JP6468777B2

JP6468777B2 - 改良型葉酸修飾シクロデキストリン誘導体

Info

Publication number: JP6468777B2
Application number: JP2014200364A
Authority: JP
Inventors: 憲治郎服部; 茂寛比木; 章司藤原
Original assignee: LEAVE A NEST CO, LTD.
Current assignee: LEAVE A NEST CO, LTD.
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2019-02-13
Anticipated expiration: 2034-09-30
Also published as: JP2016069520A

Description

本発明は、水溶性の高い葉酸修飾シクロデキストリンに関する。

本発明者らはこれまで、葉酸修飾シクロデキストリンが腫瘍細胞の表面の葉酸レセプタータンパクにより分子認識され、抗原抗体反応レベルの強い相互作用で腫瘍細胞と結合することを見出している（特許文献１）。これまでに報告された葉酸シクロデキストリン化合物のうち、代表的な化合物であるヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（特許文献１における例示化合物１）（以下、「ＮＤ１」という）は、各ピラノースの６位の炭素原子にアミノカプロン酸２量体からなるリンカーを介して７個の葉酸と結合した構造である。ＮＤ１は葉酸の作用によりがん細胞への集積を示し、薬剤を腫瘍細胞に送達できるＤＤＳキャリアとしてがん治療及びがん診断への応用が期待されている。また、本発明者らは、ＮＤ１のリンカーをアミノカプロン酸単量体に置き換えた葉酸修飾シクロデキストリン（以下、「ＮＤ２０１」という）も同様に腫瘍細胞への薬物送達を示すことを確認している。

このような葉酸修飾シクロデキストリンは、その腫瘍集積能力の応用可能性が期待される一方で、実用化においては、水への溶解性が低いことから、静脈注射液として水溶液を調製することが困難であるという問題があった。例えば、ＮＤ１及びＮＤ２０１は、純水に対する溶解度が約１ｍｇ／ｍＬと低く、そのままでは高濃度での使用が困難であった。

これまで、シクロデキストリンにＰＥＧを化学結合させた化合物についての報告は無い。シクロデキストリンとＰＥＧを組み合わせて用いる例としては、唯一、Ｄａｖｉｓらの報告（非特許文献１及び非特許文献２参照）があるのみである。Ｄａｖｉｓらは、シクロデキストリンポリマーにアダマンタン結合ＰＥＧを包接させたナノパーティクルを遺伝子デリバリーへの臨床実験に用いている。ここでは、ＰＥＧは主に細胞親和性を高める目的で結合されている。

一方、シクロデキストリンの可溶化手法として、ヒドロキシプロピル化が多用されてきた。とくにβ−シクロデキストリンの可溶化では多数の製品が実用化されている（非特許文献３）。

国際公開第ＷＯ２００９／０４１６６６号

Ｍ．Ｅ．Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ０８９５６（２０１０）Ｍ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，６，６５９−６６８（２００９）ＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，９８，１４７１−２０７６（１９９８）．

本発明者らは、葉酸修飾シクロデキストリンの溶解性を改善するために、アンモニウム塩形成や、Ｎａ塩形成を行い、処方で塩基性水溶液への溶解性を増加させることを試みた。たとえば、ｐＨ８．０アルカリ水溶液に溶解させた後、ｐＨ７．４の緩衝溶液を加えて溶解性を高めることに成功した。しかし、本方法は用時調製が必要であることから、より実用性が高く、簡便な手段が必要であると考えられた。

そこで、本発明者らは、化合物の溶解性を高める他の種々の手段について検討した結果、親水的な置換基（ポリエチレングリコール基（以下、「ＰＥＧ基」という）、及びヒドロキシプロピル基（以下、「ＨＰ基」という）等）を導入することにより、化合物そのものの溶解性を高めることで、より実用化に適した葉酸修飾シクロデキストリンを得ることに成功した。更に、本発明者らは、このような親水基導入葉酸修飾シクロデキストリンが、腫瘍細胞集積能力を維持し得るか否かについて確認したところ、驚くべきことに、親水基非導入葉酸修飾シクロデキストリンと比較して、より優れた腫瘍細胞集積能力を有することを見出し、本発明を完成させた。

よって、本発明は、親水基非導入葉酸修飾シクロデキストリンに関するものであり、より具体的には以下に記載する発明に関する。なお、本明細書全体に亘って、特に定義されていない限り、又は特にそのように介することが不整合である場合を除き、一般式（Ｉ）が含む各記号は、以下の一般式（Ｉ）の説明における定義と同じ定義を有する。

下記一般式（Ｉ）で表されるシクロデキストリン化合物

［式中、ｍは６〜８の整数を表し、
ｍ個のＲ^１は、各々独立して、水素原子、水酸基、−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｒ^２基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２基、−Ｚ基、−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｒ^２−Ｚ基、及び、−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、からなる群から選択される基を表し、
ここで、ｍ個のＲ^１のうち、少なくとも２個は、−Ｚ基、−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｒ^２−Ｚ基、及び、−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基からなる群から選択される基であり、
ｍ個のＸ^１、ｍ個のＸ^２、及びｍ個のＸ^３は、各々独立して、水素原子、水酸基、−Ｒ^２、−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨ−Ｙ−ＣＯＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基、及び、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２基からなる群から選択される基を表し、
ここで、Ｙは、各々独立して、アルキレン基、フェニレン基、及び、−Ｏ−基から選択される基を表し、
ここで、Ｒ^２は、各々独立して、ポリエチレングリコール基又はヒドロキシプロピル基を表し、
ここで、Ｚ基は下記式（ＩＩ）で表される基を示す

式中、ｎは０〜３の整数を表す］。

本明細書において、「シクロデキストリン」（「ＣｙＤ」と略記されることがある）は、６〜８個のＤ−グルコースがα１，４結合により環状に結合した物質を意味する。６個、７個、及び８個のＤ−グルコースがα１，４結合により環状に結合したしクロデキストリンを、それぞれ、α−シクロデキストリン（α−ＣｙＤ）、β−シクロデキストリン（β−ＣｙＤ）、及びγ−シクロデキストリン（γ−ＣｙＤ）と呼ぶことがある。

本明細書において、「葉酸修飾シクロデキストリン」又は「Ｆｏｌ−シクロデキストリン」とは、シクロデキストリンを構成するグルコピラノースの６位の第一級水酸基の２個以上が、同一の又は異なる、葉酸を有する置換基で置換されたシクロデキストリン化合物を意味する。例えば、本明細書における葉酸修飾シクロデキストリンは、以下の構造式で示されるＮＤ１（ｐｅｒ−Ｆｏｌ−ｃａｐ２−β−シクロデキストリン：ＷＯ２００９／０４１６６６号記載の例示化合物１）及びＮＤ２０１を含む。

本明細書において、親水基導入葉酸修飾シクロデキストリンとは、上述の葉酸修飾しクロデキストリンが更に親水基により修飾された化合物を意味する。親水基は、シクロデキストリンを構成するグルコピラノースの６位の第一級水酸基に葉酸と共に又は葉酸とは別に導入されていても良いし、シクロデキストリンを構成するグルコピラノースの２位又は３位の第二級水酸基に結合していても良い。あるいは、親水基は、シクロデキストリンを構成するグルコピラノースの３位の水素原子が置換されて導入されていても良い。

本明細書において、アルキレン基とは、直鎖、又は分岐状の炭素数が１〜１０個の２価の飽和炭化水素基（Ｃ１〜１０アルキレン基）を意味し、例えば、メチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、ｉ−プロピレン基、ｎ−ブチレン基、ｓｅｃ−ブチレン基、ｔ−ブチレン基、イソブチレン基、ｎ−ペンチレン基、イソペンチレン基、２，３−ジメチルプロピレン基、ｎ−ヘキシレン基、２−メチルペンチレン基、２，２−ジメチルブチレン基、２，３−ジメチルブチレン基、ｎ−ヘプチレン基、２−メチルヘキシレン基、３−メチルヘキシレン基、２，２−ジメチルペンチレン基、２，３−ジメチルペンチレン基、２，４−ジメチルペンチレン基、２，５−ジメチルペンチレン基、２，２，３−トリメチルブチレン基、２，２，４−トリメチルブチレン基、２，２，５−トリメチルブチレン基、２，３，４−トリメチルブチレン基、２，３，５−トリメチルブチレン基、２，４，４−トリメチルブチレン基、ｎ−オクチレン基、ｎ−ノニレン基、及びｎ−デカレン基などが挙げられ、好ましくは、Ｃ１〜６アルキレン基であり、より好ましくは、メチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、ｉ−プロピレン基、ｎ−ブチレン基、ｓｅｃ−ブチレン基、ｔ−ブチレン基、イソブチレン基、ペンチレン基、イソペンチレン基、又は２，３−ジメチルプロピレン基である。更に好ましくは、直鎖状のＣ１〜５アルキル基である。

本明細書において、「フェニレン基」とは、１，４−フェニレン基、１，３−フェニレン基、又は１，４−フェニレン基である。

本明細書において、親水基とは、ポリエチレングリコール基及びヒドロキシプロピル基を意味する。前記一般式（Ｉ）において、親水基はＲ^２で表される。本発明の化合物において、親水基は葉酸基（一般式（Ｉ）におけるＺ、以下同様）とは異なる位置（一般式（Ｉ）における、Ｘ^１，Ｘ^２及びＸ^３）であってもよいし、葉酸基と同じ位置（一般式（Ｉ）におけるＲ^１）であってもよい。親水基が葉酸基と同じ位置に存在する場合、葉酸基が親水基を介してシクロデキストリン骨格と結合していても良いし、一般式（Ｉ）におけるＲ^１の一部（例えば、１〜２個）が親水基で残りが葉酸基であっても良い。後者の場合、シクロデキストリンと結合する葉酸の数が少なくなることから、ナノクラスター効果がその分減じることが懸念されるが、本発明者らが実験により確認したところ、葉酸数が６個でも抗体と変わらない会合を示したため、この葉酸数の減少は葉酸修飾シクロデキストリンの腫瘍集積能力には影響しないと考えられる。また、葉酸基と同じ側に親水基が存在することにより、葉酸の挙動や、の包接化への影響が懸念されるが、分子全体から見ると親水基は十分に大きく、フレキシビリティもあるので、影響しないものと考えられる。

本明細書において、「ポリエチレングリコール基」とは、エチレングリコールの重合体（ＨＯ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−Ｈ）に由来する基を意味する。具体的には、「ポリエチレングリコール基」は、−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−構造を有する基であれば特に限定されるものではないが、例えば、−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−Ｈ基、及び−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−（Ｃ１〜６）アルキル基を含む。ここで、（Ｃ１〜６）アルキル基は、直鎖、又は分岐状の炭素数が１〜６個の１価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、イソブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、２，３−ジメチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、２−メチルペンチル基、２，２−ジメチルブチル基、又は２，３−ジメチルブチル基であってもよい。ポリエチレングリコールの重合度は、本発明の目的を達成できる限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば、２０〜８０とすることができ、好ましくは、３０〜６０であり、より好ましくは、４０〜５０である。

本明細書において、「ヒドロキシプロピル基」とは、−（ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ）_ｔ−Ｈで表される基を意味する。ヒドロキシプロピルの重合度は、例えば、１〜２０とすることができ、好ましくは２〜１０であり、より好ましくは３〜８であり、最も好ましくは４〜６である。

前記一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＲ^１として好ましくは、水素原子、水酸基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２基、及び、−Ｚ基からなる群から選択される基であり、より好ましくは、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_５−ＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_５−ＮＨＣＯ−ＣＨ_２−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ−ＣＨ_３基、−ＮＨＣＯＮＨ−（ＣＨ_２）_５−ＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_５−ＮＨＣＯ−ＣＨ_２−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ−ＣＨ_３基、又は−Ｚ基である。

前記式（ＩＩ）で表される基において、ｎは０〜３の整数であり、好ましくは１又は２である。

前記一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＸ^１として好ましくは、水素原子、−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基、又は−ＮＨ−Ｙ−ＣＯＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基であり、より好ましくは、水素原子、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−ＣＯＮＨ−（ＣＨ_２）_３−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ−ＣＨ_３基、又は−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ−ＣＨ_３基である。

前記一般式（Ｉ）で表される化合物におけるＸ^２として好ましくは、水素原子、又は、水酸基である。

前記一般式（Ｉ）において、Ｙは、好ましくは、アルキレン基であり、より好ましくは、メチレン基、プロピレン基、又はペンチレン基である。

特に好ましくは、本発明の親水基導入葉酸修飾シクロデキストリン化合物は以下の化合物である。

ＰＮＤ１−１（ＰＥＧ−ｐｅｒ−Ｆｏｌ−ｃａｐ２−β−シクロデキストリン）：前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、ｍは６〜８の整数であり、Ｒ^１が、−Ｚ基（ｎ＝２）であり、１個のＸ^１が、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−ＣＯＮＨ−（ＣＨ_２）_３−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ−ＣＨ_３基（ｐの平均値は４６〜４７）であり、（ｍ−１）個のＸ^１が水素原子であり、１個のＸ^２が水素原子であり、（ｍ−１）個のＸ^２が水酸基であり、Ｘ^３が水酸基である化合物。

ＰＮＤ１−３：前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、ｍは６〜８の整数であり、Ｒ^１が、−Ｚ基（ｎ＝２）であり、１個のＸ^１が、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ−ＣＨ_３基（ｐの平均値は４６〜４７）であり、（ｍ−１）個のＸ^１が水素原子であり、１個のＸ^２が水素原子であり、（ｍ−１）個のＸ^２が水酸基であり、Ｘ^３が水酸基である化合物。

ＰＮＤ１−７：前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、ｍは６〜８の整数であり、（ｍ−ｒ）個のＲ^１が、−Ｚ基（ｎ＝２）であり、ｒ個のＲ^１が、−ＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_５−ＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_５−ＮＨＣＯ−ＣＨ_２−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ−ＣＨ_３基（ｐの平均値は４６〜４７）であり、Ｘ^１が水素原子であり、Ｘ^２が水酸基であり、Ｘ^３が水酸基である化合物。

ＰＮＤ１−８：前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、ｍは６〜８の整数であり、（ｍ−ｒ）個のＲ^１が、−Ｚ基（ｎ＝２）であり、ｒ個のＲ^１が、−ＮＨＣＯＮＨ−（ＣＨ_２）_５−ＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_５−ＮＨＣＯ−ＣＨ_２−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ−ＣＨ_３基（ｐの平均値は４６〜４７）であり、Ｘ^１が水素原子であり、Ｘ^２が水酸基であり、Ｘ^３が水酸基である化合物。

ＮＤ２０１−ＨＰ：前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、ｍは６〜８の整数であり、ｓ個のＲ^１が、−Ｆｏｌａｔｅ基（ｎ＝１）であり、残りのＲ^１が水酸基であり、Ｘ^１が水素原子であり、ｔ個のＸ^２及び／又はＸ^３が−Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）０）_ｑ−Ｈ基（ｑは６までの整数）（ｔ＝１〜１６）であり、残りのＸ^２及び／又はＸ^３が水酸基である化合物。なお、本明細書において、ＮＤ２０１−ｔＨＰとは、ヒドロキシプロピル（ＨＰ）基（−Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）０）_ｑ−Ｈ基（ｑは６までの整数））がｔ個結合したＮＤ２０１を意味する。

本発明の化合物は、上記化合物の他、これらの化合物の薬理上許容されるエステルを包含する。ここで、「薬理上許容されるエステル」は、生体内において代謝されて、本願発明の化合物を与える基を含む化合物であって、医薬として体内に投与することが許容可能なエステルのことである。本明細書において、エステルは、エステル結合した化合物の他、アミド結合した化合物を含む。エステルは、生体内のエステラーゼにより分解されて活性型の化合物を与えてもよい。例えば、エステルとしては、置換され又は置換されていない、低級アルキルエステル、低級アルケニルエステル、低級アルキルアミノ低級アルキルエステル、アシルアミノ低級アルキルエステル、アシルオキシ低級アルキルエステル、アリールエステル、アリール低級アルキルエステル、アミド、低級アルキルアミド、水酸化アミドを挙げることができる。エステルとして、好ましくは、プロピオン酸エステル又はアシルエステルである。

また、本発明は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物を有効成分として含有する医薬組成物に関する。医薬組成物の種類は特に限定されず、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製することができる。また、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の化合物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水或いはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。経口投与用又は非経口投与用の任意の製剤形態で提供される。例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤又は液剤等の形態の経口投与用医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、若しくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬組成物として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。

本発明の葉酸修飾シクロデキストリンは、癌細胞への指向性を維持しながら溶解性に優れることから、所望の剤形に製剤化することができる。本発明の葉酸修飾シクロデキストリンは、より優れた腫瘍細胞集積能力を有することから、癌へのターゲティングを目的としたＤＤＳとして有用である。例えば、本発明の葉酸修飾シクロデキストリンは、抗癌作用を有する物質を包接又は結合させることにより、より副作用の少ない抗癌剤を提供することができる。また、本発明の葉酸修飾シクロデキストリンは、標識作用を有する物質を包接又は結合させることにより、より明確な癌の診断像を提供することができる。また、本発明の親水基導入葉酸修飾シクロデキストリンは、飛躍的に溶解性が増加することにより、比較的高濃度の葉酸修飾シクロデキストリン水溶液として調製することができる。このため、注射剤として哺乳動物の血流内への投与が可能となり、がん治療薬やがん診断薬として利用する他、がん治療薬やがん診断薬の非臨床試験及び臨床試験において使用することができる。

また、本発明の親水基導入葉酸修飾シクロデキストリンは優れた腫瘍集積能力を示すことから、抗がん剤を包接させることにより、包接された抗がん剤を標的となるがんまで効率的に輸送させることができる。また、造影剤を包接させることにより、包接された造影剤標的となるがんまで効率的に輸送させることができる。更に、本発明の親水基導入葉酸修飾シクロデキストリンは、水溶解性が高まる他、高分子となることから血流内の滞留性の増強、ＲＥＳ（食細胞）回避、そしてがん細胞へ直接取り込まれることによるアクティブターゲティング及びＥＰＲ効果によるパッシブターゲティングにより効果を発揮することができる。

ドキソルビシン（ＤＯＸ）内包ＮＤ１（ｐｅｒ−Ｆｏｌ−ｃａｐ２−β−ＣｙＤ）、及びドキソルビシン（ＤＯＸ）内包ＰＮＤ１−１（ＰＥＧ−ｐｅｒ−Ｆｏｌ−ｃａｐ２−β−ＣｙＤ）のＫＢ（ＦＲ（＋））細胞に対する抗腫瘍活性を表すグラフである。縦軸は、薬剤処理２４時間後の細胞生存率（％）を示し、横軸は処理した薬剤の種類を示し、左から順に、コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ドキソルビシン単独（ＤＯＸａｌｏｎｅ）、ドキソルビシン／ｐｅｒ−Ｆｏｌ−ｃａｐ２−β−シクロデキストリン（ＮＤ１）（モル比１：１）（ＤＯＸ／ｃａｐ２（１：１））、ドキソルビシン／ＰＥＧ−ｐｅｒ−Ｆｏｌ−ｃａｐ２−β−シクロデキストリン（ＰＮＤ１−１）（モル比１：１）（ＤＯＸ／ＰＥＧ−ｃａｐ２（１：１））、ｐｅｒ−Ｆｏｌ−ｃａｐ２−β−シクロデキストリン（ＮＤ１）（ｃａｐ２（１０μＭ））、及び、ＰＥＧ−ｐｅｒ−Ｆｏｌ−ｃａｐ２−β−シクロデキストリン（ＰＮＤ１−１）（ＰＥＧ−ｃａｐ２（１０μＭ））を示す。値は、平均値±Ｓ．Ｅ．を示す。ビンブラスチンの抗腫瘍活性に及ぼすＰＥＧ−ｐｅｒ−Ｆｏｌ−ｃａｐ−β−シクロデキストリン（ＰＮＤ１−１及びＰＮＤ１−３）の影響を示す。縦軸は細胞生存率（％）を示す。上図において横軸は、使用したサンプルを示し、順に、ＦＡ（−）ＲＰＭＩ培地（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＶＬＢ（１０μＭ）、ＶＬＢ／ＰＮＤ１−１（１：１）（ＶＢＬ／ＮＤ１−ＰＥＧ１（１：１））、ＶＢＬ／ＰＮＤ１−１（１：２）（ＶＢＬ／ＰＥＧ１（１：２）），ＮＤ１−ＰＮＤ１−１（１０μＭ）（ＮＤ１−ＰＥＧ１（１０μＭ）、ＰＮＤ１−１（２０μＭ）（ＮＤ１−ＰＥＧ１（２０μＭ））を示す。下図において、横軸は、使用したサンプルを示し、順に、ＦＡ（−）ＲＰＭＩ培地（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＶＬＢ（１０μＭ）、ＶＬＢ／ＰＮＤ１−３（１：１）（ＶＢＬ／ＮＤ１−ＰＥＧ３（１：１））、ＶＢＬ／ＰＮＤ１−３（１：２）（ＶＢＬ／ＮＤ１−ＰＥＧ３（１：２））、ＰＮＤ１−３（１０μＭ）、ＰＮＤ１−３（２０μＭ）（ＮＤ１−ＰＥＧ１（２０μＭ））を示す。ＰＮＤ１−１（図３Ａ）及びＰＮＤ１−３（図３Ｂ）のＫＢ（ＦＲ＋）及びＣＨＯ（ＦＲ−）細胞内取り込み評価の結果を示す。フローサイトメトリーによる細胞のＦＩＴＣの蛍光強度を示す。図３Ｃは、フローサイトメトリーによる細胞のＦＩＴＣの蛍光強度の積分量（縦軸）を示す。ＫＢ（ＦＲ（＋））細胞、及びＣＨＯ（ＦＲ（−））細胞によるＰＮＤ１−１の細胞内取り込みに及ぼす葉酸の影響を測定した結果を示すグラフである。下図の棒グラフは、ＦＩＴＣラベル化ＰＮＤ１−１（１０ｍＭ）、ＦＩＴＣラベル化ＰＮＤ１−１（１０ｍＭ）＋葉酸（４ｍＭ）の平均蛍光強度を示す。ｉｎｖｉｖｏのドキソルビシン（５ｍｇ／ｋｇ）静脈内投与における、腫瘍重量及び体重に及ぼすＰＮＤ１−１及びＰＮＤ１−３の影響を表すグラフである。縦軸は、それぞれ、（Ａ）腫瘍体積（ｍｍ^３）、及び（Ｂ）体重（ｇ）を示す。横軸はドキソルビシン投与からの経過期間（日）を示す。図中の記号は、白丸：コントロ―ル群（ｃｏｎｔｒｏｌ）、白抜きひし形：ドキソルビシン単独投与群（５ｍｇ／ｋｇ）（ＤＯＸａｌｏｎｅ（５ｍｇ／ｋｇ））、白抜き三角：ドキソルビシン／ＰＮＤ１−１複合体投与群（ＤＯＸ／ＰＮＤ１−１）、黒三角：ドキソルビシン／ＰＮＤ１−３投与群（ＤＯＸ／ＰＮＤ１−３）をそれぞれ示す。腫瘍マウスの生存率に及ぼすＰＮＤ１−１及びＰＮＤ１−３の影響を示す。図中の記号は、それぞれ、白丸：コントロール群（５％Ｍａｎｎｉｔｏｌ），白抜きひし形：ドキソルビシン単独投与群（５ｍｇ／ｋｇ），白抜き三角：ドキソルビシン／ＰＮＤ１−１＝１：１複合体投与群，白抜き四角：ドキソルビシン／ＰＮＤ１−３＝１：１複合体投与群を示す。ｎ＝３〜７であり、値は平均値を示す。ドキソルビシン（ＤＯＸ）の抗腫瘍活性に及ぼすＮＤ２０１誘導体の影響を（Ａ）ｃｏｌｏｎ−２６細胞、及び（Ｂ）を用いて調べた結果を示すグラフである。Ａ：中間体であるＮＤ２００−６ＨＰのＭＳスペクトル、及び、Ｂ：ＮＤ２００−６ＨＰを葉酸化したＮＤ２０１−６ＨＰのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。分析ＨＰＬＣ条件、カラム：ＳＥＣ型（体積排除カラム）、ＪＡＩＧＥＬＧＳ−３１０（商品名、日本分析工業）、φ２１．５ｍｍ×５００ｍｍを２本、移動相：１／１５Ｍ炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ８．２）／メタノール＝１００／５、流速：５．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ２５８ｎｍＮＤ２０１及びＮＤ２０１−６ＨＰ（ＮＤ２０１−ＨＰ）の溶解性を評価した結果を示す。縦軸は透過性を、横軸はメイロン静脈注射液（ｐＨ７．９）の量（ｍＬ）を示す。ＫＢ細胞にドキソルビシン、ドキソルビシン／ＮＤ２０１複合体、及びドキソルビシン／ＮＤ２０１−６ＨＰ複合体を添加後の細胞内におけるドキソルビシン分布を比較した写真である。左のイラストは実験の概略図である。右の写真は、ＤＩＣ（微分干渉コントラスト：細胞を示す）、ＴＲＩＴＣラベル（ＮＤ２０１又はＮＤ２０１−６ＨＰを示す）、及びそれらの重ね合わせ（Ｍｅｒｇｅ）の写真である。ＫＢ細胞内にとりこまれたドキソルビシン、ドキソルビシン／ＮＤ２０１、及びドキソルビシン／ＮＤ２０１−６ＨＰ複合体での蛍光強度の比較を示す。縦軸は蛍光強度を示す。葉酸の存在化／非存在化における、ＫＢ細胞によるＮＤ２０１及びＮＤ２０１−６ＨＰの取り込みを比較したグラフである。縦軸は平均蛍光強度（取り込まれたＮＤ２０１及びＮＤ２０１−６ＨＰの量を表す）を表し、横軸は用いたサンプルを示す。サンプルは、左から順にコントロール、葉酸非存在下ＮＤ２０１、葉酸存在下ＮＤ２０１、葉酸非存在下ＮＤ２０１−６ＨＰ、及び葉酸存在下ＮＤ２０１−６ＨＰを示す。ドキソルビシン単独、ドキソルビシン／ＮＤ２０１複合体、及びドキソルビシン／ＮＤ２０１−６ＨＰ複合体のＫＢ細胞に対する抗腫瘍活性を示すグラフである。縦軸は、コントロールを１００％とした細胞生存率（％）を示し、横軸は用いたサンプルを示す。ＮＤ２０１及びＮＤ２０１−６ＨＰ複合体のｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を腫瘍体積により評価した結果を示す。縦軸は腫瘍体積（ｍｍ^３）を示し、横軸は投与後の日数を表す。

本発明の親水基導入葉酸修飾シクロデキストリンの原料となる葉酸修飾シクロデキストリンは、国際特許公開公報ＷＯ２００４／０８５４８７号、及びＷＯ２００９／０４１６６６号、並びに、日本国特許出願公開公報第２００８−２８５５６７号、第２００９−６１４２９号、及び第２０１１−１９０３４１号に記載された方法に従って、合成することができる。例えば、前記ＮＤ１化合物はＷＯ２００９／０４１６６６号記載の実施例１記載の方法により合成することができる。

一態様において本発明は、以下の式

で表される化合物の２位、３位又は６位水酸基にポリエチレングリコール基又はヒドロキシプロピル基を導入することを特徴とする、一般式（Ｉ）で表される化合物の製造方法に関する。

（シクロデキストリン２位又は３位への親水基の導入）
葉酸修飾シクロデキストリン２位（Ｘ^３）又は３位（Ｘ^１又はＸ^２）への親水基（ポリエチレングリコール基又はヒドロキシプロピル基、以下同様）の導入は、Ｍ．Ｆｕｋｕｄｏｍｅら，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，４７，６５９９−６６０２（２００６）記載の方法に従って、葉酸修飾シクロデキストリンの２級位を修飾することにより行うことができる。

具体的には、トシルイミダゾールの作用によりシクロデキストリン２位の２級水酸基をモノトシル化した後、塩基触媒でＣ２−Ｃ３位エポキシ環を形成させる。次いで、（１）アミノカプロン酸のアミノ基をシクロデキストリン３位又は２位に反応させて、残るカルボン酸基に親水基アミンを反応させるか、あるいは、（２）直接親水基アミンを反応させることにより親水基を結合させることができる。生成物は、通常のＨＰＬＣカラム精製法で精製して、本発明の化合物を得ることができる。

（シクロデキストリン６位への親水基の導入）
葉酸修飾シクロデキストリン６位（Ｒ^１）への親水基の導入は、葉酸修飾シクロデキストリン合成の途中プロセスにおける中間体で、パーアミノカプロイル−β−シクロデキストリン（以下、「ＮＤ１００」と略す）を葉酸で修飾する前に、親水基−ＣＯＯＨと反応させて、アミノ基の一部（シクロデキストリン１分子中、１〜２個）に親水基を導入し、次いで残りのＲ^１に葉酸を導入することにより合成することもできる。反応性の親水基−ＣＯＯＨ化合物は、多数市販（例えば、ＮＯＦＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ）されている。

別の態様において本発明は、抗癌作用を有する物質を包接させた前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物の有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、癌の治療方法又は予防方法に関する。あるいは、本発明は、癌の治療又は予防に使用するための抗癌作用を有する物質を包接させた前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物に関する。更に別の態様において本発明は、標記作用を有する物質を包接させた前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物の有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、癌の診断、検出、又は標識化方法に関する。あるいは、本発明は、癌の診断、検出、又は標識化に使用するための標識作用を有する物質を包接させた前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物に関する。

本明細書において、「癌」との用語は、上皮性悪性腫瘍、脊髄由来の造血器悪性腫瘍などが含まれ、特に、卵巣癌（非粘液性卵巣癌など）、子宮癌、子宮内膜癌、乳癌、乳腺癌、前立腺癌、精巣癌（睾丸絨毛上皮癌など）、脳癌（上衣腫など）、咽喉癌、肺癌、肺腺癌、腎臓癌（腎細胞癌など）、肝癌、大腸癌（結腸癌など）、胸膜中皮腫、肉腫、慢性および急性骨髄性白血病、肺転移癌などの各種転移癌を含む。

前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物に包接させることのできる標識作用を有する物質としては、シクロデキストリンに包接することができ、標識として利用可能な物質であれば特に限定されないが、Ｌ−［３−１８Ｆ］−α−メチルチロシン（１８Ｆ−ＦＭＴ）（ポジトロン・エミッション・トモグラフィー（ＰＥＴ）用）；フルオレセイン等の蛍光色素化合物（蛍光／内視鏡用）；ガドリニウムキレート芳香族化合物等のガドリニウム（Ｇｄ）化合物（核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）用）；バリウム化合物、ヨウ素、又は、１，３，５−トリヨードベンゼン等のヨウ素化合物（Ｘ線コンピュータ断層撮影法（Ｘ線ＣＴ）用）を挙げることができる。

本発明の医薬組成物は、通常の薬学的に許容される担体を用いて、常法により製剤化することができる。経口用固形製剤を調製する場合は、主薬に賦形剤、更に必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えた後、常法により溶剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等とする。注射剤を調製する場合には、主薬に必要によりｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添加し、常法により皮下又は静脈内用注射剤とすることができる。

本発明の医薬組成物は、経口投与形態、又は注射剤、点滴剤等の非経口投与形態で用いることができる。本化合物を哺乳動物等に投与する場合、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等として経口投与してもよいし、又は、注射剤、点滴剤として非経口的に投与してもよい。投与量は症状の程度、年齢、体重、性別、投与ルート、投与形態、薬剤への反応性、疾患の種類等により適宜設定することができ、例えば、通常成人１日当たり５０〜５００ｍｇを１日１〜数回に分けて投与する。

以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。

（実施例１）ＰＮＤ１−１の合成
ＰＮＤ１−１は、ＮＤ１ → ＮＤ１−ＣＯＯＨ → ＮＤ１−ＣＯＮＨ−ＰＥＧの経路で合成した。
具体的には、国際特許公開ＷＯ２００９／０４１６６６記載の方法に従って合成したＮＤ１１００．５ｍｇを４ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、これに１−（ｐ−トルエンスルホニル）イミダゾール４．２ｍｇと、炭酸セシウム４ｍｇをＤＭＳＯ２ｍｌに溶解した溶液を加えて、室温で４０時間反応させた。次に、この反応混合物に６−アミノ−ｎ−カプロン酸（アミノＣａｐ）３．０ｍｇと１，４−ジアザビシクロ［２，２，２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）５８．８ｍｇを加え、２４時間反応させた。この反応溶液を分取ＨＰＬＣ装置にＳＥＣ型カラム（ＪＡＩＧＥＬＧＳ−３１０ φ２１．５ｍｍ×５００ｍｍ）を取り付け、溶離液として水を流速１０．０ｍｌ／ｍｉｎにて流し、ＵＶ検出２３０ｎｍにて溶離した。分取ＨＰＬＣクロマトグラムにて、最初に流出する保持時間６．０５ｍｉｎの単独のシャープなピークの成分（面積比３５％）を分取し、凍結乾燥して４０．０ｍｇを得た。

得られた生成物４０．０ｍｇをＤＭＳＯ４．０ｍｌに溶解し、Ｎ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）４７．２ｍｇ、Ｎ−イミドコハク酸（ＨＯＮＳｕ）４８．９ｍｇ及びＰＥＧアミン（ＮＯＦ社、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＭＥＰＡ−２０ＨＭＷ２０００）３８．７ｍｇを加え室温、２４時間反応させた。ＨＰＬＣ装置にＳＥＣカラム（ＪＡＩＧＥＬＧＳ−３１０ φ２１．５ｍｍ×５００ｍｍ）を用い、溶離液は、水：メタノール１００：５で１２．７ｍｉｎ（２１％）のピークを分取し、凍結乾燥してＰＮＤ１−１を得た。収量は６５．９ｍｇ（収率４７％）であった。分析ＨＰＬＣによる純度確認は１ｍｇを１ｍｌの２．７Ｍのアンモニア溶液２５μｌをＳＥＣカラム（ＪＡＩＧＥＬＧＳ−３１０７．６ｍｍ×３００ｍｍ）溶離液１／１５ＭＰＢＳ緩衝溶液を用いて流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２３０ｎｍにて、保持時間５．１６ｍｉｎに面積比７９％のピークを示した。保持時間９．３ｍｉｎに葉酸またはその関連物質と思われるピーク面積比２１％を観察している。ＰＮＤ１−１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓｆｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ）による測定では、ｍ／ｚ５０００を中心に４０００〜６０００に幅広いピークで、ＰＥＧ基導入体と思われるシャープな山なりの分布を示す４０本のメインピーク群が見られた。これとは別に７０００を中心として６０００〜８０００に分布する弱い第二ピーク群も僅かに観察された。こちらの第２ピーク群にはＰＥＧ基導入を示すシャープな山なりの分布はみられなかった。ＰＮＤ１−１の水溶性は１０ｍｇ／ｍｌであり、ＮＤ１の１０倍以上の水溶性を示した。

（実施例２）ＰＮＤ１−３の合成
ＰＮＤ１−３は、ＮＤ１ → ［ＮＤ１−ｅｐｏｘｙ］ → ＮＤ１−ＰＥＧの経路で合成した。具体的には、国際特許公開ＷＯ２００９／０４１６６６記載の方法に従って合成したＮＤ１２１．４ｍｇを１ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、１−（ｐ−トルエンスルホニル）イミダゾール１．４ｍｇと、炭酸セシウム０．９ｍｇを加え、室温で１９時間反応させた。次にこの反応混合物に１，４−ジアザビシクロ［２，２，２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）１５ｍｇ及びＰＥＧアミン（ＮＯＦ社、ＭＷ２０００）８０ｍｇを加え室温、２４時間反応させた。ＳＥＣカラムＪＡＩＧＥＬＧＳ−３１０ φ２１．５ｍｍ×５００ｍｍを２本用い、溶離液水により検出波長２３０ｎｍで１３．２ｍｉｎ（４９％）のピークを分取し、凍結乾燥することによりＰＮＤ１−３を得た。収量は４．６ｍｇであった。この物質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓｆｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ）による測定は、ｍ／ｚ５０００を中心に４０００〜６０００に幅広いピークで、ＰＥＧ基導入体と思われるシャープな山なりの分布を示すメインピーク群が見られた。ＰＮＤ１−３の水溶性は１０ｍｇ／ｍｌであり、ＮＤ１の１０倍以上の水溶性を示した。

（実施例３）ドキソルビシン内包ＰＮＤ１−１のｉｎｖｉｔｒｏにおける細胞増殖抑制作用
ＫＢ細胞（５×１０^４細胞／ウェル）を、葉酸を含有しない培地（ＲＰＭ１１６４０ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）で３７℃で２４時間培養した。細胞をＰＢＳで１回洗浄後、ドキソルビシン（ＤＯＸ）１０μＭ、ドキソルビシン／ｐｅｒ−Ｆｏｌ−ｃａｐ２−β−シクロデキストリン（ＮＤ１）（モル比１：１）１０μＭ、ドキソルビシン／ＰＥＧ−ｐｅｒ−Ｆｏｌ−ｃａｐ２−β−シクロデキストリン（ＰＮＤ１−１）（モル比１：１）１０μＭ、ｐｅｒ−Ｆｏｌ−ｃａｐ２−β−シクロデキストリン（ＮＤ１）１０μＭ、及び、ＰＥＧ−ｐｅｒ−Ｆｏｌ−ｃａｐ２−β−シクロデキストリン（ＰＮＤ１−１）１０μＭを含有する培地１５０μＬ中、３７℃で、２４時間培養した。ｎ＝８〜１１とした。ＰＢＳで１回洗浄後、１００μＬの新しいＨＢＳＳ及び１０μＬのＷＳＴ−１試薬を各ウェルに添加し、３７℃で３０分間培養した。プレートリーダーにて測定（Ｓ：４５０ｎｍ、Ｒ：６２０ｎｍ）し、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１を用いると代謝活性のある細胞のみが蛍光を示すことにより計算した結果を細胞生存率（％）とした。

結果を図１に示す。ｉｎｖｉｔｒｏにおいては、ドキソルビシン内包ＰＮＤ１−１は、ドキソルビシン単独及びドキソルビシン内包ＮＤ１と同程度の細胞増殖抑制効果を示した。

（実施例４）ビンブラスチン内包ＰＮＤ１−１及びＰＮＤ１−３のｉｎｖｉｔｒｏにおける細胞増殖抑制作用
ビンブラスチンの抗腫瘍活性に及ぼすＰＥＧ−ｐｅｒ−Ｆｏｌ−ｃａｐ−β−シクロデキストリン（ＰＮＤ１−１及びＰＮＤ１−３）の影響を調べた。ＫＢ細胞を５×１０^４細胞を９６穴プレートに調製した。３７℃、２４時間インキュベーションし、ＰＢＳ（１５０μＬで１回洗浄した。次に各種サンプルを１５０μＬ添加した。３７℃で２４時間インキュベーションした。ＰＢＳ（１５０μＬ）で洗浄。ＷＳＴ−１（１０μＬ）を添加、ＨＢＳＳ（１００μＬ）を添加。プレートリーダーにて測定（Ｓ：４５０ｎｍ，Ｒ：６２０ｎｍ）サンプルはコントロールとして葉酸を含まないＦＡ（−）ＲＰＭＩ培地、ＶＬＢ単独（１０μＭ）、ＶＬＢ／ＰＮＤ１−１（１：１）、ＶＢＬ／ＰＮＤ１−１（１：２）、ＰＮＤ１−１（１０μＭ）、ＰＮＤ１−１（２０μＭ）を用いた。

結果を図２に示す。ＫＢ細胞においてビンブラスチンとＰＮＤ１−１複合体の抗腫瘍活性は１：１仕込みではなかったが、１：２仕込みで発揮した。またビンブラスチンとＰＮＤ１−３複合体の抗腫瘍活性は１：２仕込みで有意にみられた。

（実施例５）ＰＮＤ１−１及びＰＮＤ１−３のＫＢ細胞（ＦＲ（＋））及びＣＨＯ細胞（ＦＲ（−））による細胞内取り込み評価
ＰＮＤ１−１のＫＢ（ＦＲ＋）及びＣＨＯ（ＦＲ−）細胞内取り込み評価を行った。ＫＢ細胞，あるいはＣＨＯ細胞を４×１０^５細胞／３５ｍｍｄｉｓｈに調製した。インキュベーション（３７℃，２４ｈ）の後、培地（１ｍＬ）で洗浄×１回、各種サンプル（１ｍＬ）添加した。その後、インキュベーション（３７℃，１ｈ）した後、ＰＢＳ（１ｍＬ）で洗浄×１回、ＰＢＳ（１ｍＬ）で細胞を溶解してＦＡＣＳ処理（ＦＬ１）した。フローサイトメトリーにより、３７℃で１時間インキュベーションの後、細胞のＦＩＴＣの蛍光強度を求めた。各種サンプルとして、コントロール：ＦＡ（−）培地、ＦＩＴＣラベル化ＰＮＤ１−１（１０μＭ）、ＦＩＴＣラベル化ＰＮＤ１−３（１０μＭ）とした。

次にＰＮＤ１−３のＫＢ（ＦＲ＋）及びＣＨＯ（ＦＲ−）細胞内取り込み評価を行った。実験操作はＫＢ細胞，あるいはＣＨＯ細胞を４×１０^５細胞／３５ｍｍｄｉｓｈに調製した。インキュベーション（３７℃，２４ｈ）の後、培地（１ｍＬ）で洗浄×１回、各種サンプル（１ｍＬ）添加した。その後、インキュベーション（３７℃，１ｈ）した後、ＰＢＳ（１ｍＬ）で洗浄×１回、ＰＢＳ（１ｍＬ）で細胞を溶解してＦＡＣＳ処理（ＦＬ１）した。フローサイトメトリーにより、３７℃で１時間インキュベーションの後、細胞のＦＩＴＣの蛍光強度を求めた。各種サンプルとして、コントロール：ＦＡ（−）培地、ＦＩＴＣラベル化ＰＮＤ１−１（１０μＭ）、ＦＩＴＣラベル化ＰＮＤ１−３（１０μＭ）とした。ＰＮＤ１−１及びＰＮＤ１−３の濃度は１０μＭである。

結果を図３に示す。下の棒グラフはフローサイトメトリーを用い３７℃での１時間のインキュベーション後に細胞のＦＩＴＣの蛍光強度の積分値を求めた結果である。これによるとＰＮＤ１−３ではＰＮＤ１−１よりも有意に取り込みが２倍に増大した。ＦＲの少ないＣＨＯ細胞では取り込みは少であった。

（実施例６）ＰＮＤ１−１及びＰＮＤ１−３のＫＢ細胞（ＦＲ（＋））及びＣＨＯ細胞（ＦＲ（−））による細胞内取り込みへの葉酸の影響の評価
（１）細胞内取り込みに及ぼす葉酸の影響
ＫＢ細胞及びＣＨＯ細胞を４×１０^５細胞／３５ｍｍｄｉｓｈに調製し、インキュベーション（３７℃，２３ｈ）の後、培地（１ｍＬ）で洗浄×１回、葉酸（４ｍＭ：１ｍＬ）を添加してプレインキュベーション（３７℃，１ｈ、葉酸添加群のみ）した。次に各種サンプル（１ｍＬ）添加し、インキュベーション（３７℃，１ｈ）し、ＰＢＳ（１ｍＬ）で洗浄×１回、ＰＢＳ（１ｍＬ）で細胞を溶解、ＦＡＣＳ処理（ＦＬ１）した。サンプルは、コントロール：ＦＡ（−）培地、ＦＩＴＣラベル化ＰＮＤ１−１（１０ｍＭ）、ＦＩＴＣラベル化ＰＮＤ１−１（１０ｍＭ）＋葉酸（４ｍＭ）、ＦＩＴＣラベル化ＰＮＤ１−３（１０ｍＭ）、及びＲＩＴＣラベル化ＮＤ１−３（１０ｍＭ）＋葉酸（４ｍＭ）とした。フローサイトメータにより、３７℃、１時間のインキュベーションの後に細胞のＦＩＣＴの蛍光強度を測定した。ＰＮＤ１−１の濃度は１０ｍＭであり、葉酸の濃度は４ｍＭである。

（２）細胞内取り込みに及ぼす葉酸の影響
ＫＢ細胞及びＣＨＯ細胞を４×１０^５細胞／３５ｍｍｄｉｓｈに調製し、インキュベーション（３７℃，２３ｈ）の後、培地（１ｍＬ）で洗浄×１回、葉酸（４ｍＭ：１ｍＬ）を添加してプレインキュベーション（３７℃，１ｈ、葉酸添加群のみ）した。次に各種サンプル（１ｍＬ）添加し、インキュベーション（３７℃，１ｈ）し、ＰＢＳ（１ｍＬ）で洗浄×１回、ＰＢＳ（１ｍＬ）で細胞を溶解、ＦＡＣＳ処理（ＦＬ１）した。サンプルは、コントロール：ＦＡ（−）培地、ＦＩＴＣラベル化ＰＮＤ１−１（１０ｍＭ）、ＦＩＴＣラベル化ＰＮＤ１−１（１０ｍＭ）＋葉酸（４ｍＭ）、ＦＩＴＣラベル化ＰＮＤ１−３（１０ｍＭ）、及びＲＩＴＣラベル化ＮＤ１−３（１０ｍＭ）＋葉酸（４ｍＭ）でとした。フローサイトメータにより、３７℃、１時間のインキュベーションの後に細胞のＦＩＣＴの蛍光強度を測定した。ＰＮＤ１−１の濃度は１０ｍＭであり、葉酸の濃度は４ｍＭである。

結果を図４に示す。図４下の棒グラフに葉酸の添加効果が纏めて示してある。ＫＢおよびＣＨＯ何れの細胞でも葉酸（４ｍＭ）の添加効果による阻害効果は見られなかった。

（実施例７）ドキソルビシン内包ＰＮＤ１−１及びＰＮＤ１−３のｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍作用
（１）ドキソルビシンの抗腫瘍効果に及ぼすＰＮＤ１−１及びＰＮＤ１−３の影響（ｉｎｖｉｖｏ）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（♂，４週齢）の左後肢に、Ｃｏｌｏｎ−２６細胞（２×１０^５細胞／１００ｍＬ）を接種した。腫瘍直径が８ｍｍになったのを確認後、ドキソルビシン／ＰＮＤ１−１，ドキソルビシン／ＰＮＤ１−３（１：１，１００μＬ）を静脈内投与した。経時的に腫瘍体積及び体重を約３０日間測定した。

（２）腫瘍マウスの生存率に及ぼすＰＮＤ１−１及びＰＮＤ１−３の影響
担がんマウス（ＢＡＬＢ／ｃ雄性，Ｃｏｌｏｎ−２６細胞）に以下のサンプル（１００μＬ）を静脈内投与した。５％Ｍａｎｎｉｔｏｌ（コントロール），ドキソルビシン単独（５ｍｇ／ｋｇ），ドキソルビシン／ＰＮＤ１−１＝１：１複合体，ドキソルビシン／ＰＮＤ１−３＝１：１複合体。ｎは３〜７とした。

結果を図５及び図６に示す。図５からＤＯＸとＰＮＤ１−１およびＰＮＤ１−３は腫瘍増大を３０日間にわたり完全に抑制した。体重変化もなく副作用もない事が推定される。図６の生存率はＰＮＤ１−３で１００日以上１００％であった。ＰＮＤ１−１でも８０日以上１００％であった。良好な抗腫瘍活性が見られた。

（実施例８）ＰＮＤ１−４の合成
ＰＮＤ１−４は、ＮＤ１→ＮＤ１−ＮＨ_２→ＮＤ１−ＮＨＣＯ−ＰＥＧの経路にて合成した。具体的には、国際特許公開ＷＯ２００９／０４１６６６記載の方法に従って合成したＮＤ１１００．５ｍｇを４ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、１−（ｐ−トルエンスルホニル）イミダゾール４．２ｍｇと、炭酸セシウム２ｍｇを加えて、室温で４０時間反応させた。次にこの反応混合物にヘキサメチレンジアミン３．０ｍｇと１，４−ジアザビシクロ［２，２，２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）５８．８ｍｇを加え、２４時間反応した。この反応溶液をＳＥＣカラムＪＡＩＧＥＬＧＳ−３１０φ２１．５ｍｍ×５００ｍｍに水を溶離液として流速１０．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出２３０ｎｍにて分取した。ＨＰＬＣクロマトグラムにて、最初に流出する単独のシャープなピークの成分（面積比３５％）を分取し、凍結乾燥しＮＤ１のヘキサメチレン誘導体３８．０ｍｇを得た。

ＮＤ１のヘキサメチレン誘導体８ｍｇに対しＰＥＧ２０００ＯＳｕＭＥ−０２０ＡＳ（ＮＯＦ）２．７７ｍｇを１ｍｌのＤＭＳＯ溶液中室温で一夜反応させた。生成物はそのまま、ＨＰＬＣ精製した。ＳＥＣカラムＪＡＩＧＥＬφ２１．５ｍｍ×５００ｍｍを用い、検出波長２３０ｍｍで先頭のピーク保持時間１２．５ｍｉｎを分取し、凍結乾燥して２．４ｍｇ（３０％）のＰＮＤ１−４を得た。ＨＰＬＣ純度は９８％であった。

（実施例９）ＰＮＤ１−２の合成
ＰＮＤ１−２は、ＮＤ１００（Ｃａｐ２）＋ＰＥＧ−ＯＳｕ→ＮＤ１００−ＮＨＣＯ−ＰＥＧ→ＮＤ１−ＰＥＧ（１級位）の経路で合成した。具体的には、国際特許公開ＷＯ２００９／０４１６６６記載の方法に従って合成したＮＤ１の前駆体６−ヘプタキス（５−アミノカプリルアミドカプリルアミド）−β−シクロデキストリン１０ｍｇにＮＭＭ２．６ｍｇ、ＰＥＧＯＳｕ７．４ｍｇを室温一夜反応させた後、葉酸５１．９ｍｇとＤＭＴ−ＭＭ３３．３ｍｇを室温で４５時間反応させた。生成物はそのまま、ＨＰＬＣ精製した。先頭のピークを分取し、凍結乾燥して２０．０ｍｇのＰＮＤ１−２を得た。

（実施例１０）ＰＮＤ１−７の合成
ＰＮＤ１−７は、ＮＤ１００→ＮＤ１００−ＮＨＣＯ−ＰＥＧ（ＳＴＥＰ１）、及び、ＮＤ１００−ＮＨＣＯ−ＰＥＧ→ＰＮＤ１−７（ＳＴＥＰ２）の経路により合成した。

（Ｓｔｅｐ１）国際特許公開ＷＯ２００９／０４１６６６記載の方法に従って合成した６−ヘプタキス（５−アミノカプリルアミドカプリルアミド）−β−シクロデキストリン（ＮＤ１００）２００．０ｍｇを４ｍｌのメタノールに溶解し、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ＮＯＦ社：ＭＥ−０２０−ＡＣ（ＭＷ２０００））１１８．３ｍｇとＤＭＴ−ＭＭ２１．３ｍｇ及びＮ−メチルモルホリンを１００μｌを加えて常温で１６時間撹拌した後、３５℃で２３時間加温した。この反応溶液を１／１５Ｍ炭酸アンモニウム水溶液を４ｍｌ加えて８ｍｌとし、ＨＰＬＣ装置を用いて、ＳＥＣカラム（ＪＡＩＧＥＬＧＳ−３１０φ２１．５ｍｍ×５００ｍｍ）を２本に１／１５Ｍ炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ８．２）を溶離液として流速５．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出ＵＶ２８６ｎｍにて分取した。ＨＰＬＣクロマトグラムにて、最初に流出する単独のシャープなピークＡと２番目に流出する単独のシャープなピークＢの成分を分取した。それぞれ凍結乾燥を行い、二つの白色粉末Ａ（２３．５ｍｇ）、Ｂ（８５．９ｍｇ）を得た。この生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓｆｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ）による測定では、Ａはｍ／ｚ７２２０を中心に６６００〜８０００にＰＥＧ基が２置換したＮＤ１００と推定される幅広いピークが見られた。また、ｍ／ｚ２０００付近にＰＥＧ−ＣＯＯＨと見られる幅広いピークが痕跡量確認された。Ｂではｍ／ｚ４９６６を中心に４１００〜５９００にＰＥＧ基が１置換したＮＤ１００と推定される幅広いピークが見られた。また、ｍ／ｚ２０００付近にＰＥＧ−ＣＯＯＨと見られる幅広いピークが痕跡量確認された。同様にｍ／ｚ７０００付近にＰＥＧ基が２置換したＮＤ１００と推定される幅広いピークが痕跡量確認された。不純物を無視した場合のＰＥＧ基が２置換したＮＤ１００の収率は４．０％、ＰＥＧ基が１置換したＮＤ１００の収率は２４％であった。

（Ｓｔｅｐ２）ＰＥＧ基が１置換したＮＤ１００８０．８ｍｇ及び葉酸１８９．３ｍｇをＤＭＳＯ４０ｍｌに溶かし、ＤＭＴ−ＭＭ１３７．８ｍｇ、及びメタノール５０ｍｌを加えて、３５℃で４８時間反応させた。生成した化合物が例示化合物ＮＤ１−ＰＥＧ＃７（ＰＮＤ１−７）であることを、ＳＥＣカラムを付した分析ＨＰＬＣにより下記の条件にて確認した。保持時間は９．０分付近で出発物質のＮＤ１００−ＮＨＣＯ−ＰＥＧ保持時間由来と異なるピークが観測された。また反応進行状況は、ＳＥＣカラムを付した分析ＨＰＬＣを用いて下記の条件で確認し、４８時間で反応の進行が終了したことを確認した。

分析ＨＰＬＣ条件
カラム：ＳＥＣ型（体積排除カラム）
ＪＡＩＧＥＬＧＳ−３１０−Ａ（商品名、日本分析工業製）
φ７ｍｍ×５００ｍｍ
移動相：１／１５Ｍ炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ８．２）／メタノール＝１００／５
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５８ｎｍ

この反応混合物をアセトン中で沈殿を形成させた。その沈殿を濾別したのちｐＨ８．２に調製した１／１５Ｍ炭酸アンモニウム水溶液を加えて５０ｍｌとし、ＳＥＣカラムを付した分取ＨＰＬＣを用いて下記の条件で分取した。ＨＰＬＣクロマトグラムにて、最初に流出する単独のシャープなピークの成分（保持時間２６分付近）を分取し、凍結乾燥しＰＮＤ１−７を４９．９ｍｇ（収率４２％）得た。分取物のＨＰＬＣ純度は９７％であった。他にフリー葉酸がピーク面積比４％存在することを確認した。これは、１分子のＰＮＤ１−７あたり、１．４分子の葉酸の存在を示す。

この生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓｆｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ）による測定は、ｍ／ｚ５０００を中心に４５００〜６０００にＰＥＧ無置換のＮＤ１と推定される幅広いピークが見られた。またｍ／ｚ７２００を中心に６０００〜８０００に幅広いピークがあり、ＰＥＧ基が１個の導入体と思われる山なりの分布を示すピークが見られた。ＰＥＧ基２個以上のピーク、及び原料のＮＤ１００のピークは観測されなかった。

分取ＨＰＬＣ条件
カラム：ＳＥＣ型（体積排除カラム）
ＪＡＩＧＥＬＧＳ−３１０（商品名、日本分析工業）
φ２１．５ｍｍ×５００ｍｍを２本
移動相：１／１５Ｍ炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ８．２）／メタノール＝１００／５
流速：５．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５８ｎｍ

（実施例１１）ＰＮＤ１−７の連続簡易合成
国際特許公開ＷＯ２００９／０４１６６６記載の方法に従って合成した６−ヘプタキス（５−アミノカプリルアミドカプリルアミド）−β−シクロデキストリン（ＮＤ１００）２０．３ｍｇを５ｍｌのメタノールに溶解し、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ＮＯＦ社）１７ｍｇとＤＭＴ−ＭＭ１０．０ｍｇ及びＮ−メチルモルホリンを１００μｌを加えて３５℃で２３時間加温した。引き続き葉酸１６７ｍｇ、ＤＭＴ−ＭＭ２０２．５ｍｇ、及びメタノール３ｍｌを加えて、３５℃で９４時間反応させた。

精製操作は次のとおりである。この反応溶液を１／１５Ｍ炭酸アンモニウム水溶液を加えて５０ｍｌとし、をＳＥＣカラムＪＡＩＧＥＬＧＳ−３１０ φ２１．５ｍｍ×５００ｍｍを２本に炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）を溶離液として流速７．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出ＵＶ２８６ｎｍにて分取した。ＨＰＬＣクロマトグラムにて、最初に流出する単独のシャープなピークの成分を分取し、凍結乾燥しＰＥＧ化ＮＤ１（ＰＮＤ１−７）を１６．４ｍｇ（収率３０％）を得た。分取物のＨＰＬＣ純度は７８％であった。他にフリー葉酸がピーク面積比１８％存在することを確認した。この生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓｆｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ）による測定は、ｍ／ｚ５０００を中心に４５００〜６０００にＰＥＧ無置換のＮＤ１と推定される幅広いピークが見られた。またｍ／ｚ７２００を中心に６０００〜８０００に幅広いピークがあり、ＰＥＧ基が１個の導入体と思われる山なりの分布を示すピークが見られた。ＰＥＧ基２個以上のピーク、及び原料のＮＤ１００のピークは観測されなかった。同じ生成物をプロトンＮＭＲで観察した結果、フリー葉酸が９分子の存在と確認された。

分取ＨＰＬＣ精製で除けなかったフリー葉酸は、生成物を水とアセトン混合液中で沈殿を形成させた。その沈殿を再度水に溶解してｐＨ５に調整し、そこで生成した沈殿を、セライトろ過で取り除き、溶液を凍結乾燥して生成物を得た。分析ＨＰＬＣのクロマトグラムでは、残留のフリー葉酸は面積比３％以下と判定された。生成物ＮＤ１−ＰＥＧ７の面積比９５％であった。

（実施例１２）ＰＮＤ１−７のｉｎｖｉｔｒｏ評価
（１）ＤＯＸの抗腫瘍活性に及ぼすＮＤ２０１誘導体の影響（Ｃｏｌｏｎ２６）
Ｃｏｌｏｎ−２６細胞を５×１０^４細胞／ｗｅｌｌで９６穴プレートに１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含むＲＰＭＩ１６４０（Ｆｏｌ−ｆｒｅｅ）培地を用いて播種した。インキュベーション（２４ｈ，３７℃）した後ＰＢＳ１５０ｍＬを用いて洗浄した。次に各種サンプルを含有した無血清ＲＰＭＩ１６４０（Ｆｏｌ−ｆｒｅｅ）培地１５０μＬ添加した。サンプルは、無血清ＲＰＭＩ１６４０（Ｆｏｌ−ｆｒｅｅ）培地（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ドキソルビシン単独（１０ｍＭ）（ＤＯＸａｌｏｎｅ）、ＤＯＸ／ＰＮＤ１−７（モル比１：１）（１０ｍＭ）、ＤＯＸ／８ＨＰ−ＮＤ２０１（モル比１：１）（１０ｍＭ）とした。次にインキュベーション（２４ｈ，３７℃）し、ＰＢＳ１５０ｍＬを用いて洗浄した。ＨＢＳＳ１００ｍＬ及びＷＳＴ−１溶液１０ｍＬ添加した後、インキュベーション（３０ｍｉｎ，３７℃）した。マイクロプレートリーダーにより吸光度測定（Ｓ：４５０ｎｍ，Ｒ：６２０ｎｍ）

（２）ＤＯＸの抗腫瘍活性に及ぼすＮＤ２０１誘導体の影響（ＫＢ細胞、図８Ｂ参照）
ＫＢ細胞を５×１０^４細胞／ｗｅｌｌで９６穴プレートに１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｆｏｌ−ｆｒｅｅ）培地を用いて播種した。培養（２４時間，３７℃）後、ＰＢＳ１５０μＬを用いて洗浄した。サンプル含有無血清ＲＰＭＩ１６４０（Ｆｏｌ−ｆｒｅｅ）培地１５０μＬ添加した。サンプルは、無血清ＲＰＭＩ１６４０（Ｆｏｌ−ｆｒｅｅ）培地（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ドキソルビシン単独（１０ｍＭ）（ＤＯＸａｌｏｎｅ、ＤＯＸ／ＰＮＤ１−７（モル比１：１）（１０ｍＭ）、ＤＯＸ／８ＨＰ−ＮＤ２０１（モル比１：１）（１０ｍＭ）とした。培養（２４ｈ，３７℃）後、ＰＢＳ１５０ｍＬを用いて洗浄して、ＨＢＳＳ１００ｍＬ及びＷＳＴ−１溶液１０μＬを添加し、インキュベーション（３０ｍｉｎ，３７℃）した後、マイクロプレートリーダーにより、吸光度測定（Ｓ：４５０ｎｍ，Ｒ：６２０ｎｍ）した。

結果を図７に示す。Ｉｎｖｉｔｒｏ実験において、Ｃｏｌｏｎ−２６細胞ではＮＤ２０１−８ＨＰおよびＰＮＤ１−７の何れの複合体でも細胞殺傷効果が見られた。ＫＢ細胞でも同様であった。

（実施例１３）ＰＮＤ１−８の合成
ＰＮＤ１−８は、ＮＤ１００→ＮＤ１００−ＮＨＣＯＮＨ−ＰＥＧ→ＰＮＤ１−８の経路により合成した。具体的には、窒素気流中でＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ＮＯＦ社ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＭＥ−０２０ＡＣ）５０．６ｍｇを５ｍｌのＤＭＳＯ溶液にして、ＤＰＰＡを５０μｌ及びＤＡＢＣＯを１５．２ｍｇ加え、油浴で１２５℃にて２時間加熱した。室温に冷却後、国際特許公開ＷＯ２００９／０４１６６６記載の方法に従って合成したＮＤ１の前駆体６−ヘプタキス（５−アミノカプリルアミドカプリルアミド）−β−シクロデキストリン（ＮＤ１００）７７．６ｍｇを３ｍｌのＤＭＳＯに溶解して加えた。さらにＤＡＢＣＯ３０ｍｇを加えて、室温で４５時間反応させた。次にこの反応混合物に葉酸２３３ｍｇと等モルのＤＭＴ−ＭＭ及び１，４−ジアザビシクロ［２，２，２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）５８．８ｍｇを加え、４５時間反応した。

この反応溶液をＳＥＣカラムＪＡＩＧＥＬＧＳ−３１０ φ２１．５ｍｍ×５００ｍｍに炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）を溶離液として流速７．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出２８６ｎｍにて分取した。ＨＰＬＣクロマトグラムにて、最初に流出する単独のシャープなピークの成分（面積比３４％）を分取し、凍結乾燥しＰＥＧ化ＮＤ１（ＰＮＤ１−８）３０ｍｇ（収率３２％）を得た。ＨＰＬＣ純度は８０％であった。

この生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓｆｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ）による測定は、ｍ／ｚ５３２３を中心に４５００〜６５００に幅広いピークで、ＰＥＧ基が１個導入したと思われる山なりの分布を示す単一のピークが見られた。原料のＮＤ１００が３０８１及びＰＥＧ体２２９０のピークも見られた。

ＰＮＤ１−８はＰＥＧ−ＣＯＯＨをＤＰＰＡ試薬によりＰＥＧ−ＮＣＯに変えて、反応性を高めた後に、１：１モル比の反応を行った後、ＰＥＧの導入結合はウレタン結合となっている。残りのＲ２位に葉酸をアミド結合で導入した。ＰＮＤ１−７に比べて短時間で収率よく合成が出来た。

ここで、ＰＮＤ１−７、ＰＮＤ１−８合成では、葉酸導入数は必然的に７個ではなく６個となる。ナノクラスター効果がその分減じることが懸念されるが、経験的には６個でも抗体と変わらない会合を示した例があり、影響がないと考えられる。また、ＰＮＤ１−８合成で用いたＰＥＧ−ＮＣＯは２級水酸基とも反応性が良いので、２級位側にも導入が可能である。

（実施例１４）ＮＤ２０１−６ＨＰの合成
０．３７ＭのＮａＯＨ水溶液５．０ｍｌにＮＤ２００（Ｐｅｒ（ＨＣｌ・ａｍｉｎｏＣａｐ）−β−ＣＤ）３００ｍｇを室温で溶解したのち氷浴にて冷却しながら６７．５μｌの酸化プロピレンを２０分かけてゆっくりと滴下した。そののち室温に戻して２０時間撹拌した。反応の終了はＴＬＣで確認し原料スポットの消失を確認した。０．５Ｍ−ＨＣｌで中和して反応を終了した。塩を取り除くために透析した。透析液は一度交換した。凍結乾燥後して、ＨＰ化ＮＤ２００を収量１００．３ｍｇで得た。

次に、ＤＭＳＯ４０ｍｌに葉酸７０１．０ｍｇを加えて、７０℃に加温して溶解した。先に得られたＨＰ化ＮＤ２００１００．３ｍｇを室温でＤＭＳＯ１２．９ｍｌに溶解した。この溶解液に、Ｎ−メチルモルホリン１７４．６μｌ，ＤＭＴ−ＭＭ４３９．４ｍｇをメタノール１００μｌとＤＭＳＯ２ｍｌの混合溶液に溶解したものを加えた。同量のＤＭＴ−ＭＭ溶液を１１日間で５回添加し、反応の進行をＨＰＬＣにて追跡した。１１日後にアセトン再沈し吸引ろ過した。サンプルは１Ｍアンモニアを用いて透析した。透析を２回繰り返したのち、溶液を濃縮し、炭酸アンモニア溶液に溶解しＨＰＬＣ分取してＮＤ２０１−６ＨＰを得た。収量は５９．９ｍｇであった。生成物はＴＬＣ（展開液：ブタノール、エタノール、水、アンモニア、呈色：ヨウ素）により、Ｒｆ値０．６７として確認した。ＨＰ化ＮＤ２００はＭＳスペクトルで確認し、ＨＰ化ＮＤ２０１ＨＰＬＣクロマトグラムでも構造を確認した。

ＨＰ化したＮＤ２００の構造の確認に使用したＭＳスペクトルデータ及びＨＰ化ＮＤ２０１のＨＰＬＣのデータを図８に示す。ＭＳスペクトルからＨＰ基は１−９個が導入された混合物である。ＨＰＬＣデータからＮＤ２０１と一致する保持時間に葉酸化した生成物の生成が確認された。

（実施例１５）ＮＤ２０１−６ＨＰの溶解性の評価
ＮＤ２０１あるいはＮＤ２０１−６ＨＰは４．０ｍｇをメイロン静脈注射液（ｐＨ７．９）１．５ｍｌに溶解し，室温にて超音波で３０分処理し、６６０ｎｍの透過率を測定した。ここに溶媒を順次追加して、超音波処理、透過率測定を繰り返した。最大溶解濃度はＮＤ２０１が９ｍｌの溶媒下で透過率２８％であるのに対しＮＤ２０１−６ＨＰは透過率５７．９％と観測された。透過率を吸光度に換算しその比較から溶解濃度の比率が求められた。

結果を図１０に示す。メイロン静脈注射液（ｐＨ７．９）９ｍｌでの６６０ｎｍ透過率％比較からＡ＝−ｌｏｇＴであるので（−ｌｏｇ０．５７９／−ｌｏｇ０．２８）＝０．５５２７／０．２３８０＝２．３２と溶解性の比が求められた。ＮＤ２０１−６ＨＰの溶解性は、ＨＰ化により、ＮＤ２０１と比較して溶解濃度が２．３２倍と増大した。

（実施例１６）ＮＤ２０１−６ＨＰのＫＢ細胞（ＦＲ（＋））による細胞内取り込み評価
ＫＢ細胞内におけるドキソルビシン、ドキソルビシン／ＮＤ２０１複合体、及びドキソルビシン／ＮＤ２０１−６ＨＰ複合体それぞれにおけるドキソルビシンの分布量を比較した。ＫＢ細胞（５×１０^４細胞／ｗｅｌｌ）は葉酸非含有培地にて３７℃で２４時間培養した。細胞は葉酸非含有培地で一度洗浄した後に、ドキソルビシン、ドキソルビシン／ＮＤ２０１、及びドキソルビシン／ＮＤ２０１−６ＨＰをそれぞれ含む培地１ｍｌで３７℃、２４時間培養した。葉酸非含有で洗浄後、蛍光マイクロスコープで走査した。ドキソルビシン、ＮＤ２０１及びＮＤ２０１−６ＨＰの濃度は１０μＭである。

結果を図１０及び図１１に示す。ＮＤ２０１−６ＨＰは、ｉｎｖｉｔｒｏでＫＢ細胞への取り込みはＮＤ２０１とほぼ同じであった。この結果ＮＤ２０１−６ＨＰのドキソルビシンの細胞内への取り込み量はＮＤ２０１と同程度であることを示した。

（実施例１７）ＮＤ２０１−６ＨＰのＫＢ細胞（ＦＲ（＋））による細胞内取り込みへの葉酸の影響の評価
ＫＢ細胞に対してＴＲＩＴＣラベル化ＮＤ２０１とＴＲＩＴＣラベル化ＮＤ２０１−６ＨＰの葉酸の細胞への取り込み効果を調べた。フローサイトメータにより３７℃、１時間の培養後にＴＲＩＴＣの蛍光強度を測定した。ＮＤ２０１とＮＤ２０１−６ＨＰの濃度は１０μＭである。ＮＤ２０１及びＮＤ２０１−ＨＰ系での葉酸の濃度は１０μＭである。

結果を図１２に示す。ＫＢ細胞に対しＴＲＩＴＣラベル化ＮＤ２０１−６ＨＰは、ＴＲＩＴＣラベル化ＮＤ２０１に比して４倍の取り込みを示した。しかし葉酸（１０ｍＭ）の添加により取り込みは大きく減少した。この系への葉酸の阻害作用と考えられる。

（実施例１８）ドキソルビシン内包ＮＤ２０１−６ＨＰのｉｎｖｉｔｒｏにおける細胞増殖抑制作用
ＫＢ細胞において２４時間処理でのドキソルビシン、ドキソルビシン／ＮＤ２０１複合体、ドキソルビシン／ＮＤ２０１−６ＨＰ複合体の抗腫瘍活性を示す。ドキソルビシン、ＮＤ２０１、及びＮＤ２０１−６ＨＰの濃度は１０μＭである。

結果を図１３に示す。ドキソルビシン内包ＮＤ２０１−６ＨＰは、ＫＢ腫瘍細胞の増殖抑制効果がＮＤ２０１よりもさらに改善された。

（実施例１９）ドキソルビシン内包ＮＤ２０１−６ＨＰのｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍作用
ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス（４週齢，２０ｇ）の左後肢に、１日前から１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｆｏｌ−ｆｒｅｅ）培地で培養したＣｏｌｏｎ−２６細胞懸濁液を２×１０^５細胞／１００μＬ播種した。約１０日後、マウスの腫瘍直径が８ｍｍに達したマウスをｉｎｖｉｖｏ実験に使用した。１００μＬのマンニトール溶液（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ドキソルビシン溶液（ＤＯＸ５ｍｇ／ｋｇ）、ＤＯＸ／ＮＤ２０１，ＤＯＸ／ＮＤ２０１−６ＨＰ複合体溶液（ＤＯＸ／ＮＤ２０１−ＨＰ）を担がんマウスの尾静脈内に投与した。ドキソルビシンはいずれも５ｍｇ／ｋｇ相当量となるように用いた。投与後、３１日間、腫瘍体積、体重を経時的に追跡した。生存率をモニタリングした。

結果を図１４に示す。ドキソルビシン内包ＮＤ２０１−６ＨＰは、３０日間にわたって、ＮＤ２０１に比して約３倍の腫瘍増大抑制効果を示した。

Claims

下記一般式（Ｉ）で表されるシクロデキストリン化合物
［式中、ｍは６〜８の整数を表し、
ｍ個のＲ^１は、各々独立して、水素原子、水酸基、−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｒ^２基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２基、−Ｚ基、−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｒ^２−Ｚ基、及び、−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、からなる群から選択される基を表し、
ここで、ｍ個のＲ^１のうち、少なくとも２個は、−Ｚ基、−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｒ^２−Ｚ基、及び、−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２−Ｚ基からなる群から選択される基であり、
ｍ個のＸ^１、ｍ個のＸ^２、及びｍ個のＸ^３は、各々独立して、水素原子、水酸基、−Ｒ^２、−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨＣＯＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−ＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基、−ＮＨ−Ｙ−ＣＯＮＨ−Ｙ−Ｒ^２基、及び、−ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｙ−Ｒ^２基からなる群から選択される基を表し、
かつ、ｍ個のＲ ^１のうち、少なくとも１個はＲ ^２を含む基であり、
ここで、Ｙは、各々独立して、アルキレン基、フェニレン基、及び、−Ｏ−基から選択される基を表し、
ここで、Ｒ^２は、各々独立して、二価の場合には、−（ＣＨ _２ −ＣＨ _２ −Ｏ） _ｐ −基、又は、−（ＣＨ _２ −ＣＨ（ＣＨ _３）−Ｏ） _ｔ −基を表し、一価の場合には、−（ＣＨ _２ −ＣＨ _２ −Ｏ） _ｐ −Ｈ基、−（ＣＨ _２ −ＣＨ _２ −Ｏ） _ｐ −Ｃ１〜６アルキル基、又は、−（ＣＨ _２ −ＣＨ（ＣＨ _３）−Ｏ） _ｔ −Ｈ基（ここで、ｐは２０〜８０、ｔは１〜２０である）を表し
ここで、Ｚ基は下記式（ＩＩ）で表される基を示す
式中、ｎは０〜３の整数を表す］。