KR101466511B1 - 저산소증 관련 질환의 진단 및 치료용 저산소 감응형 나노입자 - Google Patents

저산소증 관련 질환의 진단 및 치료용 저산소 감응형 나노입자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 저산소 조건에서 성질 및 구조가 변할 수 있는 양친성 고분자 및 이의 자가조립을 통해 형성된 나노입자에 관한 것이다. 본 발명에 따른 저산소 감응형 나노입자는 저산소 조건에서 선택적으로 약물을 방출함으로써, 저산소증을 수반하는 질환에 대한 선택적인 진단 및 치료에 적용할 수 있다. 특히, 암 치료에 있어서 타겟 종양에 대하여만 약물을 방출할 수 있어, 부작용을 최소화시키고 치료효과를 극대화할 수 있다.

Description

저산소증 관련 질환의 진단 및 치료용 저산소 감응형 나노입자{hypoxia-responsive nanoparticle for therapy and imaging of hypoxia-involving diseases}
본 발명은 저산소 조건에서 성질이 변함으로써 저산소증 관련 질환의 진단 및 치료용으로 사용할 수 있는 나노입자에 대한 것이다.
적절한 산소의 공급이 이루어지지 않는 병리적 상태를 의미하는 저산소증(hypoxia)은 암, 심장질환, 허혈성 질환, 류마티스 관절염 및 혈관 관련 질환과 같은 다양한 난치병의 전형적인 특징이다. 예를 들어, 허혈성 뇌졸증 및 암에서 측정된 조직의 산소 분압(tPO2)이 거의 0 mmHg으로, 정상 조직에서보다(~ 30 mmHg) 상당히 낮다는 것이 실험적 또는 임상적으로 입증되었다. 저산소증이 질병의 다양한 측면에 연관되어 있기 때문에, 이는 병의 치료 반응에 상당한 영향을 미친다. 특히, 저산소증은 약제내성(chemoresistance), 방사성 저항성(radioresistance), 혈관형성, 생체내침입성 및 암세포의 전이에 기여하기 때문에, 암 치료에 있어서 부정적인 영향을 미친다. 그럼에도 불구하고, 정상 조직에서 드물게 발견되는 이런 독특한 특성 때문에 저산소증은 진단제 및 치료용 약물의 개발에 있어서 표적으로 부상하고 있다. 저산소증-타겟 암 치료를 위한 대표적인 접근은 약제내성을 유발하는 저산소 유도인자(hypoxia inducible factor-1)를 규제하는 것 및 저산소 환원성 분위기에서 활성화되는 생체환원성 프로드러그(bioreductive prodrugs)의 사용에 기초하고 있다.
저산소증 영상을 위하여, 많은 니트로방향족 또는 퀴논 유도체가 진단제로서의 분자 설계에 저산소-민감성 물질(moieties)로서 적용되었다. 2-니트로이미다졸은 저산소에 대해 높은 민감성을 가지기 때문에, 생체환원성 프로드러그 뿐만 아니라 영상물질로도 가장 널리 이용되어 왔다. 저산소 조건하에서, 2-니트로이미다졸(NIs)은 선택적 생체환원을 통해 친수성 2-아미노이미다졸로 변한다. 이러한 2-아미노이미다졸은 저산소 조직의 거대분자에 대해 높은 반응성을 가진다.
양친성(amphiphilic) 고분자로 이루어진 자기 조립 고분자 나노입자는 다양한 항암 약물의 유망한 나노캐리어로 주목받고 있다. 이는 약물전달용 나노캐리어로서 독특한 특징을 가지고 있다. 이러한 특징은 강화된 약물 용해성, 높은 열역학적 안정성 및 enhanced permeation and retention(EPR)을 통한 암 세포내로의 우선적 축적 등을 포함한다. 그러나, 종래의 나노캐리어는 타겟 지역에 특이적이지 않은 약물 방출로 인해 제한된 항암 효능을 보여주었다. 최근, 치료적 효과를 증가시키기 위해, 암 병리적인 조건에 반응하는 고분자 재료를 사용한 약물 전달을 위한 나노입자가 제조되고 있다. 이러한 자극-반응성 나노입자는 EPR 효과를 통해 암 위치에 도달하고, 암 조직에 노출되었을 때 약물을 빠르게 방출한다. 이러한 스마트 나노캐리어를 위해, 다양한 자극의 적용이 연구되어 왔다. 이러한 자극은 자외선, 글루타티온, pH 및 온도를 포함한다. 그 결과, 임상실험에서 몇몇 자극 반응성 약물 캐리어가 개발되었다.
그러나, 저산소증(Hypoxia)이 다양한 난치병 질환과 관련이 있음에도 불구하고 아직까지 저산소 조건에 능동적으로 감응하여 약물을 방출하는 고분자 및 그를 이용한 나노입자는 개발되지 않았다.
이에, 본 발명자들은 저산소증을 수반하는 각종 난치성 질환의 진단 및 치료에 응용 가능한 나노캐리어에 대해 연구하던 중, 산소농도(oxygen concentration)에 따라 그 구조가 달라지는 양친성 고분자 복합체가 저산소 조건에서 선택적으로 약물을 방출하여 저산소증 관련 질환의 진단 및 치료에 응용가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 카르복시기를 갖는 카르복시메틸 덱스트란(CM-Dex), 및 아민기를 갖는 하기 화학식 1의 화합물이 아미드 결합으로 결합된(conjugated) 양친성 고분자를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112013103060008-pat00001
상기 식에 있어서, 상기 R1은 아민 또는 C1 내지 C10인 알킬아민이다.
본 발명에서, 상기 양친성 고분자는 5,000 내지 1,000,000의 분자량을 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 수성 용매 내에서 본 발명에 따른 양친성 고분자가 자가조립(self-assembled)을 통해 형성된 나노입자로서, 상기 나노입자는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 내부에 상기 카르복시메틸 덱스트란이 외부에 위치하는 것인, 나노입자를 제공한다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
"저산소증(hypoxia)"은, 정상조직과 비교했을 때 조직세포의 산소분압이 비정상적으로 낮은 경우를 가리킨다. 이는 암, 허혈성 뇌졸증, 관절염 등의 난치성 질환에서 공통적으로 나타나는 특징이다. 암의 경우, 암조직이 성장함에 따라 고형암의 내부가 혈관으로부터 산소 공급을 받지 못하여 저산소 환경이 된다. 예를 들어, 정상조직에서의 산소분압이 약 30 mmHg인 반면 암 조직의 산소분압은 거의 0 mmHg이다.
본 발명의 양친성 고분자는 위와 같은 저산소 조건에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 니트로기가 아미노기로 환원되는, 저산소 감응성을 발휘하는 것이 특징이다. 따라서, 이러한 본 발명의 양친성 고분자를 이용하면 저산소 감응형 나노입자 및 약물전달용 캐리어를 제공할 수 있다.
본 발명의 양친성 고분자 중 상기 화학식 1의 화합물 부분은 선택적 생체환원의 특성으로 인해, 저산소 조건(20 mmHg 이하, 바람직하기로 약 0 mmHg) 하에서 2-니트로이미다졸의 니트로기(-NO2)가 아미노기(-NH2)로 환원되어, 2-아미노이미다졸이 될 수 있다. 이때, 아미노기는 니트로기에 비해 상대적으로 친수성을 나타내므로 상기 화학식 1의 화합물 부분이 저산소 조건에서 환원됨으로써 친수성으로 전환된다. 실제로 2-니트로이미다졸의 환원 유도체(reductive derivative)인 2-아미노이미다졸은 물에 잘 용해되는 성질이 있다. 이러한 니트로기의 아민으로의 환원은 6개의 전자의 이동을 통해 발생하고, 니트로소(-N=O) 및 하이드록시아미노(NHOH) 중간체와 관련되어 있다.
아민기를 갖는 상기 화학식 1의 화합물은 아민 개질된 2-니트로이미다졸계 화합물로, 소수성을 나타낸다. 본 발명에 있어서 “소수성”이란 화합물이 물과의 반발력으로 인해 물 또는 수상에서 거의 용해되지 않고 자가응집 하는 성질을 의미한다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 소수성 기능기인 니트로기(-NO2)를 포함함으로써, 화합물 전체가 소수성을 나타낼 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 비제한적인 예로서, 상기 R1이 C6인 알킬아민인 하기 화학식 2로 표시되는 화합물(6-(2-nitro-1H-imidazol-1-yl)hexan-1-amine)이 있다.
[화학식 2]
Figure 112013103060008-pat00002
상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 하기와 같이, 니트로이미다졸과 6-(Boc-아미노)헥실 브로마이드를 반응시켜 6-(2-니트로이미다졸)헥실아민으로 변환시키고(단계 1), 단계 1에서 얻어진 생성물을 농축한 후 메탄올에 용해시키고 HCl을 첨가하여 제조할 수 있다(단계 2).
Figure 112013103060008-pat00003

본 발명에서 사용되는 용어 "카르복시메틸 덱스트란"은, 다당류의 일종으로, 하기와 같은 구조로 표현될 수 있다. 카르복시메틸 덱스트란은 생체적합성 및 생분해성을 가지고 있기 때문에 약물 캐리어로 널리 사용되어 왔다.
Figure 112013103060008-pat00004
상기 카르복시메틸 덱스트란의 일 구조 예에 있어서, 상기 n은 10 내지 2,000일 수 있으나, 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 카르복시메틸 덱스트란은 친수성 백본(backbone)을 형성하고, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 아미드 결합으로 상기 카르복시메틸 덱스트란과 결합되어 소수성을 부여함으로써 양친성을 갖는 고분자를 형성할 수 있다.
구체적으로 카르복시메틸 덱스트란(CM-Dex)과 화학식 2로 표시되는 화합물은 하기와 같은 방법으로 결합하여 양친성 고분자를 형성할 수 있다.
Figure 112013103060008-pat00005

본 발명에서, 상기 카르복시메틸 덱스트란과 화학식 1의 화합물의 복합체는 상기 카르복시메틸 덱스트란의 카르복시기 100개당 화학식 1로 표시되는 화합물이 8 내지 20개가 결합될 수 있다. 바람직하게는, 화학식 1로 표시되는 화합물이 8 내지 11개가 결합될 수 있다. 화학식 1의 화합물이 8 미만으로 결합되는 경우, 과도한 친수성으로 인해 수상에서 나노입자를 형성하지 못한다. 화학식 1의 화합물이 20개 이상으로 결합되는 경우, 입자의 크기가 지나치게 커져서 바람직하지 않거나, 수상에서 나노입자를 형성하지 못하고 침전된다.
나아가 본 발명은 수성 용매 내에서 상기 본 발명에 따른 양친성 고분자가 자가조립을 통해 형성된 나노입자로서, 상기 나노입자는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 내부에 상기 카르복시메틸 덱스트란이 외부에 위치하는 것인, 나노입자를 제공한다.
본 발명에 따른 고분자는 친수성인 카르복시메틸 덱스트란에 소수성기 도입(2-니트로이미다졸)으로 양친성을 나타내어 수성 용매 내에서 자발적인 자가조립(self-assembled)으로 나노입자를 형성할 수 있다. 이때 소수성인 화학식 1의 화합물(2-니트로이미다졸)은 물과의 반발력으로 인해 내부에 위치하여 소수성 코어를 형성하고, 친수성인 카르복시메틸 덱스트란은 외부에 위치하게 된다. 특히 상기 소수성 코어 부분에는 소수성 첨가제(예를 들어, 소수성 약물)의 봉입이 가능하다.
본 발명에서, 상기 수성 용매는 물 또는 이의 혼합물일 수 있으며, 생체 내 pH 범위의 완충액일수도 있다.
형성된 나노입자의 크기는 카르복시메틸 덱스트란의 카르복시기 100개당 화학식 1로 표시되는 화합물의 결합량에 따라 달라진다. 바람직하게는, 생성된 나노입자의 크기는 평균 직경이 170 nm 내지 500 nm 사이, 더 바람직하게는 170 nm 내지 200 nm 일 수 있다.
자가조립된 나노입자는 친수성 부분이 입자의 바깥에, 소수성 부분이 입자의 안쪽에 위치한다. 상기 나노입자는 저산소 조건인 20 mmHg 이하의 산소 분압 하에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 니트로기가 아미노기로 환원될 수 있다. 즉, 소수성인 화학식 1의 화합물의 니트로기가 저산소 환경에 노출되는 경우 아민기로 환원됨으로써 친수성으로 전환됨은 앞서 설명한 바와 같다. 따라서 이러한 성질을 이용하여 저산소증과 관련된 질환의 여러 의약적 용도로 응용할 수 있다.
본 발명의 나노입자는 내부에 약물과 같은 첨가제를 탑재할 수 있다. 상기첨가제는 나노입자의 내부가 소수성이므로(소수성 코어), 소수성인 것이 바람직하고, 이 경우 자가조립시 입자 내부에 소수성 첨가제(예를 들어, 약물)가 봉입될 수 있다. 소수성 첨가제는 소수성을 띄는 물질로서, 친수성 물질이더라도 표면이 소수성으로 개질된 첨가제도 포함하며, 특히 이의 의학적인 유용성을 고려하였을 때 소수성 약물, 소수성 조영제, 소수성으로 표면 개질된 약물, 소수성으로 표면 개질된 조영제 또는 이의 조합일 수 있다.
나아가 본 발명의 나노입자는 Enhanced Permeation and Retention(EPR) 효과를 통해 암 조직에만 특이적으로 축적될 수 있다. 이러한 EPR 효과를 이용하여 약물 수송을 하는 경우에는 적극적인 약물 표적화 시스템과는 달리, 암 세포에 특이적인 표적화 부위에 의존하지 않아, 경구 또는 단순 혈액 내 투여 등을 통해서도 암 세포에만 특이적으로 약물을 수송할 수 있다.
본 발명에 따라 소수성 첨가제를 탑재한 나노입자는 혈관을 따라 체내를 이동하다가, 종양 위치에서 저산소 환경(20 mmHg 이하)에 노출 시, 나노입자 내부의 화학식 1의 화합물 부분의 니트로기가 아민기로 환원된다. 따라서, 나노입자 내부는 친수성으로 전환되며 내부에 포함되어 있던 소수성 첨가제가 반발력으로 인해 나노입자 외부로 방출된다. 즉, 저산소 환경에서만 선택적으로 첨가제를 방출할 수 있다.
따라서, 본 발명의 저산소 감응형 나노입자는 저산소증과 관련된 질환의 진단 및 치료를 위한 약물전달을 위한 캐리어로서 사용될 수 있다.
저산소증과 관련된 질환의 비제한적인 예로는 암, 심장질환, 허혈성 질환, 류마티즘 관절염 및 혈관 관련 질환이 있다. 따라서, 본 발명의 나노입자는 상기 질환의 진단 및 치료에 관련된 약물을 상기 질환부위로 운반할 수 있는 담체(carrier)로 사용될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 나노입자에 탑재될 수 있는 첨가제는 양친성 고분자로 이루어진 나노입자 내부의 소수성 코어 영역에 봉입될 수 있는 한, 어떠한 약물도 포함될 수 있다. 이에 대한 비제한적인 예로는 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cis-platin), 도세탁셀(decetaxel), 타목시펜(tamoxifen), 캄토세신(camtothecin), 아나스테로졸(anasterozole), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 베로테칸(belotecan), 이리노테칸(irinotecan), 글리벡(gleevec), 및 빈크리스틴(vincristine) 등의 항암제가 있다. 또한 상기 소수성 약물의 비제한적인 예로는 살리실레이트(salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 나프록센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐타존(phenyltazone), 메소트렉세이트(methotrexate), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone), 및 코르티코스테로이드(corticosteroid) 등의 항염증제가 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 생체 내(in vivo) 생분배(biodistribution) 실험을 수행하였다. 요약하면, 살아있는 동물의 NIRF 이미지는 본 발명의 HR-NPs이 효과적으로 종양 사이트에 축적될 수 있음을 보여주었다. 또한 DOX-HR-NPs가 free DOX와 비교하여 향상된 항종양 효과를 보여주었다. 전체적으로, 본 발명에 따른 실험 결과들은 HR-NPs가 소수성 약물을 저산소 세포 내로 선택적인 전달을 할 수 있는 약물 전달체임을 뒷받침할 수 있다.
본 발명에 따른 저산소 감응형 나노입자는 저산소 조건에서 입자의 성질변화로 인해 선택적으로 약물을 방출함으로써, 저산소증을 수반하는 질환에 대한 선택적인 진단 및 치료에 적용할 수 있다. 특히, 암 치료에 있어서 타겟 종양에 대하여만 약물을 방출할 수 있어, 부작용을 최소화시키고 치료효과를 극대화할 수 있다.
도 1은 화학식 1의 화합물, 6-(2-니트로이미다졸)헥실아민 및 본 발명의 저산소 감응형 나노입자의 1H NMR 결과이다.
도 2a는 DS수가 8(HR-NP8) 및 11(HR-NP11)일때의 입자 크기 분포 및 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 2b는 HR-NP8 및 HR-NP11 나노입자의 체내 환경에서의 입자 크기 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 정상산소 및 저산소 환경에서 HR-NP8 및 HR-NP11 나노입자의 제타 전위를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 정상산소 및 저산소 환경에서 입자(HR-NP8 및 HR-NP11)의 흡수 스펙트라를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 정상산소 및 저산소 환경에서 DOX가 로딩된 입자의 in vitro DOX 방출 거동을 나타낸 그래프이다.
도 6a는 DOX가 로딩되지 않은 나노입자의 in vitro 세포 독성을, 도 6b는 DOX가 로딩된 나노입자 및 free DOX의 세포 독성을 나타낸 것이다.
도 7은 (a) 정상산소 및 (b) 저산소 환경에서 HR-NPs로부터 DOX의 세포 내 방출을 나타낸 이미지이다.
도 8은 종양-배양 생쥐의 생체 내(in vivo) HR-NP11의 비-침습성 형광 이미지이다. (a) SCC7 종양이 배양된 무흉선 누드 생쥐의 Cy5.5-HR-NP11 정맥 주사 이후, 시간-의존적 몸 전체 이미지를 나타낸 것이고, (b) HR-NP11 주사 하루 이후에 수집된, 정상 장기 및 종양 조직의 탈체(ex vivo) 형광 이미지를 나타낸 것이고, (c) 정상 장기 및 종양 조직의 HR-NP11의 정량화를 나타낸 것으로, 오차 바(error bar)는 그룹 당 5마리 동물들간의 표준 편차를 나타낸 것이고, (d) 저산소 종양 조직의 시간적 스테이닝을 나타낸 것으로, FITC-표식된 단일 클론 항체가 저산소 조직 스테이닝으로 사용된 것을 나타낸 것이다.
도 9는 DOX-HR-NP11의 항종양 효과를 나타낸 것이다. (a) 식염수, free DOX 및 DOX-HR-NP11가 DOX 투여량으로 5mg/kg 만큼 처리된, 이종 이식SCC7 종양의 성장을 나타낸 것이고, (b) 처리 16일 후 종양 무게를 나타낸 것으로, 오차 바(error bar)는 그룹 당 5마리 동물들간의 표준 편차를 나타낸 것이다. (별표(*)는 one-way Anova test로 계산된, 통계적으로 현저한 차이(p < 0.05)를 의미한다.)
도 10은 본 발명의 약물-탑재 저산소 감응형 나노입자(HR-NPs)의 합성 과정 및 생체 내(in vivo) 종양-표적 경로를 나타낸 것이다. 상기 HR-NPs는 종양 사이트에 EPR 효과를 통하여 도달할 수 있으며, 이어서 저산소 조직 세포 내에서 약물을 방출할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 저산소 -반응성 복합체의 제조
1) NI 유도체의 제조
Figure 112013103060008-pat00006
2-니트로이미다졸(0.6 g, 5.3 mmol)을 DMF에 용해시키고, 여기에 K2CO3(1.1g, 7.05 mmol)을 첨가하였다. 여기에 6-(Boc-아미노)헥실 브로마이드(1.56 g, 5.57 mmol)를 적가하고 밤새 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 메탄올로 세척한 후, 잔여 용매를 증발시켰다. 수득된 고체를 물에 분산시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 황산나트륨으로 건조시킨 후, 생성물을 농축시켰다. 이를 메탄올에 용해시키고 0℃로 냉각하고, 1.25 M HCl 10 ml를 첨가하고 24시간 교반하였다. 회전식 증발기를 이용하여 반응 혼합물로부터 용매를 제거하였다. 조(crude) 고체를 에탄올로 재결정화하고 아민-기능화된 2-니트로이미다졸계 화합물(NI 유도체)을 수득하였다. 제조된 NI 유도체의 NMR 데이터를 도 1a에 나타내었다.
2) 저산소 반응성 복합체의 제조
포름아미드와 디메틸포름아미드의 1:1 혼합물에 CM-Dex(0.2g, 0.9 mmol)를 용해시킨 후, EDC 및 NHS를 첨가하고 15분간 교반하였다. DMF 중 NI 유도체를 반응 혼합물에 천천히 첨가하고 하루동안 교반하였다. NI 유도체, EDC 및 NHS의 양을 달리하여 총 4가지 조건에서 실험하였으며, 각 실험 조건은 하기 표 1과 같다.
샘플 NI EDC NHS
HR-NP1 0.038g
(0.18mmol)		 0.138g
(0.71mmol)		 0.082g
(0.71mmol)
HR-NP3 0.076g
(0.36mmol)		 0.276g
(1.43mmol)		 0.162g
(1.43mmol)
HR-NP8 0.191g
(0.9mmol)		 0.690g
(3.6mmol)		 0.410g
(3.6mmol)
HR-NP11 0.382g
(1.8mmol)		 1.380g
(7.2mmol)		 0.830g
(7.2mmol)
생성 용액을 하루 동안 과량의 물/메탄올(1v/3v)로 투석시키고, 2일 동안 증류수로 투석한 후 동결건조 하였다. UV/Vis 분광광도계(Optizen 3220UV, Mecasys Co., Ltd., Daejeon, Korea)를 이용하여 325 nm에서 NI 유도체의 특징적인 피크를 통해 CM-Dex에 대한 NI 유도체의 양을 분광광도학적으로 결정하였다.
실험된 샘플 중 HR-NP11을 D 2O: CD 3OD(1v:1v)에 녹이고, 300 MHz에서 동작하는 1H NMR(JNM-AL300, JEOL, Tokyo, Japan)을 이용하여 복합체의 화학구조를 특정하였다. 그 결과를 도 1b에 나타내었다. 그 결과, 복합체에서 CM-Dex의 양성자 피크 및 NI 유도체의 양성자 피크가 관찰되었다(1.2 - 2.6 ppm: 지방족 양성자, 7.2 및 7.2 ppm: 2-니트로이미다졸의 양성자). 이를 통해, CM-Dex 및 NI 유도체의 복합체가 형성되었음을 확인할 수 있었다.
실험예 1: 입자의 특성 분석
CM-Dex의 카르복시기에 대한 NI 유도체 아민기의 Molar feed ratio를 다르게 하여, 다양한 복합체를 제조하였다. Molar feed ratio에 따라 DS(치환정도, CM-Dex의 당 잔기 100개당 NI 유도체의 수)값이 달라졌으며, 그 상관관계를 하기 표 2에 나타내었다. HR-NPn은, 저산소 감응형 나노입자(Hypoxia response nanoparticle)의 약자로, n은 DS 수를 의미한다(예: HR-NP8 = CM-Dex의 당 잔기 100개당 NI 유도체가 8개 결합된 저산소 감응형 나노입자).
입자의 크기는 25℃에서 FPAR-1000 fiber optics particle analyzer(Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 결정하였다. 그 결과 DS값이 7보다 큰 경우에만 입자가 형성되었다. DS 값이 이보다 낮은 경우에는 강한 친수성으로 인해 나노입자가 형성되지 않았다. 이를 하기 표 2에 나타내었다.
샘플[a] FR[b] DS[c] Size (nm)[d] X[e]
HR-NP1 0.2 1.86 - 1.65
HR-NP5 0.4 3.35 - 2.98
HR-NP8 1.0 7.99 176.38 ± 3.55 7.11
HR-NP11 2.0 11.76 192.22 ± 3.42 10.47
[a] 다양한 DS 값을 갖는 HR-NPs, [b] CM-Dex의 당 잔기에 대한 N-아민의 Molar feed ratio, [c] 325 nm에서 UV-vis 스펙트라를 이용하여 측정된 CM-Dex 분자에 대한 N-아민의 치환 정도, [d] 입자 분석기를 이용하여 특정된 평균 직경, [e] 복합체 내 NI 유도체의 중량비
또한, DS가 8일때(HR-NP8) 및 11일때(HR-NP11)의 입자 크기 분포 결과를 도 2a에 나타내었다. 그 결과, 상기 두 입자의 평균 직경은 179-194 nm 사이였고, DS값이 클수록, 크기의 분포 정도가 작음을 확인할 수 있었다.
200 ekV의 가속 전압에서 작동하는 TEM(TEM, Philips CM30)을 이용하여 입자의 형태(morphology)를 관찰하였다. 실험은 HR-NP8 및 HR-NP11을 이용하였다. TEM 이미지를 얻기 위해, 샘플을 증류수에 분산시키고 200 메쉬의 구리 그리드(copper grid)에 떨어뜨렸다. 모든 샘플은 1% 우라닐 아세테이트로 음성 염색하였다. 상기 결과를 도 2a에 나타내었고, 직경 약 200 nm의 원형입자가 생성되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 생리적 용액(pH 7.4)에 4일 동안 두면서 입자 크기 변화를 관찰하고, 이를 도 2b에 나타내었다. 이를 통해, 시간이 경과해도 입자크기의 변화가 없으며 생성된 나노입자가 체내에서 뛰어난 안정성을 가짐을 확인할 수 있었다.
zetasizer(90 PLUS, BrookHAVEN Instruments Cooperation, New York, USA)를 이용하여 HR-NP8 및 HR-NP11의 정상산소 및 저산소 조건에서 제타 전위를 측정하였다. 저산소 조건은 CO2/O2 incubator(Vision Scientific Co., Ltd, Korea)를 이용하여 유지시켰다. 측정된 제타 전위 값을 도 3에 나타내었다. 모든 제타 전위 값은 음수였고, 이를 통해 나노입자의 표면이 친수성인 CM-Dex로 이루어졌음을 확인할 수 있었다. NI 유도체가 CM-Dex의 카복실기와 결합하기 때문에, HR-NP8보다 HR-NP11이 더 낮은 제타 전위를 나타내었다. 즉, HR-NP11은 복합체에 NI 유도체가 더 많이 결합되어 있기 때문에 제타 전위의 감소가 두드러짐을 확인할 수 있었다.
실험예 2: HR - NPs 의 저산소 민감도 측정
생성된 HR-NPs, 즉 HR-NP8 및 HR-NP11의 저산소 조건에서의 민감도를 흡수 스펙트럼으로 측정하였다. 생성된 HR-NP8 및 HR-NP11 입자 각각을 정상산소(20% O2, 5% CO2) 또는 저산소(0.1% O2, 5% CO2) 조건의 PBS(pH 7.4)에 3시간 동안, 37도에서 배양시킨 후 흡수 피크의 변화를 측정하고, 이를 도 4에 나타내었다.
그 결과, 정상 산소 조건의 경우 HR-NP8 및 HR-NP11 모두에서 특정한 흡수 피크의 변화가 나타나지 않았다. 그러나 저산소 조건의 경우, HR-NP8 및 HR-NP11 모두에서 325 nm에서 복합체의 2-니트로이미다졸의 특징적인 피크가 완전히 사라졌고 278 nm에서 2-아미노이미다졸에 해당하는 특징적인 피크가 나타났다. 이를 통해 저산소 조건하에서 2-니트로이미다졸의 니트로기가 아미노기로 변환된 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3: HR - NPs 로부터 약물 로딩 및 DOX 방출 실험
저산소 조건이 약물 방출 거동에 미치는 영향을 분석하기 위해, HR-NP11 캡슐안에 DOX를 포함시켰다.
약물 로딩 효율은 76% 이었으며, 에멀젼 법을 이용하였다. 즉, 3.0 등몰의 트리에틸아민을 포함하고 있는 클로로폼에 DOX-HCl를 용해시켰다. 생성 용액을 HR-NPs의 수성 용액에 첨가하여, oil-in-water 에멀전을 형성시켰다. 이를 밤새 어두운 환경에 놓고, 교반하여 클로로폼을 증발시켰다. 그리고 로딩되지 않은 DOX를 제거하기 위해 상기 용액을 24시간 동안 과량의 증류수로 투석하였다. 그 후 동결건조하여 DOX-HR-NP11을 수득하였다.
약물 DOX의 로딩 효율 및 로딩 함량은 하기 식에 따라 계산되었다:
로딩 효율(%)=(탑재(로딩)된 약물의 무게/투입한 약물의 무게) × 100%
로딩 함량(%)=(탑재된 약물의 무게/고분자의 무게) × 100%
DOX가 탑재(로딩)된 DOX-HR-NPs의 로딩 효율과 로딩 함량은 각각 76% 및 7.6 wt%였다.
방출 실험을 위해, DOX-HR-NP11을 PBS(pH 7.4)안에 분산시켰다. 상기 용액을 셀룰로오스 멤브레인 튜브(MWCO = 3500 Da)안으로 이동시켰다. 그 후, 100 μM NADPH를 함유한 진공처리된 PBS안으로 dialysis tube를 침지시켰다. 그리고 방출 실험 동안 질소 진공처리를 유지하였다. 저산소 조건을 유지하기 위해 진공처리를 계속 수행하였다. 대조군 실험을 위해(정상산소), 샘플을 진공처리 없이 100 μM NADPH를 함유하는 PBS(pH 7.4)안으로 침지시켰다. 각각의 샘플을 37℃에서 100 rpm으로 부드럽게 교반하였다. 배지(medium)를 기정시간 간격으로 새롭게 하고 485 nm에서 UV/VIS spectrophotometer를 이용하여 DOX 농도를 측정하였다. 상기 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 3시간 동안 정상산소 조건 또는 저산소 조건에 노출되었을때 각각 DOX-HR-NP11의 형광 스펙트라를 보여준다. 정상산소 조건에서, DOX의 형광 강도는 미세하게 증가하고, 이는 HR-NP11로부터 적은 양의 DOX가 방출되었음을 의미한다. 그러나, HR-NP11이 저산소 조건으로 처리된 경우, 강한 형광 신호가 관찰되었다. 이는, DOX의 급격한 방출을 나타낸다. HR-NP11의 DOX 방출을 시간에 따라 정량적으로 분석하여 도 3b에 나타내었다. 예상과 같이, DOX 방출은 정상산소 조건보다 저산소 조건에서 현저하게 높았다.
즉, 상기 결과는 정상산소 조건의 경우, 12시간동안 49%의 DOX가 방출되지만, 저산소 조건의 경우, 12시간 후 DOX가 완전히 방출된다는 것을 보여준다. 이를 통해 HR-NP11이 저산소 조건에서 선택적으로 DOX를 방출한다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 세포 독성 및 세포 내 약물 방출 실험
본 발명에 따른 저산소 감응형 나노입자의 생체 내 세포독성을 평가하기 위해, MTT 분석을 이용하였다.
American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)으로부터 구입한 SCC7(squamous carcinoma) 세포주를 10% (v/v) fetal bovine serum 및 1% (w/v) 페니실린-스트렙토마이신을 포함하고 있는 RPMI 1640 배지에서, 37℃의 습한 5% CO2 - 95% 공기 분위기에서 배양하였다. 상기 세포는 96-well 평판 플레이트에 1×104 cells/well의 농도로 씨딩(seeding)하였다. 하루 동안 성장시킨 후, 세포를 PBS(pH 7.4)로 두번 세척하고 정상산소 또는 저산소 조건하에서 free DOX 또는 다양한 농도의 DOX-HR-NPs(HR-NP8 및 HR-NP11)로 배양시켰다. 세포는 PBS로 두번 세척하고 새로운 배지(fresh culture medium)를 첨가하였다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 용액(PBS 중 5 mg/ml) 20 마이크로리터를 각각의 well에 첨가하고, 세포를 추가적으로 4시간 동안 37℃에서 배양하였다 그 후, 배지(medium)을 제거하고, 세포를 DMSO에 용해시켰다. microplate reader(BioTek, Seoul, Korea)를 이용하여 570 nm에서의 흡수도를 측정하였다.
상기 방법으로 분석된 세포 독성 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6a에서 고분자 농도가 100 ㎍/ml에 이를 때까지, HR-NP8 및 HR-NP11은 SCC7 세포에 대하여 세포독성을 보여주지 않았다. 또한, 정상산소 및 저산소 조건에서 free DoX도 실험하였다.(도 6b) 저산소 조건에서 free DOX의 세포독성은 정상산소 조건에서의 세포독성과 유사하였다. 반면, 저산소 조건에서 DOX-HR-NP11은 정상산소 조건에서보다 현저히 높은 세포독성을 보여주었다. 이는 감소된 산소 농도하에서 HR-NP11의 빠른 DOX 방출에 기인하는 것으로 보인다. 이를 통해, 저산소 조건이 HR-NP11의 DOX 방출을 촉진한다는 것을 확인할 수 있었다.
HR-NP11로부터 세포 내 약물 방출을 조사하기 위해서, 세포를 DOX-HR-NP11과 함께 12시간 동안 정상산소 또는 저산소 조건하에서 배양시켰다. 세포를 PHS(pH 7.4)로 두 번 세척하고 4% 포름알데히드 용액을 이용하여 고정시켰다. 핵 염색을 위해, 세포를 4,6-디아미노-2-페닐인돌(DAPI)로 10시간 동안 상온에서 배양하고, PBS(pH 7.4)로 세척하였다. HR-NP11로부터 방출된 DOX의 세포 내 위치는 IX81-ZDC focus drift compensating microscope(Olympus, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다. 상기 결과를 도 7에 나타내었다.
그 결과, 저산소 조건에서 DOX-HR-NP11을 12시간 동안 배양시킨 후, 세포의 세포질에서 강한 형광이 관찰되었다(도 7b). 이는, 본 발명의 나노입자로부터의 급격한 DOX의 방출을 의미한다. 반면, 정상산소 조건에서 배양시킨 샘플은 세포질에서 약한 형광이 관찰되었다.(도 7a) 즉, 이를 통해 저산소 조건에서 세포 내 약물 방출이 촉진된다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5: 생체 내 ( in vivo ) HR - NPs 의 생분배 ( biodistribution ) 및 조직 스테이닝
종래 다수의 나노입자들이 시험관 내(in vitro)에서 우수한 약물 전달 캐리어로서의 효과를 보여주었지만, 정작 임상 응용에 있어서는 대다수가 의도치 않은 생분배(biodistribution) 내지 낮은 종양 표적화의 문제를 보였다. 이에 본 발명에 따른 저산소 감응형 나노입자인 HR-NPs(HR-NP11)의 종양 표적성을 생체 내(in vivo) 측정해보기 위하여, 이를 real-time near-infrared fluorescence(NIRF) 이미지 기법을 이용하여, 아래의 Cy5.5-표식된 HR-NP11을 SCC7 종양-유발 생쥐의 꼬리 혈관에 투여하여 전신 노출(systemic administration) 시켰다.
생리 식염수(100 μl) 내 1×106 SCC7 세포가 분산된 용액을 무흉선 누드 생쥐(7 주, 20-25 g)의 피하에 주사하여 종양-유발 생쥐를 준비하였다. 피하 주사한지 14일이 지난 뒤, Cy5.5-HR-NP11를 종양-유발 생쥐의 꼬리 혈관에 5 mg/kg의 투여량(dose)으로 주사하였다. HR-NP11의 생분배(biodistribution)를 eXplore Optix system(ART Advanced Research Technologies Inc., Montreal, Canada)을 이용하여 시간에 대한 함수로 측정하였다. 레이저 출력 및 카운트 타임 설정은 각각 15 μW 및 0.3초(/point)로 최적화하였다. 선택된 관심 부분에 대하여 1mm의 스텝으로 여기(excitation) 및 방출(emission) 스팟을 래스터 스캔(raster-scanned)하였다. 700nm에서의 형광 방출을 광전자증배관(fast photomultiplier tube, Hammamatsu, Japan) 및 시간상관 단일광자 계수장치(time-correlated single photon counting system (Becker and Hickl Gmbh, Berlin, Germany)를 이용하여 각각 모으고 감지하였다. Cy5.5-HR-NP11를 정맥 주사한지 24시간 뒤에, 주요 장기들과 종양들을 SCC7 종양-유발 생쥐로부터 절개하였다. 절개된 장기들과 종양들의 NIR 형광 이미지를 특수 C-mount 렌즈와 Cy5.5 대역통과 필터(bandpass emission filter, 680 nm to 720 nm, Omega Optical)가 장착된 12-bit CCD 카메라(Kodak Image Station 4000 MM, New Haven, CT)를 이용하여 얻었다. HR-NP11의 조직 분포(tissue distribution)를 관심 부분의 NIR 형광 강도를 측정하여 수량화하였다. 5마리 동물들로 이루어진 군에 대하여 모든 값은 평균값 ± SD로 나타내었다.
저산소 조직 스테이닝(staining)을 위해, 피모니다졸·하이드로클로라이드(HypoxyprobeTM-1)를 저산소 스테이닝 프로브로서 사용하였다. 저산소 세포 내에서 피모니다졸은 활성화되고, 그 뒤에 티올-함유 단백질, 펩타이드 및 아미노산과 공유결합 부가체(adduct)를 형성한다. 부가체는 형광 수식된 단일 클론 항체(Mab1)를 사용하여 스테이닝될 수 있다. 피모니다졸·하이드로클로라이드(100 mg/kg)를 SCC7 종양-배양 생쥐의 꼬리 혈관에 정맥 투여하고, 30분이 지난 뒤 Cy5.5-HR-NP11(5 mg/kg)를 주입하고 1시간 동안 방치하였다. 최종적으로, Hoechst 33342를 주입하고 세포 핵을 표식하기 위해 10분 동안 방치하였다. 저산소 조직 스테이닝을 위하여, 종양 조직을 희생 생쥐로부터 제거하고, 2% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액에 고정하고, 파라핀 내에 넣었다. 냉동 조직을 동결 절단기(CM1850, Leica Microsystems Nussloch GmbH, Germany)를 이용하여 10 내지 20 mm로 분할하였다. 냉동 부분을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액으로 옮기고 4?에서 20분 동안 고정하였다. 고정된 슬라이드를 PBS로 세척하고 메탄올과 함께 -20 ?에서 10분 동안 배양하였고, PBS 함유 1% 소혈청알부민으로 막았다. FITC-결합된 IgG1 마우스 단일 클론 항체(clone 4.3.11.3, Hypoxyprobe, Inc. Burlington, MA, USA)로 1:400 희석하여 1시간 동안 피모니다졸 부가체를 감지하였다. 최종적으로, 스테이닝된 부분을 마운팅 용액에 첨가하고, 커버 슬립으로 커버를 씌우고, 나아가 40× water-emersion objective가 장착된 공초점 현미경(LSM 700, Carl Zeiss Micro Imaging GmbH, Germany)으로 분석하였다. 전체 몸에서 12시간 동안 현저한 NIRF 신호가 검출되었으며, 이는 혈액 내에서 HR-NP11가 계속하여 순환하고 있음을 시사하였다(도 8a). 흥미롭게도, 종양 사이트에서 강한 NIRF신호는 단지 주입 1시간 이후에 관측되었다. 주입 24시간 이후에 회수된, 조직의 탈체(ex vivo) 이미지는 본 발명의HR-NP11이 높은 종양 표적성을 지니고 있음을 뒷받침해주었다(도 8b). 정량적인 분석은, 종양 조직에서의 HR-NP11의 양이 정상 장기(간, 폐, 비장, 신장 및 심장) 내에서보다 최소 4배 더 높음을 보여주었다(도 8c). 또한 면역조직화학법(immunohistochemistry) 기술을 사용한 나노입자적 분배(nanoparticular distribution)가 저산소 종양 조직에서 관측되었다. 도 8d에 나타난 바와 같이, FITC-표식된 단일 클론 항체로 스테이닝된 저산소 조직은 상당량의 HR-NP11를 흡수하였다. 이러한 결과들은 본 발명의 HR-NPs가 생체 내(in vivo) 전신 노출 후에도 효과적으로 저산소 종양 사이트에 도달할 수 있음을 보여준다.
실험예 6: DOX - HR - NPs 의 생체 내( In vivo ) 항종양 효과
본 발명의 HR-NPs의 항-종양 효과를 측정하기 위하여, SCC7 종양 배양 생쥐를 전술한 바와 동일하게 준비하였다. 생쥐는 세개의 그룹으로 나누었다: (i) 정상 식염수 (ii) free DOX, 5 mg/kg 및 (iii) DOX-HR-NP11, 5 mg DOX/kg. 종양들이 8 mm의 직경에 이르렀을 때, 각각의 샘플들을 매일 하루에 3번씩 주사하였다. 종양 부피는 a× b 2/2로 계산하였으며, a 는 가장 큰 직경이고 b 는 가장 작은 직경이다. 테스트된 그룹간 차이의 통계적 유의성(p < 0.05)은 one-way ANOVA test를 이용하여 결정하였다.
식염수로 처리된 대조군은 시간에 따라 종양 부피의 급격한 증가 양상을 보였다. free DOX 투여군의 경우에도 또한 상당한 크기의 증가를 보였으며, 이는 낮은 종양 표적성에 기인한 것이다. 그러나 특히, 종양 부피의 아주 작은 증가만을 보인 군은 DOX-HR-NP11로 처리된 군임이 관찰되었으며, 이는 DOX-HR-NP11가 효율적이고 높은 항종양 효과가 있음을 시사한다(도 9a). 예상한 바와 같이, DOX-HR-NP11로 처리된 생쥐는 그룹들 사이에서 가장 체중이 낮았다(도 9b). 이러한 DOX-HR-NPs의 높은 항종양 활성은, 이들의 종양 선택적 축적 및 이에 뒤이어 저산소 세포 내 약물 방출로 인한 것이다(도 6 및 도 7).
요약하면, 살아있는 동물의 NIRF 이미지는 본 발명의 HR-NPs이 효과적으로 종양 사이트에 축적될 수 있음을 보여주었다. 또한 DOX-HR-NPs가 free DOX와 비교하여 향상된 항종양 효과를 보여주었다. 전체적으로, 상기 실험 결과들은 HR-NPs가 소수성 약물을 저산소 세포 내로 선택적인 전달을 할 수 있는 약물 전달체임을 뒷받침한다.

Claims (13)

  1. 카르복시기를 갖는 카르복시메틸 덱스트란(CM-Dex), 및 아민기를 갖는 하기 화학식 1의 화합물이 아미드 결합으로 결합된(conjugated) 양친성 고분자:
    [화학식 1]
    Figure 112013103060008-pat00007

    상기 식에 있어서, 상기 R1은 아민 또는 C1 내지 C10인 알킬아민이다.
  2. 제1항에 있어서, 5,000 내지 1,000,000의 분자량을 갖는 것인, 양친성 고분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2의 화합물인 것을 특징으로 하는 양친성 고분자:
    [화학식 2]
    Figure 112013103060008-pat00008
    .
  4. 제1항에 있어서, 상기 카르복시메틸 덱스트란은 친수성 백본(backbone)을 형성하고, 상기 화학식 1의 화합물은 아미드 결합으로 결합되어 소수성을 부여함으로써 양친성을 갖는 것을 특징으로 하는 양친성 고분자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 카르복시메틸 덱스트란의 카르복시기 100개당 상기 화학식 1의 화합물이 8 내지 20개가 결합된 것을 특징으로 하는 양친성 고분자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 카르복시메틸 덱스트란의 카르복시기 100개당 상기 화학식 1의 화합물이 8 내지 11가 결합된 것을 특징으로 하는 양친성 고분자.
  7. 수성 용매 내에서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 양친성 고분자가 자가조립을 통해 형성된 나노입자로서,
    상기 나노입자는, 상기 화학식 1의 화합물이 내부에 상기 카르복시메틸 덱스트란이 외부에 위치하는 것인, 나노입자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 나노입자는 20 mmHg 이하의 산소 분압 하에서 상기 화학식 1의 화합물의 니트로기가 아미노기로 환원되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  9. 제7항에 있어서, 평균 직경이 170 nm 내지 500 nm인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  10. 제7항에 있어서, 평균 직경이 170 nm 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  11. 제7항에 있어서, 상기 나노입자 내부에 소수성 첨가제를 탑재하고 있는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 첨가제는 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cis-platin), 도세탁셀(decetaxel), 타목시펜(tamoxifen), 캄토세신(camtothecin), 아나스테로졸(anasterozole), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 베로테칸(belotecan), 이리노테칸(irinotecan), 글리벡(gleevec), 빈크리스틴(vincristine), 살리실레이트(salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 나프록센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐타존(phenyltazone), 메소트렉세이트(methotrexate), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone), 및 코르티코스테로이드(corticosteroid)로 이루어진 약물 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  13. 제11항에 있어서, 상기 나노입자는 20 mmHg 이하의 산소 분압 하에서 상기 화학식 1의 화합물의 니트로기가 아미노기로 환원되어 친수성으로 전환되고,
    상기 소수성 첨가제가 방출되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
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