CN110208236A - 基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的制备方法,包括以下步骤:(1)取脱铁铁蛋白加入水中,调pH至酸性使脱铁铁蛋白解聚;(2)将上述步骤(1)的溶液震荡均匀后逐滴加入由pH敏感和pH不敏感的两种染料组成的混合液,继续震荡一段时间,调节溶液pH至中性使脱铁铁蛋白重新聚合;(3)将上述步骤(2)的混合液室温震荡后过滤,取滤液,超滤离心后收集截留液,即得含有基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的溶液,4℃保存备用。本发明通过将pH敏感和pH不敏感的两种染料经简便的一步混合同时封装到脱铁铁蛋白内部空腔,构建了用于检测细胞内pH值的比率型荧光纳米探针,该探针具有制备简便、稳定性好,抗干扰能力强,细胞毒性低、生物相容性好的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米探针,尤其涉及一种基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针、制备方法及其应用。
背景技术
细胞内pH值是维持细胞内环境的动态平衡及各种细胞器功能正常运行的关键因素。研究表明,许多疾病如乳腺癌、阿尔兹海默症、结肠直肠癌、心肌缺血、囊性纤维化等都与细胞内pH的变化有关,监测细胞内pH的变化有助于了解细胞生理和病理的变化过程。因此,细胞内pH检测对生物体疾病的发生机理及治疗方法的研究具有重要意义。
荧光法因其灵敏度高、操作简便、成本低的优点被用于pH的检测。然而,一般的荧光法检测pH是通过测定单个波长的荧光强度随pH的变化来检测pH值。在此类方法中,探针的荧光强度易受到探针浓度、背景环境、溶剂性质及仪器参数的影响,导致造成测量结果不准确。现有pH响应纳米材料,存在一系列缺陷,譬如生物稳定性和生物相容性差、需复杂的有机反应、化学修饰成本高、无法通过简便、可控的方式调控其响应性能,从而阻碍了其实际应用。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明的目的之一在于提供一种基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的制备方法,具有操作方便,原料易得,可广泛应用的特点。
本发明的目的之二在于提供一种基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针。
本发明的目的之三在于提供一种基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现:
基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)取脱铁铁蛋白加入水中,调pH至酸性使脱铁铁蛋白解聚;
(2)将上述步骤(1)的溶液震荡均匀后逐滴加入由pH敏感和pH不敏感的两种染料组成的混合液,继续震荡一段时间,调节溶液pH至中性使脱铁铁蛋白重新聚合;
(3)将上述步骤(2)的混合液室温震荡后过滤,取滤液,超滤离心后收集截留液,即得含有基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的溶液,4℃保存备用。
进一步地,上述步骤(1)中取置换保存液为水的浓度为1×10-4mol/L脱铁铁蛋白加入水中溶解备用,脱铁铁蛋白的终浓度为5×10-7mol/L。
进一步地,上述步骤(1)中添加0.1mol/LHCl调pH至酸性。
进一步地,上述步骤(2)中pH敏感染料为荧光素,pH不敏感染料为罗丹明B,总终浓度为5×10-4mol/L,荧光素和罗丹明B的摩尔比例为1-9:9-1。
进一步地,上述步骤(2)中震荡10min后加入染料混合液,再继续震荡20min后调节pH至中性。
进一步地,上述步骤(2)中加入0.1mol/LNaOH调节溶液至中性。
进一步地,上述步骤(3)中将混合液在室温震荡2h,采用0.2μm的过滤膜除去聚沉物,用水清洗滤膜后收集滤液。
进一步地,上述步骤(3)中将滤液于30KDa超滤管,6000g,4min,离心4次。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现:
基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针,由上述方法制备得到。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现:
基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的应用,将其用于检测细胞内pH的变化。
脱铁铁蛋白(APO)因具有pH依赖的解聚/自组装性能(在酸性条件下解聚成24亚基,在中性条件下重新聚合),高的生物稳定性和生物相容性,其作为理想的纳米载体被用于生物医学领域。与现有的纳米材料相比,APO还具有尺寸均一、溶液分散性能好,易于在内腔中包载功能分子和易于进行纳米颗粒表面修饰等优点。比率型荧光分析法则可以通过同时测量两个发射波长处荧光强度的变化,来有效地消除探针浓度及其所处环境波动等引起的误差,从而保障了复杂体系中pH测量的准确性。
本申请的比率型荧光纳米探针的原理如图1所示,构建过程主要包括:首先,加HCl调节溶液pH为酸性使得APO解聚为亚基,加入荧光素(Flu)和罗丹明B(RB)搅拌、震荡;然后,加入适量NaOH调节溶液pH为中性,使亚基重新聚合为笼状结构的APO,并伴随着将Flu和RB包载于APO的内部空腔。由于Flu的荧光强度随pH的升高而增强,而RB的荧光强度随pH的改变几乎不变。因此,荧光比率信号FFlu/FRB将随着pH值的改变而发生变化。基于此,构建的比率型荧光纳米探针以荧光比值为输出信号可以用于pH值的检测。在绘制细胞内pH检测工作曲线的基础上,实现了在药物刺激后细胞内pH变化的检测应用。
相比现有技术,本发明的有益效果在于:本发明提供一种基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的制备方法,有效地结合比率型荧光分析法的高灵敏性、高准确性和APO纳米颗粒高生物稳定性、高生物相容性的特点,通过将pH敏感和pH不敏感的两种染料经一步混合同时封装到脱铁铁蛋白内部空腔,构建了用于检测细胞内pH值的比率型荧光纳米探针,该比率型荧光纳米探针可通过自组装的方式进行构建,避免了进行化学修饰。该荧光纳米探针具有稳定性好,抗干扰能力强,细胞毒性低、生物相容性好,可有效地用于细胞内pH检测的特点。
附图说明
图1为本发明基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的制备原理示意图;
图2为APO和本发明制备的纳米探针的透射电镜图,标尺为100nm;
图3为本发明制备的纳米探针、APO、Flu、RB的紫外可见吸收光谱图;
图4为不同用量比的Flu和RB制备的探针在不同pH缓冲溶液中荧光比率信号F515/F575随pH的变化曲线;
图5为本发明制备的纳米探针分散在水中荧光比率信号F515/F575随时间的变化曲线;
图6为本发明制备的纳米探针分散在0.01mol/L,pH7.4的PBS缓冲溶液中荧光比率信号F515/F575随时间的变化曲线,其中空白处插图为线框标注部分的放大图;
图7为本发明制备的纳米探针分散在含人血清体积分数为15%,0.01mol/L,pH7.4的PBS缓冲溶液中荧光比率信号F515/F575随时间的变化曲线,其中空白处插图为线框标注部分的放大图;
图8为本发明制备的纳米探针抗干扰性能实验结果统计图;
图9为本发明制备的纳米探针在不同pH缓冲溶液中的抗稀释性能实验结果统计图;
图10为本发明制备的纳米探针在pH4-7之间的可逆性能实验结果统计图;
图11为本发明制备的纳米探针细胞毒性检测结果统计图;
图12中A为本发明制备的纳米探针对不同pH值的Hela细胞的激光共聚焦成像,Flu为绿色荧光通道,RB为红色荧光通道,Merge为绿色荧光和红色荧光的叠加,B为不同pH下相应的归一化灰度值随位置的变化曲线,图中标尺表示为10μm;
图13为细胞内荧光比率信号F515/F575随pH值变化的工作曲线,误差棒代表三次独立实验的标准偏差;
图14为本发明制备的纳米探针用于药物刺激Hela细胞后的激光共聚焦成像图;
图15为图14中对应图像的荧光比率信号F515/F575的柱状图。
具体实施方式
下面,结合附图以及具体实施方式,对本发明做进一步描述,需要说明的是,在不相冲突的前提下,以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的制备方法,包括以下步骤:
(1)取置换保存液为水后浓度为1×10-4M的脱铁铁蛋白5μL加入439μL水中,缓慢加入178μL,0.1M HCl调上述溶液至酸性使脱铁铁蛋白解聚;
(2)将上述步骤(1)的溶液震荡10min后逐滴加入200μL浓度为2.5×10-3M的pH敏感染料荧光素和pH不敏感染料罗丹明B组成的混合物,其中两种染料的投料摩尔比为1:9,继续震荡20min,缓慢加入178μL,0.1M NaOH调节上述溶液至中性使脱铁铁蛋白重新聚合;
(3)将上述步骤(2)的混合液室温震荡2h后采用0.2μm过滤膜除去聚沉物,取2ml水清洗滤膜,并收集滤液,共3ml,采用30KDa超滤管离心6000g,4min,离心4次,除去自由的Flu、RB,即得含有基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针溶液,4℃保存备用。
基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针,由上述方法制备得到。
实施例2
实施例2和实施例1的区别为荧光素和罗丹明B的摩尔比例为2:8,其余均和实施例1相同。
实施例3
实施例3实施例1的区别为荧光素和罗丹明B的摩尔比例为3:7,其余均和实施例1相同。
实施例4
实施例4和实施例1的区别为荧光素和罗丹明B的摩尔比例为4:6,其余均和实施例1相同。
实施例5
实施例5和实施例1的区别为荧光素和罗丹明B的摩尔比例为5:5,其余均和实施例1相同。
实施例6
实施例6和实施例1的区别为荧光素和罗丹明B的摩尔比例为6:4,其余均和实施例1相同。
实施例7
实施例7和实施例1的区别为荧光素和罗丹明B的摩尔比例为7:3,其余均和实施例1相同。
实施例8
实施例8和实施例1的区别为荧光素和罗丹明B的摩尔比例为8:2,其余均和实施例1相同。
实施例9
实施例9和实施例1的区别为荧光素和罗丹明B的摩尔比例为9:1,其余均和实施例1相同。
实验例
溶液的配置:下述实验过程所用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的配置过程如下:准确称取71.64g Na2HPO4·12H2O,加入900mL MilliQ水溶解,最终定容于1000mL的容量瓶中,摇匀静置;准确称取21.01g C6H8O7·H2O加入900mL MilliQ水溶解,最终定容于1000mL的容量瓶中,摇匀静置;高温高压灭菌,冷却后置于4℃冰箱保存。使用时按照不同体积配制不同pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液。
所用的pH 7.4的0.01mol/L PBS缓冲液的配置过程如下:分别准确称取8.0gNaCl,0.2000g KCl,1.4400g NaH2PO4,0.2400g KH2PO4,加入900mL MilliQ水溶解,用1.0mol/L的HCl溶液调节至pH为7.4,最终定容于1000mL的容量瓶中;摇匀静置,高温高压灭菌,冷却后置于4℃冰箱保存。
1、透射电镜表征
采用透射电子显微镜(TEM)对APO以及实施例1制备的自组装比率型荧光纳米探针(以下简称APO@Flu@RB)的形状、结构、尺寸大小进行表征。APO和实施例1制备APO@Flu@RB的TEM图分别如图2A和B所示,由图中可以看到APO具有球状的蛋白质外壳(白色)和内部空腔(黑色),整个APO尺寸约为10-13nm,分散性好。经过pH调控的解聚/重聚所制得的APO@Flu@RB仍保持球形结构,尺寸大小没有改变,粒径处于10-13nm。
2、紫外可见吸收光谱表征
分别对实施例1制备的纳米荧光探针APO@Flu@RB、APO、Flu、RB进行紫外可见吸收光谱表征,结果如图3所示,APO在280nm处有强的特征吸收峰;Flu在480nm附近有一个宽的强吸收峰,RB在555nm处有强的特征吸收峰。而本发明制备的纳米荧光探针的紫外可见吸收光谱图显示其在280nm左右的强吸收峰变为肩峰,为APO包载物质之后的吸收峰,在555nm有明显特征吸收峰,在480nm和450nm处均有弱吸收峰,说明APO@Flu@RB具备APO包载物质后的峰形变化特征,同时具有Flu、RB的特征吸收峰,初步表明实施例1已成功制备纳米荧光探针,即Flu、RB同时负载到了APO的内部空腔。
3、荧光光谱表征
将100nmol/L的实施例1至9制备的纳米探针加入到pH为3.0、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0、7.6和8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中,用多功能读板机在单波长激发下(激发波长为488nm)检测以不同摩尔投料比制备的探针的荧光光谱,从而得到其荧光比率信号F515/F575随pH的变化曲线(F515、F575分别表示纳米探针在515nm和575nm处的荧光强度),结果如图4所示,以不同摩尔投料比制备的APO@Flu@RB的荧光比率信号F515/F575随pH的升高而增大。其中Flu和RB比例为3:7制备的纳米探针APO@Flu@R具备最佳的pH响应灵敏度,且其响应的线性范围为4-7。
4、探针在水、PBS缓冲溶液和含人血清体积分数为15%的PBS溶液中的稳定性
将实施例1制备的纳米探针分散于水、PBS、含人血清体积分数为15%的PBS溶液中来观察探针在不同溶液中的保存及荧光稳定性,结果如图5-7所示:在水溶液、PBS、含人血清体积分数为15%的PBS溶液中,随着时间的改变其荧光比率信号F515/F575基本保持不变,表明探针在水、PBS缓冲溶液和含人血清体积分数为15%的PBS溶液中皆具有较好的稳定性,且荧光性质稳定,便于储存。
5、探针的抗干扰能力
细胞中一些常见的离子及氧化还原性物质可能会干扰APO@Flu@RB的荧光性能,因此取Na+,K+,Mg2+和H2O2各100μmol/L,glucose和Gly各5mmol/L存在下,含100nmol/L实施例1制备探针的PBS溶液(0.01mol/L,pH 7.4)进行荧光测定,同时以不加干扰物的含100nmol/L实施例1制备探针的PBS溶液为空白对照,考察细胞中常见离子及氧化还原性物质对其荧光强度比率信号F515/F575的影响。结果如图8所示:干扰物的加入对该探针的荧光比率信号F515/F575的影响很小,可忽略不计,表明纳米探针具有较好的抗干扰能力。
6、探针的抗稀释能力
探针进入细胞后并不是完全均匀分布的,了解探针的抗稀释能力可以避免因探针分布不均匀造成的pH测量误差。通过两次稀释含有100nmol/L实施例1制备APO@Flu@RB的不同pH缓冲溶液,对其抗稀释能力进行考察。结果如图9所示,APO@Flu@RB在不同pH缓冲溶液中的荧光比率信号F515/F575随着两次稀释几乎没有变化,表明其具有很好的抗稀释性能。
7、探针的可逆性
为了考察探针的可逆性能,调节pH在4到7之间循环,测量实施例1制备APO@Flu@RB的荧光比率信号,绘制荧光比率信号随pH在4到7转换时的变化曲线。如图10所示,当pH从4上升至7时APO@Flu@RB的荧光比率信号F515/F575增大,当pH从7降低至4时APO@Flu@RB的荧光比率信号F515/F575减小,循环三次,APO@Flu@RB的荧光比率信号F515/F575随pH变化的趋势相同,且荧光比率信号稳定。实验结果表明纳米探针APO@Flu@RB在pH 4到7之间具有好的可逆响应性能,适用于细胞内pH变化测定。
8、探针的细胞毒性
采用CCK-8法考察实施例1制备探针APO@Flu@RB对细胞的毒性,以不加探针和染料的细胞为对照,设定其存活率为100%。结果如图11所示,细胞与不同浓度的探针APO@Flu@RB孵育24h后,当浓度小于等于0.2μmol/L时,细胞存活率高达97.1%以上;当浓度增大到1μmol/L时,细胞仍有接近93.7%的存活率。选择用来做细胞实验的探针浓度为0.5μmol/L,此时细胞存活率高达94.9%。根据APO@Flu@RB中每个APO包载染料的个数,选取当量染料Flu-RB混合物与细胞孵育24h后考察细胞毒性,细胞存活率明显下降,小于等于0.5μmol/L的APO@Flu@Ru与细胞孵育24h后,细胞存活率高于95.3%。说明构建的自组装比率型荧光纳米探针APO@Flu@RB细胞毒性低、生物相容性好,可用于细胞内pH的检测。
9、探针对不同pH下细胞的比率荧光成像
将实施例制备探针APO@Flu@RB应用于细胞内pH的测定,需要建立探针对于细胞内pH值响应的工作曲线。将细胞与探针孵育后,加入含尼日利亚菌素(10μmol/L)的不同pH值HEPES缓冲溶液(尼日利亚菌素具有调控细胞内外K+、H+交换的作用,从而可以调节细胞内的pH与外界缓冲溶液的pH保持一致),孵育30min后,在激光共聚焦下成像。如图12A所示,当pH从5变到7时,Flu的绿色荧光铸件增强,RB的红色荧光没有明显变化,探针APO@Flu@RB的绿色荧光逐渐增强,红色荧光没有明显变化。图12B是对应pH荧光成像的Flu荧光通道和RB荧光通道的灰度值(gray),同时除以各自对应的荧光通道的最大灰度值,所获的细胞荧光成像的归一化值随位置变化的响应曲线,可以看出随着pH从5变至7,Flu和RB的灰度值之比呈上升趋势。图13是根据荧光比率信号随pH变化所做的细胞内pH检测的工作曲线,可以看到探针响应线性范围为pH 5-7,线性方程为Y=0.9408X-4.4170,r=0.9957(Y为荧光比率信号FFlu/FRB,X为pH值)。上述实验结果表明,随着pH的增大,荧光比率信号值(FFlu/FRB)逐渐增大,该探针对细胞内pH具有很好的响应性能,该探针可有效地用于细胞内pH检测。
10、药物刺激细胞后pH变化的检测
考察实施例1的探针APO@Flu@RB对细胞内pH变化的检测性能,探针与Hela细胞孵育后,加入药物作用改变细胞内pH值,在激光共聚焦下成像。结果如图14和15所示,与无药物作用的对照组相比,CQ作用后,绿色荧光强度明显升高,经信号处理,CQ刺激后细胞内的荧光比率信号FFlu/FRB为1.96±0.07,代入细胞内pH检测工作曲线,计算可知此时细胞内pH约为6.8;NAC作用后,绿色荧光强度有所降低,而红色荧光强度几乎不变,经信号处理,NAC刺激后细胞内的荧光比率信号FFlu/FRB为0.73±0.08,代入细胞内pH检测的工作曲线,计算可知此时细胞内pH约为5.5;由未经药物处理的对照组细胞的荧光比率信号计算,得到未处理细胞的pH约为5.9。这说明CQ处理后细胞内pH值升高,而NAC处理导致了细胞内pH值降低。上述结果表明,本申请的自组装比率型荧光纳米探针APO@Flu@RB成功地用于药物刺激后细胞内pH值变化的测定。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式,不能以此来限定本发明保护的范围,本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取脱铁铁蛋白加入水中,调pH至酸性使脱铁铁蛋白解聚;
(2)将上述步骤(1)的溶液震荡均匀后逐滴加入由pH敏感和pH不敏感的两种染料组成的混合液,继续震荡一段时间,调节溶液pH至中性使脱铁铁蛋白重新聚合;
(3)将上述步骤(2)的混合液室温震荡后过滤,取滤液,超滤离心后收集截留液,即得含有基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的溶液,4℃保存备用。
2.根据权利要求1所述基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的制备方法,其特征在于,上述步骤(1)中取置换保存液为水的浓度为1×10-4mol/L脱铁铁蛋白加入水中溶解备用,脱铁铁蛋白的终浓度为5×10-7mol/L。
3.根据权利要求1所述基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的制备方法,其特征在于,上述步骤(1)中添加0.1mol/L HCl调pH至酸性。
4.根据权利要求1所述基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的制备方法,其特征在于,上述步骤(2)中pH敏感染料为荧光素,pH不敏感染料为罗丹明B,总终浓度为5×10- 4mol/L,荧光素和罗丹明B的摩尔比例为1-9:9-1。
5.根据权利要求1所述基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的制备方法,其特征在于,上述步骤(2)中震荡10min后加入染料混合液,再继续震荡20min后调节pH至中性。
6.根据权利要求1所述基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的制备方法,其特征在于,上述步骤(2)中加入0.1mol/LNaOH调节溶液至中性。
7.根据权利要求1所述基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的制备方法,其特征在于,上述步骤(3)中将混合液在室温震荡2h,采用0.2μm的过滤膜除去聚沉物,用水清洗滤膜后收集滤液。
8.根据权利要求1所述基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的制备方法,其特征在于,上述步骤(3)中将滤液于30KDa超滤管,6000g,4min,离心4次。
9.基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针,其特征在于,由权利要求1至8任一项所述方法制备得到。
10.基于脱铁铁蛋白的比率型荧光pH纳米探针的应用,其特征在于,将其用于检测细胞内pH的变化。
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