ES2315713T3 - Sondas fluorescentes para su utilizacion en un ensayo de union de inhibidores de quinasas de proteinas. - Google Patents
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Abstract
La sonda fluorescente con la siguiente fórmula general (I): R1 - L - X - Y (I) en la que R1 es un radical de un compuesto que se une al centro activo de una quinasa; L es un enlace directo o un grupo alquileno C1-C16 grupo, un grupo alquenileno C2-C16 o un grupo alquinileno C2-C16, en el que uno o más de los grupos -CH2- disponibles presentes en el grupo alquileno C1-C16, grupo alquenileno C2-C16 o grupo alquinileno C2-C16, están opcionalmente e independientemente reemplazados por -O-, -C(O)-, -S(O)p-, en el que p es de 0 a 2, o -N(R2)-; X se selecciona de entre el grupo que consiste en O, S, -N(R2)C(O)-, -C(O)N(R2)-, -N(R2)C(S)-, -C(S)N(R2)-, -N(R2)C(S)NH-, -NHC(S)N(R2)-, -N(R2)C(O)NH-, -NHC(O)N(R2), -SO2NR2-, -NR2SO2-, -CH2N(R2)-, -N(R2)CH2-, -CH2S-, -SCH2-, -C(O)CH2S-, -SC(O)CH2-, -NHCH2CH2S-, -SCH2CH2NH-, -NC(O)O-, -ONC(O)-, -C(O)O-, -OC (O)-, -NH-N=C(R2)-, -C(R2)=N-NH-, -NHCH(R2)- y -CH(R2)NH-; R2 es H o alquilo C1 - 3; e Y es un marcaje fluorescente; y en la que R1 es una nitropirimidina de fórmula (III) (Ver fórmula) en la que R4 se selecciona de entre fenilo y naftilo, y está opcionalmente sustituido con de uno a tres grupos seleccionados de entre Cl, F, Br, I, -CH3, -CN, -CO2CH3, -NO2, -OH, -NH2 y -CF3.
Description
Sondas fluorescentes para su utilización en un
ensayo de unión de inhibidores de quinasas de proteínas.
Esta solicitud reivindica prioridad sobre la
solicitud provisional con número U.S. 60/508.539, registrada el 3 de
octubre de 2003.
Esta invención está relacionada en general con
un nuevo formato de ensayo de cribado que puede aplicarse
ampliamente con miembros de la familia de genes de quinasas de
proteínas, y es útil en la detección y evaluación de inhibidores de
quinasas. Esta invención también está relacionada con nuevas sondas
fluorescentes utilizadas en el ensayo.
Las quinasas de proteínas tienen un papel
crítico en la regulación de virtualmente todos los aspectos de la
regulación celular y comprenden una de las áreas de investigación
más activas en la industria farmacéutica actualmente. Los 522
dominios quinasa de proteínas del genoma humano pueden proporcionar
tremendas oportunidades de desarrollo de nuevos fármacos para
enfermedades no tratadas, y el desarrollo de nuevos inhibidores de
quinasas de proteínas se ha convertido en uno de los principales
puntos de interés creciente de la industria farmacéutica. Se ha
descrito que los inhibidores de las quinasas de proteínas son útiles
en el tratamiento de numerosas enfermedades, lo que incluye el
cáncer, enfermedades inflamatorias e inmunológicas. Véase por
ejemplo I.K. Mellinghoff y C.L. Sawyers, Kinase Inhibitor Therapy
in Cancer, 14(12):1-11, 2000; J. Dumas,
Growth factor receptor quinase inhibitors: recent progress and
clinical impact, Current Opinion in Drug Discovery &
Development, 4(4):378-89, 2001; J. Dumas,
Protein quinase inhibitors: emerging pharmacophores,
1997-2000, Expert Opinion on Therapeutic Patents.
11(3):405-429, 2001; D.H. Williams y T.
Mitchell, Latest developments in crystallography and
structure-based design of protein quinase inhibitors
as drug candidates, Current Opinion in Pharmacology,
2(5):567-73, 2002; S.B. Noonberg y C.C. Benz,
Tyrosine quinase inhibitors targeted to the epidermal growth factor
receptor subfamily: role as anticancer agents, Drugs,
59(4):753-67, 2000; S. Brunelleschi, L.
Penengo, M.M. Santoro y G. Gaudino, Receptor tyrosine kinases as
target for anti-cancer therapy, Current
Pharmaceutical Design. 8(22):1959-72, 2002;
P.G. Goekjian y M.R. Jirousek, Protein quinase C in the treatment of
disease: signal transduction pathways, inhibitors, and agents in
development, Current Medicinal Chemistry.
6(9):877-903, 1999, A. Gordon, The
increasing efficacy of breast cancer treatment, Clinical Oncology
(Royal College of Radiologists), 9(5):
338-42, 1997.
Aunque esta gran familia de genes representa una
rica fuente de nuevas dianas para los fármacos, los ensayos en
desarrollo utilizados para determinar la afinidad del compuesto son
altamente problemáticos. Los ensayos de cribado de inhibidores de
quinasas de proteínas a gran escala actuales miden la incorporación
de fosfato en un sustrato proteico o peptídico. El método mejor
establecido para el ensayo de inhibidores de quinasas de proteínas
es un ensayo radiométrico en el que el fosfato gamma del ATP se
marca con ^{32}P o ^{33}P. Cuando la quinasa transfiere el
fosfato gamma al hidroxilo del sustrato proteico durante la reacción
de fosfotransferasa la proteína queda covalentemente marcada con el
isótopo. La proteína se separa del ATP marcado y se determina la
cantidad de proteína radiactiva. Este ensayo sigue siendo el
principal de entre los ensayos cuantitativos para quinasas de
proteínas. La adaptación de este ensayo a un formato a gran escala
es problemática debido a los laboriosos pasos de separación y las
grandes cantidades de radiactividad que se utilizan.
Un ensayo radiométrico alternativo con el que es
posible un escalado mayor es el SPA o ensayo de proximidad de
centelleo (Amersham International). En este ensayo, cuentas
impregnadas con una sustancia de centelleo emiten luz cuando el
sustrato marcado se une a la cuenta. Este ensayo está limitado por
el nivel de radioactividad y la eficiencia del sustrato
peptídico.
La mayoría de ensayos no radiactivos utilizan
anticuerpos que reconocen el producto de la reacción quinasa, es
decir un fosfopéptido. Los ensayos de unión utilizan anticuerpos que
se detectan con una lectura de luminiscencia catalizada por una
enzima. Estos métodos están limitados por la disponibilidad de
reactivos, el recubrimiento de los pocillos y los múltiples pasos
de lavado e incubación.
Las técnicas que utilizan la polarización de la
fluorescencia para medir la actividad de la quinasa de proteínas o
la unión del inhibidor se basan en un anticuerpo o sustrato
peptídico marcado. En estos ensayos, la enzima transfiere el
fosfato gamma del ATP a un sustrato proteico o peptídico. Esta
actividad se monitoriza mediante la detección del fosfopéptido
mediante métodos como los anticuerpos. La unión del anticuerpo al
fosfopéptido retardará la rotación libre del péptido en solución y,
por lo tanto, puede detectarse una señal de polarización del
producto de la reacción catalítica. Ejemplos incluyen la patente de
Burke et al. US 2001/0004522 A1 o T.C. Turek et al.,
Analytical Biochemistry, 2001, 299 (1), 25-53.
Cada uno de los ensayos descritos anteriormente
determina la afinidad de un inhibidor basado en reducciones en la
formación del producto de la enzima. A pesar de que existen muchas
alternativas para medir el producto de la enzima, cada formato de
ensayo requiere una enzima activa, un sustrato de alta afinidad y un
anticuerpo especializado que se una al fosfopéptido. En la mayoría
de casos, obtener una enzima activa involucra la fosforilación del
bucle de activación que se sitúa a lo largo del sitio catalítico.
Esta fosforilación puede ser altamente problemática cuando se
desconoce la anterior quinasa que realiza esta función. Incluso si
la quinasa activadora se conoce, es necesario el clonaje o
coexpresión de múltiples quinasas. En algunos casos, deben añadirse
cofactores adicionales como las ciclinas para activar totalmente la
proteína.
Las quinasas de proteínas muestran una gran
selección de sustrato específica de secuencia. Por lo tanto, deben
encontrarse los sustratos específicos adecuados para cada quinasa.
Además, si la diana en el sustrato es una serina o treonina deben
obtenerse entonces anticuerpos especializados fosfoespecíficos para
monitorizar la actividad en un formato de ensayo a gran escala.
Estas necesidades añaden incertidumbre al diseño de nuevos ensayos
quinasa, a la vez que costes añadidos.
En la WO 03/032977 A1 se describen compuestos
orgánicos de bajo peso molecular que interaccionan con un número de
quinasas de proteínas. Éstos pertenecen al grupo de las pirimidinas
2,4,5-trisustituidas de fórmula general A
De acuerdo con esta solicitud, éstos pueden
utilizarse para el tratamiento de enfermedades que se caracterizan
por una proliferación celular excesiva o anormal.
Un determinado derivado
bis-indolilmalerimida (FIM-1) que se
une al punto de unión del ATP en el dominio catalítico de la
quinasa de proteínas C (PKC\alpha) se describe en Janoshazi y de
Barry (1999), Biochemistry, vol. 38, págs.
13316-13327. En este estudio se muestra como este
compuesto puede utilizarse en estudios cinéticos de esta enzima,
por ejemplo mediante la valoración del cambio en la intensidad de la
fluorescencia por longitud de onda durante la reacción de
proteólisis.
En resumen, los problemas con el desarrollo de
ensayos quinasa de proteínas se encuentran más frecuentemente en el
paso de activación y en la selección de la proteína sustrato. El
desarrollo de un ensayo de cribado a gran escala para nuevas
quinasas de proteínas actualmente dura 6-12 meses.
Además del clonaje y expresión de la proteína la enzima debe
activarse, deben encontrarse los sustratos y deben generarse los
reactivos para detectar el producto de la reacción enzimática. Este
es un ensayo que requiere un gran consumo de tiempo y un esfuerzo
intenso, y cada ensayo debe ser específico de una o de un pequeño
subgrupo de quinasas de proteínas.
Cualquier ensayo que utilice métodos de unión de
sustratos fosfopéptidos está limitado por la concentración de ATP
utilizada en el ensayo. Esto es inevitable ya que tanto los
aminoácidos fosforilados del sustrato peptídico como los fosfatos
del ATP compiten entre ellos por el sitio de unión del reactivo
añadido. Las quinasas con valores de K_{m} de medios a elevados
que se analizan a valores por debajo de su K_{m} dan problemas de
conversión del sustrato.
Finalmente, es deseable contra con un ensayo que
exprese la afinidad del compuesto en K_{d} en lugar de como
CI_{50}. Esto permite una comparación transparente de los
inhibidores entre quinasas, crítica para determinar la selectividad
del compuesto. No se pueden comparar las medidas de CI_{50} entre
quinasas sin datos adicionales de la K_{m} del ATP.
Para superar estos problemas sería deseable
contar con un ensayo para la medida de la afinidad de los
inhibidores que sea compatible con un cribado a gran escala, sea
homogéneo (sin pasos de lavado), no requiera proteína activada, no
requiera una reacción catalítica, sea independiente de sustrato, sea
independiente de las concentraciones de ATP y mida los valores de
K_{d} del compuesto. Tal ensayo ahorraría a las instituciones y
compañías involucradas en la investigación para el descubrimiento
de fármacos millones de dólares al reducir el tiempo de desarrollo
del ensayo y el coste en reactivos.
Esta invención proporciona un ensayo de unión
para medir la afinidad de los inhibidores a las quinasas de
proteínas. El ensayo de unión se creó alrededor de una serie de
sondas marcadas para el centro activo descritas a continuación que
se utilizan y se detectan en un formato de polarización de la
fluorescencia. El desplazamiento de la sonda marcada por el
inhibidor puede utilizarse para generar una K_{d} del inhibidor a
la enzima.
Esta invención también proporciona nuevas sondas
para su utilización en un ensayo de unión de inhibidores a quinasas
de proteínas.
Una realización de la invención proporciona un
ensayo para la identificación de un agente inhibidor de quinasas
que comprende los pasos de:
a) establecer la K_{d} de una sonda del centro
activo por un sitio de unión de ATP;
b) poner en contacto la sonda del centro activo
con una proteína que comprende un dominio quinasa y medir una señal
de dicha sonda para establecer un nivel de señal de línea base;
c) incubar el complejo de sonda del centro
activo: quinasa con un agente inhibidor candidato y medir la señal
de dicha sonda;
d) comparar la señal del paso b) con la señal
del paso c);
e) derivar la K_{d} del agente inhibidor
candidato en base a la K_{d} de la sonda por su lugar de unión a
ATP y la respuesta a la dosis del agente inhibidor candidato; bajo
condiciones en las que la sonda puede ser desplazada por el
inhibidor candidato y en las que la sonda del centro activo se une
al dominio de unión a ATP de dicha quinasa, y dicha sonda del
centro activo es la sonda del centro activo descrita a continuación
de acuerdo con la invención.
En otra realización de la invención la proteína
que comprende el dominio quinasa es una quinasa completa.
En otra realización de la invención la sonda es
una sonda fluorescente y la señal se mide como un cambio en la
polarización de la fluorescencia de la sonda. Otra realización de la
invención proporciona un ensayo en el que el dominio quinasa es STK
12.
Otra realización de la invención proporciona un
ensayo que utiliza la sonda de fórmula general I descrita aquí.
En otra realización de la invención la sonda del
centro activo es ácido
6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-[6-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-hexil]-isoftalámico
con el dominio quinasa STK12.
La Figura 1 muestra los resultados de
polarización de la fluorescencia obtenidos mediante titulación de la
sonda fluorescente de ácido
6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-[6-(5-nitro-2-fenilaminopirimidin-4-ilamino)-hexil]-isoftalámico
con el dominio quinasa STK12.
La Figura 2 muestra los resultados de
polarización de la fluorescencia obtenidos durante el cribado con un
compuesto de prueba de actividad inhibitoria del dominio quinasa
STK12 a varias diluciones utilizando la sonda fluorescente con
ácido
6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-[6-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-hexil]-isoftalámico
en un ensayo de la presente invención.
La presente invención se dirige a un ensayo
quinasa para la detección y evaluación de inhibidores de miembros
de la familia génica de quinasas de proteínas. El nuevo formato de
ensayo utiliza sondas del centro activo para competir con los
inhibidores de la enzima, eliminando así la necesidad de activación
de la enzima y de sustratos. La utilización de este método de
ensayo permite obtener datos de la unión del inhibidor
independientemente de un ensayo catalítico, permitiendo así que los
ensayos de HTS se puedan realizar sin una proteína activada y sin
sustratos. El ensayo utiliza un conjunto definido de sondas
marcadas, definidas a continuación, que pueden obtenerse con un
coste nominal.
Las sondas fluorescentes de la presente
invención se unen al centro activo de una quinasa y tienen la
siguiente fórmula general (I):
(I)R_{1}-L-X-Y
en la que R_{1} es el radical del
compuesto que se une al centro activo de la quinasa, Y es una marca
fluorescente, L es un enlazante de uno o más átomos entre R_{1} y
X, y X es el grupo funcional que une L y la marca fluorescente
Y.
El ensayo de la presente invención se cree que
será útil en la detección de inhibidores de miembros de la familia
quinasa. De acuerdo con ello, la porción R_{1} de la la sonda
fluorescente de la presente invención debería seleccionarse de
forma que se una al centro activo (lugar del ATP) de una serie de
quinasas de una forma específica de lugar. Por lo tanto, este
radical tendría una estructura que se sabe se une a varias quinasas.
R_{1} es la estructura
2,4-diamino-5-nitropirimidina
de la fórmula (III) a continuación, en la que R_{3} y R_{4} se
describen más adelante.
Los marcajes fluorescentes adecuados para su
utilización en la invención como residuos Y incluyen cualquiera de
los conocidos en la materia. Véanse, por ejemplo, los descritos en
"Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals" de
Richard P. Haugland, sexta edición (1996). La séptima edición está
disponible en CD-ROM y una séptima edición
actualizada está disponible en la página web
www.sondas.com/handbook/. Hay disponibles a nivel comercial una
variedad de marcajes fluorescentes adecuados en Molecular Probes
Inc. Es preferible que la fluorescencia del marcaje fluorescente se
emita a una longitud de onda relativamente elevada, es decir,
superior a alrededor de 450 nm, para evitar la interferencia de la
fluorescencia originada por la célula y la fluorescencia originada
por los compuestos de prueba e impurezas presentes en el sistema o
procedentes de los contenedores de vidrio y plástico. De acuerdo
con esto, en una realización, el marcaje fluorescente de la
invención emite fluorescencia a una longitud de onda superior a
alrededor de 450 nm.
Ejemplos de marcajes fluorescentes útiles en la
presente invención incluyen la rodamina y derivados de la rodamina
como tetrametilrodamina, carboxitetrametilrodamina, Lissamine^{TM}
rodamina B, Texas Red®, carboxi-X rodamina y
rodamina Red^{TM}-X, y otros derivados de la
rodamina conocidos en la materia, la fluoresceína y derivados de la
fluoresceína como las fluoresceínas fluoradas como Oregon Green® y
sus derivados, fluoresceinamina, carboxifluoresceína,
alfa-yodoacetamidofluoresceína,
4'-aminometilfluoresceína,
4'-N-alquilaminometilfluoresceína,
5-aminometilfluoresceína,
6-aminometilfluoresceína,
2,4-dicloro-1,3,5-triazin-2-il-aminofluoresceína
(DTAF),
4-cloro-6-metoxi-1,3,5-triazin-2-il-aminofluoresceína
y fluoresceinisotiocianato, y otros derivados de la fluoresceína
conocidos en la materia,
4,4-difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno
y sus derivados, los colorantes cianina y los colorantes Alexa
Fluor®.
Los marcajes fluorescentes más preferibles
incluyen la fluoresceína y los derivados de la fluoresceína como
las fluoresceínas fluoradas como Oregon Green® y sus derivados,
fluoresceinamina, carboxifluoresceína,
alfa-yodo-aceta-midofluoresceína,
4'-aminometilfluoresceína,
4'-N-alquil-aminometilfluoresceína,
5-aminometilfluoresceína,
6-amino-metilfluoresceína,
2,4-dicloro-1,3,5-triazin-2-il-amino-fluoresceína
(DTAF),
4-cloro-6-metoxi-1,3,5-triazin-2-il-aminofluoresceína
y fluoresceinisotiocianato, y otros derivados de la fluoresceína
conocidos en la materia.
Las sondas fluorescentes de la invención tienen
la siguiente fórmula general (I):
(I)R_{1}-L-X-Y
en la
que
R_{1} es un radical de un compuesto que se une
al centro activo de una quinasa;
L es un enlace directo o un grupo alquileno
C_{1}-C_{16} grupo, un grupo alquenileno
C_{2}-C_{16} o un grupo alquinileno
C_{2}-C_{16}, en el que uno o más de los grupos
-CH_{2}- disponibles presentes en el grupo alquileno
C_{1}-C_{16}, grupo alquenileno
C_{2}-C_{16} o grupo alquinileno
C_{2}-C_{16,} están opcionalmente e
independientemente reemplazados por -O-, -C(O)-,
-S(O)_{p}-, en el que p es de 0 a 2, o
-N(R_{2})-;
X se selecciona de entre el grupo que consiste
en O, S, -N(R_{2})C(O)-,
-C(O)N(R_{2})-,
-N(R_{2})C(S)-,
-C(S)N(R_{2})-,
-N(R_{2})C(S)NH-,
-NHC(S)N(R_{2})-,
-N(R_{2})C(O)NH-,
-NHC(O)N(R_{2}), -SO_{2}NR_{2}-,
-NR_{2}SO_{2}-, -CH_{2}N(R_{2})-,
-N(R_{2})CH_{2}-, -CH_{2}S-, -SCH_{2}-,
-C(O)CH_{2}S-, -SC(O)CH_{2}-,
-NHCH_{2}CH_{2}S-, -SCH_{2}CH_{2}NH-,
-NC(O)O-, -ONC(O)-, -C(O)O-,
-OC(O)-, -NH-N=C(R_{2})-,
-C(R_{2})=N-NH-, -NHCH(R_{2})- y
-CH(R_{2})NH-;
R_{2} es H o alquilo
C_{1-3};
y Y es un marcaje fluorescente; y
en la que:
R_{1} es una nitropirimidina de fórmula
(III)
R_{4} se selecciona de entre fenilo y naftilo,
y está opcionalmente sustituido con entre uno y tres grupos
seleccionados entre Cl, F, Br, I, -CH_{3}, -CN, -CO_{2}CH_{3},
-NO_{2}, -OH, -NH_{2} y -CF_{3}.
Los siguientes ejemplos son específicos de
sondas fluorescentes dentro del alcance de la presente invención y
no pretenden ser limitantes en modo alguno:
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Cualquier sonda fluorescente de esta invención
que contenga uno o más átomos de carbono asimétrico pueden aparecer
como racematos y mezclas racémicas, enantiómeros sencillos, mezclas
de diastereómeros y diastereómeros individuales. Todas las formas
isoméricas de estos compuestos están expresamente incluidas en la
presente invención. Cada carbono estereogénico puede estar en
configuración R o S, o en una combinación de configuraciones.
Algunas de las sondas fluorescentes de la
invención pueden existir en más de una forma tautomérica. La
invención incluye todos los tautómeros.
Las sondas fluorescentes de la invención sólo
son aquellas que se consideran "químicamente estables" como
podrán apreciar los expertos en la materia. Por ejemplo, los
compuestos que pueden tener una "valencia abierta" o un
"carbanión" no son compuestos contemplados en la invención.
Los métodos para la síntesis de las sondas
fluorescentes se proporcionan en la sección de Ejemplos
sintéticos.
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Los ensayos de polarización de la fluorescencia
se basan en el principio de que la excitación de una solución de
fluoróforos con luz polarizada en un plano fotoselecciona aquellos
fluoróforos con momentos dipolo de excitación orientados en
paralelo en relación a la luz de excitación. La emisión de
fluorescencia de estos fluoróforos se depolarizará hasta un punto
que viene determinado por varios factores, lo que incluye la tasa de
difusión que aparece durante la vida media del estado excitado.
Esta tasa, a su vez, es determinada por varios factores, lo que
incluye el volumen de las especies en rotación. Por lo tanto, puede
utilizarse la polarización de la fluorescencia a la medida de la
interacción entre los fluoróforos y moléculas mayores.
Las nuevas sondas fluorescentes descritas aquí
pueden utilizarse en un ensayo de polarización de la fluorescencia
para detectar y evaluar los compuestos que se unen al lugar del ATP
de las quinasas. También se entiende que el método de la invención
puede utilizarse con quinasas completas así como con versiones
truncadas de las quinasas y con quinasas híbridas que mantienen el
dominio quinasa y la actividad quinasa. La invención incluye las
sondas marcadas con fluorescencia que pueden utilizarse en ensayos
de cribado a gran escala para la identificación de inhibidores
candidatos de una serie de diferentes quinasas. En otras palabras,
la misma sonda fluorescente puede utilizarse en diferentes ensayos
a gran escala para la identificación de inhibidores candidatos de la
quinasa A, quinasa B, etc. Las nuevas sondas fluorescentes están
diseñadas para tener una reactividad cruzada a lo largo de la
familia génica de las quinasas y ser específicas en su unión al
lugar de unión del ATP de una quinasa seleccionada de entre las
quinasas humanas. La polarización de la fluorescencia de la sonda
cambia al unirse al dominio quinasa, de forma que cuando existe la
competencia de un inhibidor, la polarización de la sonda disminuye
de forma detectable. Este cambio en la polarización sirve como
detección en este ensayo. A no ser que se especifique de otro modo,
las condiciones que pueden utilizarse para realizar los ensayos de
polarización de la fluorescencia de la presente invención (por
ejemplo, presión, temperatura, pH, solventes, tiempo) pueden ser
determinados fácilmente por un experto en la materia.
Puede diseñarse un ensayo que utiliza el método
de la presente invención de la siguiente forma:
(a) seleccionar un par sonda del centro activo -
quinasa adecuado determinando los calores de polarización de las
sondas fluorescentes libres y la de las sondas fluorescentes unidas
a una quinasa.
(b) determinar la K_{d} del par sonda
fluorescente del centro activo - quinasa.
(c) demostrar que la sonda fluorescente puede
establecer competencia en su unión al lugar de ATP, con ADP,
estaurosporina o un inhibidor que sea muy parecido a la porción de
unión a la quinasa (R_{1}) de la sonda.
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Como paso preliminar, se determinan los
espectros de absorbancia, excitación de la fluorescencia y emisión
de la fluorescencia de cada sonda fluorescente. El espectro de
absorbancia se mide para evitar el efecto de filtro interno. Los
espectros de excitación de la fluorescencia y emisión de
fluorescencia se recogen para poder elegir las longitudes de onda
de excitación y emisión adecuadas para la detección de la sonda.
Estos espectros pueden determinarse utilizando cualquier
espectrofotómetro y fluorímetro convencionales, con la sonda en un
tampón de ensayo adecuado.
Para identificar una sonda apropiada para una
quinasa o dominio quinasa de interés (paso (a)), se ha desarrollado
un esquema inicial de titulación de 4 puntos. Cada quinasa se criba
frente a un panel de sondas fluorescentes. Los criterios para una
selección positiva en este paso del ensayo son:
i.) intensidad de la fluorescencia de la sonda
aceptable;
ii.) cambio de la polarización tras la unión a
la quinasa aceptable;
iii.) rango de concentración de quinasa en el
que ocurre la unión de la sonda aceptable.
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La concentración de la sonda debe dar lugar a
intensidades de fluorescencia aceptables que deben determinarse
para cada sonda ya que el rendimiento cuántico de los diferentes
fluoróforos varía. El tipo de placa de 96 o 384 pocillos debe
determinarse cuidadosamente para minimizar la adsorción no
específica de la sonda a las paredes de los pocillos. La adsorción
de la sonda puede causar un aumento artificial en la polarización
medida. Alternativamente, puede utilizarse una a cubeta. Las
muestras se mezclan y se dejan en incubación durante un periodo
predeterminado de tiempo previamente a la medida de la polarización.
Los ajustes del instrumento vienen definidos por las
características de fluorescencia de la sonda (espectro de
excitación, espectro de emisión, rendimiento cuántico). El cambio
de la polarización necesario viene definido por el instrumental a
utilizar en el cribado. Se determinó que el cambio mínimo de la
polarización en este paso es de 100 miliunidades de polarización
(mP). La afinidad aproximada de la sonda por la quinasa necesaria
viene definida por el suministro de proteína y el consumo esperado
a lo largo del proceso de cribado. Cuando un par sonda/ quinasa se
identifica mediante el proceso descrito en el paso (a), se realiza
una titulación de la unión en equilibrio completa para determinar
la constante de disociación en el equilibrio (K_{d}) que describe
la interacción (paso (b)). La sonda se mantiene constante a la
concentración predeterminada fijada para cada pocillo en una placa
de 96 o 384 pocillos. Alternativamente puede utilizarse una cubeta.
Se realiza una dilución seriada de la quinasa de interés para
cubrir un rango de concentración amplio a lo largo de la placa. El
rango de concentración debería cubrir la concentración en la que en
el paso a se ha demostrado que la sonda se une a la quinasa.
Además, varios pocillos deben contener sólo sonda o sonda con la
concentración más elevada de quinasa. Esto se realiza para calcular
la proporción Qb/ Qf del par sonda/ quinasa. Esto es una medida de
la intensidad total de la sonda unida (Qb) dividido por la
intensidad total de la sonda libre (Qf), que es necesaria para
incluirla en el análisis de datos para luego determinar de forma
precisa la K_{d}. La K_{d} puede obtenerse utilizando métodos
convencionales (por ejemplo, análisis de la regresión).
Los criterios para una selección positiva en
este paso del ensayo son:
i.) cambio de la polarización tras la unión a la
quinasa aceptable;
ii.) rango de concentración de quinasa en el que
ocurre la unión de la sonda aceptable
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De nuevo, estos valores se definen tanto por la
instrumentación como por el suministro de proteína.
En el siguiente paso (c), es necesario
determinar si la interacción es específica y aparece en el lugar de
unión del ATP de la quinasa. Esto puede ocurrir sólo tras la
determinación de la K_{d} (paso (b)) ya que la elección de la
concentración de quinasa depende del cambio total de polarización
que aparece tras la unión de la sonda. Para demostrar la unión
específica al lugar de unión (lugar del ATP), se utilizan
inhibidores que mimetizan muy bien la química del núcleo (porción
de unión a la quinasa) de la sonda. Alternativamente, pueden
utilizarse ADP o estaurosporina con esta aplicación. En este paso,
se mezcla ADP, estaurosporina o inhibidor con la mezcla de complejo
sonda fluorescente-quinasa obtenida en el paso (b),
y la mezcla resultante de sonda fluorescente, quinasa y ADP se
incuba para facilitar la competición u otra interacción. Si el
compuesto de prueba es insoluble en agua, puede ser necesario
disolver primero el compuesto de prueba en un solvente orgánico
apropiado, por ejemplo DMSO, previamente a su dilución en la
solución acuosa tamponada. Las condiciones de incubación de este
paso pueden variar, pero generalmente la incubación se conduce a una
temperatura entre alrededor de 25ºC y alrededor de 30 minutos.
Cuando la diferencia en los valores de polarización de la
fluorescencia obtenidas en el paso (c) es negativa, es decir,
existe una disminución de la polarización en presencia de ADP,
estaurosporina o compuesto de prueba, esto puede indicar que la
sonda fluorescente se está uniendo al lugar de unión del ATP de la
quinasa.
Cuando este paso de la invención se realiza
utilizando múltiples diluciones de ADP, estaurosporina o a compuesto
de prueba, el rango de los valores de polarización de la
fluorescencia de prueba obtenidos pueden representarse en un
gráfico adecuado. Si se desea, se pueden utilizar métodos
convencionales (por ejemplo, análisis de regresión) para calcular
la constante de disociación en el equilibrio de la unión del
compuesto de prueba a la quinasa.
La invención también incluye un ensayo en el que
puede evaluarse la capacidad de los compuestos de prueba de
competir con el dominio del centro activo de la sonda fluorescente.
Esto se describe en más detalle en el Ejemplo 3 a continuación.
A pesar de ello, el método preferible de la
invención es utilizar una sonda fluorescente o una sonda
fluorescente sensible al ambiente. Cuando se utiliza una sonda
sensible al ambiente se medirá el cambio de intensidad fluorescente
en lugar de la intensidad de la fluorescencia.
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Sólo algunos de los ejemplos se refieren a
compuestos de acuerdo con la invención. El resto se proporcionan
con un propósito meramente ilustrativo.
Las sondas fluorescentes de la invención pueden
obtenerse como se describe a continuación. En cada uno de los
métodos y esquemas descritos a continuación, los grupos R_{1}, L y
X, cuando se muestran, son como se ha definido anteriormente para
las fórmulas generales I, II y III excepto si se así se indica. Las
condiciones de reacción y los tiempos de reacción óptimos pueden
variar dependiendo de los reactivos particulares utilizados. A no
ser que se especifique de otro modo, los solventes, temperaturas,
presiones y otras condiciones de reacción pueden ser seleccionadas
fácilmente por un experto en la materia. Los procedimientos
específicos se proporcionan en la sección de Ejemplos sintéticos.
Normalmente, el progreso de la reacción puede monitorizarse mediante
cromatografía en capa fina (TLC) si se desea. Los intermediarios y
productos pueden purificarse mediante cromatografía en gel de
sílice y/o recristalización. Los materiales de partida y los
reactivos están disponibles comercialmente o pueden ser preparados
por un experto en la materia utilizando los métodos descritos en la
literatura química.
Como se ha discutido anteriormente, la porción
R_{1} de la fórmula I puede corresponder a una estructura que se
une al centro activo de una quinasa, como las estructuras que se
muestran en las fórmulas II y III. Por ejemplo, los compuestos de
fórmula I con R_{1} = II pueden sintetizarse como se ilustra en el
Esquema 1 a continuación:
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Esquema
I
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Como se ha ilustrado anteriormente, el ácido
4-nitrobenzoico se acopla con una amina que posee L
y X' para proporcionar el intermediario IV. Pueden utilizarse las
condiciones de acoplamiento estándar conocidas en la materia, por
ejemplo una reacción en un solvente adecuado como el cloruro de
metileno en presencia de un agente de acoplamiento como
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
y 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) en un solvente
adecuado como cloruro de metileno. El grupo nitro de IV entonces se
reduce, por ejemplo mediante un tratamiento con hidrógeno o una
fuente de hidrógeno como el formato de amonio en un solvente
adecuado como etanol en presencia de un catalizador adecuado como
el paladio sobre carbono. La reacción de V con el intermediario VI
en un solvente como DMF mientras se calienta a alrededor de 75ºC y
120ºC proporciona el intermediario VII. El intermediario VI puede
prepararse a partir de
1-acetil-2-indolinona
opcionalmente sustituida a reflujo con trietilortobenzoato en
anhídrido acético, seguido de hidrólisis del grupo acetilo como se
describe en W. Grell et al., U.S. 6.043.254. La reacción de
VII con Y', un marcaje fluorescente que posee un grupo funcional
que reaccionará con X' proporciona el compuesto deseado de fórmula
I. X' e Y', y la química para formar X-Y se
describen en más detalle a continuación.
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Los compuestos de fórmula I con R_{1} = III
pueden prepararse como se describe en el Esquema II.
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Esquema
II
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Como se ha ilustrado anteriormente, la reacción
del intermediario tiocianato VIII con
H_{2}N-L-X' en un solvente
adecuado como el cloruro de metileno proporciona el intermediario
IX. El intermediario VIII puede prepararse a partir de
4,6-dicloro-5-nitropirimidina
disponible comercialmente haciéndola reaccionar con una sal
tiocianato, como el tiocianato de potasio, en un solvente adecuado,
como EtOH seguido de la reacción del intermediario resultante con
R_{4}NH_{2} en un solvente adecuado, como EtOH, y en presencia
de una base, como trietilamina. La reacción de IX con Y'
proporciona el compuesto deseado de fórmula I.
Una serie de marcajes fluorescentes adecuados
como Y están disponibles comercialmente (véase por ejemplo Molecular
Probes, Inc. en www.probes.com). Estos marcajes están disponibles
con una serie de funcionalidades reactivas que pueden acoplarse a
R_{1}-L-X' para producir el
R_{1}-L-X-Y
deseado. La porción de conexión X obtenida dependerá de la X' y la
funcionalidad reactiva de Y elegidas. Por ejemplo, en el último paso
del Esquema I anterior, puede hacerse reaccionar un marcaje
fluorescente Y con un grupo CO_{2}H, es decir, el compuesto
Y-CO_{2}H, (Y') con
R_{1}-L-X' con una funcionalidad
amina como X', es decir, el compuesto
R_{1}-L-NH_{2}, para obtener un
compuesto de fórmula (I),
R_{1}-L-X-Y, en la
que X es -NHC(O)-.
La Tabla 1 a continuación muestra ejemplos de
otras funcionalidades reactivas en sondas fluorescentes que están
disponibles comercialmente y el grupo X que puede formarse mediante
la reacción con grupos X' funcionales. Las condiciones de reacción
son conocidas para los expertos en la materia. Generalmente, esto
involucra la combinación del marcaje fluorescente que contiene la
funcionalidad reactiva (Y') con el
R_{1}-L-X' deseado en un solvente
adecuado, como cloruro de metileno, acetato de etilo, THF o DMF,
opcionalmente en presencia de un catalizador adecuado, como se
conoce en la materia, por ejemplo una base como trietilamina, o un
reactivo de acoplamiento, a una temperatura adecuada de entre
alrededor de -10ºC y la de temperatura de reflujo del solvente,
preferiblemente entre alrededor de 0ºC y temperatura ambiente. Las
condiciones de reacción particulares y los tiempos de reacción
pueden variar dependiendo de la naturaleza de Y' y
R_{1}-LX'. El progreso de la reacción se
monitoriza fácilmente mediante métodos conocidos en la materia como
la cromatografía en capa fina.
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Utilizando los métodos descritos anteriormente,
un experto en la material podrá preparar fácilmente las diferentes
sondas fluorescentes (I) dentro del alcance de la presente
invención.
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Los siguientes ejemplos ilustran métodos
mediante los que pueden sintetizarse las sondas fluorescentes.
\newpage
(No forma parte de la presente
invención)
Compuesto
A:
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Se combinaron ácido
p-nitrobenzoico (500 mg, 2,99 mmol),
N-Boc-hexanodiano (834 mg, 3,3
mmol), clorhidrato de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(EDC) (699 mg, 3,65 mmol) y 1-hidroxibenzotriazol
hidrato (HOBT) (493 mg, 3.65 mL) en diclorometano (15 mL) y se
agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La reacción se
diluyó con EtOAc (50 mL), se lavó con agua, bicarbonato sódico
saturado y salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato
magnésico y se filtró. La capa orgánica se concentró mediante
evaporación en rotación para recoger 1,01 g de
[6-(4-nitro-benzoilamino)-hexil]-carbamato
de terc-butilo como un sólido blanco (rendimiento del
92%).
\newpage
La amida anterior (265 mg, 0,750 mmol) se
disolvió en EtOH (25 mL). Se introdujo en la mezcla de reacción
formato de amonio (500 mg) y paladio sobre carbono al 10% (100 mg) y
se agitó durante 4 días a temperatura ambiente. La reacción se
filtró a través de tierra de diatomeas y se concentró para recuperar
265 mg de
[6-(4-amino-benzoilamino)-hexil]-carbamato
de terc-butilo como un sólido blanco cristalino (rendimiento
cuantitativo).
Se combinaron
1-acetil-3-[1-etoxi-1-fenil-met-(Z)-iliden]-1,3-dihidro-indol-2-ona
(50 mg, 0,163 mmol) y
[6-(4-amino-benzoilamino)-hexil]-carbamato
de terc-butilo (65 mg, 0,195 mmol) en DMF (1 mL) y se
agitaron durante 24 horas a 110ºC. El DMF se eliminó mediante
evaporación en rotación bajo un vacío elevado. El residuo se
redisolvió en MeOH (1 mL), se añadió una solución de metóxido
sódico 0,5 M (0,5 mL) y la reacción se agitó a temperatura ambiente
durante 1 hora. Se añadió HCl 4 N en dioxano (1 mL) y la reacción
se agitó durante toda la noche. La reacción se concentró mediante
evaporación en rotación. Una cromatografía rápida en un gradiente
polar de [20%(hidróxido de amonio al 10% en MeOH) y 80%
diclorometano] proporcionó 60 mg de
N-(6-amino-hexil)-4-({[2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-fenil-metil}-amino)-benzamida
(rendimiento del 82%).
Se disolvieron
N-(6-amino-hexil)-4-({[2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-fenil-metil}-amino)-benzamida
(5 mg, 0,01 mmol) y Oregon green 488 carboxilato de succinimidilo
"isómero 5" (5 mg, 0,01 mmol) en DMF (1 mL) y se agitaron
durante 16 horas a temperatura ambiente. La reacción se concentró
mediante evaporación en rotación bajo un vacío elevado. Se
introdujo el residuo en una placa de TLC preparativa y se eluyó con
una fase móvil de [30%(hidróxido de amonio al 10% en MeOH) y 70%
diclorometano]. El compuesto del título (2 mg) se obtuvo como un
sólido naranja brillante (rendimiento del 20%).
Ejemplos de otras sondas preparadas mediante el
método A pero que no forman parte de la presente invención se
muestran a continuación:
Compuesto B: Ácido
N-{6-[4-({[6-Cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-fenilmetil}-amino)-benzoilamino]-hexil}-6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-isoftalámico
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Compuesto C: Ácido
N-{6-[4-({[5-bencensulfonilamino-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-fenil-metil}-
amino)-benzoilamino]-hexil}-6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-isoftalámico
amino)-benzoilamino]-hexil}-6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-isoftalámico
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\newpage
Compuesto D: Ácido
6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-{6-[4-({[5-nitro-2-oxo-1,2-dihidro-
indol-(3Z)-iliden]-fenil-metil}-amino)-benzoilamino]-hexil}-iso-ftalámico
indol-(3Z)-iliden]-fenil-metil}-amino)-benzoilamino]-hexil}-iso-ftalámico
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Compuesto E:
3-[1-(4-{6-[3-carboxi-4-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-benzoilamino]-hexilcarba-moil}-fenilamino)-1-fenil-met-(Z)-iliden]-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-6-carboxilato
de metilo
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Compuesto F: Ácido
N-{6-[4-({[6-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-fenilmetil}-amino)-benzoil-
amino]-hexil}-6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-iso-ftalámico
amino]-hexil}-6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-iso-ftalámico
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Compuesto
G:
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Se disolvió
(5-nitro-4-tiocianato-pirimidin-2-il)-fenil-amina
(85 mg, 0,311 mmol) en diclorometano (3 mL). Se añadió
hexanodiamina a la reacción y la mezcla se agitó durante 16 horas a
temperatura ambiente. Se introdujo la mezcla de reacción
directamente en una columna (gel de sílice) de cromatografía rápida
y se eluyó con un gradiente de diclorometano, MeOH e hidróxido de
amonio. Se aisló
N4-(6-amino-hexil)-5-nitro-N2-fenil-pirimidin-2,4-diamina
(80 mg, rendimiento del 78%) como un sólido amarillo. La anterior
diamina (5 mg, 0,01 mmol) y Oregon green 488 carboxilato de
succinimidilo "isómero 5" (5 mg, 0,01 mmol) se disolvieron en
DMF (1 mL) y se agitaron durante 16 horas a temperatura ambiente.
La reacción se concentró mediante evaporación en rotación bajo un
vacío elevado. Se introdujo el residuo en una placa de TLC
preparativa y se eluyó con una fase móvil de [30% (hidróxido de
amonio al 10% en MeOH) y 70% diclorometano]. El compuesto del título
se recogió como un sólido anaranjado brillante (7 mg, rendimiento
del 64%).
\newpage
Ejemplos de otras sondas preparadas mediante el
método B se muestran a continuación:
Compuesto H: Ácido
N-{6-[2-(4-cloro-fenilamino)-5-nitro-pirimidin-4-ilamino]-hexil}-6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-isoftalámico
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Compuesto I: Ácido
6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-{6-[2-(naftalen-2-ilamino)-5-nitro-pirimidin-4-ilamino]-hexil}-isoftalámico
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\newpage
Compuesto J: Ácido
6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-{2-[2-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-etilcarbamoil]-etil}-isoftalámico
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Compuesto K: Ácido
6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-(2-{2-[3-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-propionilamino]-etilcarbamoil-etil)-isoftalámico
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Paso
uno
Inicialmente se evalúa un espectro de
absorbancia de cada sonda. Los espectros de excitación y emisión se
miden entonces para identificar las longitudes de onda de excitación
y emisión adecuadas para detectar la sonda. Un ejemplo de tal sonda
es el ácido
6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-[6-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-hexil]-isoftalámico
en el que la excitación y emisión máximas son 496 nm y 524 nm,
respectivamente. Estos espectros de fluorescencia se midieron en un
fluorímetro SLM-8100 con la sonda disuelta en un
tampón de ensayo (HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5
mM, glicerol al 5%, TCEP 200 mM y CHAPS 0,01% (p/v), DMSO al 2%). La
afinidad de la sonda por el dominio quinasa STK12 se determinó
entonces en un experimento de titulación. El ensayo de polarización
se realizó en placas de fonda plano negras opacas de 96 pocillos
Coming Costar NBS. En este ejemplo, se utilizó un LJL Analyst con
los filtros apropiados para las características de excitación/
emisión de la sonda fluorescente. Se realizó una dilución seriada
del dominio quinasa STK12 en los pocillos que contenían sonda 25 nM
para cubrir un amplio rango de concentración a lo largo de la placa.
Además, varios pocillos contienen tanto sonda sola como sonda con
la mayor concentración de dominio quinasa STK12. Esto se realiza
para calcular la proporción Qb/ Qf del par sonda/ dominio quinasa.
Esto es una medida de la intensidad total de sonda unida (Qb)
dividido por la intensidad total de sonda libre (Qf), que es
necesaria para incluirla en el análisis de datos para la
determinación precisa de la K_{d}. Se utilizó un análisis de la
regresión de mínimos cuadrados no lineal para calcular la constante
de disociación en el equilibrio de la sonda a partir de los valores
de polarización obtenidos de la unión del dominio quinasa STK12 a
la sonda. La Figura 1 muestra los resultados de este experimento de
titulación.
Paso
dos
La placa se prepara creando un complejo inicial
entre el dominio quinasa STK12 y la sonda fluorescente ácido
6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-[6-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-hexil]-isoftalámico
que se une al centro activo del dominio quinasa STK12. En este
ejemplo, el complejo entre sonda y STK12, se preformó en tampón de
ensayo (HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM, glicerol
al 5%, TCEP 200 mM y CHAPS 0,01% (p/v), DMSO al 2%). Las
concentraciones de dominio quinasa STK12 y sonda en esta solución
se prepararon de forma que la concentración final en el ensayo fue
del dominio quinasa STK12 200 nM y de sonda 25 nM. Entonces se
realizó una dilución seriada del compuesto de prueba en tampón de
ensayo, a lo largo de la placa. El complejo preformado dominio
quinasa STK12-sonda se añadió entonces a todos los
pocillos y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La
polarización de la fluorescencia se midió entonces utilizando un
lector en placas de la polarización de la fluorescencia fijado en
las longitudes de onda apropiadas para la sonda fluorescente. En
este ejemplo, se utilizó un LJL Analyst con filtros apropiados para
las características de excitación/ emisión de la sonda
fluorescente. Entonces se utilizó un análisis de regresión de
mínimos cuadrados no lineal para calcular las constantes de
disociación en equilibrio del compuesto de prueba, un derivado
nitropirimidina, que se une al dominio quinasa STK12 a partir de
los valores de polarización de la sonda unida al dominio quinasa
STK12 en presencia del compuesto de prueba.
La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo
de competición con dominio quinasa STK12200 nM, sonda 25 nM y una
molécula de competición a varias diluciones seriadas. Estos
resultados muestran un descenso en la polarización de la
fluorescencia del complejo sonda - dominio quinasa STK12 en
presencia del compuesto de prueba, que es una evidencia de que este
compuesto de prueba es un inhibidor competitivo del dominio quinasa
STK12 que compite con la sonda fluorescente ácido
6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-[6-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-hexil]-isoftalámico
por el centro activo del dominio quinasa STK12.
Claims (7)
1. La sonda fluorescente con la siguiente
fórmula general (I):
(I)R_{1}-L-X-Y
en la
que
R_{1} es un radical de un compuesto que se une
al centro activo de una quinasa;
L es un enlace directo o un grupo alquileno
C_{1}-C_{16} grupo, un grupo alquenileno
C_{2}-C_{16} o un grupo alquinileno
C_{2}-C_{16}, en el que uno o más de los grupos
-CH_{2}- disponibles presentes en el grupo alquileno
C_{1}-C_{16}, grupo alquenileno
C_{2}-C_{16} o grupo alquinileno
C_{2}-C_{16,} están opcionalmente e
independientemente reemplazados por -O-, -C(O)-,
-S(O)_{p}-, en el que p es de 0 a 2, o
-N(R_{2})-;
X se selecciona de entre el grupo que consiste
en O, S, -N(R_{2})C(O)-,
-C(O)N(R_{2})-,
-N(R_{2})C(S)-,
-C(S)N(R_{2})-,
-N(R_{2})C(S)NH-,
-NHC(S)N(R_{2})-,
-N(R_{2})C(O)NH-,
-NHC(O)N(R_{2}), -SO_{2}NR_{2}-,
-NR_{2}SO_{2}-, -CH_{2}N(R_{2})-,
-N(R_{2})CH_{2}-, -CH_{2}S-, -SCH_{2}-,
-C(O)CH_{2}S-, -SC(O)CH_{2}-,
-NHCH_{2}CH_{2}S-, -SCH_{2}CH_{2}NH-,
-NC(O)O-, -ONC(O)-, -C(O)O-,
-OC(O)-, -NH-N=C(R_{2})-,
-C(R_{2})=N-NH-, -NHCH(R_{2})- y
-CH(R_{2})NH-;
R_{2} es H o alquilo
C_{1-3};
e Y es un marcaje fluorescente;
y en la que R_{1} es una nitropirimidina de
fórmula (III)
en la que R4 se selecciona de entre
fenilo y naftilo, y está opcionalmente sustituido con de uno a tres
grupos seleccionados de entre Cl, F, Br, I, -CH_{3}, -CN,
-CO_{2}CH_{3}, -NO_{2}, -OH, -NH_{2} y
-CF_{3}.
2. La sonda fluorescente de la reivindicación 1
escogida de entre:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un ensayo para la identificación de un agente
inhibidor de quinasas que comprende los pasos de:
a) establecer la K_{d} de una sonda del centro
activo por el lugar de unión de ATP;
b) poner en contacto la sonda del centro activo
con una proteína que comprende un dominio quinasa y medir una señal
de dicha sonda para establecer el nivel de la señal de línea de
base;
c) incubar el complejo sonda del centro activo:
quinasa con un agente inhibidor candidato y medir la señal de dicha
sonda;
d) comparar la señal del paso b) con la señal
del paso c);
e) obtener la K_{d} del agente inhibidor
candidato en base a la K_{id} de la sonda por su lugar de unión
de ATP y la respuesta a la dosis del agente inhibidor candidato;
bajo condiciones en las que la sonda puede ser desplazada por el
inhibidor candidato y en las que la sonda del centro activo se une
al dominio de unión de ATP de dicha quinasa y dicha sonda del
centro activo es la sonda del centro activo de la reivindicación 1
y/o reivindicación 2.
4. El ensayo de la reivindicación 3 en el que la
proteína que comprende el dominio quinasa es una quinasa
completa.
5. El método de la reivindicación 3 en el que la
sonda es una sonda fluorescente y la señal se mide como un cambio
en la polarización de la fluorescencia de la sonda.
6. Los métodos de la reivindicación 3 en los que
el dominio quinasa es STK12.
7. El método de la reivindicación 3 en el que la
sonda del centro activo es ácido
6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxi-3H-xanten-9-il)-N-[6-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-hexil]-isoftalámico
con el dominio quinasa STK12.
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