CN111560026A - 高光学稳定性细胞膜荧光标记物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了高光学稳定性细胞膜荧光标记物及其制备方法与应用，将2‑甲基噁唑[4,5‑b]吡啶与卤代烷烃反应得到化合物4；化合物4与化合物5反应，得到高光学稳定性细胞膜荧光标记物，可以作为细胞膜荧光标记物；本发明首次公开了一类高光学稳定性的细胞膜荧光标记物，改善了细胞膜荧光标记物的生物活性，公开解决了现有细胞膜标记物光稳定性差的问题；而且本发明公开的高光学稳定性的细胞膜标记物，可以通过改变荧光团来调控标记物发射波长，使细胞膜标记物可以用于不同通道化合物的标记；另外本发明的高光学稳定性的细胞膜荧光标记物通过将细胞膜荧光标记物与β‑环糊精形成主客体包合物来增加细胞膜标记物的光学性能，这具有重大的科学意义和商业价值。

Description

高光学稳定性细胞膜荧光标记物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于荧光标记物技术，具体涉及基于含氮杂环的一类新型的高光学稳定性的细胞膜荧光标记物。
背景技术
细胞膜又称细胞质膜，是细胞中关键的细胞器，它位于细胞的表面将细胞和外界环境分割开来，控制物质进出细胞以保持整个细胞的完整性。细胞膜的屏障作用保证了细胞内环境的相对稳定，使得各种生化反应能够有序的进行（参考：Q. Xu, T. Zhao, Z.Sun, Monitoring drug-lipid membrane interactions via a molecular rotor probe,Analyst, 141 (2016) 4676-4684.）；同时细胞膜又将各种细胞器分隔开来，为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境；细胞膜与细胞迁移、胞吞、增殖、凋亡等重要的细胞生物学活动密切相关（参考：J.-J. Liu, J. Yang, J.-L. Wang, Z.-F. Chang, B. Li, W.-T.Song, et al., Tetrathienylethene based red aggregation-enhanced emissionprobes: super red-shifted mechanochromic behavior and highly photostable cellmembrane imaging, Materials Chemistry Frontiers, 2 (2018) 1126-1136.），因此膜受损会导致生命活动出现异常（参考：L. Shi, Y.H. Liu, K. Li, A. Sharma, K.K. Yu,M.S. Ji, et al., An AIE-Based Probe for Rapid and Ultrasensitive Imaging ofPlasma Membranes in Biosystems, Angew Chem Int Ed Engl, (2019).）。所以对细胞膜的实时监测特别重要（参考：M.H. Lee, H.M. Jeon, J.H. Han, N. Park, C. Kang, J.L.Sessler, et al., Toward a Chemical Marker for Inflammatory Disease: AFluorescent Probe for Membrane-Localized Thioredoxin, Journal of the AmericanChemical Society, 136 (2014) 8430-8437.）。在现今的检测手段中，荧光标记因其灵敏度高、选择性好、使用方便、成本低等优点受到了越来越多科学家的青睐。因此，近年来具有细胞膜标记的荧光染料和荧光探针也越来越多（参考：Y. Niko, P. Didier, Y. Mely, G.Konishi, A.S. Klymchenko, Bright and photostable push-pull pyrene dyevisualizes lipid order variation between plasma and intracellular membranes,Sci Rep, 6 (2016) 18870.）。
由于细胞膜的重要性以及细胞膜荧光标记技术的便捷性，在过去的一段时间内，对细胞膜荧光标记的文章层出不穷（参考：M. Kubankova, P.A. Summers, I. Lopez-Duarte, D. Kiryushko, M.K. Kuimova, Microscopic Viscosity of Neuronal PlasmaMembranes Measured Using Fluorescent Molecular Rotors: Effects of OxidativeStress and Neuroprotection, ACS Appl Mater Interfaces, 11 (2019) 36307-36315.）。纵观大部分细胞膜荧光标记的文章不难发现，已有的相对比较成熟的细胞膜标记物，例如碳菁类有机小分子、FM类、Nile Red类等虽然可以标记细胞膜但是存在着相应的缺点：例如碳菁类小分子（DiO、DiD、DiI、DiA），具有菁类化合物稳定性差的缺点（参考：Y. Ye,Y. Zheng, C. Ji, J. Shen, M. Yin, Self-Assembly and Disassembly ofAmphiphilic Zwitterionic Perylenediimide Vesicles for Cell Membrane Imaging,ACS Appl Mater Interfaces, 9 (2017) 4534-4539.），不能稳定的标记细胞膜；FM类和Nile Red类具有水溶性差且染色效率低，容易被光漂白，被细胞内吞，以至于也不能较好的标记细胞膜（参考：X. Zhang, C. Wang, L. Jin, Z. Han, Y. Xiao, Photostablebipolar fluorescent probe for video tracking plasma membranes relatedcellular processes, ACS Appl Mater Interfaces, 6 (2014) 12372-12379.）。现今商用的细胞膜标记物大部分是碳菁类小分子，但是此类标记物的光稳定性一直是困扰的话题。这意味着开发出染色性能较好、光稳定高、细胞毒性低的细胞膜标记物至关重要。
发明内容
本发明公开了基于含氮杂环的一类新型的高光学稳定性的细胞膜荧光标记物，可以作为细胞膜荧光标记物；本发明首次公开了一类高光学稳定性的细胞膜荧光标记物，改善了细胞膜荧光标记物的生物活性，公开解决了现有细胞膜标记物光稳定性差的问题；而且本发明公开的高光学稳定性的细胞膜标记物，可以通过改变荧光团来调控标记物发射波长，使细胞膜标记物可以用于不同通道化合物的标记；另外本发明的高光学稳定性的细胞膜荧光标记物通过将细胞膜荧光标记物与β-环糊精形成主客体包合物来增加细胞膜标记物的光学性能，这具有重大的科学意义和商业价值。
本发明采用如下技术方案：
高光学稳定性细胞膜荧光标记物，其化学结构式如下：
Figure 967576DEST_PATH_IMAGE001
其中，R1为直链烷基，R2为荧光基团；优选的，所述直链烷基的碳原子数量大于7，比如为15～20，所述荧光基团含有苯环；进一步优选的，所述直链烷基为C17H35，所述荧光基团为以下化学式中的一种：
Figure 366327DEST_PATH_IMAGE002
本发明高光学稳定性细胞膜荧光标记物或者其中间体含有常规阴离子配体，比如卤素。
比如所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物的化学结构式如下：
Figure 265013DEST_PATH_IMAGE003
本发明公开了上述高光学稳定性细胞膜荧光标记物在细胞膜标记中的应用；或者上述高光学稳定性细胞膜荧光标记物在制备细胞膜荧光试剂中的应用。
本发明公开的高光学稳定性细胞膜荧光标记物具有较高的光学稳定性，尤其是高光学稳定性细胞膜荧光标记物1c,1d,1f处于β-环糊精内腔时能增加标记物的荧光强度。
本发明公开了上述高光学稳定性细胞膜荧光标记物的制备方法，包括以下步骤，2-甲基噁唑[4,5-b]吡啶与卤代烷烃反应得到化合物4；化合物4与化合物5反应，得到高光学稳定性细胞膜荧光标记物。
本发明公开了细胞荧光成像的方法，包括以下步骤，2-甲基噁唑[4,5-b]吡啶与卤代烷烃反应得到化合物4，化合物4与化合物5反应，得到高光学稳定性细胞膜荧光标记物；将细胞与含有所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物的培养基共培养，再进行细胞成像，完成细胞荧光成像。
本发明公开了细胞荧光成像的方法，包括以下步骤，2-甲基噁唑[4,5-b]吡啶与卤代烷烃反应得到化合物4，化合物4与化合物5反应，得到高光学稳定性细胞膜荧光标记物；将细胞与含有所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物、β-环糊精的培养基共培养，再进行细胞成像，完成细胞荧光成像。
本发明中，细胞、培养基为常规产品，对本发明技术效果没有影响；可以将高光学稳定性细胞膜荧光标记物溶液加入培养基中，得到含有所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物的培养基；可以将高光学稳定性细胞膜荧光标记物溶液、β-环糊精加入培养基中，得到含有所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物、β-环糊精的培养基；优选的，含有所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物的培养基中，所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物在培养基中的浓度为2～6 μM；含有所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物、β-环糊精的培养基中，高光学稳定性细胞膜荧光标记物在培养基中的浓度为0.5～1.5μM，β-环糊精的浓度为0.5～300μM。
细胞成像可以利用激光共聚焦显微镜进行，比如绿光通道选用488 nm激发，收集468-550 nm范围内的荧光信号，红光通道使用561 nm激发，收集570-750 nm范围内的荧光信号；细胞成像结果显示本发明高光学稳定性细胞膜荧光标记物作为染料在细胞中能够很好的标记细胞膜，可作为细胞膜绿色、红色标记物。
共培养为在饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱共同培养5分钟；优选的加入现有细胞膜标记物后再培养5分钟，然后用PBS缓冲液洗涤，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。
本发明中，化合物4的化学结构式如下：
Figure 585267DEST_PATH_IMAGE004
卤代烷烃的化学式为R1X，X为卤素；
化合物5的化学结构式如下：
Figure 735757DEST_PATH_IMAGE005
取代基R1、R2与上文相同。
本发明首次公开了一类高光学稳定性的细胞膜荧光标记物，与细胞共培养后，可以实现细胞成像；本发明公开的高光学稳定性细胞膜荧光标记物，改善了荧光标记物的生物活性，通过改变荧光团来调控标记物发射波长，可以用于不同光通道的荧光成像；将荧光标记物与β-环糊精形成主客体包合物，以此增加染料的光学性能，进行细胞成像时样品使用量少、细胞毒性低、对生物样品损坏小、成像清晰、荧光强度大，这具有重大的科学意义和商业价值。
附图说明
图1为本发明涉及的染料的合成路线；
图2为染料1a-g的光稳定性；
图3为染料1a在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；
图4为染料1b在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；
图5为染料1c在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；
图6为染料1d在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；
图7为染料1e在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；
图8为染料1f在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；
图9为染料1g在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；
图10为染料1a在Hela细胞中的细胞成像图；
图11为染料1b在Hela细胞中的细胞成像图；
图12为染料1c在Hela细胞中的细胞成像图；
图13为染料1d在Hela细胞中的细胞成像图；
图14为染料1e在Hela细胞中的细胞成像图；
图15为染料1f在Hela细胞中的细胞成像图；
图16为染料1g在Hela细胞中的细胞成像图；
图17为染料1c在Hela细胞中加β-环糊精前后的细胞成像；
图18为染料1d在Hela细胞中加β-环糊精前后的细胞成像；
图19为染料1f在Hela细胞中加β-环糊精前后的细胞成像。
具体实施方式
本发明实施例的合成路线参见附图1，化学式下方的数字表示化合物，常规配位阴离子为碘离子。本发明化合物合成中，原料比例以及纯化方法采用常规比例或者常规纯化方法，实施例为示意性表述，且本发明通过氢谱、碳谱、高分辨质谱验证产物结构的正确性。
实施例一
取化合物2（2-甲基噁唑[4,5-b]吡啶，10.0毫摩尔，1340.1毫克，CAS号: 86467-39-2）、化合物3（1-碘十八烷）（10毫摩尔，3800.0毫克）溶解于100.0毫升乙腈中。反应体系通过氮气置换三次。随后于85℃反应12小时。降至室温后，将反应后的混合物通过旋转蒸发仪除去溶剂。加入乙醚洗涤三次得纯净中间体4，淡黄色固体，4626.0毫克，产率90%。
实施例二
取中间体4（1.0毫摩尔，514.0毫克），化合物5a（2,3-二氢苯并呋喃-5-甲醛，1.0毫摩尔，148.1毫克），溶于8毫升DMF中,向其中加入350微升的TMSCl。随后在回流条件下反应6小时。降至室温后，二氯甲烷萃取三次，收集下层有机层通过旋转蒸发仪除去溶剂。纯净染料1a经柱层析分离后得到，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（15/1，v/v），淡黄色固体，193.28毫克，产率30%。
染料1a的核磁共振氢谱(400 MHz, CDCl3) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ(ppm)9.49 (s, 1H, Ar-H), 8.63 (d, J = 6.7 Hz, 1H, Ar-H), 8.18 (d, J = 15.78 Hz,1H, Ar-H), 8.06 (s, 1H, Ar-H), 7.62 (s, 1H, Ar-H), 7.51. (d, J = 8.4 Hz 1H,Ar-H), 6.96 (d, J = 15.7 Hz, 2H, 2 × CH 2), 5.02 (d, J = 6.0 Hz, 2H, CH 2) 4.72(d, J = 8.0 Hz, 2H, CH 2), 3.32 (t, J = 7.9 Hz, 2H, CH 2), 1.38 (s, 32H, 16 ×CH 2), 0.88 (t, J = 4.0 Hz, 3H, CH 3).
染料1a的核磁共振碳谱(151 MHz, CDCl3,) 13C NMR (151 MHZ, CDCl3) δ(ppm)171.36, 164.59, 150.98, 149.64, 146.12, 140.36, 131.67, 129.10, 126.61,125.74, 125.69, 122.05, 110.40, 106.67, 72.42, 55.90, 31.88, 30.88, 30.33,29.66, 29.62, 29.61, 29.59, 29.50, 29.33, 29.31, 28.99, 28.96, 26.29, 22.64,14.07. HRMS (ESI+):m/z 分子式： C34H49N2O2 + [M]+: 517.3789，找到：517.3768.
取中间体4（1.0毫摩尔，514.0毫克），化合物5b（9-乙基-9H-咔唑-3-乙醛，1.0毫摩尔，223.1毫克），溶于8毫升DMF中,向其中加入350微升的TMSCl。随后在回流条件下反应6小时。降至室温后，二氯甲烷萃取三次，收集下层有机层通过旋转蒸发仪除去溶剂。乙酸乙酯洗涤三次，混合物进行抽滤，固体用乙醚再洗涤三次得纯净染料1b，橙色固体，539.25毫克，产率75%。
染料1b的核磁共振氢谱(400 MHz, CDCl3) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ(ppm)9.42 (s, 1H, Ar-H), 8.46 (t, J = 9.0 Hz 3H, Ar-H), 8.16 (d, J = 7.4 Hz 1H,Ar-H), 7.98 (s, 1H, Ar-H), 7.85 (d, J = 7.9 Hz, 1H, Ar-H), 7.37 (t, J = 6.9Hz, 1H, CH 2 ), 7.15 (d, J = 5.5 Hz, 1H, CH 2 ), 5.02 (s, 2H, CH 2 ), 4.43 (s, 2H,CH 2), 1.66 (t, J = 7.0 Hz, 3H, CH 3), 1.23 (s, 32H, 16 × CH 2), 0.88 (t, J =6.5 Hz, 3H, CH 3).
染料1b的核磁共振碳谱(151 MHz, CDCl3) 13C NMR (151 MHZ, CDCl3) δ(ppm)171.19, 150.70, 150.61, 145.90, 142.53, 141.01, 140.60, 126.96, 126.74,125.12, 124.69, 123.83, 122.97, 122.67, 121.90, 120.70, 120.46, 109.46,109.30, 106.13, 55.70, 38.00, 31.88, 30.43, 29.66, 29.61, 29.53, 29.35,29.31, 29.01, 26.31, 22.64, 14.07, 13.86. HRMS (ESI+):m/z 分子式： C40H54N3O+[M]+: 592.4261，找到：592.4283.
取中间体4（1.0毫摩尔，514.0毫克），化合物5c（4-（二乙氨基）苯甲醛，1.0毫摩尔，177.2毫克），溶于8毫升DMF中,向其中加入350微升的TMSCl。随后在回流条件下反应6小时。降至室温后，二氯甲烷萃取三次，收集下层有机层通过旋转蒸发仪除去溶剂。染料1c经柱层析分离后得到纯净产物，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（15/1，v/v），深绿色固体，208.72毫克，产率31%。
染料1c的核磁共振氢谱(400 MHz, CDCl3) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ(ppm)9.39 (d, J = 6.2 Hz, 1H, Ar-H), 8.44 (d, J = 7.9 Hz, 1H, Ar-H), 8.11 (d, J =15.5 Hz, 1H, Ar-H), 7.90 (t, J = 7.2 Hz, 1H, Ar-H), 7.58 (d, J = 8.4 Hz, 2H,Ar-H), 6.74 (q, J = 6.3 Hz,3H, Ar-H), 4.97 (t, J = 7.1 Hz, 2H, CH 2 ), 3.50 (q,J = 6.9 Hz, 4H, 2 × CH 2), 2.18 (t, J = 6.0 Hz,2H, CH 2), 1.37 (q, J = 4.5 Hz,6H, 2 × CH 3), 1.24 (s, 30H, 15 × CH 2), 0.88 (t, J = 6.6 Hz,3H, CH 3).
染料1c的核磁共振碳谱(151 MHz, CDCl3,) 13C NMR (151 MHZ, CDCl3) δ(ppm)172.41, 151.80, 151.47, 150.23, 146.17, 139.13, 132.26, 124.04, 120.91,120.72, 111.67, 102.08, 55.37, 44.84, 31.86, 30.23, 29.64, 29.61, 29.59,29.57, 29.50, 29.32, 29.29, 28.97, 26.25, 22.62, 14.05, 12.59. HRMS (ESI+):m/z 分子式： C36H56N3O+ [M]+: 546.4418，找到：546.4412.
取中间体4（1.0毫摩尔，514.0毫克），化合物5d（7-（二乙氨基）-2-氧-2H-苯并吡喃-3-甲醛，1.0毫摩尔，245.1毫克），溶于8毫升DMF中,向其中加入350微升的TMSCl。随后在回流条件下反应6小时。降至室温后，二氯甲烷萃取三次，收集下层有机层通过旋转蒸发仪除去溶剂。染料1d经柱层析分离后得到纯净产物，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（15/1，v/v），深绿色固体，237.2毫克，产率32%。
染料1d的核磁共振氢谱(400 MHz, CDCl3) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ(ppm)9.46 (s, 1H, Ar-H), 8.58 (d, J = 6.8 Hz,1H, Ar-H), 8.05 (t, J =16.8 Hz,3H,Ar-H), 7.74 (d, J = 15.5 Hz, 1H, Ar-H), 7.47 (d, J =8.8 Hz,1H, Ar-H), 6.68(d, J = 8.8 Hz, 1H, Ar-H), 6.50 (s, 1H, Ar-H), 5.01 (t, J =7.2 Hz, 2H, CH 2),3.50 (q, J = 6.8 Hz, 4H, 2 × CH 2), 2.22 (s, J =9.7 Hz, 2H, CH 2), 1.37 (q, J =6.7 Hz, 6H, 2 × CH 3), 1.24 (s, 32H, 16 × CH 2), 0.88 (t, J = 6.6 Hz,3H, CH 3).
染料1d的核磁共振碳谱(151 MHz, CDCl3,) 13C NMR (151 MHZ, CDCl3) δ(ppm)171.98, 159.76, 157.35, 153.17, 151.13, 148.04, 146.24, 145.05, 140.13,131.30, 125.38, 121.73, 113.16, 110.34, 110.13, 109.18, 96.85, 55.85, 45.33,31.88, 30.37, 29.67, 29.64, 29.62, 29.60, 29.52, 29.35, 29.32, 29.00, 26.30,22.65, 14.08, 12.50. HRMS (ESI+):m/z 分子式： C40H60N3O3 + [M]+: 614.4316，找到：614.4294.
取中间体4（1.0毫摩尔，514.0毫克），化合物5e（4-（二苯胺基）苯甲醛，1.0毫摩尔，273.1毫克），溶于8毫升DMF中,向其中加入350微升的TMSCl。随后在回流条件下反应6小时。降至室温后，二氯甲烷萃取三次，收集下层有机层通过旋转蒸发仪除去溶剂。乙酸乙酯洗涤三次得到纯净的染料1e，红色固体，615.4毫克，产率80%。
染料1e的核磁共振氢谱(400 MHz, CDCl3) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ(ppm)9.89 (s, 1H, Ar-H), 8.53 (s, J = 6.9 Hz, 1H, Ar-H), 8.09 (s, J = 11.0 Hz,2H,Ar-H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 2H, Ar-H), 7.36 (d, J = 7.6 Hz, 4H, Ar-H), 7.19(d, J = 7.7 Hz, 6H, Ar-H), 7.04 (s, 1H, Ar-H), 7.01 (s, 1H, CH 2 ), 6.90 (d, J= 15.8 Hz, 1H, CH 2 ), 5.11 (q, J = 7.6 Hz, 2H, CH 2), 1.43 (s, 32H, 16 × CH 2),0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H, CH 3).
染料1e的核磁共振碳谱(151 MHz, CDCl3,) 13C NMR (151 MHZ, CDCl3) δ(ppm)171.18, 152.04, 150.81, 148.75, 146.00, 145.90, 141.51, 130.74, 129.74,126.21, 125.65, 125.26, 125.18, 121.99, 120.02, 106.04, 55.78, 31.88, 30.51,29.65, 29.61, 29.58, 29.50, 29.33, 29.31, 29.02, 26.32, 22.64, 14.08. HRMS(ESI+):m/z 分子式： C44H56N3O+ [M]+: 642.4418，找到：642.4415.
取中间体4（1.0毫摩尔，514.0毫克），化合物5f（3-（7-（二乙氨基）-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-基）丙烯醛，1.0毫摩尔，271.1毫克），溶于8毫升DMF中,向其中加入350微升的TMSCl。随后在回流条件下反应6小时。降至室温后，二氯甲烷萃取三次，收集下层有机层通过旋转蒸发仪除去溶剂。染料1f经柱层析分离后得到纯净产物，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（15/1，v/v），深紫色固体，199.5毫克，产率26%。
染料1f的核磁共振氢谱(400 MHz, CDCl3) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ(ppm)9.51 (s, 1H, Ar-H), 8.60 (d, J = 6.8 Hz,1H, Ar-H), 7.98 (q, J =6.3 Hz, 2H,Ar-H), 7.85 (d, 1H, Ar-H), 7.66 (t, J =8.4 Hz,1H, Ar-H), 7.40 (d, J = 9.3 Hz,1H, Ar-H), 7.11 (d, J = 8.1 Hz,1H, CH 2 ), 6.62 (d, J = 14.5 Hz,2H, 2 ×CH 2 ),6.48 (s, 1H, CH 2 ), 5.01 (t, J =6.7 Hz, 2H, CH 2), 3.50 (q, J = 6.8 Hz, 4H, 2 ×CH 2), 1.37 (q, J = 6.7 Hz, 6H, 2 × CH 3), 1.24 (s, 32H, 16 × CH 2), 0.88 (t, J= 6.6 Hz,3H, CH 3).
染料1f的核磁共振碳谱(151 MHz, CDCl3) 13C NMR (151 MHZ, CDCl3) δ(ppm)171.03, 160.20, 156.60, 152.09, 151.03, 150.94, 146.18, 144.23, 141.63,140.29, 130.31, 127.58, 125.42, 121.90, 115.07, 111.71, 109.86, 109.11,96.88, 77.22, 55.83, 45.13, 31.88, 30.36, 29.67, 29.64, 29.62, 29.60, 29.51,29.35, 29.32, 28.99, 26.29, 22.64, 14.08, 12.49. HRMS (ESI+):m/z 分子式：C41H58N3O3 + [M]+: 640.4473，找到：640.4465。
对比例
取化合物2（2-甲基噁唑[4,5-b]吡啶，10.0毫摩尔，1340.1毫克，CAS号: 86467-39-2）、化合物6（1-碘庚烷）（10毫摩尔，2261.0毫克）溶解于100.0毫升乙腈中。反应体系通过氮气置换三次。随后于85℃反应12小时。降至室温后，将反应后的混合物通过旋转蒸发仪除去溶剂。加入乙醚洗涤三次得纯净中间体7，淡黄色固体，4626.0毫克，产率90%。
取中间体7（1.0毫摩尔，233.2毫克），化合物5d（7-（二乙氨基）-2-氧-2H-苯并吡喃-3-甲醛，1.0毫摩尔，245.1毫克），溶于8毫升DMF中,向其中加入350微升的TMSCl。随后在回流条件下反应6小时。降至室温后，二氯甲烷萃取三次，收集下层有机层通过旋转蒸发仪除去溶剂。染料1g经柱层析分离后得到纯净产物，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（15/1，v/v），深绿色固体，230.1毫克，产率50%。
染料1g的核磁共振氢谱(400 MHz, DMSO) 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ(ppm)8.90 (d, J = 5.9 Hz, 1H, Ar-H), 8.83 (d, J = 8.9 Hz,1H, Ar-H), 8.56 (s, 1H,Ar-H), 8.11 (d, J = 15.7 Hz, 1H, Ar-H), 7.94 (t, J =6.8 Hz, 1H, Ar-H), 7.62(d, J = 15.7 Hz, 1H, Ar-H), 7.54 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Ar-H), 6.86 (d, J =16.1Hz, 1H, CH 2), 6.65 (s, 1H, CH 2), 4.77 (q, J = 6.4 Hz, 2H, CH 2), 3.53 (q, J =6.7 Hz, 4H, 2 × CH 2), 1.99 (s, 2H, CH 2), 1.34 (d, J =7.3 Hz,4H, 2× CH 2),1.26 (d, J =8.6 Hz,5H, CH2), 1.16 (t, J =7.0 Hz,6H, 2× CH3), 0.88 (t, J =7.9Hz, 3H, CH3).
染料1g的核磁共振碳谱(151 MHz, CDCl3,) 13C NMR (151 MHZ, CDCl3) δ(ppm)171.69, 159.80, 157.29, 153.09, 150.84, 147.99, 146.18, 144.76, 141.11,131.29, 125.57, 122.07, 113.20, 110.37, 110.25, 109.19, 96.90, 55.91, 45.34,31.48, 30.50, 28.66, 26.30, 22.48, 14.00, 12.48. HRMS (ESI+):m/z 分子式：C28H34N3O3 + [M]+: 460.2595，找到：460.2621。
实施例三
对上述制备的染料1a-g（浓度为10 μM）进行光稳定性测试，首先称取相应质量的染料1a-g和参照物Cys7，将其分别溶解在乙腈中（浓度为10 μM），用飞利浦碘钨灯（500W）照射所有的样品，灯与样品间的距离设为25cm。在灯和样品之间放置一个8cm厚的NaNO2（60g.L-1）冷阱，以消除热量和短波长光。连续照射6小时，其中每半小时进行一次紫外荧光测试，六小时后，光稳定性根据照射前后不同时间吸收强度的变化来计算剩余吸收率。如图2所示，荧光标记物光稳定性分别是1a：80%，1b：96%，1c：92%，1d：91%，1e：97%，1f：94%，1g：92%，可以看出染料1a-g有着较高的光稳定性。
实施例四
对上述制备的染料（浓度为10 μM）在氯仿中的紫外吸收和荧光发射进行了测试，横坐标为波长，纵坐标分别为吸光度和荧光强度，结果如图3至9所示。
在紫外-可见吸收光谱图中，染料1a（浓度为10 μM）在氯仿中的紫外吸收和荧光发射进行了测试，横坐标为波长，纵坐标分别为吸光度和荧光强度，结果如图3所示。在紫外-可见吸收光谱图中，染料1a在418 nm处有最大吸收；在荧光光谱图中，染料1a在517 nm处有最高的荧光强度，此时的激发波长为440 nm，狭缝宽度为3 nm/5nm。
对染料1b（浓度为10 μM）在氯仿中的紫外吸收和荧光发射进行了测试，横坐标为波长，纵坐标分别为吸光度和荧光强度，结果如图4所示。在紫外-可见吸收光谱图中，染料1b的最大吸收波长为484 nm；在荧光光谱图中，染料1b的最大发射波长为574 nm，此时的激发波长为440 nm，狭缝宽度为3 nm/3 nm。
对染料1c（浓度为10 μM）在氯仿中的紫外吸收和荧光发射进行了测试，横坐标为波长，纵坐标分别为吸光度和荧光强度，结果如图5所示。在紫外-可见吸收光谱图中，染料1c的最大吸收波长为535 nm；在荧光光谱图中，染料1c的最大发射波长为598 nm，此时的激发波长为481 nm，狭缝宽度为3 nm/3 nm。
对染料1d（浓度为10 μM）在氯仿中的紫外吸收和荧光发射进行了测试，横坐标为波长，纵坐标分别为吸光度和荧光强度，结果如图6所示。在紫外-可见吸收光谱图中，染料1d在547 nm处有最大吸收；在荧光光谱图中，染料1d在634 nm处有最高的荧光强度，此时的激发波长为501 nm，狭缝宽度为3 nm/3 nm。
对染料1e（浓度为10 μM）在氯仿中的紫外吸收和荧光发射进行了测试，横坐标为波长，纵坐标分别为吸光度和荧光强度，结果如图7所示。在紫外-可见吸收光谱图中，染料1e的最大吸收波长为521 nm；在荧光光谱图中，染料1e的最大发射波长为659 nm，此时的激发波长为472 nm，狭缝宽度为3 nm/3 nm。
对染料1f 在氯仿中的紫外吸收和荧光发射进行了测试，横坐标为波长，纵坐标分别为吸光度和荧光强度，浓度为10 μM，结果如图8所示。在紫外-可见吸收光谱图中，染料1f的最大吸收波长为558 nm；在荧光光谱图中，染料1f的最大发射波长为683 nm，此时的激发波长为540 nm，狭缝宽度为3 nm/3 nm。
对染料1g 在氯仿中的紫外吸收和荧光发射进行了测试，横坐标为波长，纵坐标分别为吸光度和荧光强度，浓度为10 μM，结果如图9所示。在紫外-可见吸收光谱图中，染料1g的最大吸收波长为350 nm；在荧光光谱图中，染料1g的最大发射波长为550 nm，此时的激发波长为519 nm，狭缝宽度为1.5 nm/3 nm。
实施例五
使用DMSO（二甲基亚砜）将染料1a配制成母液，随后加入常规DMEM细胞培养基（含有青霉素（100 μmL-1）,10%的小牛血清，链霉素（100 μg mL-1）和L-谷氨酰胺（2.5´10-4 M））中，使得染料1a在细胞培养基中的浓度为6 μM，与Hela细胞在饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱共同培养5分钟，随后加入现有细胞膜红色标记物DiD (15 μM)再培养5分钟；然后用PBS缓冲液洗涤三次，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像（以下实验相同，除了染料浓度有变化外）。绿光通道选用488 nm激发，收集468-550 nm范围内的荧光信号。红光通道使用561 nm激发，收集570-750 nm范围内的荧光信号。细胞成像结果显示染料1a在Hela细胞中能够很好的标记细胞膜，可作为细胞膜绿色标记物。
细胞成像结果如图10所示，其中(a)为细胞明场成像图，(b)为染料1a的细胞成像图，(c)为DiD是细胞膜红色标记物的细胞成像图，(d)为绿光通道和红光通道的叠加图，(e)为叠加图中ROI线的荧光强度。
染料1b在细胞培养基中的浓度为6 μM，与Hela细胞共同培养5分钟，随后加入细胞膜红色标记物DiD (15 μM)再培养5分钟；然后用PBS缓冲液洗涤三次，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。绿光通道选用458 nm激发，收集468-550 nm范围内的荧光信号。红光通道使用561 nm激发，收集570-750 nm范围内的荧光信号。细胞成像结果显示染料1b在Hela细胞中能够很好的标记细胞膜，可作为细胞膜绿色标记物。
细胞成像结果如图11所示，其中(a)为细胞明场成像图，(b)为染料1b的细胞成像图，(c)为DiD是细胞膜红色标记物的细胞成像图，(d)为绿光通道和红光通道的叠加图，(e)为叠加图中ROI线的荧光强度。
染料1c在细胞培养基中的浓度为2 μM，与Hela细胞共同培养5分钟，随后加入细胞膜绿色标记物DiO (15 μM)再培养5分钟；然后用PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。绿光通道选用488 nm激发，收集493-530 nm范围内的荧光信号。红光通道使用561 nm激发，收集570-750 nm范围内的荧光信号。细胞成像结果显示染料1c在Hela细胞中能够很好的标记细胞膜，可作为细胞膜红色标记物。
细胞成像结果如图12所示，其中(a)为细胞明场成像图，(b)为染料1c的细胞成像图，(c)为DiO是细胞膜绿色标记物的细胞成像图，(d)为绿光通道和红光通道的叠加图，(e)为叠加图中ROI线的荧光强度。
染料1d在细胞培养基中的浓度为2 μM，与Hela细胞共同培养5分钟，随后加入细胞膜绿色标记物DiO (15 μM)再培养5分钟；然后用PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。绿光通道选用488nm激发，收集493-530 nm范围内的荧光信号。红光通道使用561 nm激发，收集570-750 nm范围内的荧光信号。细胞成像结果显示染料1d在Hela细胞中能够很好的标记细胞膜，可作为细胞膜红色标记物。
细胞成像结果如图13所示，其中(a)为细胞明场成像图，(b)为染料1d的细胞成像图，(c)为DiO是细胞膜绿色标记物的细胞成像图，(d)为绿光通道和红光通道的叠加图，(e)为叠加图中ROI线的荧光强度。
染料1e在细胞培养基中的浓度为6 μM，与Hela细胞共同培养5分钟，随后加入细胞膜红色标记物DiD (15 μM)再培养5分钟; 然后用PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。绿光通道选用488 nm激发，收集498-580 nm范围内的荧光信号。红光通道使用561 nm激发，收集570-750 nm范围内的荧光信号。细胞成像结果显示染料1e在Hela细胞中能够很好的标记细胞膜，可作为细胞膜绿色标记物。
细胞成像结果如图14所示，其中(a)为细胞明场成像图，(b)为染料1e 的细胞成像图，(c)为DiD是细胞膜红色标记物的细胞成像图，(d)为绿光通道和红光通道的叠加图，(e)为叠加图中ROI线的荧光强度。
染料1f在细胞培养基中的浓度为6 μM，与Hela细胞共同培养5分钟，随后加入细胞膜绿色标记物DiO (15 μM)再培养5分钟; 然后用PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。绿光通道选用488 nm激发，收集498-580 nm范围内的荧光信号。红光通道使用561 nm激发，收集570-750 nm范围内的荧光信号。细胞成像结果显示染料1f在Hela细胞中能够很好的标记细胞膜，可作为细胞膜红色标记物。
细胞成像结果如图15所示，其中(a)为细胞明场成像图，(b)为染料1f的细胞成像图，(c)为DiO是细胞膜绿色标记物的细胞成像图，(d)为绿光通道和红光通道的叠加图，(e)为叠加图中ROI线的荧光强度。
对比例
使用DMSO（二甲基亚砜）将染料1g配制成母液，随后加入常规细胞培养基（与实施例五一致）中，使得染料1g在细胞培养基中的浓度为2 μM，与Hela细胞在饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱共同培养5分钟，随后加入细胞膜绿色标记物DiO (15 μM)再培养5分钟；然后用PBS缓冲液洗涤三次，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。绿光通道选用488 nm激发，收集468-550 nm范围内的荧光信号。红光通道使用561 nm激发，收集570-750 nm范围内的荧光信号。细胞成像结果显示染料1g在Hela细胞中不能够很好的标记细胞膜，所以不可作为细胞膜标记物。
细胞成像结果如图16所示，其中(a、c)为细胞明场成像图，(b)为染料1g的细胞成像图， (d)为染料1g的细胞成像图。从图中可以看出，两次细胞成像所染色细胞器不一致，而且重复三次细胞实验结果都是如此，所以染料1g不适合做细胞膜标记物。
实施例六
使用DMSO（二甲基亚砜）将染料1c配制成母液，随后加入常规细胞培养基（与实施例五一致）中，使得染料1c在细胞培养基中的浓度为1 μM，与Hela细胞在饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱共同培养（以下实验相同）2分钟，然后用PBS缓冲液洗涤三次，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像；然后在同一皿细胞中加入β-环糊精共同培育5分钟，再利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。红光通道使用561 nm激发，收集570-750 nm范围内的荧光信号。细胞成像结果显示染料1c在加入β-环糊精后细胞膜染色明显变亮。
细胞成像结果如图17所示，其中(a)为细胞明场成像图，(b)为染料1c的细胞成像图，(c) 为细胞明场成像图，(d)为染料1c加入β-环糊精后的细胞成像图，(e)为染料1c ROI线的荧光强度，(f)为染料1c 加入β-环糊精后ROI线的荧光强度。与图12的2μM相比如何，加入β-环糊精后的荧光强度明显增强，则说明β-环糊精的加入可降低染料用量。
将染料1d（1 μM）加入Hela细胞共同培养2分钟; 然后用PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。在同一皿细胞中加入β-环糊精共同培育5分钟，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。红光通道使用561 nm激发，收集570-750 nm范围内的荧光信号。细胞成像结果显示染料1d 在加入β-环糊精后细胞膜染色明显变亮。
细胞成像结果如图18所示，其中(a、c)为细胞明场成像图，(b)为染料1d 的细胞成像图， (d)为染料1d 加入β-环糊精后的细胞成像图，(e)为染料1d ROI线的荧光强度，(f)为染料1d 加入β-环糊精后ROI线的荧光强度。
将染料1f（1 μM）加入Hela细胞共同培养2分钟; 然后用PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。在同一皿细胞中加入β-环糊精共同培育5分钟，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。红光通道使用561 nm激发，收集570-750 nm范围内的荧光信号。细胞成像结果显示染料1f 在加入β-环糊精后细胞膜染色明显变亮。
细胞成像结果如图19所示，其中(a、c)为细胞明场成像图，(b)为染料1f的细胞成像图，(d)为染料1f 加入β-环糊精后的细胞成像图，(e)为染料1fROI线的荧光强度，(f)为染料1f加入β-环糊精后ROI线的荧光强度。
可以看出，本发明首次公开了一类高光学稳定性的细胞膜荧光标记物，与细胞共培养后，可以实现细胞成像。加入β-环糊精后和细胞共培养，可以是用较低浓度的标记物使细胞成像更亮。本发明改善标记物生物活性的同时，通过改变荧光团使得标记物可以适用于红光通道和绿光通道的细胞成像，而且进行细胞成像时细胞毒性低、对生物样品的损坏小、可以对细胞实时监测，这些实验结果表明染料对细胞膜有着优异的靶向性。

Claims (10)

1.高光学稳定性细胞膜荧光标记物，其特征在于，所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物的化学结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中，R1为直链烷基，R2为荧光基团。
2.根据权利要求1所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物，其特征在于，所述直链烷基的碳原子数量大于7；所述荧光基团含有苯环。
3.权利要求1所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物在细胞膜标记中的应用；或者权利要求1所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物在制备细胞膜荧光试剂中的应用。
4.权利要求1所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，2-甲基噁唑[4,5-b]吡啶与卤代烷烃反应得到化合物4；化合物4与化合物5反应，得到高光学稳定性细胞膜荧光标记物。
5.根据权利要求4所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物的制备方法，其特征在于，化合物4与化合物5的反应在三甲基氯硅烷存在下进行。
6.一种细胞荧光成像的方法，其特征在于，包括以下步骤，2-甲基噁唑[4,5-b]吡啶与卤代烷烃反应得到化合物4，化合物4与化合物5反应，得到高光学稳定性细胞膜荧光标记物；将细胞与含有所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物的培养基共培养，再进行细胞成像，完成细胞荧光成像。
7.根据权利要求6所述细胞荧光成像的方法，其特征在于，含有所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物的培养基中，所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物在培养基中的浓度为2～6μM。
8.一种细胞荧光成像的方法，其特征在于，包括以下步骤，2-甲基噁唑[4,5-b]吡啶与卤代烷烃反应得到化合物4，化合物4与化合物5反应，得到高光学稳定性细胞膜荧光标记物；将细胞与含有所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物、β-环糊精的培养基共培养，再进行细胞成像，完成细胞荧光成像。
9.根据权利要求8所述细胞荧光成像的方法，其特征在于，含有所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物的培养基中，所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物在培养基中的浓度为0.5～1.5 μM，β-环糊精的浓度为0.5～300 μM。
10.细胞荧光成像用染料溶液，其特征在于，所述细胞荧光成像用染料溶液的制备方法包括以下步骤，2-甲基噁唑[4,5-b]吡啶与卤代烷烃反应得到化合物4；化合物4与化合物5反应，得到高光学稳定性细胞膜荧光标记物；将所述高光学稳定性细胞膜荧光标记物溶于溶剂，得到细胞荧光成像用染料溶液。
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