CN102796511A

CN102796511A - 一种定量检测肝素的荧光探针及其合成方法和用途

Info

Publication number: CN102796511A
Application number: CN2011101394064A
Authority: CN
Inventors: 汪鹏飞; 代青; 刘卫敏; 赵文文; 庄晓青
Original assignee: Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Current assignee: Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Priority date: 2011-05-27
Filing date: 2011-05-27
Publication date: 2012-11-28

Abstract

本发明公开了一种荧光探针，具有如下结构式：

式中：R₁，R₂，R₃，R₄，R₅选自1～18个碳的烷基，芳基，酯基或醚基；n，m选自0～8；Ar选自萘，蒽或芘；X-选自F^-，Cl^-，Br^-或I^-。本发明还公开了该荧光探针的合成方法和用途，其可以用于检测血液中的肝素，它分子结构简单，响应时间短，测定灵敏度高，合成方法简便。

Description

一种定量检测肝素的荧光探针及其合成方法和用途

技术领域

本发明涉及化学分析、生物分析领域，尤其是涉及一种荧光探针及其合成方法和用途。

背景技术

众所周知，肝素是能够迅速达到抗凝血作用的首选药物。它可用于外科预防血栓的形成以及妊娠者的抗凝血治疗。对于急性心肌梗死患者，可用肝素来预防病人发生静脉栓塞病，并可预防大块的前壁透壁性心肌梗死病人发生动脉栓塞等。肝素的另一重要临床应用是在心脏、手术和肾脏透析时维持血液体外循环畅通。此外，肝素可用于治疗各种原因引起的弥散性血管内凝血(DIC)，也可用于治疗肾小球肾炎、肾病综合征、类风湿性关节炎等。

肝素的主要不良反应是易引起自发性出血，表现为各种黏膜出血、关节腔积血和伤口出血等；而肝素诱导的血小板减少症是一种药物诱导的血小板减少症，是肝素治疗中的一种严重并发症。药物所致的血小板减少症主要分为两型：(1)骨髓被药物毒性作用抑制所致；(2)药物通过免疫机制破坏血小板所致。后者中以肝素、奎宁、奎尼丁与磺胺类药物发病较高。临床症状极不一致，血小板减少至(1.0～80)×10⁹/L，轻者无症状，重者可因颅内出血或因肝素导致内皮细胞的免疫损害，这些副作用合并在一起会引起危及生命的肺栓塞与动脉血栓。临床诊断主要依靠：(1)药物治疗期间血小板减少；(2)停药后血小板减少消除。严重患者血清中可检出药物依赖性血小板抗体，但敏感性不高而常呈假阴性。治疗的关键是：立即停用相关药物，严重病例可使用输注血小板、激素、丙球甚或血浆置换

肝素不宜用于溶血尿毒综合征。溶血尿毒综合征(HUS)是小儿急性肾功能衰竭常见病因之一。儿童期典型腹泻后HUS90％由出血性大肠杆菌0157:H7引起。目前认为HUS发病的中心环节是内毒素启动内皮细胞受损，继而出现凝血系统激活，炎症介质释放，内皮素-一氧化氮轴紊乱等多环节参与发病。全身各器官均有不同程度受损，主要是肾脏，其次是脑。治疗上强调支持疗法和早期透析，典型HUS的治疗不提倡应用肝素、抗生素和激素。不典型HUS可适用血浆置换，有一定疗效。鉴于肝素的这些严重副作用，迫切需要发展能够高选择性高灵敏度的检测肝素的荧光探针。

光化学传感器是近几年来迅速发展起来的一个新的科学问题，它的出现和超分子科学的进展诸如分子组装，主客体化学，氢键作用，疏水作用，光诱导电子转移过程，分子内电荷转移等特性密切相关。它的发展也和许多科学技术领域诸如：生物化学，临床医学，药物化学以及环境科学中涉及的大量实际问题密切相关。由于上述的种种原因，有力地推动了光化学传感器的发展。

光化学传感器按照其信号检测的不同，可以分为荧光化学传感器(Fluorescent Chemosensor)和比色化学传感器(Colorimetric Chemosensor)。荧光化学传感器(即荧光探针)主要是依靠荧光信号为检测手段，通常有荧光的增强，淬灭或者发光波长的变化；比色化学传感器则是借助于色调的变化，通过肉眼观察就可检测，实际应用方便。

用来对外来物种进行检测的荧光化学传感器的设计和研究，是近年来受到广泛关注的一个课题。荧光传感器的检测过程是通过器件接受体部分对外来物种(包括阳离子，阴离子以及中性分子)进行选择性接纳，然后经过不同的机制如光诱导电子转移(PET)，能量转移(LMCT)，金属-配体电荷转移(MLCT)，分子内电荷转移(ICT)，分子间的激基络合物等，发生光学信号的变化，再通过器件的信号报告部分给出器件在接纳物种过程中的信息变化。

通过分子的发光现象和吸收光谱的变化来探测分子间的相互作用，其优点可以概括为以下几个方面，(1)方便快捷，具有很高的灵敏度；(2)可以利用光纤技术实现单细胞的实时检测；(3)如果在吸收光谱上有比较大的变化，可以在不借助于任何仪器的情况下，直接通过颜色的变化来达到检测的目的。许多分子结构因素和它所处的环境因素都可用来控制荧光发光效率和吸收光谱的变化。因此，如TICT发光、MLCT发光、LMCT发光、激基缔合物和激基复合物发光以及和重原子效应、光诱导电子转移、电子能量转移等相关的光物理和光化学特征等都已成功地用于化学敏感器的设计中。

荧光化学传感器由于其选择性好，灵敏度高，响应时间快等特点，目前在生物分子的检测中受到越来越广泛的关注。对于大多数肝素的荧光化学传感器，其设计机制主要是通过阴-阳离子静电作用，或者多点识别来实现荧光检测。

比率的荧光探针通常是探针分子在与被检测物作用后，其在不同于原波长处出现一新的发射峰，并且该发射波长处的荧光逐渐增强，而原发射波长强度却不断减弱的探针分子。相对于单波长响应的荧光探针，比率的荧光探针可以对两个发射波长的荧光信号强度进行监测，带有分子内的自我校正，可以有效地消除全部或绝大部分来自于环境的干扰，同时将“on-off”型响应的探针分子的缺点最小化，使得其被广泛地应用在复杂生物样品检测中。

蒽和芘分子是非常有用的荧光团，它不仅显示单体的精细结构荧光发射光谱，而且在一定条件下会在波长较长处显示激基缔合物的发射峰，显示很好的比率信号响应机制。

目前文献报道的肝素化学传感器很少，且这些传感器的选择性差，灵敏度低，荧光发射波长短或者是仅用单一波长检测，造成检测结果不可靠，误差大，难以避免血液中其它荧光物质的干扰，能够实际应用的几乎没有。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种荧光探针；该荧光探针克服了现有技术中用于肝素检测的荧光探针的性能和结构上的不足，选择性好，灵敏度高。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种荧光探针的合成方法；该合成方法简单、易操作。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种荧光探针的用途。

为解决第一个技术问题，本发明提供一种荧光探针，它具有如下结构式：

式中：

R₁，R₂，R₃，R₄，R₅选自1～18个碳的烷基，芳基，酯基或醚基；

n，m选自0～8；

Ar选自萘，蒽或芘；

X^-选自F^-，Cl^-，Br^-或I^-。

为解决第二个技术问题，本发明提供一种荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

将带有取代基为R₁，R₂，R₃，R₄，R₅的单季铵盐二胺溶解在有机溶剂中，加入卤代烷基芳香烃，反应后直接析出沉淀，再进行重结晶，得到具有下式(A)结构的化合物：

所述R₁，R₂，R₃，R₄，R₅选自1～18个碳的烷基，芳基，酯基或醚基；

所述卤代烷基芳香烃选自含1～9个烷基碳的萘，蒽或芘；

所述卤素选自F^-，Cl^-，Br^-或I^-；

式(A)中：R₁，R₂，R₃，R₄，R₅选自1～18个碳的烷基，芳基，酯基或醚基；n，m选自0～8；Ar选自萘，蒽或芘；X^-为F^-，Cl^-，Br^-或I^-。

进一步地，所述有机溶剂是甲醇，乙醇，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，二甲亚砜，乙腈，二氧六环，二氯甲烷，苯，甲苯中的一种或两种以上混合物。

进一步地，所述的带有取代基为R₁，R₂，R₃，R₄，R₅的单季铵盐二胺是按照以下步骤合成的：将带有取代基为R₁，R₂，R₄，R₅的三级二胺溶解在有机溶剂中，加入卤代的R₃化合物，在反应温度为30～100℃条件下反应0.5～12小时；反应后将溶液浓缩，经过柱层析，得到具有如下式(C)结构的化合物白色固体；所述三级二胺和所述卤代R₃化合物的摩尔比为1∶0.5～1：

所述取代基R₁，R₂，R₃，R₄，R₅选自1～18个碳的烷基，芳基，酯基或醚基；

所述卤素选自F^-，Cl^-，Br^-或I^-；

式(C)中，R₁，R₂，R₃，R₄，R₅选自1～18个碳的烷基，芳基，酯基或醚基；n选自0～8；X^-选自F^-，Cl^-，Br^-或I^-。

所述有机溶剂是甲醇，乙醇，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，二甲亚砜，乙腈，二氧六环，二氯甲烷，苯，甲苯中的一种或两种以上混合物。

进一步地，所述卤代烷基芳香烃与所述带有取代基为R₁，R₂，R₃，R₄，R₅的单季铵盐二胺的摩尔比值为1～5∶1。

进一步地，所述反应是在温度为30～100℃条件下反应0.5～80小时。

进一步地，所述反应得到的物质是具有式(A)结构的浅黄色固体。

本发明提供了一种荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

将带有取代基为R₁的1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)单季铵盐溶解在有机溶剂中，加入卤代烷基芳香烃，反应后直接析出沉淀，得到具有下式(B)的化合物：

所述取代基R₁选自1～18个碳的烷基，芳基，酯基或醚基；

所述卤代烷基芳香烃选自含1～9个烷基碳的萘，蒽或芘；

所述卤素选自F^-，Cl^-，Br^-或I^-；

式(B)中：R₁选自1～18个碳的烷基，芳基，酯基或醚基；m选自0～8；Ar选自萘，蒽或芘；X^-选自F^-，Cl^-，Br^-或I^-。

进一步地，所述带有取代基为R₁的DABCO单季铵盐是按照以下步骤合成的：将卤代的R₁化合物加入到DABCOD的有机溶剂中，在反应温度为30～100℃条件下反应0.5～12小时；反应后将溶液浓缩，经过柱层析方法，得到具有下面结构式的白色固体；所述卤代的R₁化合物与所述DABCO的摩尔比为0.5～1∶1：

所述取代基R₁选自1～18个碳的烷基，芳基，酯基或醚基；

所述卤素选自F^-，Cl^-，Br^-或I^-；

式(B)中：R₁选自1～18个碳的烷基，芳基，酯基或醚基；X^-选自F^-，Cl^-，Br^-或I^-。

进一步地，所述卤代烷基芳香烃与所述带有取代基为R¹取代的DABCO单季铵盐的摩尔比值为1～5∶1。

进一步地，所述反应得到的物质是具有式(B)结构的浅黄色固体。

为解决上述第三个技术问题，本发明一种荧光探针的用途，可用于检测血液中的肝素含量，尤其是用于临床上检测血液中肝素的浓度，也可用于化学模拟生物体系中肝素的检测，以及临床医学上血液、血清或者组织中肝素的检测。

本发明的检测血液中肝素含量的荧光探针在使用时没有特殊的限制，其对肝素的检测过程为：将探针分子储存在水和有机溶剂的溶液中，取含探针分子的储存溶液，加入生理盐水或羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)的缓冲水溶液中然后再逐渐加入血清，得到测试溶液，用荧光仪上逐一记录其荧光发射光谱，根据其在双发射波长的荧光强度比的变化可以知道是否含有肝素以及肝素的含量。

本发明具有以下优点：

1、本发明提供了一种以双季铵盐为母体，用于检测血液中肝素的荧光探针；该荧光探针对肝素有很好的选择性，人血清白蛋白、免疫球蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、氨基酸等对其的检测没有干扰；

2、本发明的荧光探针的激基缔合物和单体的荧光强度比与肝素的浓度在一定的浓度范围内(肝素浓度范围：0.53x10^-6到22.5x10^-6摩尔/升)具有很好的线性关系，显示出定量检测特性，完全可以满足临床上对手术后以及慢性病人抗凝血治疗中肝素浓度的检测要求；

3、本发明的荧光探针在用于检测血液中肝素含量时没有特殊的限制，可以将探针分子溶解在生理盐水或羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)的缓冲水溶液中，或者将探针分子溶解在甲醇、乙醇、乙腈、二甲亚砜、二甲酰胺等有机溶剂中，或者将探针分子溶解在水和上述有机溶剂任意比例的混合溶剂中，然后在溶解有探针分子的上述溶液中加入含肝素的血清样品；

4、本发明的荧光探针响应时间短，测定灵敏度高，分子结构简单，合成方法简便，使得其极易实际推广应用。

附图说明

图1为实施例17中的荧光探针A分别应用于其他阴离子、肝素、硫酸软骨素时，得到的荧光强度与波长的关系图。

图2为实施例17中的荧光探针A应用于不同浓度的肝素时，荧光强度和波长的关系图。

图3为实施例17中的荧光探针A应用于肝素时，激基缔合物/单体荧光强度比与肝素浓度的关系图。

具体实施方式

实施例1

制备单季铵盐二胺，包括以下步骤：

将四甲基乙二胺溶解溶解在甲醇中，然后加入四甲基乙二胺0.8倍摩尔量的十四烷基溴，在60℃反应10小时，将反应溶液浓缩后，加入水，用有机溶剂萃取分层，并经柱色谱分离，二氯甲烷/甲醇混合溶剂(体积比8/1)作淋洗剂，得到白色固体化合物：N，N，N’，N’-四甲基-N-十四烷基乙二胺a。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ0.85(t，3H)，1.25(m，22H)，1.73(m，2H)，2.27(s，6H)，2.80(t，2H)，3.24(t，2H)，3.30(s，6H)，3.34(t，2H)；

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ14.2，20.7，22.7，28.1，29.3，29.6，31.8，45.6，51.7，52.2，60.8，64.4.ESI-MS m/z＝313.39M⁺，calcd for C₂₀H₄₅N₂ ⁺ 313.36。

实施例2

制备单季铵盐二胺，包括以下步骤：

将四甲基丙二胺溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，加入是四甲基丙二胺0.8倍摩尔量的十四烷基溴，于50℃反应10小时，将反应溶液浓缩后，加入水，用有机溶剂萃取分层，并经柱色谱分离，二氯甲烷/甲醇混合溶剂(体积比9/1)作淋洗剂，得到白色固体化合物：N，N，N’，N’-四甲基-N-十四烷基丙二胺b。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ0.85(t，3H)，1.26(m，22H)，1.73(m，2H)，1.83(m，2H)，2.27(s，6H)，2.36(t，2H)，3.24(t，4H)，3.30(s，6H)；

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ14.1，20.1，20.7，22.7，28.1，29.3，29.6，31.8，45.9，52.5，57.6，62.4，64.7.ESI-MS m/z＝327.39M⁺，calcd forC₂₁H₄₇N₂ ⁺ 327.37。

实施例3

制备单季铵盐二胺，包括以下步骤：

将四甲基己二胺溶解在二氯甲烷和无水甲醇的混合溶剂中(二氯甲烷和无水甲醇的体积比为6∶1)，加入是四甲基己二胺0.8倍摩尔量的溴代十四烷基羧酸甲酯，于30℃反应6小时，将反应溶液浓缩后，以二氯甲烷/甲醇混合溶剂(体积比15/1)作为淋洗剂，经过硅胶柱层析得到白色固体c。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ，1.26(m，6H)，1.29(m，10H)，1.30(m，2H)，1.68(m，2H)，1.73(m，2H)，1.83(m，2H)，2.25(t，2H)，2.27(t，6H)，2.36(t，2H)，3.24(t，4H)，3.30(s，6H)，3.58(s，3H).

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ20.1，20.7，25.0，28.1，29.0，29.3，29.6，33.6，45.4，51.9，52.5，57.6，62.4，64.7，173.1.ESI-MS m/z＝371.36M⁺，calcd for C₂₂H₄₇N₂O₂ ⁺ 371.36。

实施例4

制备单季铵盐二胺，包括以下步骤：

将四(2-乙氧基2-氧代乙基)乙二胺溶解在二甲亚砜中，加入是四(2-乙氧基2-氧代乙基)乙二胺0.8倍摩尔量的氯代十六烷，于30℃反应6小时，将反应溶液浓缩后，加入水并用有机溶剂萃取，然后以二氯甲烷/甲醇混合溶剂(体积比15/1)作为淋洗剂，经过硅胶柱层析得到白色固体d。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ，0.86(t，3H)，1.26(m，20H)，1.29(m，6H)，1.30(t，12H)，1.73(m，2H)，2.80(t，2H)，3.24(t，2H)，3.32(s，4H)，3.34(t，2H).4.12(q，8H)，4.20(s，4H)，

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ14.1，20.7，22.7，28.1，29.3，29.6，31.8，46.1，54.9，55.2，55.6，58.8，61.0，167.3，169.5.ESI-MS m/z＝629.47M⁺，calcd for C₃₄H₆₅N₂O₈ ⁺ 629.47。

实施例5

制备单季铵盐二胺，包括以下步骤：

将四甲基乙二胺溶解在二氯甲烷中，加入是四甲基乙二胺0.8倍摩尔量的对十二烷氧基苄基溴，于30℃反应5小时，将反应溶液浓缩后，以二氯甲烷/甲醇混合溶剂(体积比10/1)作为淋洗剂，经过硅胶柱层析得到白色固体e。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ，0.86(t，3H)，1.26(m，14H)，1.29(m，2H)，1.43(m，2H)，1.74(m，2H)，2.28(t，6H)，2.8(t，2H)，3.30(s，6H)，3.34(t，2H)，4.06(m，2H)，4.50(s，2H)，6.65(d，2H)，6.95(d，2H).

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ14.1，22.7，25.9，29.3，29.6，31.8，45.6，51.7，51.8，60.4，68.3，68.8，114.4，124.2，129.6，154.4，ESI-MS m/z＝391.30M⁺，calcd for C₂₅H₄₇N₂O⁺ 391.37。

实施例6

制备单季铵盐二胺，包括以下步骤：

将四(2-乙氧基2-氧代乙基)乙二胺溶解在二甲亚砜中，加入是四(2-乙氧基2-氧代乙基)乙二胺1.0倍摩尔量的氯代十六烷，于50℃反应12小时，将反应溶液浓缩后，加入水并用有机溶剂萃取，然后以二氯甲烷/甲醇混合溶剂(体积比15/1)作为淋洗剂，经过硅胶柱层析得到白色固体f。

实施例7

制备单季铵盐二胺，包括以下步骤：

将四甲基乙二胺溶解在二氯甲烷中，加入是四甲基乙二胺0.5倍摩尔量的对十二烷氧基苄基溴，于100℃反应0.5小时，将反应溶液浓缩后，以二氯甲烷/甲醇混合溶剂(体积比10/1)作为淋洗剂，经过硅胶柱层析得到白色固体g。

实施例8

制备DABCO单季铵盐，包括以下步骤：

将三乙烯二胺(DABCO)溶解在无水甲醇中，加入是DABCO 0.8倍摩尔量的十四烷基溴，于60℃反应6小时，将反应溶液浓缩后，以二氯甲烷/甲醇混合溶剂(体积比为6/1)作为淋洗剂，经过硅胶柱层析得白色固体化合物：十四烷基DABCO单盐h。

¹H NMR(DMSO，400MHz，)δ(ppm)：0.85(t，3H)，1.24(m，22H)，1.73(m，2H)，2.80(t，6H)，3.24(t，2H)，3.34(t，6H)；

¹³C NMR(CDCl3，100MHz)δ(ppm)：13.9，21.1，22.1，25.9，28.6，28.8，28.9，29.1，31.3，44.7，51.3，63.0.ESI-MS m/z：M+，calc.for C₂₀H₄₁N₂，309.33；found，309.35.

实施例9

制备DABCO单季铵盐，包括以下步骤：

将三乙烯二胺(DABCO)溶解在无水甲醇中，加入是DABCO 0.8倍摩尔量的对十二烷氧基苄基溴，于60℃反应6小时，将反应溶液浓缩后，以二氯甲烷/甲醇混合溶剂(体积比为6/1)作为淋洗剂，经过硅胶柱层析得白色固体化合物i。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ，0.86(t，3H)，1.26(m，14H)，1.29(m，2H)，1.43(m，2H)，1.74(m，2H)，2.80(t，6H)，3.34(t，6H)，4.06(m，2H)，4.50(s，2H)，6.65(d，2H)，6.95(d，2H).

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ14.1，22.7，25.9，29.3，29.6，31.8，48.9，48.5，63.4，114.3，124.2，129.6，154.4ESI-MS m/z＝387.30M⁺，calcd forC₂₅H₄₇N₂O⁺ 387.33。

实施例10

制备DABCO单季铵盐，包括以下步骤：

将三乙烯二胺(DABCO)溶解在无水二氧六环中，加入是DABCO 1.0倍摩尔量的1-碘代十四烷基羧酸甲酯，于60℃反应6小时，将反应溶液浓缩后，以二氯甲烷/甲醇混合溶剂(体积比为6/1)作为淋洗剂，经过硅胶柱层析得白色固体化合物j。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ，1.26(m，6H)，1.29(m，12H)，1.68(m，2H)，1.74(m，2H)，2.25(t，2H)，2.80(t，6H)，3.24(t，2H)，3.34(t，6H)，3.58(s，3H).

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ21.3，25.0，28.1，29.0，29.3，29.6，33.6，49.5，49.3，51.9，59.4，173.1.ESI-MS m/z＝353.31M⁺，calcd for C₂₁H₄₁N₂O₂ ⁺353.31。

实施例11

制备DABCO单季铵盐，包括以下步骤：

将三乙烯二胺(DABCO)溶解在无水甲醇中，加入是DABCO 0.5倍摩尔量的十四烷基溴，于30℃反应12小时，将反应溶液浓缩后，以二氯甲烷/甲醇混合溶剂(体积比为6/1)作为淋洗剂，经过硅胶柱层析得白色固体化合物：十四烷基DABCO单盐k。

实施例12

制备DABCO单季铵盐，包括以下步骤：

将三乙烯二胺(DABCO)溶解在无水二氧六环中，加入是DABCO 1.0倍摩尔量的1-碘代十四烷基羧酸甲酯，于100℃反应0.5小时，将反应溶液浓缩后，以二氯甲烷/甲醇混合溶剂(体积比为6/1)作为淋洗剂，经过硅胶柱层析得白色固体化合物l。

实施例13

一种荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

将实施例1中的产物N，N，N’，N’-四甲基-N-十四烷基乙二胺a溶解在甲醇中，然后加入是N，N，N’，N’-四甲基-N-十四烷基乙二胺a1.0倍摩尔量的芘甲基溴，于60℃反应48小时，反应冷却后析出浅黄色沉淀，并用甲醇重结晶得到浅黄色固体化合物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ0.85(t，3H)，1.26(m，18H)，1.29(m，4H)，1.73(m，2H)，3.24(t，2H)，3.30(s，12H)，3.69(t，4H)，4.94(s，2H)，7.62(d，2H)，7.71(m，4H)，7.82-7.90(m，2H)，8.01(d，2H)；

¹³C NMR(100MHz，DMSO/CDC l 3，4/1)：δ14.2，20.7，22.7，28.1，29.3，29.6，31.8，51.8，52.2，58.7，59.1，66.5，124.7，124.8，125.3，125.7，126.3，126.6，127.2，128.2，128.3，130.4，133.4，135.5.SIMS m/z＝528.44(M-1)⁺，calcd for C₃₇H₅₆N₂ ²⁺ 528.45。

实施例14

一种荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

将实施例2中的产物N，N，N’，N’-四甲基-N-十四烷基丙二胺单季铵盐b溶解在乙腈中，然后加入是N，N，N’，N’-四甲基-N-十四烷基丙二胺b1.0倍摩尔量的蒽甲基氯，于60℃反应60小时，反应冷却后析出浅黄色沉淀，并用乙腈重结晶得到浅黄色固体化合物。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ0.85(t，3H)，1.26(m，18H)，1.29(m，4H)，1.73(m，2H)，3.24(t，2H)，3.30(s，12H)，3.69(t，4H)，4.94(s，2H)，7.37(m，4H)，7.89(d，2H)，7.96(d，2H)，8.15(s，1H)；

¹³C NMR(100MHz，DMSO/CDCl3，4/1)：δ14.2，20.7，22.7，28.1，29.3，29.6，31.8，51.8，52.2，58.7，59.1，64.5，64.9，124.7，125.2，125.3，126.0，128.2，130.5，131.9.SIMS m/z＝518.45M⁺，calcd for C₂₆H₅₈N₂ ²⁺ 518.46。

实施例15

一种荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

将实施例3中的产物c溶解在无水甲醇/DMF(体积比为100/1)中，加入是c2.0倍摩尔量的蒽甲基氯，40℃反应72小时，随着反应进行直接有沉淀析出，并用甲醇/DMF重结晶得到浅黄色固体。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ，1.26(m，6H)，1.29(m，10H)，1.30(m，2H)，1.68(m，2H)，1.73(m，2H)，2.17(m，2H)，2.25(t，2H)，3.24(t，4H)，3.30(s，12H)，3.58(s，3H)，4.94(s，2H)，7.37(m，4H)，7.89(d，2H)，7.96(d，2H)，8.15(s，1H)；

¹³C NMR(100MHz，DMSO/CDCl3，4/1)：δ16.5，20.7，25，28.1，29.0，29.3，29.6，33.6，52.1，52.5，62.8，63.2，64.7，65.2，124.7，125.2，125.3，126.0，128.2，130.5，131.9，173.1.S IMS m/z＝504.45M⁺，calcd forC₃₅H₅₆N₂O₂ ²⁺ 504.44。

实施例16

一种荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

将实施例4中的产物d溶解在二甲亚砜中，加入是d 2.0倍摩尔量的芘甲基氯，40℃反应72小时，随着反应进行直接有沉淀析出，并用二甲亚砜/甲醇重结晶得到浅黄色固体。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ，0.86(t，3H)，1.26(m，20H)，1.29(m，6H)，1.30(t，12H)，1.73(m，2H)，3.24(t，2H)，3.68(t，4H)，4.12(q，8H)，4.20(s，8H)，4.94(s，2H)，7.61(d，1H)，7.71(d，4H)，7.76(m，1H)，7.70-7.82(m，2H)，8.12(d，1H).

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ14.1，20.7，22.7，28.1，29.3，29.6，31.8，53.5，53.1，54.9，58.8，60.9，61.0，124.7，125.7，126.2，126.6，127.2，128.3，133.0，133.4，137.5，167.3.S IMS m/z＝844.45M⁺，calcd forC₅₁H₇₆N₂O₈ ²⁺ 844.56。

实施例17

一种荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

将实施例5中的产物e溶解在二氯甲烷和二甲亚砜混合溶剂中(体积比为10/1)，加入是e 2.0倍摩尔量的蒽甲基氯，40℃反应12小时，随着反应进行直接有沉淀析出，并用乙腈/二甲亚砜重结晶得到浅黄色固体A。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ，0.86(t，3H)，1.26(m，14H)，1.29(m，2H)，1.43(m，2H)，1.74(m，2H)，3.30(s，12H)，3.68(t，2H)，4.06(m，2H)，4.50(s，2H)，4.94(s，2H)，6.65(d，2H)，6.95(d，2H)，7.37-7.40(m，4H)，7.89(d，2H)，7.96(d，2H)，8.15(s，1H).

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ14.1，22.7，25.9，29.3，29.6，31.8，51.8，58.7，64.9，68.3，68.8，114.4，124.2，124.6，125.2，125.3，126.0，128.2，129.6，130.5，131.9，132.2，154.4，ESI-MS m/z＝582.45M⁺，calcd forC₄₀H₅₈N₂O²⁺ 582.45。

实施例18

一种荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

将实施例6中的产物f溶解在二甲亚砜中，加入是f 3.0倍摩尔量的芘甲基氯，30℃反应80小时，随着反应进行直接有沉淀析出，并用二甲亚砜/甲醇重结晶得到浅黄色固体。

实施例19

一种荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

将实施例7中的产物g溶解在二氯甲烷和二甲亚砜混合溶剂中(体积比为10/1)，加入是g5.0倍摩尔量的蒽甲基氯，100℃反应0.5小时，随着反应进行直接有沉淀析出，并用乙腈/二甲亚砜重结晶得到浅黄色固体。

实施例20

一种荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

将实施例8中的产物-十四烷基DABCO单盐h溶解在无水甲醇中，加入是h1.0倍摩尔量的芘甲基氯，40℃反应72小时，随着反应进行直接有沉淀析出，并用甲醇重结晶得到浅黄色固体A。

¹H NMR(DMSO，400MHz，)δ(ppm)：0.85(t，3H)，1.24(m，22H)，1.64-1.66(m，4H)，1.80(s，2H)，3.47(t，2H)，3.54(t，2H)，3.67(t，2H)，3.81(s，12H)，5.23(s，2H)，8.08-8.13(m，2H)，8.20(s，2H)，8.27-8.35(m，4H)，8.40(d，1H)；

¹³C NMR(DMSO/CDCl3，4/1，100MHz)δ(ppm)：13.9，18.8，21.4，22.1，25.6，26.0，28.5，28.7，28.8，29.0，29.1，31.3，50.3，54.5，63.3，63.5，68.9，70.6，123.4，123.9，124.1，124.4，125.2，125.2，126.1，127.0，127.2，127.5，128.7，130.2，130.6，130.7，131.6.SIMS m/z：(M-1)+，calc.forC₄₁H₆₀N₂O，595.46；found，595.46.

实施例21

一种荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

将实施例9中的产物i溶解在二氯甲烷和DMF混合溶剂中(体积比为10/1)，加入是i 0.9倍摩尔量的蒽甲基碘化物，40℃反应12小时，随着反应进行直接有沉淀析出，并用乙腈/二甲亚砜重结晶得到浅黄色固体。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ，0.86(t，3H)，1.26(m，14H)，1.29(m，2H)，1.43(m，2H)，1.74(m，2H)，4.06(t，2H)，4.50(s，2H)，4.94(s，2H)，6.65(d，2H)，6.95(d，2H)，7.37-7.38(m，4H)，7.89(m，2H)，7.96(d，2H)，8.15(s，1H).

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ14.1，22.7，29.3，29.6，58.7，59.9，63.3，114.3，124.2，124.6，125.2，125.3，126.0，128.2，129.6，130.5，131.9，132.2，154.4.ESI-MS m/z＝578.42M⁺，calcd for C₄₀H₅₄N₂O²⁺ 578.42。

实施例22

一种荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

将实施例10中的产物j溶解在二氯甲烷和二氧六环混合溶剂中(体积比为5/1)，加入是j 0.9倍摩尔量的芘甲基溴，30℃反应12小时，随着反应进行直接有沉淀析出，并用乙腈/二氧六环重结晶得到浅黄色固体B。

¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ，1.26(m，6H)，1.29(m，12H)，1.68(m，2H)，1.74(m，2H)，2.25(t，2H)，2.80(t，6H)，3.24(t，2H)，3.58(s，3H)，3.68(t，12H)，7.71(d，4H)，7.82(m，1H)，7.88(m，1H)，8.12(m，1H)，8.48(m，1H)，8.51(d，1H).

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ21.3，25.0，28.1，29.0，29.3，29.6，33.6，51.9，58.7，59.4，61.6，122.0，124.8，126.0，126.6，126.3，128.3，133.4，173.1.ESI-MS m/z＝554.37M⁺，calcd for C₃₇H₅₀N₂O₂ ²⁺ 554.38。

实施例23

一种荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

将实施例11中的产物k溶解在二氯甲烷和DMF混合溶剂中(体积比为10/1)，加入是k 0.9倍摩尔量的蒽甲基碘化物，40℃反应12小时，随着反应进行直接有沉淀析出，并用乙腈/二甲亚砜重结晶得到浅黄色固体。

实施例24

一种荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

将实施例12中的产物l溶解在二氯甲烷和二氧六环混合溶剂中(体积比为5/1)，加入是10.9倍摩尔量的芘甲基溴，30℃反应12小时，随着反应进行直接有沉淀析出，并用乙腈/二氧六环重结晶得到浅黄色固体。

实施例25

使用实施例17中的化合物A作为荧光探针，评价该荧光探针对肝素的检测作用和选择性：

取化合物A在乙醇中的储存溶液(1.0x10^-3摩尔/升)150微升，加入到800微升HEPES缓冲水溶液中(pH＝7.4)，再加入50微升的血清，得到浓度为1.0x10^-4摩尔/升的化合物A的水/乙醇(85/15，v/v)测试溶液，其中血清浓度为5％。

用荧光仪记录其荧光发射光谱，从图1中可以看出(该化合物A的荧光曲线化合物A表示)，其中，激发波长选为345nm：

向上述化合物A溶液中加入是化合物A 10倍摩尔量的磷酸根，单磷酸腺苷、三磷酸腺苷、硫酸根、醋酸根、透明质酸阴离子、谷氨酸阴离子或天冬氨酸阴离子(图1中以化合物A+其他阴离子表示)，该化合物A溶液的发射光谱完全没有变化；

向上述化合物A溶液中加入是化合物A 10倍摩尔量的硫酸软骨素时，该化合物A溶液的激基缔合物发射峰仅有一点点的变化(图中以化合物A+硫酸软骨素表示)，该化合物A溶液的激基缔合物发射峰仅有一点点的变化，基本上不造成干扰；

向上述化合物A溶液中加入肝素(图1中以化合物A+肝素表示)，该化合物A溶液的的单体荧光(短波发射处)逐渐减弱，而在长波处逐渐出现一激基缔合物的发射峰，并逐渐增强，当加入的肝素量接近1倍摩尔量时，激基缔合物发射峰已经增大到超过单体发射峰的强度，如图2所示；可以看出整个过程本发明的传感分子可以对肝素产生比率的信号响应。

由上述结果可说明，在将该化合物A作为荧光探针时，该荧光探针对肝素有良好的选择性识别和实际应用性。

实施例26

使用实施例17中的化合物A作为荧光探针，并评价该荧光探针用于定量检测肝素的实用效果。

按照与实施例25相同的方法配制测试溶液，得到化合物A浓度为100微摩尔/升，血清含量为5％的水/乙醇(85/15，v/v)测试溶液。

以激基缔合物与单体的发射峰比值作纵轴，以肝素的摩尔浓度作横轴，研究其定量检测效果，如图3所示。结果表明：化合物A的比率变化与肝素的浓度在0到25微摩尔/升的范围内具有非常好的线形关系，这个范围完全可以满足临床上对手术后以及慢性病人抗凝血治疗中肝素浓度的检测要求(1.7-10微摩尔/每升)，因此本发明的荧光探针可以很好地应用于血液中肝素含量的检测。

实施例27

使用实施例22中的化合物B作为荧光探针。

取化合物B在乙醇中的储存溶液(1.0x10^-3摩尔/升)150微升，加入到800微升生理盐水中，再加入50微升的血清，得到浓度为1.0x10^-4摩尔/升的化合物B的水/乙醇(85/15，v/v)测试溶液，其中血清浓度为5％，用荧光仪记录其荧光发射光谱。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一种荧光探针，其特征在于，具有如下结构式：

式中：

n，m选自0～8；

Ar选自萘，蒽或芘；

X-选自F^-，Cl^-，Br^-或I^-。

2.如权利要求1所述的一种荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

将带有取代基为R₁，R₂，R₃，R₄，R₅的单季铵盐二胺溶解在有机溶剂中，加入卤代烷基芳香烃，反应后析出沉淀，得到具有下式(A)结构的物质：

所述卤代烷基芳香烃选自含1～9个烷基碳的萘，蒽或芘；

所述卤素选自F^-，Cl^-，Br^-或I^-；

式(A)中：R₁，R₂，R₃，R₄，R₅选自1～18个碳的烷基，芳基，酯基或醚基；

n，m选自0～8；Ar选自萘，蒽或芘；X^-为F^-，Cl^-，Br^-或I^-。

3.根据权利要求2所述的一种荧光探针的合成方法，其特征在于，所述有机溶剂是甲醇，乙醇，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，二甲亚砜，乙腈，二氧六环，二氯甲烷，苯，甲苯中的一种或两种混合物。

4.根据权利要求2所述的一种荧光探针的合成方法，其特征在于，所述带有取代基为R₁，R₂，R₃，R₄，R₅的单季铵盐二胺是按照以下步骤合成的：将带有取代基为R₁，R₂，R₄，R₅的三级二胺溶解在有机溶剂中，加入卤代的R₃化合物，在反应温度为30～100℃条件下反应0.5～12小时；反应后将溶液浓缩，经过柱层析，得到具有如下式(C)的化合物；所述三级二胺和所述卤代R₃化合物的摩尔比为1∶0.5～1：

所述卤素选自F^-，Cl^-，Br^-或I^-；

5.根据权利要求4所述的一种荧光探针的合成方法，其特征在于，所述有机溶剂是甲醇，乙醇，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，二甲亚砜，乙腈，二氧六环，二氯甲烷，苯，甲苯中的一种或两种混合物。

6.根据权利要求2所述的一种荧光探针的合成方法，其特征在于，所述卤代烷基芳香烃与所述带有取代基为R₁，R₂，R₃，R₄，R₅的单季铵盐二胺的摩尔比为1～5∶1。

7.根据权利要求2所述的一种荧光探针的合成方法，其特征在于，所述反应是在温度为30～100℃条件下反应0.5～80小时。

8.如权利要求1所述的一种荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

将带有取代基为R₁的1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)单季铵盐溶解在有机溶剂中，加入卤代烷基芳香烃，反应后析出沉淀，得到具有下式(B)的化合物：

所述取代基R₁选自1～18个碳的烷基，芳基，酯基或醚基；

所述卤代烷基芳香烃选自含1～9个烷基碳的萘，蒽或芘；

所述卤素选自F^-，Cl^-，Br^-或I^-；

9.根据权利要求8所述的一种荧光探针的合成方法，其特征在于，所述有机溶剂是甲醇，乙醇，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，二甲亚砜，乙腈，二氧六环，二氯甲烷，苯，甲苯中的一种或两种混合物。

10.根据权利要求8所述的一种荧光探针的合成方法，其特征在于，所述带有取代基为R₁的DABCO单季铵盐是按照以下步骤合成的：将卤代的R₁化合物加入到DABCOD的有机溶剂中，在反应温度为30～100℃条件下反应0.5～12小时；反应后将溶液浓缩，经过柱层析方法，得到具有下式(D)的化合物；所述卤代的R₁化合物与所述DABCO的摩尔比为0.5～1∶1：

所述取代基R₁选自1～18个碳的烷基，芳基，酯基或醚基；

所述卤素选自F^-，Cl^-，Br^-或I^-；

式(B)中：R₁选自1～18个碳的烷基，芳基，酯基或醚基；X^-选自F^-，Cl^-，Br^-，I^-。

11.根据权利要求10所述的一种荧光探针的合成方法，其特征在于，所述有机溶剂是甲醇，乙醇，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，二甲亚砜，乙腈，二氧六环，二氯甲烷，苯，甲苯中的一种，两种或两种以上混合物。

12.根据权利要求8所述的一种荧光探针的合成方法，其特征在于，所述卤代烷基芳香烃与所述带有取代基为R₁的DABCO单季铵盐的摩尔比值为：1～5∶1。

13.根据权利要求8所述的一种荧光探针的合成方法，其特征在于，所述反应是在温度为30～100℃条件下反应0.5～80小时。

14.如权利要求1所述的一种荧光探针的用途，其特征在于，所述荧光探针可用于检测血液中的肝素含量，也可用于化学模拟生物体系中肝素的检测，以及临床医学上血液、血清或者组织中肝素的检测。

15.根据权利要求14所述的一种荧光探针的用途，其特征在于，所述荧光探针检测肝素的过程为：将探针分子溶解在生理盐水或羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)的缓冲水溶液中，然后在溶解有探针分子的溶液中加入血清，得到测试溶液，用荧光仪上逐一记录其荧光发射光谱，根据其在双发射波长的荧光强度比的变化能得到肝素的信息。