素的方法により切断することができる任意の結合、例えば、ジスルフィド結合、保護されたジスルフィド結合、酸不安定性結合（例えば、ヒドラゾン結合）、エステル結合、オルトエステル結合、ホスホンアミド結合、生体開裂性ペプチド結合、アゾ結合又はアルデヒド結合を組み込むことができる。このような開裂性リンカーは、ＷＯ第２００７／０４０４６９号の第１２〜１４頁、同第２００８／０２２３０９号の第２２〜２８頁に詳述されている。

特定の実施態様では、該核酸分子は、１つのエンドサイトーシスを促進する分子に連結することができる。代替的に、複数のエンドサイトーシスを促進する分子（例えば、２、３又は４つ）を、１つの核酸分子に取り付けることができる。

具体的な実施態様では、エンドサイトーシスを促進する分子、特に、コレステロールと核酸分子との間のリンカーは、ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ（式中、ｎは、１〜１０の整数であり、好ましくは、ｎは、３、４、５及び６からなる群より選択される）である。非常に特定の実施態様では、リンカーは、ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_４（カルボキサミドテトラエチレングリコール）又はＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_３（カルボキサミドトリエチレングリコール）である。リンカーは、核酸分子に、該核酸分子の活性を改変させない任意の都合の良い位置に連結することができる。特に、リンカーは、５’端に連結させることができる。したがって、好ましい実施態様では、企図されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、ヘアピン構造を有し、エンドサイトーシスを促進する分子に、好ましくは、リンカーを介して、その５’端においてコンジュゲートしているＤｂａｉｔ分子である。

別の具体的な実施態様では、エンドサイトーシスを促進する分子、特に、コレステロールと核酸分子との間のリンカーは、ジアルキル−ジスルフィド｛例えば、（ＣＨ_２）_ｒ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_ｓ（ここで、ｒ及びｓは、１〜１０、好ましくは、３〜８、例えば、６の整数である）｝である。

最も好ましい実施態様では、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、３２bpのＤＮＡ二本鎖部分又はステム（例えば、配列番号：１〜５、特に、配列番号：４からなる群より選択される配列を有する）と、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジラート（Ｔ４）及び１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択されるリンカー含む又はからなるＤＮＡ二本鎖部分又はステムの２つの鎖を連結しているループと、３つの改変ホスホジエステル骨格（特に、ホスホロチオアートヌクレオチド間連結）を有するＤＮＡ二本鎖部分又はステムの遊離端（すなわち、ループの反対側）とを含むヘアピン核酸分子であり、前記Ｄｂａｉｔ分子は、コレステロールにその５’端において、好ましくは、リンカー（例えば、カルボキサミドオリゴエチレングリコール、好ましくは、カルボキサミドトリエチレン又はテトラエチレングリコール）を介してコンジュゲートしている。

好ましい実施態様では、ＮＮＮＮ−（Ｎ）_ｎ−Ｎは、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号：１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号：２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号：３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号：４）もしくはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号：５）の少なくとも６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０もしくは３２個の連続的なヌクレオチドを含むか、又は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号：１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号：２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号：３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号：４）もしくはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号：５）の２０、２２、２４、２６、２８、３０もしくは３２個の連続的なヌクレオチドからなる。特定の実施態様では、ＮＮＮＮ−（Ｎ）_ｎ−Ｎは、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号：１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号：２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号：３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号：４）もしくはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号：５）、より好ましくは、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号：４）含むか、又は、これらからなる。

したがって、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子は、
ＮＮＮＮ−（Ｎ）_ｎ−Ｎが配列番号：１である場合、

ＮＮＮＮ−（Ｎ）_ｎ−Ｎが配列番号：２である場合、

ＮＮＮＮ−（Ｎ）_ｎ−Ｎが配列番号：３である場合、

ＮＮＮＮ−（Ｎ）_ｎ−Ｎが配列番号：４である場合、

ＮＮＮＮ−（Ｎ）_ｎ−Ｎが配列番号：５である場合、

［Ｌ、Ｌ’、Ｃ、ｐ及びｍについては、式（Ｉ）と同じ定義を有する］
からなる群より選択することができる。

好ましい実施態様では、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）及び（Ｉｅ）で示される分子は、１つ又は複数の下記特徴：
−下線を引いたヌクレオチドが、ホスホロチオアート又はメチルホスホナート骨格、より好ましくは、ホスホロチオアート骨格を有し又は有さないヌクレオチドを意味し、好ましくは、下線を引いたヌクレオチドが、ホスホロチオアート又はメチルホスホナート骨格、より好ましくは、ホスホロチオアート骨格を有するヌクレオチドを意味し、及び／又は
−連結しているＬ’が、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジラート（Ｔ４）及び１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択され、及び／又は
−ｍが、１であり、Ｌが、カルボキサミドポリエチレングリコール、より好ましくは、カルボキサミドトリエチレン又はテトラエチレングリコールであり、及び／又は
−ｐが、１であり、及び／又は
−Ｃが、コレステロール、一本鎖もしくは二本鎖脂肪酸、例えば、オクタデシル、オレイン酸、ジオレイルもしくはステアリン酸、又は細胞レセプターをターゲットにするリガンド（ペプチド、タンパク質、アプタマーを含む）、例えば、葉酸、トコフェロール、糖、例えば、ガラクトース及びマンノース並びにそのオリゴ糖、ペプチド、例えば、ＲＧＤ及びボンベシン、並びにタンパク質、例えば、トランスフェリン及びインテグリンからなる群より選択され、好ましくは、コレステロールである
を有する。

好ましくは、Ｃ−Ｌｍは、トリエチレングリコールリンカー（１０−Ｏ−［１−プロピル−３−Ｎ−カルバモイルコレステリル］−トリエチレングリコール基）又はテトラエチレングリコールリンカー（１０−Ｏ−［１−プロピル−３−Ｎ−カルバモイルコレステリル］−テトラエチレングリコール基）である。

式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）及び（Ｉｅ）で示されるＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子の具体的な実施態様では、Ｌ’は、好ましくは、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジラート（Ｔ４）及び１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択される。

式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）及び（Ｉｅ）で示されるＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子の具体的な実施態様では、Ｃが、コレステロールである場合、Ｃ−Ｌ_ｍは、基

である。

好ましい実施態様では、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子は、（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）及び（Ｉｅ）［式中、Ｃ−Ｌ_ｍが、基

であり、ここで、Ｌ’が、好ましくは、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジラート（Ｔ４）及び１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカン、より好ましくは、１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択される］
からなる群より選される。

非常に具体的な実施態様では、Ｄｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子は、下記式

［式中、
Ｃ−Ｌ_ｍが、テトラエチレングリコールリンカー（１０−Ｏ−［１−プロピル−３−Ｎ−カルバモイルコレステリル］−テトラエチレングリコール基）であり、Ｌ’が、１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンであり、ここで、下線を引いたヌクレオチドが、ホスホロチオアート骨格を有する］
を有する。

したがって、該分子は、下記構造を有し、実施例セクションにおいて、「ｃｏＤｂａｉｔ」又は「ＤＴ０１」と呼ばれる。

この分子の別の表現は、以下：

に示される。

代替的な分子は、下記：

である。

別の好ましい実施態様では、該核酸分子は、下記式

［式中、Ｎは、デオキシヌクレオチドであり、ｎは、１〜１９５の整数であり、下線を引いたＮは、改変ホスホジエステル骨格を有し又は有さないヌクレオチドを意味し、Ｌ’は、リンカーであり、Ｃは、コレステロールであり、Ｌは、リンカーであり、ｍは、０又は１である整数であり、ｐは、１である］
のものを有する。好ましくは、下線を引いたＮは、改変ホスホジエステル骨格を有するヌクレオチドを意味する。

ＤＮＡ傷害処置
コンジュゲートＤｂａｉｔ分子に加えて、処置は、抗腫瘍処置、好ましくは、ＤＮＡ傷害剤又は放射線療法による処置を更に含むこともできる。ＤＮＡ傷害処置は、放射線療法もしくはＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤による化学療法又はそれらの組み合わせであることができる。

ＤＮＡ鎖開裂は、電離放射線により達成することができる（放射線療法）。放射線療法は、γ−線、Ｘ−線及び／又は腫瘍細胞への放射性同位体の指向性を有する送達を含むが、これらに限定されない。他の放射線療法は、マイクロ波及びＵＶ照射を含む。放射線療法への他のアプローチも、本発明において企図される。

ＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤は、好ましくは、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤、ＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡアルキル化剤、代謝拮抗剤及び紡錘体阻害剤からなる群より選択される。

トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤は、エトポシド、トポテカン、カンプトテシン、イリノテカン、アムサクリン、イントプリシン、アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、イダンルビシン及びミトキサントロンを含むが、これらに限定されない。トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤は、イントプレシンを含むが、これに限定されない。好ましい実施態様では、ＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤は、ドキソルビシンである。

ＤＮＡ架橋剤は、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンを含むが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、ＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤は、カルボプラチン及びオキサリプラチンからなる群より選択される。

代謝拮抗剤は、核酸合成を担う酵素を遮断し、又は、ＤＮＡに組み込まれる。同組込みにより、不適切な遺伝子コードが生じ、アポトーシスがもたらされる。その非排他的な例は、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似物、プリン類似物及びアデニンデアミナーゼ阻害剤、とりわけ、メトトレキサート、フロキシウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビンホスファート、ペントスタチン、５−フルオロフラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビシン及びカペシタビシンを含むが、これらに限定されない。

ＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤は、アルキル化剤であることができる。同アルキル化剤は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホナート、ニトロソウレア、金属塩及びトリアゼンを含むが、これらに限定されない。その非排他的な例は、ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（CYTOXAN（登録商標））、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ホテムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、チオテパ、ストレプトゾシン、ダカルバジン及びテモゾロミドを含む。

紡錘体阻害剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、ラロラキセル（ＸＲＰ９８８１とも呼ばれる；Sanofi-Aventis）、ＸＲＰ６２５８（Sanofi-Aventis）、ＢＭＳ−１８４４７６（Bristol-Meyer-Squibb）、ＢＭＳ−１８８７９７（Bristol-Meyer-Squibb）、ＢＭＳ−２７５１８３（Bristol-Meyer-Squibb）、オルタタキセル（ＩＤＮ５１０９、ＢＡＹ５９−８８６２又はＳＢ−Ｔ−１０１１３１とも呼ばれる；Bristol-Meyer-Squibb）、ＲＰＲ１０９８８１Ａ（Bristol-Meyer-Squibb）、ＲＰＲ１１６２５８（Bristol-Meyer-Squibb）、ＮＢＴ−２８７（TAPESTRY）、ＰＧ−パクリタキセル（ＣＴ−２１０３、ＰＰＸ、パクリタキセルポリグルマックス、パクリタキセルポリグルタマート又はXyotax（商標）とも呼ばれる）、ABRAXANE（登録商標）（Ｎａｂ−パクリタキセルとも呼ばれる；ABRAXIS BIOSCIENCE）、テセタキセル（ＤＪ−９２７とも呼ばれる）、ＩＤＮ５３９０（INDENA）、タキソプレキシン（ドコサヘキサエン酸−パクリタキセルとも呼ばれる；PROTARGA）、ＤＨＡ−パクリタキセル（Taxoprexin（登録商標）とも呼ばれる）及びＭＡＣ−３２１（WYETH）を含むが、これらに限定されない。Hennenfent & Govindanのレビュー（2006, Annals of Oncology, 17, 735-749）も参照のこと。

好ましくは、ＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤は、トポイソメラーゼＩ及び／もしくはＩＩ阻害剤、ＤＮＡ架橋剤、代謝拮抗剤又はそれらの組み合わせである。好ましい実施態様では、ＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤は、ドキソルビシン、５−ＦＵ、カルボプラチン及びオキサリプラチン又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。最も好ましい実施態様では、コンジュゲートＤＢａｉｔは、ＤＴ０１であり、ＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤は、ドキソルビシン、カルボプラチン、５−ＦＵ及びオキサリプラチンからなる群より選択される。

処置されるガン又は腫瘍
本発明で記載された医薬組成物及び製品、キット、又は組み合わせ製剤は、対象におけるガンを処置するのに使用することができる。

「ガン」、「ガン性」又は「悪性腫瘍」という用語は、典型的には、制限されていない細胞増殖により特徴付けられる哺乳類における生理状態を意味し又は説明する。ガンの例は、例えば、白血病、リンパ腫、芽腫、ガン腫及び肉腫を含む。このようなガンのより特定の例は、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ ＡＬＬ）、扁平細胞ガン腫、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、グリオーマ、胃腸ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、直腸結腸ガン、子宮内膜ガン、腎臓ガン、前立腺ガン、甲状腺ガン、神経芽腫、膵臓ガン、多形神経膠芽腫、子宮頸ガン、胃ガン、膀胱ガン、肝細胞ガン、乳ガン、結腸ガン及び頚椎部ガン、胃ガン、生殖細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病、マスト細胞症及びマスト細胞症に関連する任意の症候を含む。

「白血病」は、血液形成臓器の侵襲性の悪性疾患を意味し、一般的には、血中の白血球及びその前駆体並びに骨髄の歪められた増殖及び発展により特徴付けられる。白血病は、一般的には、（１）疾患の期間及び特徴−急性又は慢性；（２）関与する細胞の種類；骨髄（骨髄性）、リンパ球（リンパ球性）又は単球性；並びに（３）血中の異常な細胞数の増大又は非増大−白血球又は無白血球性（亜白血球性）に基づいて臨床的に分類される。白血病は、例えば、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ−細胞白血病、無白血球性白血病、白血球血症性白血病、好塩基求性白血病、芽細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリー細胞白血病、血芽球性白血病、血球芽細胞性白血病、組織球性白血病、幹細胞白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ性白血病、リンパ様白血病、リンパ性肉腫細胞白血病、マスト細胞白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ型白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞白血病、シリング型白血病、幹細胞白血病、亜白血球性白血病及び未分化細胞白血病を含む。特定の態様では、本発明は、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病及び／又はフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ ＡＬＬ）についての処置を提供する。

種々のガンも、本発明の範囲に包含される。同ガンは、下記：膀胱（亢進性及び転移性膀胱ガンを含む）、乳房、結腸（直腸結腸ガンを含む）、腎臓、肝臓、肺（小細胞及び非小細胞肺ガン並びに肺腺ガンを含む）、卵巣、前立腺、精巣、尿生殖管、リンパ系、直腸、咽頭、膵臓（外分泌膵臓ガン腫を含む）、食道、胃、胆嚢、子宮頚管、甲状腺及び皮膚（扁平細胞ガン腫を含む）のガン腫を含むガン腫；リンパ球系統の造血性腫瘍（白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、Ｔ−細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、組織細胞性リンパ腫及びバーキットリンパ腫を含む）；骨髄系統の造血性腫瘍（急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病並びに前骨髄球性白血病を含む）；中枢神経系及び抹消神経系の腫瘍（星状細胞腫、神経芽腫、グリオーマ及びシュワン細胞腫を含む）；間葉系起源の腫瘍（線維肉腫、横紋筋肉芽腫及び骨肉腫を含む）；他の腫瘍（メラノーマ、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞ガン及び奇形ガン腫を含む）；メラノーマ、切除不能なステージＩＩＩ又はＩＶの悪性メラノーマ、扁平細胞ガン腫、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、グリオーマ、胃腸ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、直腸結腸ガン、子宮内膜ガン、腎臓ガン、前立腺ガン、甲状腺ガン、神経芽腫、膵臓ガン、多形神経膠芽腫、子宮頸ガン、胃ガン、膀胱ガン、肝細胞ガン、乳ガン、結腸ガン及び頚椎部ガン、網膜芽腫、胃ガン、生殖細胞腫瘍、骨ガン、骨腫瘍、骨の成人悪性線維性組織細胞腫；骨の小児悪性線維性組織細胞腫、肉腫、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、新生物、形質細胞新生物；骨髄異形成症候群；神経芽腫；精巣生殖細胞腫瘍、眼内メラノーマ、骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、滑膜肉腫を含むが、これらに限定されない。加えて、障害は、色素性蕁麻疹、マスト細胞症、例えば、びまん性皮膚マスト細胞症、ヒトにおける単発性マスト細胞腫及びイヌのマスト細胞腫並びに一部の稀な亜型、例えば、水疱性紅皮症性及び末梢血管拡張性マスト細胞症、血液障害に関連するマスト細胞症、例えば、骨髄増殖又は骨髄異形成症候群又は急性白血病、マスト細胞症に関連する骨髄増殖性障害、マスト細胞白血病を、他のガンに加えて含む。他のガンも、障害の範囲内に含まれる。同ガンは、下記：膀胱、尿路上皮ガン腫、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頚管、甲状腺、精巣、特に、卵巣セミノーマ及び皮膚（扁平細胞ガン腫を含む）のガン腫を含むガン腫；消化管間質性腫瘍（「ＧＩＳＴ」）；リンパ系統の造血性腫瘍（白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、Ｔ−細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫を含む）；骨髄系統の造血性腫瘍（急性及び慢性骨髄性白血病並びに前骨髄細胞性白血病を含む）；間葉系起源の腫瘍（線維肉腫及び横紋筋芽肉腫を含む）；他の腫瘍（メラノーマ、セミノーマ、奇形ガン腫、神経芽腫及びグリオーマを含む）；中枢神経系及び抹消神経系の腫瘍（星状細胞腫、神経芽腫、グリオーマ及びシュワン細胞腫を含む）；間葉系起源の腫瘍（線維肉腫、横紋筋肉芽腫及び骨肉腫を含む）；並びに他の腫瘍（メラノーマ、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞ガン、奇形ガン腫、化学療法難治性非セミノーマ性生殖細胞腫瘍及びカポジ肉腫を含む）並びにそれらの任意の転移を含むが、これらに限定されない。

本発明の好ましい実施態様では、ガンは、固体腫瘍である。「固体腫瘍」という用語は、特に、乳ガン、卵巣ガン、結腸ガン及び、一般的には、ＧＩ（消化管）管、子宮頸ガン、肺ガン、特に、小細胞肺ガン及び非小細胞肺ガン、頚椎部ガン、膀胱ガン、前立腺ガン又はカポジ肉腫を意味する。

本発明で記載された医薬組成物及び製品、キット又は組み合わせ製剤は、固体腫瘍の成長を阻害し、腫瘍体積を減少させ、腫瘍の転移性拡散及び微小転移の成長又は進行を予防するのに有用であることができる。本発明で記載された医薬組成物及び製品、キット又は組み合わせ製剤は、乏しい予後の患者又は放射線もしくは化学療法抵抗性腫瘍の処置に特に適している。

一実施態様において、ガンは、メラノーマ、グリオブラストーマ、乳ガン、結腸ガン、肺ガン、胃腸ガン、肝臓ガン及び頚椎部ガンから選択することができる。

好ましい実施態様では、ガンは、放射線抵抗性又は化学療法抵抗性ガンである。とりわけ、ガンは、放射線抵抗性メラノーマ、トリプルネガティブ乳ガン（ＴＮＢＣ）、化学療法抵抗性肝細胞ガン（ＨＣＣ）、化学療法抵抗性肺ガン、化学療法抵抗性卵巣ガン及び転移性肝臓ガンからなる群より選択される。より具体的には、ガンは、ドキソルビシン−抵抗性肝細胞ガン（ＨＣＣ）、プラチナ抵抗性トリプルネガティブ乳ガン、プラチナ抵抗性卵巣ガン及び直腸結腸肝臓転移からなる群より選択される。

具体的な実施態様では、本発明は、オキサリプラチン及び５−ＦＵとの組み合わせにおける直腸結腸ガン腫の処置のための、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子の使用に関する。好ましくは、直腸結腸ガン腫は、転移性であり、より好ましくは、肝臓及び／又は腹膜における転移を有する。

非常に具体的な実施態様では、本発明は、腹腔内に位置していない放射線抵抗性又は化学療法抵抗性ガンの処置のための、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子の使用に関する。したがって、このようなガンは、直腸結腸ガン腫（例えば、肝臓及び腹膜のＣＲＣ転移）を包含しない。とりわけ、ガンは、ＴＮＢＣ及び化学療法抵抗性卵巣ガンからなる群より選択される。より具体的には、ガンは、プラチナ抵抗性ＴＮＢＣ及びプラチナ抵抗性卵巣ガンからなる群より選択される。

更なる実施態様では、本発明は、トリプルネガティブ乳ガンの処置のための、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子の使用に関する。より具体的には、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、特に、シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンから選択されるプラチナ含有抗ガン剤との組み合わせで使用される。具体的な実施態様では、本発明は、カルボプラチンとの組み合わせでのトリプルネガティブ乳ガン（ＴＮＢＣ）の処置のための、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子の使用に関する。場合により、この処置は、放射線療法と組み合わせることができる。

計画、用量及び投与経路
本発明の組み合わせ製剤に利用される組み合わせパートナーそれぞれの有効用量は、利用される特定の化合物又は医薬組成物、投与モード、処置される症状、処置される症状の重症度に応じて変更することができる。このため、本発明の組み合わせ製剤の投与計画は、各種の要因に従って選択される。同要因は、投与経路及び患者の状態を含む。通常の技能を有する内科医、臨床医又は獣医であれば、症状を予防し、同症状に対向し、又は、同症状の進行を停止させるのに必要とされる１つの有効成分の有効量を容易に判断し、処方することができる。毒性なしに有効性が得られる範囲内での有効成分の濃度を達成するのに最適な精度は、ターゲット部位への有効成分の利用能の動態に基づく計画を必要とする。

ＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤がコンジュゲートＤｂａｉｔ分子との組み合わせで使用される場合、ＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤及びコンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、同じ経路により又は別個の経路により投与することができる。ＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤用の投与経路は、経口、非経口、静脈内、腫瘍内、皮下、頭蓋内、動脈内、局所、直腸、経皮、皮内、鼻、筋肉内、骨内等であることができる。

コンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、照射及び／又はＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤の投与前及び／又はこれらと同時及び／又はこれらの後に、より好ましくは、照射及び／又はＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤の投与前及び／又はこれらと同時に投与される。照射及び／又はＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤の投与は、照射が適用される際又はＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤が腫瘍細胞に達する際に、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子が腫瘍細胞に存在するように行われる。通常の技能を有する内科医、臨床医又は獣医であれば、有効成分、ターゲット部位への利用能のその動態又は血漿におけるその薬物動態プロファイルに基づいて計画を決定することができる。予備的な結果から、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、１日の間活性な状態にあることが示されている。第１の好ましい実施態様では、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子による処置の開始時に、又は、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子により処置後に、照射が適用され、又は、ＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤が投与される。例えば、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子による処置の開始後３〜２４時間で、照射が適用され、又は、ＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤が投与される。ＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤及びコンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、同時にも投与することができる。

放射線療法又はＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤による処置が開始されると、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子による処置は、放射線療法又はＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤による処置が適用され又は投与される限りにおいて継続させることができる。代替的に、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子による処置を終了させることもできる。

コンジュゲートＤｂａｉｔ分子について、本発明の組み合わせ製剤、キット又は製品に利用されるＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤の有効用量は、投与モード、処置される症状、処置される症状の重症度に応じて変動させることができる。このため、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子の投与計画は、各種の要因に従って選択される。同要因は、投与経路及び患者の状態を含む。通常の技能を有する内科医、臨床医又は獣医であれば、特に、選択されたＤＮＡ傷害処置との特定の組み合わせにおいて、ガンを予防し、同ガンに対向し、又は、同ガンの進行を停止させるのに必要とされるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子の有効量を容易に判断し、処方することができる。

当業者であれば、特に、毎日処置プロトコール又は毎週処置プロトコールにおいて、腫瘍１cm³当たりに少なくとも０．０１mg、好ましくは、腫瘍１cm³当たりに０．１〜４０mg、最も好ましくは、腫瘍１cm³当たりに１〜２０mgの、腫瘍中の有効量のコンジュゲートＤｂａｉｔ分子を得るための量に適合させることができる。例えば、静脈内又は腹腔内経路について、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子の有効量又は単位用量は、０．１〜１００mg、好ましくは、４〜４０mgであることができる。したがって、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子の有効量又は単位用量は、０．０６〜０．６mg/kg 患者であることができる。当然、用量及び計画は、当業者であれば、化学療法及び／又は放射線療法計画を考慮して適合させることができる。

放射線療法について、当技術分野において公知の任意の放射線療法計画、特に、定位照射（例えば、１５Gy）又は分割照射を使用することができる。分割照射の使用が、特に効率的であることができ、例えば、照射は、毎日又は２〜５日毎、好ましくは、３〜４日毎に、１、２、３、４、５又は６週の期間適用することができる。照射は、１〜１０Gy、好ましくは、２〜５Gy、特に、２、３、４又は５Gyであることができる。例えば、６週間における１５×２Gy又は２週間における４〜６×５Gyの分割照射を企図することができる。好ましい実施態様では、企図される放射線療法は、２週間での５Gyの４回の照射によるプロトコールである。照射及びＤｂａｉｔ分子によるガンの組み合わせ処置における異なる計画又は条件が試験され、Ｄｂａｉｔ分子による腫瘍の放射線感受性がＤｂａｉｔ分子の用量に依存するが、照射線量には依存しないことを証明することができた。

化学療法について、本発明の組み合わせ製剤、キット又は製品又は本発明の組成物との組み合わせで利用されるＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤の有効用量は、利用される特定のＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤、投与モード、処置される症状、処置される症状の重症度に応じて変更することができる。このため、ＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤の投与計画は、投与経路及び患者の状態を含む各種の要因に従って選択される。通常の技能を有する内科医、臨床医又は獣医であれば、ガンを予防し、同ガンに対向し、又は、同ガンの進行を停止させるのに必要とされるＤＮＡ−傷害性抗腫瘍剤の有効量を容易に判断し、処方することができる。

処置は、１回又は複数回のサイクル、例えば、２〜１０回のサイクル、特に、２、３、４又は５回のサイクルを含むことができる。該サイクルは、連続させ又は分離することができる。例えば、各サイクルは、１〜８週、好ましくは、３〜４週の期間により分離される。

本発明の更なる態様及び利点は、下記実験セクションに開示されるであろう、同実験セクションは、例証であり、本願の範囲を限定しないとみなされるべきである。数多くの参考文献が、本明細書において引用されており、これらの引用文献はそれぞれ、参照により本明細書に組み入れられる。

ＤＴ０１により、ＣＲＣ（ＨＴ２９）肝臓転移モデルにおいてＣＴに対する感受性が有意に向上する。肝臓内腫瘍を有するＮＭＲＩ^{ＮＵ／ＮＵ}マウスを材料及び方法に記載されたように処置し、処置後２２日で殺処分した。肝臓を肉眼観察検査及び顕微観察検査用に採取した。（Ａ）ＤＴ０１及びＣＴ治療の配列。ＣＴをＤＴ０１処置後２又は４時間で行った。（Ｂ）各処置群における平均肝臓腫瘍体積（mm³）。（Ｃ）各群における肝臓腫瘍の代表的な肉眼観察及びＨＥＳ切片。（Ｄ）腫瘍壊死成分をＨＥＳ染色により評価した。分析された組織切片の総腫瘍表面の割合（％）として壊死を表現する。（Ｅ〜Ｆ）免疫組織化学。生きている腫瘍成分の増殖及び平均微小血管密度をＫｉ６７（Ｄ）及びＣＤ３１（Ｅ）染色それぞれにより決定した。結果を平均±ＳＥＭとして表現する。 ＤＴ０１とＣＴとの関連付けにより、腹膜腫瘍体積が有意に減少する。肝臓内腫瘍を有するＮＭＲＩ^{ＮＵ／ＮＵ}マウスを図４に記載されたように処置し、処置後２２日で殺処分した。腹膜転移の存在を処置の期間中に視覚的にモニタリングし、殺処分時に測定した。（Ａ）各処置群における平均腹膜腫瘍体積（mm³）。（Ｂ）各群における腹膜腫瘍の代表的な肉眼観察画像。結果を平均±ＳＥＭとして表現する。 ２つのＴＮＢＣ異種移植モデルにおける全身投与と局所投与との比較。脂肪パッドにＴＮＢＣ細胞系統を移植されたＮＭＲＩ^{ＮＵ／ＮＵ}マウスをＤｂａｉｔのＳＣ又はＩＰ注射により、１回のサイクル（左パネル）又は、処置を行わない２週間でそれぞれを分離した３回のサイクル（右パネル）について５連続日の間に処置した。各Ｄｂａｉｔ注射の用量を凡例に示す。データは、処置開始後の種々の時点での平均相対腫瘍体積（Ｖｔ／Ｖｉ）を表わす。 カルボプラチンとのＤＴ０１の関連付けにより、ＴＮＢＣモデルにおける腫瘍成長が有意に低下する。処置群当たりの中央腫瘍体積（ＤＴ０１処置群及びＤＴ０１＋カルボプラチン群におけるエラーバーは、平均の標準誤差ＳＥＭを示す）。 カルボプラチンとのＤＴ０１の関連付けにより、ＴＮＢＣモデルにおける生存が有意に向上する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１モデルにおける動物生存のカプラン−マイヤー表現。 図４及び５における処置スキーム。

実施例１：直腸結腸肝臓転移の化学療法感受性のための新規な治療戦略としてのＤＴ０１
直腸結腸ガン（ＣＲＣ）からの転移性肝臓疾患は、著しい臨床的問題である。これは、主に、多くの場合、利用可能な化学療法に対する低い感受性を表わし、一部のＤＮＡ修復機能の過剰活性化により部分的に薬剤抵抗性に発展する切除不可能な転移が原因である。組み合わせ治療により、幾らかの疾患抑制が示されたが、ＣＲＣ肝臓転移の根絶を達成するためのより効率的な化学療法についての必要性が未だに存在する。

本発明者らは、従来の化学療法との関連付けにおけるＤｂａｉｔの許容範囲及び有効性を調査した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、Ｄｂａｉｔ処置により、ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６ ＣＲＣ細胞系統の感受性が向上する。Ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｄｂａｉｔのコレステロールコンジュゲート臨床形態であるＤＴ０１の薬物動態、生体分布及び有効性を評価した。ＣＲＣ肝臓転移用のモデルとして使用した肝臓内ＨＴ２９異種移植マウスにおいて、ＤＴ０１の化学療法感受性能をオキサリプラチン及び５−フルオロウラシルとの関連付けにおいて評価した。ＤＴ０１の高い取込みから、肝臓が特異的なターゲットであることが示される。本発明者らは、オキサリプラチン及び５−フルオロウラシルとの組み合わせにおけるＤＴ０１処置による、化学療法単独と比較した肝臓転移モデルにおける有意な抗腫瘍効果を証明した（平均：５０１ ｖｓ ８７２mm²、ｐ＝０．０２）。腫瘍体積の減少は、壊死、増殖、血管新生及びアポトーシスにおける顕著な組織学的変化と更に関連付けられる。ＤＴ０１の繰返しサイクルにより、化学療法の毒性は増大しない。ＤＴ０１を従来の化学療法と組み合わせることは、転移性肝臓ガンの処置における安全で効果的な治療戦略であると、証明することができる。

この研究の目的は、第一に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＤＴ０１の有効性を証明し、第二に、肝臓におけるＤＴ０１の薬物動態及び分布を評価し、第三に、ＣＲＣ転移性肝臓腫瘍モデルにおける従来の化学療法（オキサリプラチン及び５’−フルオロウラシル）との組み合わせにおけるＤＴ０１の全身投与の併用効果を証明することであった。

結果
Ｄｂａｉｔ処置により、結腸ガン細胞系統の化学療法に対する感受性が向上する
本発明者らは、ＤｂａｉｔがＤＮＡ−ＰＫキナーゼを活性化することにより作用することを以前に示した。同ＤＮＡ−ＰＫキナーゼは、ヒストン変異Ｈ２ＡＸを含む数多くのターゲットをリン酸化する。本発明者らは、まず、２つのＣＲＣ細胞系統（ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９）におけるＤｂａｉｔの活性を、Ｈ２ＡＸのパン−核リン酸化をモニタリングすることにより確認した。

まず、化学療法に対する細胞生存におけるＤｂａｉｔの効果を調査するために、本発明者らは、Ｄｂａｉｔ又はオキサリプラチン（ＯＸＡ）及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）又はＤｂａｉｔと化学療法（ＣＴ）との組み合わせによる処置後の種々の時点において、生きている細胞数を測定した（図１Ｂ）。線維芽細胞において既に観察されたように（Quanz, 2009, PloS one, 4, e6298）、Ｄｂａｉｔ単独では、両細胞系統における細胞増殖に影響を有さないようである。ＯＸＡ及び５−ＦＵによる処置により、細胞増殖の減少がもたらされた。一方、増殖レベルが、ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９の両細胞系統において、化学療法処置前にＤｂａｉｔによりトランスフェクションされた細胞では、化学療法単独と比較して９日目までに有意に低下した（それぞれｐ＜０．００１及びｐ＜０．０２）。これらの差異は、より遅い時点（処置後５日以降）において特に明らかとなる。このことは、Ｄｂａｉｔによる有効性の向上は、ゆっくり進行する場合があることを示す。

ＯＸＡ及び５−ＦＵとの組み合わせにおけるＤｂａｉｔの化学療法感受性効果を確認するために、クローン原性生存アッセイをＨＣＴ１１６及びＨＴ２９に行った。ＨＣＴ１１６細胞は、Ｄｂａｉｔ単独処置後に約３０％（ｐ＜０．０１）の死亡率を示した。このことは、生存のための修復活性におけるその依存性を証明している。一方、有意な効果は、ＨＴ２９において示されなかった。Ｄｂａｉｔに対するＨＣＴ１１６の感受性は増殖の最初の８日間では検出されなかったため、この結果から、Ｄｂａｉｔを含んで増殖する細胞は、その生存を後になって損なう致死性病変を蓄積することが示唆される。化学療法単独（ＯＸＡ／５−ＦＵ）による処置により、ＨＣＴ１１６の生存における有意な減少がもたらされ（ｐ＜０．００１）、一方で、ＨＴ２９細胞系統では、傾向のみが観察された（ｐ＝０．０８）。一方、Ｄｂａｉｔと化学療法との組み合わせにより、両細胞系統における生存の有意な減少がもたらされた（ｐ＝０．０５）。ＨＣＴ１１６とＨＴ２９とは、それらのＰ５３ステータス（ＨＣＴ１１６は能力があり、一方、ＨＴ２９は変化している）を含む多くのパラメータにより異なる。この例では、Ｄｂａｉｔの単独処置に対するそれらの感受性における幾らかの差異に関わらず、両細胞系統は、ＣＴとＤｂａｉｔとの組み合わせに対して、等しく感受性であった。

ＤＴ０１の腹腔内ｖｓ静脈内投与の薬物動態及び生体分布分析
トランスフェクタントアジュバント毒性を避けるために、全てのｉｎ ｖｉｖｏ研究をＤＴ０１により行った。Ｄｂａｉｔ−コレステロールコンジュゲートは、更なる毒性なしに、これらの分子の細胞取込みを促進する。ＤＴ０１マウスの全身投与に最良な経路を決定するために、マウスを用量５mg ＤＴ０１の１回の腹腔内（ＩＰ）又は静脈内（ＩＶ）投与のいずれかにより処置した。ＩＰ投与により、５７８μg/mlのＣ_ｍａｘ、１時間のＴ_ｍａｘ及び７９９のＡＵＣ_０−６がもたらされ、一方、ＩＶにより、１，９１７μg/mlのＣ_ｍａｘ、０．０８時間のＴ_ｍａｘ及び７９９のＡＵＣ_０−６がもたらされた。薬物動態分析から、ＩＰ注射により、ＤＴ０１の血漿暴露がＩＶ投与によるＡＵＣの約７０％に対応するＡＵＣを有するＩＶボーラス注入の血漿暴露より長かったことが証明された。

本発明者らは、蛍光ラベルされたｃｙ５−ＤＴ０１分子を使用して、切除された臓器全体における生体分布をモニタリングした。ｃｙ５−ＤＴ０１及びＤＴ０１は両方とも、薬物動態及びＤＮＡ−ＰＫ活性化に関して類似する特性を有する。ＤＴ０１の最大蛍光が、両経路による肝臓、腸及び腎臓において観察された。ここで、最大強度が、ＩＰ投与後の肝臓及び腸において観察された。マウスにおいて観察された腎臓及び尿により発せられた高い蛍光から、ＤＴ０１は、腎臓により優先的に排出されることが示唆される。血中には測定可能なＤＴ０１が、注射後６時間では存在しなかったが、相当な量のＤＴ０１が、未だに肝臓において検出可能であった。このことは、この臓器における特異的な保持を示している。

ｉｎ ｖｉｔｒｏで既に証明されたように、組織におけるＤＮＡ−ＰＫのＤＴ０１活性化は、ヒストンＨ２ＡＸのリン酸化により証明することができる。本発明者らは、ＨＴ２９移植腫瘍を有する肝臓におけるＨ２ＡＸリン酸化の分布を分析することにより、ＤＴ０１活性をモニタリングした。興味深いことに、高レベルのγ−Ｈ２ＡＸが、腫瘍において特異的に観察されたが、周囲の正常な組織では観察されなかった。このことは、肝臓の腫瘍細胞におけるＤＴ０１分子の優先的な取込み又は活性を示している。

ＤＴ０１により、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＯＸＡ及び５−ＦＵに対する感受性が有意に向上する
ＤＴ０１を転移性ＣＲＣのための第一線の処置と関連付ける関心を調査するために、本発明者らは、ＨＴ２９異種移植肝臓腫瘍モデルを使用した。以前の報告及びｉｎ ｖｉｔｒｏデータから、この系統が、主にＶ６００Ｅ ＢＲＡＦ変異により、非常に化学療法抵抗性であることが証明されているためである。この動物を、生体分布データに基づく２つの異なるスケジュールを使用して、患者に対する伝統的なＦＯＬＦＯＸプロトコールに近い処置である、ＯＸＡ及び５−ＦＵにより処置した（図１Ａ）。２つのスケジュールは、２回の処置間の２又は４時間の間隔のいずれかからなる。肝臓において最大レベルのＤＴ０１が、処置後１時間及び３時間で観察された。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて以前観察されたように、腫瘍は、ＣＴ単独に対して非常に抵抗性であり、ＤＴ０１は、単独で投与された場合には、中程度の効果のみを有した（図１Ｂ、１Ｃ）。興味深いことに、ＯＸＡ及び５−ＦＵに対するＤＴ０１の関連付けにより、肝臓腫瘍サイズが、両方の組み合わせ処置群において、ＣＴ単独と比較して、ＣＴ前の２時間（平均体積：５２５．８０ ｖｓ ８７２．０１mm³、ｐ＝０．０３）及び４時間（平均体積：５０１．０５ ｖｓ ８７２．０１mm³、ｐ＝０．０２）で投与された場合、有意に減少した（図１Ｂ、１Ｃ）。この効果は、ＤＴ０１を１つの化学療法剤であるＯＸＡ又は５−ＦＵのいずれかと関連付けた場合には観察されなかった。生きている腫瘍面積、壊死及びアポトーシスの測定を含む詳細な盲検組織学分析をヘマトキシリン−エオシン−サフラン（ＨＥＳ）染色切片において、熟練の病理医により評価した。ＤＴ０１とＣＴとの組み合わせ処置による両群は、１つの処置を受けた群より高い処置の有効性を示した。ＣＴとＤＴ０１との間を２時間間隔で処置した群（ｐ＜０．０１）より、４時間間隔で処置した群（ｐ＜０．０００１）における壊死が、ＣＴ単独と比較して顕著に増大した（図１Ｄ）。更に、高いアポトーシスインデックスが、ＤＴ０１及びＣＴにより処置された両群において明らかとなった。他の組織学パラメータと同様に、アポトーシスの度合いは、４時間遅らせて処置された動物において上昇した（ｐ＜０．０００１）。これらの組織学的知見は、ＤＴ０１又は化学療法単独での処置群では見られなかった。

多くの固体腫瘍について、増殖及び微小血管形成は、腫瘍進行及び転移に必須である。これらのパラメータを更に調査するために、それぞれ細胞増殖及び血管新生のマーカーであるＫｉ６７及びＣＤ３１についての免疫染色を生きている腫瘍成分において行った（図１Ｅ、１Ｆ）。Ｋｉ６７免疫応答性から、ＤＴ０１又は化学療法単独のいずれかで処置された腫瘍は、高度の増殖により密に詰まっていたことが示された。ＤＴ０１とＣＴとの間の２時間間隔での処置により、細胞増殖における中程度の減少がもたらされた（ｐ＝０．０２）（図１Ｅ）。きわだって、Ｋｉ６７の免疫応答性は、ＤＴ０１とＣＴとの間を４時間間隔で処置された群において１０倍低下した（ｐ＜０．００１）（図１Ｅ）。この群では、免疫反応性が、腫瘍の中心コア領域で観察された高度の壊死のために、腫瘍の縁においてのみ検出された。加えて、それにも関わらず、腫瘍内血管の減少が、ＤＴ０１及びＣＴの組み合わせで処置された群において、ＣＴ単独と比較して検出された（図１Ｆ）。一方、平均微小血管密度も、２時間間隔（ｐ＝０．０２）と比較して、４時間間隔（ｐ＜０．００１）で処置された群において、より顕著に低下した。２時間及び４時間処置スケジュールの両方での腫瘍成長における抗腫瘍効果の類似性にも関わらず、組織学的には、有効性は、壊死、アポトーシス、増殖及び血管新生に関して、４時間間隔において、有意により顕著であった。

予期しなかったことに、ＤＴ０１とＣＴとの間の４時間の遅延により処置され、処置後２２日で採取された腫瘍は、一定割合の腫瘍内で溶解された肝細胞及び隣接する非悪性肝臓における僅かな浮腫を有するのを、毒性の更なる臨床的サイン、例えば、体重減少を伴わずに表わした。組織学的分析から、他の群における毒性の形態学的サインは明らかとならなかった（図１）。加えて、肝臓酵素試験から、対照群と組み合わせ処置群との間での有意差は明らかとならなかった。

興味深いことに、同じ処置を受けた動物を３０〜６５日の間で殺処分した際に、更なる浮腫は観察されなかった。このことは、２２日目に観察された浮腫が経時的に可逆性であることを示唆している。有意な腫瘍効果が処置後２２日で観察されたにも関わらず、この時点後にモニタリングされた腫瘍は、進行を再開した。組織学的分析から、増殖性成分は、処置後３０〜４５日において、約５０％に達し、非処置腫瘍において観察されたレベルをわずかに下回ったのみであった。

組み合わせ処置が肝臓に対する更なる毒性を誘引しないことを確認するために、本発明者らは、ＯＸＡ又は５−ＦＵに関連付けられたＤＴ０１の許容範囲を、延長した処置サイクルについて分析した。本発明者らは、５０匹のマウスのコホートにおけるＯＸＡ又は５−ＦＵに関連付けられた２回のサイクル（処置サイクル当たりに５×ＤＴ０１の投与）についての全身投与後に、上昇する用量のＤＴ０１（総用量３０、５０又は８０mg）の毒性を決定した。体重減少は、処置中又は同処置後の動物において観察されなかった。同様に、毒性の他の臨床的サイン、例えば、下痢又は挙動変化は、これらのマウスにおいて示されなかった。２回目のサイクルの処置後６週間での検死解剖において、全ての腹部臓器、胸腔及び内容物は正常に見えた。肝臓の重量又は組織学の大きな変化は、媒体群と組み合わせ処置群との間で観察されなかった。

これらの結果から、肝臓腫瘍を有する動物において組み合わせ処置後に検出された可逆性の浮腫は、おそらく、効率的な組み合わせ処置に対した腫瘍応答に対する急性反応であろう。

腹膜転移処置
ＣＲＣは、多くの場合、肝臓及び腹膜に転移する。興味深いことに、ＣＲＣ腫瘍を肝臓内に異種移植したマウスの９０％が、腹膜転移に進行した。この特性により、本発明者らは、ＤＴ０１の効果を、肝臓腫瘍だけでなく、腹膜転移をもモニタリングすることが可能となった。ＤＴ０１と化学療法との組み合わせを受けた動物は、化学療法単独と比較した場合、２時間間隔（平均体積：３００．３１ ｖｓ ８６７．２０mm³、それぞれｐ＜０．０１）及び４時間間隔（平均体積：２５９．５１ ｖｓ ８６７．２０mm³、それぞれｐ＜０．０１）の両方において、有意に減少した腹膜腫瘍体積を示した（図２Ａ、２Ｂ）。腫瘍体積のわずかな減少がＤＴ０１単独により処置された群において観察されたが、これは、統計学的な有意差に達さなかった。

議論
ＣＲＣを有する患者の約５０％が、肝臓及び／又は腹膜転移のいずれかを表し、又は、一連のそれらの疾患に進行するであろう。ＣＲＣ肝臓転移を有する患者の大部分は、切除不能な疾患を表わし、全身性の化学療法が、唯一の治療形態でないにしても、主なものを表わす。しかしながら、化学療法の治療ウインドウは、腫瘍の抵抗性及び非ターゲット組織に対する高い毒性により限られる。このような臨床的状況において、侵襲性の化学療法計画単独では、生存を改善できないおそれがあるだけでなく、クオリティ・オブ・ライフに有害に影響を及ぼすおそれもある。その結果として、これらの患者の死亡率は高いままである。したがって、化学療法抵抗性を包囲し、正常な組織には控えるように、ＤＮＡ修復を特異的にターゲットする新たな作用剤の開発が、これらのガンの処置に必須である。ＤＴ０１は、ＤＮＡ修復におけるその中心的役割に基づいて、魅力的な薬剤候補である。

本研究において、本発明者らは、全身性ＤＴ０１処置により、ＣＲＣ細胞が従来の化学療法に対して増感することを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイにより初めて示した。ＣＲＣ転移性モデルにおいて、本発明者らは、ＯＸＡ及び５−ＦＵとの組み合わせにおけるＤＴ０１処置による（末期症状とみなされた）肝臓及び腹膜における有意な抗腫瘍効果を証明した。有意な抗腫瘍効果が、１つの作用剤による化学療法ではなく、ＯＸＡ及び５−ＦＵの両方に関連付けられたＤＴ０１に限られたことが興味深い。これにより、従来の臨床環境と一致して、ＤＴ０１との組み合わせは、ＣＲＣ転移の処置において、１つの作用剤による化学療法ではなく、二重の化学療法に関連付けられる必要があることが証明される。この研究では、ＤＴ０１と組み合わせられた二重の化学療法を受けた腫瘍が、増殖を再開し、後の時点（２２日より後）で再成長したことが更に強調されている。したがって、処置の繰返しサイクルが、現在の従来の化学療法プロトコールと同様に、長期の疾患抑制を達成するのに必要であろう。これは、ＤＴ０１単独又はＯＸＡもしくは５−ＦＵとの組み合わせにおいて、追加的な毒性が観察されなかったため可能であろう。

ＤＴ０１は、優先的に、全身注射後に肝臓及び腸に蓄積する。Ｃｙ５−ＤＴ０１注射後に肝臓全体が均一に蛍光を示したが、Ｈ２ＡＸのリン酸化により証明されたＤＮＡ−ＰＫの活性化は、専ら腫瘍細胞において観察され、この腫瘍の周囲の正常な組成では観察されなかった。この観察から、ＤＴ０１は非腫瘍細胞には入らない、及び／又は、ＤＴ０１は正常な肝臓組織では活性ではないことのいずれかが示される。第一にバイオアベイラビリティを向上させ、第二にガン細胞と正常細胞との間での基質取込みにおける差異を果たすために、ＤＴ０１を、コレステロールコンジュゲートにより特別に設計した。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は、コレステロール経路の主な成分である。悪性細胞によるＬＤＬの高い要求、及びこのため、その結果としてのＬＤＬレセプターの過剰発現が、ＤＴ０１の腫瘍細胞特異的ターゲットを生成する多くの種類のガン細胞において示された。加えて、免疫組織化学による正常なヒト組織及びガン性のヒト組織の広範な分析から、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ又はＫｕ８０のいずれかが、肝臓及び乳房の上皮において一致して存在しなかったこと、特異的な転写後レギュレーションが他の組織及びほとんどの腫瘍で見出されなかったことが証明された。まとめると、これらのデータから、ＤＴ０１がおそらく肝臓ガンの処置に効率的な薬剤であろうことが強調される。

まとめると、乏しい予後及び驚くべき死亡率を有する急速な侵襲性疾患である二次肝臓悪性腫瘍をターゲットにする新たな処置選択肢の喫緊の必要性が存在する。本研究により、ＤＴ０１の全身投与を従来の化学療法と組み合わせることは、肝臓及び腹膜のＣＲＣ転移の処置における安全で効果的な治療戦略であることができることが証明された。

材料及び方法
細胞培養、構築物、Ｄｂａｉｔ分子、免疫蛍光及びウェスタンブロット
ＣＲＣ細胞系統；ＨＴ２９（変異型ｐ５３、ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−３８）及びＨＣＴ１１６（野生型ｐ５３、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２４７）をＡＴＣＣから直接購入した。これらの細胞は、Promega PowerPlex（登録商標）システムを使用して、複数のＳＴＲ遺伝子座及び（性別判定のための）アメロゲニンを同時に増幅させることにより、ヒトショートタンデムリピートプロファイルを生成することによって、ＡＴＣＣにより認証された。これらの細胞を、本研究を行った際に、購入日から６ヶ月未満で研究室において、１０％ ウシ胎児血清、１％ ピルビン酸ナトリウム、１００mg/ml ストレプトマイシン及び１００mg/ml ペニシリンを添加したＤＭＥＭ培地（Invitrogen, Carlsbad CA）中で培養した。ルシフェラーゼを安定して発現しているＨＴ２９細胞系統は、ｐＧＬ４．５ルシフェラーゼレポーターベクター（ｌｕｃ２／ＣＭＶ／Ｈｙｇｒｏ）（Promega）を使用して社内で確立された。ＨＴ２９ルシフェラーゼ細胞に、２００μg/ml ヒグロマイシンＢを添加した。全ての細胞系統をマイコプラズマ検査に社内で更に供し、マイコプラズマ汚染を含まなかった（Biovalley, France）。

細胞を２．５μg Ｄｂａｉｔ（5’-GCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA-(H) TCTAGGCTTGTTTGCTGGGTTGTGGGCACAGC-3’ 配列番号：９）（Eurogentec, Belgium）によりトランスフェクションした。同配列中、Ｈは、ヘキサエチレングリコールリンカーであり、下線を引いたヌクレオチドは、ホスホロチオアートである。細胞を以前に記載された（Quantz et al, 2009, PloS one, 4, e6298）、１１kDa ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と複合体化させた８bp オリゴヌクレオチド対照（８Ｈ）によりシャムトランスフェクションした。

γＨ２ＡＸ免疫蛍光を以前に記載されたようにモノクローナル抗ホスホヒストンＨ２Ａ．Ｘ（Ｓｅｒ１３９）抗体クローンＪＢＷ３０１（１：５００希釈；０５−６３６、Millipore, USA）（９）を使用して行った。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖アッセイ
細胞を３×１０^４個／６０mm ディッシュの密度で播種し、Ｄｂａｉｔによりトランスフェクションした。処置後に、細胞を洗浄し、処置せず又は５μM オキサリプラチン（ＯＸＡ、Sigma）及び２．５μM ５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、Sigma）の組み合わせにより処置し、生きている細胞のカウントを１、３、５、６、７及び９日目に行った。

クローン原性アッセイ
細胞をＤｂａｉｔによりトランスフェクションし、処置しないまま又は５μM ＯＸＡ及び２．５μM ５−ＦＵにより１時間処置した。細胞を希釈し、１４日間増殖させ、クローンをクリスタルバイオレットにより染色し、カウントした。

Ｉｎ ｖｉｖｏ実験
本研究をEuropean Union guidelines for animal careに準拠して厳密に行った。全ての動物実験は、Institut Curie and the French ministryの倫理委員会の承認を受けた。外科手術は、苦痛を最少化するために、局所無痛による麻酔下で行った。

動物
体重２０〜２２ｇの、６週齢のメスのＮＭＲＩ^{ＮＵ／ＮＵ}マウス（Janvier, France）を特定の病原体を含まない環境に１２時間明及び１２時間暗スケジュールで収容し、食餌及び水を自由に与えた。６匹以上の動物をケージには収容せず、ｉｎ ｖｉｖｏ研究を開始する前に少なくとも１週間慣れさせた。

肝臓内ＨＴ２９Ｌ移植
ＨＴ２９ルシフェラーゼ（ＨＴ２９Ｌ）細胞を、左葉の上側表面上に細胞懸濁液（１×１０^６個／１０μL ＰＢＳ）の直接注入により移植した。腫瘍成長を生体発光分析（IVIS, Caliper sciences）によりモニタリングした。

ＤＴ０１分子
ｉｎ ｖｉｖｏ研究のために、ＤＴ０１（５’端に包含させたコレステロールテトラエチレングリコールを有するＤｂａｉｔ）を使用した（Agilent technologies, Boulder, CO）。

ＤＴ０１の薬物動態
ＨＴ２９Ｌ移植マウスを５mg ＤＴ０１の１回の腹腔内（ＩＰ、ｎ＝４）又は静脈内（ＩＶ、ｎ＝３）注射により処置した。血液サンプルを処置前並びに処置後１、５、１０、３０分、１時間、２時間、４時間及び６時間で収集した。血漿を遠心分離により回収し、ＥＬＩＳＡによりアッセイした。

臓器の蛍光測定
ＥＬＩＳＡ技術による組織における信頼性のある定量を生成することができなかったため、本発明者らは、分子分布を評価するのに信頼性のある技術である蛍光撮像を使用した（１５）。ＮＭＲＩ^{ＮＵ／ＮＵ}マウスに、１mg ＤＴ０１蛍光分子（ＤＴ０１−Ｃｙ５）を、ＩＰ（ｎ＝３）又はＩＶ（ｎ＝３）投与により注射した。蛍光ＤＴ０１（ＤＴ０１−Ｃｙ５）は、シアニン５をリンカーの直後に位置するチミジンにおいて包含している。注射の６時間後、蛍光撮像を、Typhoonスキャナ（GE Helathcare）を使用して行った。

ＤＴ０１及び化学療法処置
ＨＴ２９Ｌ移植動物（ｎ＝４９）を処置群に割り当て、１回のサイクルの処置を投与した。ＤＴ０１をＩＰ注射により、０日目（Ｄ０）から開始する５mg/日の用量で５連続日間、全身に投与した。ＯＸＡ（６mg/kg、サイクル当たりに１回、１日目）及び５−ＦＵ（２５mg/kg、サイクル当たりに３回、１〜３日目）をＤＴ０１処置後２又は４時間で投与した。これらのマウスを処置後２２日で殺処分した。

ＤＴ０１及びＯＸＡ／５−ＦＵにより４時間間隔で処置された更なる群（ｎ＝１０）を処置後、終了ガイドラインが一致するまで維持して、処置の有効性の持続を評価した。

肝機能評価
処置後０日目、４日目及び１８日目において、血液サンプルを顎下出血によりリチウムヘパリン管（Sarstedt）に得た。血漿アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、アミラーゼ（ＡＭＹＬ）及び総ビリルビン（ＴＢＩＬ）を、MS-Scan II（Melet Schloesing Laboratories, France）を使用して測定した。

毒性アッセイ
ＮＭＲＩ^{ＮＵ／ＮＵ}マウス（ｎ＝５０）を２回のサイクルのＤＴ０１により、ＩＰ注射による３mg/日（合計３０mg）、５mg/日（合計５０mg）又は８mg/日（合計８０mg）の増加する用量で、ＯＸＡ又は５’−ＦＵとの組み合わせにおいて処置した。ＯＸＡ及び５’−ＦＵを全身ＩＰ注射により、それぞれ１×６mg/kg又は３×２５mg/kgの用量でＤＴ０１処置後４時間に投与した。動物を任意の有害作用について定期的に観察した。

組織学
ヘマトキシリン、エオシン及びサフラン（ＨＥＳ）染色腫瘍切片を熟練の病理医（Dr. Huerre, Institut Curie）により盲検様式で評価した。生きている成分及び壊死性成分（大きくなった細胞サイズ、区別できない細胞境界、好酸球性細胞質、核の喪失もしくは濃縮又は関連する炎症を示す）を総腫瘍表面の割合（％）として表現した。アポトーシスを代表的な非壊死視野から高倍率において推測した（弱 ＜５％、中程度 ５〜１０％、顕著 １０〜２０％及び非常に顕著 ２０〜５０％）。

デジタル化及び画像キャプチャを、全スライドスキャンシステム（Philips digital pathology solutions）を使用して行った。

Ｋｉ６７及びＣＤ３１により免疫組織化学
免疫組織化学を、ウサギ抗Ｋｉ６７（ａｂ２８３６４、１／５００；Abcam, UK）及びウサギ抗ＣＤ３１（ａｂ１５５８０、１／５００；Abcam, UK）抗体を使用して行った。これに続けて、二次ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＢＡ−１０００；Vector, USA）及びウサギ特異的ＨＲＰ／ＤＡＢ（ABC）検出キットを使用して明らかにした。画像を、蛍光顕微鏡（Eclipse 90i, Nikon）を使用してキャプチャした。平均Ｋｉ６７インデックスを、切片当たりに５つのランダムに選択した顕微観察視野において、Ｋｉ６７＋ｖｅと−ｖｅ細胞との間の比を確立することによりスコアした。平均微小血管密度をＣＤ３１染色により決定した。ＣＤ３１陽性血管を切片当たりに５つのランダムに選択した顕微観察視野においてカウントした。

統計学的分析
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を最低でも２回の独立した実験により行った。対応のない両側ｔ検定を細胞の死亡及び生存の比較に使用した。クラスカル・ウォリス検定を、腫瘍体積及び組織学データを比較するのに使用した。エラーバーは、特別に示された場合を除いて、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。全ての統計学的分析を、StatELソフトウェア（adScience, France）を使用して行い、≦０．０５のＰ値を、統計学的に有意であると考えた。

実施例２：トリプルネガティブ乳ガン（ＴＮＢＣ）のモデルにおけるＤＴ０１及びカルボプラチンとの共処置における増強効果
ＴＮＢＣモデルにおけるＤＴ０１単独での効果
本研究の目的は、乳ガンモデル、特に、トリプルネガティブ乳ガンモデルにおけるＤＴ０１単独での全身効果を証明することであった。動物モデルは、移植後４５日のマウスである。マウスの乳房脂肪パッドに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を皮下移植した。

以前の実験において、本発明者らは、ＤＴ０１により腫瘍成長を、全ての試験したトリプルネガティブ乳ガンモデル（ＢＣ２２７、ＢＣ１７３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系統を移植されたマウス）において、局所投与により効果的に抑制できたことを証明した。

図３に示されたように、本発明者らは、２つのＴＮＢＣ異種移植モデルにおいて、腹腔内投与と局所投与（腫瘍内及び腫瘍周囲の皮下）とを比較した。本発明者らは、驚くべきことに、局所投与と同様の有効性のために、３〜５倍以上のＤＴ０１が必要であることを観察した。

投与経路を、ヒトにおける静脈内かん流投与をマウスにおいて模倣する腹腔内投与とした。ＤＴ０１の用量レベルを５mg/動物/日とした。ＤＴ０１の腹腔内投与を、各サイクル間で１週間処置を行わない５連続日の３回のセッションで行った。１３匹のマウスを含ませた。そのうちの７匹にＤＴ０１を受けさせた。対照群には、０．９％ ＮａＣｌの媒体単独を受けさせた。

毒性は観察されなかった。ＤＴ０１の腹腔内投与は十分許容された。

ＤＴ０１処置により、処置群より顕著に良好な腫瘍成長抑制及び動物生存が示された。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ乳ガンモデルを選択した。同モデルは、以前の実験において、腫瘍内及び腫瘍周辺皮下投与を使用したＤＴ０１処置に対して最も抵抗性であったためである。

この実験から、ＤＴ０１の単独投与により、乳ガン腫瘍における腫瘍成長が遅延したことが確認される。

ＴＮＢＣモデルにおけるＤＴ０１とカルボプラチンとの組み合わせの効果
図６に示されたように、各処置サイクルに、５mg/動物/日の用量レベルでの５日連続のＤＴ０１による投与を含ませた。処置を単独又はカルボプラチンとの関連付けのいずれかにおいて、サイクル間に２週間の間隔を空けて３回のサイクルで投与した。１つの用量のカルボプラチンのみをＤＴ０１処置サイクル当たりに注射した（各サイクルの２日目）。カルボプラチンの用量をサイクル当たりに５０mg/kg とした。処置を７週にわたって行った（３サイクルの処置）。

実験中に、毒性は観察されない。毒性のサイン、例えば、体重減少は、ＤＴ０１処置群において見られなかった。ＤＴ０１＋カルボプラチン処置群における体重減少又は毒性の増大は、カルボプラチン群と比較して観察されなかった。

１７７日の実験の間に、カルボプラチン単独処置群における１匹を除いて、異常な死は起きなかった。

ＤＴ０１の腹腔内投与は十分許容される。

抗腫瘍活性を、処置中及び同処置後に腫瘍体積を測定することにより評価した。５日処置の３回のセッション（各セッション間に２週間の休薬を伴う）間に、ＤＴ０１を腹腔内に投与した。カルボプラチンを各ＤＴ０１処置サイクルの２日目において、１週間に１回投与した。

ＤＴ０１＋カルボプラチンの組み合わせ処置により、ＤＴ０１単独処置と比較して、より良好な腫瘍成長抑制が示された（図４）。曲線は、各群における最初の死亡の日数において中断されている。加えて、ＤＴ０１＋カルボプラチンの組み合わせは、生存も向上させる。

この研究において、カルボプラチンとのＤＴ０１の組み合わせ処置は効率的であり、単独の処置より良好な腫瘍成長の遅延をもたらす。

材料及び方法
ＤＴ０１分子
コレステロール テトラエチレングリコール包含型のＤｂａｉｔであるＤＴ０１を、自動固相オリゴヌクレオチド合成（Agilent technologies, USA）により合成した。

細胞及び動物
ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞系統は、ヒト乳房腺ガンから得られるものであり、ＡＴＣＣに注文することができる。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を乳房の脂肪パッドに、添加剤を含まないＤＭＥＭ ０．１mlに再懸濁させた１０．１０^６個 細胞で移植した。胸腺欠損ヌードマウスは免疫不全であるため、異種移植及びヒト腫瘍の成長が可能である。

Claims (13)

1. 放射線抵抗性又は化学療法抵抗性ガンを処置するのに使用するための核酸分子であって、
   該核酸分子は、下記式：
   
   ［式中、
   Ｎは、デオキシヌクレオチドであり、ｎは、１５〜１９５の整数であり、下線を引いたＮは、改変ホスホジエステル骨格を有し又は有さないヌクレオチドを意味し、Ｌ’は、リンカーであり、Ｃは、脂溶性分子又はレセプター媒介性エンドサイトーシスを可能にする細胞レセプターをターゲットにするリガンドから選択されるエンドサイトーシスを促進する分子であり、Ｌは、リンカーであり、ｍは、０又は１である整数であり、ｐは、１である］
   で示されるものを有し、
   ここで、該核酸は、キノリンエンドソーム分解剤の投与を何ら組み合わせることなく使用され、
   ここで、該核酸は、腹腔内及び静脈内経路から選択される非経口全身経路により投与される、
   使用のための核酸分子。
2. 式（Ｉ）で示される核酸が、１つ又は複数の下記特徴：
   −Ｎが、Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）及びＧ（グアニン）からなる群より選択され、ＣｐＧジヌクレオチドの発生を避け、ヒトゲノムにおける任意の遺伝子に対する８０％未満の配列同一性を有するように選択されるデオキシヌクレオチドであり、及び／又は
   −連結しているＬ’が、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジラート（Ｔ４）及び１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択され、及び／又は
   −ｍが、１であり、Ｌが、カルボキサミドポリエチレングリコール、より好ましくは、カルボキサミドトリエチレン又はテトラエチレングリコールであり、及び／又は
   −Ｃが、コレステロール、一本鎖もしくは二本鎖脂肪酸、例えば、オクタデシル、オレイン酸、ジオレイルもしくはステアリン酸、又は細胞レセプターをターゲットにするリガンド（ペプチド、タンパク質、アプタマーを含む）、例えば、葉酸、トコフェロール、糖、例えば、ガラクトース及びマンノース並びにそのオリゴ糖、ペプチド、例えば、ＲＧＤ及びボンベシン、並びにタンパク質、例えば、トランスフェリン及びインテグリンからなる群より選択され、好ましくは、コレステロール又はトコフェロール、更により好ましくは、コレステロールである
   を有する、請求項１記載の使用のための核酸分子。
3. 該核酸分子が、下記式：
   
   ［式中、
   下線を引いたヌクレオチドが、ホスホロチオアート又はメチルホスホナート骨格を有し又は有さないヌクレオチドを意味し、連結しているＬ’が、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジラート（Ｔ４）及び１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択され、ｍが、１であり、Ｌが、カルボキサミドオリゴエチレングリコールであり、Ｃが、ジオレイル、オクタデシル、葉酸、トコフェロール及びコレステロールからなる群より選択される］
   で示されるものを有する、請求項１又は２記載の使用のための核酸分子。
4. 該核酸が、
   
   であり、
   ここで、下線を引いたヌクレオチドが、ホスホロチオアート骨格を有するヌクレオチドを意味し、連結しているＬ’が、１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンであり、ｍが、１であり、Ｌが、カルボキサミドテトラエチレングリコールであり、Ｃが、コレステロールである、請求項１〜３のいずれか一項記載の使用のための核酸。
5. 該核酸が、静脈内経路により投与される、請求項１〜４のいずれか一項記載の使用のための核酸。
6. 該核酸が、注射、静脈点滴、ボーラス又はポンプにより投与される、請求項１〜５のいずれか一項記載の使用のための核酸。
7. ガンが、腹腔内に局在していない放射線抵抗性又は化学療法抵抗性ガンである、請求項１〜６のいずれか一項記載の使用のための核酸。
8. 腹腔内に局在していない放射線抵抗性又は化学療法抵抗性ガンが、トリプルネガティブ乳ガン（ＴＮＢＣ）、化学療法抵抗性肺ガン及び化学療法抵抗性卵巣ガンからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項記載の使用のための核酸。
9. ガンが、プラチナ抵抗性卵巣ガン及びプラチナ抵抗性トリプルネガティブ乳ガンからなる群より選択される、請求項８記載の使用のための核酸。
10. 該核酸が、放射線療法及び／又は化学療法との組み合わせで使用される、請求項１〜９のいずれか一項記載の使用のための核酸。
11. 該核酸が、ＤＮＡ傷害剤との組み合わせで使用される、請求項１〜１０のいずれか一項記載の使用のための核酸。
12. ＤＮＡ傷害剤が、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤、ＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡアルキル化剤、代謝拮抗剤及び紡錘体阻害剤からなる群より選択される、請求項１１記載の使用のための核酸。
13. 該核酸が、ドキソルビシン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン及び５−ＦＵからなる群より選択される化学療法との組み合わせで使用される、請求項１〜１２のいずれか一項記載の使用のための核酸。