JP4949845B2 - タンパク質キナーゼインヒビター結合アッセイにおける使用のための蛍光プローブ - Google Patents
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Description
この出願は2003年10月３日に出願された米国仮特許出願第60/508,539号（その内容が本明細書に含まれる）の優先権を主張する。
本発明は一般にタンパク質キナーゼ遺伝子ファミリーの広い員に適用でき、かつキナーゼインヒビターの検出及び評価に有益である新規スクリーニングアッセイフォーマットに関する。また、本発明はそのアッセイに使用される新規蛍光プローブ、及びこのような蛍光プローブの製造方法に関する。
本発明は一般にタンパク質キナーゼ遺伝子ファミリーの広い員に適用でき、かつキナーゼインヒビターの検出及び評価に有益である新規スクリーニングアッセイフォーマットに関する。また、本発明はそのアッセイに使用される新規蛍光プローブ、及びこのような蛍光プローブの製造方法に関する。
タンパク質キナーゼは細胞調節の実際に全ての局面の調節に重要な役割を果たし、今日の医薬工業における研究の最も活発な領域の一つを構成する。ヒトゲノム中の522タンパク質キナーゼドメインは未治療疾患のための新しい薬物を開発するのに面倒な状況を与えることがあり、タンパク質キナーゼインヒビターの開発が医薬工業について重要な焦点に次第になってきている。タンパク質キナーゼインヒビターは癌、炎症性疾患及び免疫疾患を含む多くの疾患の治療に有益であると報告されていた。例えば、I.K. Mellinghoff及びC.L. Sawyers, Kinaze Inhibitor Therapy in Cancer, 14(12):1-11, 2000; J. Dumas著“成長因子受容体キナーゼインヒビター：最近の進歩及び臨床上の影響”, Current Opinion in Drug Discovery & Development, 4(4):378-89, 2001; J. Dumas著“タンパク質キナーゼインヒビター：出現する薬作用発生団”, 1997-2000, Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11(3):405-429, 2001; D.H. Williams及びT. Mitchell著“薬物候補としてのタンパク質キナーゼインヒビターの結晶学及び構造に基づく設計における最近の開発”, Current Opinion in Pharmacology, 2(5):567-73, 2002; S.B. Noonberg及びC.C. Benz著“表皮成長因子受容体サブファミリーを標的とするチロシンチロシンキナーゼインヒビター：抗癌剤としての役割”, Drugs, 59(4):753-67, 2000; S. Brunelleschi, L. Penengo, M.M. Santoro及びG. Gaudino著“抗癌療法の標的としての受容体チロシンキナーゼ”, Current Pharmaceutical Design. 8(22):1959-72, 2002; P.G. Goekjian及びM.R. Jirousek著“疾患の治療におけるタンパク質キナーゼＣ：シグナル伝達経路、開発中のインヒビター、及び薬剤”, Current Medicinal Chemistry. 6(9):877-903, 1999; A. Gordon著“乳癌治療の増大する効力”, Clinical Oncology (Royal College of Radiologists), 9(5):338-42, 1997を参照のこと。
この大きい遺伝子ファミリーは新しい薬物標的の豊富な源に相当するが、化合物アフィニティーを測定するのに使用されるアッセイの開発は高度に問題がある。現在のタンパク質キナーゼインヒビターのためのハイスループットスクリーニングアッセイはタンパク質又はペプチド基質へのホスフェートのとり込みを測定する。タンパク質キナーゼインヒビターをアッセイするための最も実証された方法はATPのガンマホスフェートが32P又は33Pで標識される放射アッセイである。キナーゼがリントランスフェラーゼ反応中にガンマホスフェートをタンパク質基質のヒドロキシルに導入する場合に、タンパク質が同位元素で共有結合標識されるようになる。タンパク質が標識されたATPから除去され、放射性タンパク質の量が測定される。このアッセイは依然として定量的タンパク質キナーゼアッセイの優れた標準である。ハイスループットフォーマットへのこのアッセイの採用は労力を集中する分離工程及び使用される多量の放射能のために問題がある。
高速で処理することができる別の放射アッセイはSPA即ちシンチレーション近接アッセイ（アメーシャム・インターナショナル）である。このアッセイでは、標識された基質がビードに結合される場合に、シンチラント含浸ビードが光を放出する。このアッセイは放射能のレベル及びペプチド基質の有効性により制限される。
殆どの非放射性アッセイはキナーゼ反応の生成物、即ち、リンペプチドを認識する抗体を使用する。結合アッセイは酵素触媒ルミネセンスの読み取りで検出される抗体を使用する。これらの方法は試薬入手可能性、ウェル被覆、並びに多くの洗浄工程及びインキュベーション工程により制限される。
高速で処理することができる別の放射アッセイはSPA即ちシンチレーション近接アッセイ（アメーシャム・インターナショナル）である。このアッセイでは、標識された基質がビードに結合される場合に、シンチラント含浸ビードが光を放出する。このアッセイは放射能のレベル及びペプチド基質の有効性により制限される。
殆どの非放射性アッセイはキナーゼ反応の生成物、即ち、リンペプチドを認識する抗体を使用する。結合アッセイは酵素触媒ルミネセンスの読み取りで検出される抗体を使用する。これらの方法は試薬入手可能性、ウェル被覆、並びに多くの洗浄工程及びインキュベーション工程により制限される。
タンパク質キナーゼ活性又はインヒビター結合を測定するために蛍光偏光を使用する技術は標識された抗体又はペプチド基質に頼る。これらのアッセイでは、酵素がATPのガンマホスフェートをタンパク質又はペプチド基質に導入する。この活性が抗体の如き手段によりリンペプチドを検出することにより監視される。リンペプチドへの抗体の結合は溶液中のペプチドの自由な回転を遅くし、それ故、触媒反応の生成物からの偏光シグナルが検出し得る。例として、BurkeらのUS 2001/0004522 A1又はT.C. Turekら, Analytical Biochemistry, 2001, 299(1), 25-53が挙げられる。
上記アッセイの夫々が酵素の生成物生成の減少に基づいてインヒビターのアフィニティーを測定する。酵素生成物を測定するための多くの別法にかかわらず、夫々のアッセイフォーマットは活性酵素、高アフィニティー基質及びリンペプチドに結合する特殊な抗体を必要とする。殆どの場合、活性酵素を得ることは触媒中裂を横切っている活性化ループのリン酸化を伴う。このリン酸化はこの機能を奏する上流キナーゼが未知である場合に高度に問題があり得る。たとえ活性化キナーゼが知られているとしても、その要件はクローニング又は同時発現多重キナーゼを必要とする。或る場合には、サイクリンの如き付加的なコファクターがタンパク質を充分に活性化するために添加される必要がある。
タンパク質キナーゼは多量の配列特異性基質選択を示す。それ故、好適な特異性基質が夫々のキナーゼについて見つけられる必要がある。加えて、基質部位がセリン又はスレオニンである場合、特殊なリン特異性抗体がハイスループットアッセイフォーマットで活性を監視するために得られる必要がある。これらの要件は新しいキナーゼアッセイの設計に不確かさだけでなく、追加費用を加える。
上記アッセイの夫々が酵素の生成物生成の減少に基づいてインヒビターのアフィニティーを測定する。酵素生成物を測定するための多くの別法にかかわらず、夫々のアッセイフォーマットは活性酵素、高アフィニティー基質及びリンペプチドに結合する特殊な抗体を必要とする。殆どの場合、活性酵素を得ることは触媒中裂を横切っている活性化ループのリン酸化を伴う。このリン酸化はこの機能を奏する上流キナーゼが未知である場合に高度に問題があり得る。たとえ活性化キナーゼが知られているとしても、その要件はクローニング又は同時発現多重キナーゼを必要とする。或る場合には、サイクリンの如き付加的なコファクターがタンパク質を充分に活性化するために添加される必要がある。
タンパク質キナーゼは多量の配列特異性基質選択を示す。それ故、好適な特異性基質が夫々のキナーゼについて見つけられる必要がある。加えて、基質部位がセリン又はスレオニンである場合、特殊なリン特異性抗体がハイスループットアッセイフォーマットで活性を監視するために得られる必要がある。これらの要件は新しいキナーゼアッセイの設計に不確かさだけでなく、追加費用を加える。
要するに、タンパク質キナーゼアッセイ開発による問題は活性化工程及びタンパク質基質選択に最もしばしば遭遇される。新しいタンパク質キナーゼについてのハイスループットスクリーニングアッセイの開発は現在6-12ヶ月を要する。クローニング及びタンパク質発現に加えて、酵素が活性化される必要があり、基質が見つけられる必要があり、かつ酵素反応の生成物を検出するための試薬が生成される必要がある。これは非常に時間を浪費し、労働を集中する努力であり、夫々のアッセイがタンパク質キナーゼの一種又は小さいサブセットについて特殊化される必要がある。
リンペプチド基質を結合するための方法を使用するあらゆるアッセイはそのアッセイに使用されるATPの濃度により制限される。これは不可避である。何とならば、ペプチド基質のリン酸化アミノ酸及びATPのホスフェートの両方が添加された試薬の結合部位について互に競合するからである。sub Km値でアッセイされる中間〜高いKm値を有するキナーゼは基質変換を問題のあるものにする。
最後に、化合物アフィニティーをIC50ではなくKdとして表すアッセイを有することが望ましい。これは化合物選択性を測定するのに重要な、キナーゼ間のインヒビターの明らかな比較を可能にする。追加のATP KmデータなくしてはIC50測定をキナーゼ毎に比較することができない。
これらの問題を解決するために、ハイスループットスクリーニングと適合性であり、均一であり（無洗浄工程）、活性化タンパク質を必要とせず、触媒反応を必要とせず、基質非依存性であり、ATP濃度に依存せず、しかも化合物Kd値を測定するインヒビターアフィニティーを測定するためのアッセイを有することが望ましいであろう。このようなアッセイはアッセイ開発時間及び試薬のコストを低減することにより薬物発見研究に関係する学会及び会社に数百万ドルを節減させるであろう。
リンペプチド基質を結合するための方法を使用するあらゆるアッセイはそのアッセイに使用されるATPの濃度により制限される。これは不可避である。何とならば、ペプチド基質のリン酸化アミノ酸及びATPのホスフェートの両方が添加された試薬の結合部位について互に競合するからである。sub Km値でアッセイされる中間〜高いKm値を有するキナーゼは基質変換を問題のあるものにする。
最後に、化合物アフィニティーをIC50ではなくKdとして表すアッセイを有することが望ましい。これは化合物選択性を測定するのに重要な、キナーゼ間のインヒビターの明らかな比較を可能にする。追加のATP KmデータなくしてはIC50測定をキナーゼ毎に比較することができない。
これらの問題を解決するために、ハイスループットスクリーニングと適合性であり、均一であり（無洗浄工程）、活性化タンパク質を必要とせず、触媒反応を必要とせず、基質非依存性であり、ATP濃度に依存せず、しかも化合物Kd値を測定するインヒビターアフィニティーを測定するためのアッセイを有することが望ましいであろう。このようなアッセイはアッセイ開発時間及び試薬のコストを低減することにより薬物発見研究に関係する学会及び会社に数百万ドルを節減させるであろう。
本発明はタンパク質キナーゼに対するインヒビターのアフィニティーを測定するための結合アッセイを提供する。その結合アッセイは蛍光偏光フォーマットで使用され、検出される以下に記載される一連の標識された、活性部位プローブについてつくられた。インヒビターによる標識されたプローブの置換は酵素に対するインヒビターについてのKdを生じるのに使用し得る。
また、本発明はタンパク質キナーゼに対するインヒビターの結合アッセイにおける使用のための新規プローブを提供する。
本発明の一実施態様は、プローブが候補インヒビターにより置換でき、かつ活性部位プローブが前記キナーゼのATP結合ドメインに結合する条件下で、
a)ATP結合部位のための活性部位プローブのKdを実証する工程、
b)活性部位プローブをキナーゼドメインを含むタンパク質と接触させ、前記プローブからのシグナルを測定して基準線レベルシグナルを実証する工程、
c)活性部位プローブ：キナーゼ複合体を候補インヒビター薬剤とともにインキュベートし、前記プローブからのシグナルを測定する工程、
d)工程b)からのシグナルを工程c)からのシグナルと比較する工程、
e)そのATP結合部位のためのプローブのKd及び候補インヒビター薬剤の用量応答に基づいて候補インヒビター薬剤についてのKdを誘導する工程
を含むことを特徴とするキナーゼインヒビター薬剤の同定のためのアッセイを提供する。
また、本発明はタンパク質キナーゼに対するインヒビターの結合アッセイにおける使用のための新規プローブを提供する。
本発明の一実施態様は、プローブが候補インヒビターにより置換でき、かつ活性部位プローブが前記キナーゼのATP結合ドメインに結合する条件下で、
a)ATP結合部位のための活性部位プローブのKdを実証する工程、
b)活性部位プローブをキナーゼドメインを含むタンパク質と接触させ、前記プローブからのシグナルを測定して基準線レベルシグナルを実証する工程、
c)活性部位プローブ：キナーゼ複合体を候補インヒビター薬剤とともにインキュベートし、前記プローブからのシグナルを測定する工程、
d)工程b)からのシグナルを工程c)からのシグナルと比較する工程、
e)そのATP結合部位のためのプローブのKd及び候補インヒビター薬剤の用量応答に基づいて候補インヒビター薬剤についてのKdを誘導する工程
を含むことを特徴とするキナーゼインヒビター薬剤の同定のためのアッセイを提供する。
本発明の別の実施態様において、キナーゼドメインを含むタンパク質は完全長キナーゼである。
本発明の別の実施態様は蛍光プローブを提供し、そのシグナルがプローブの蛍光偏光のシフトとして測定される。
本発明の別の実施態様は本明細書に記載された一般式Ｉのプローブを使用するアッセイを提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記載された一般式IIのプローブを使用するアッセイを提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記載された一般式IIIのプローブを使用するアッセイを提供する。
本発明の別の実施態様において、活性部位プローブはSTK12キナーゼドメインを含む6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-N-〔6-(5-ニトロ-2-フェニルアミノ-ピリミジン-4-イルアミノ)-ヘキシル〕-イソフタラミン酸である。
本発明の別の実施態様は蛍光プローブを提供し、そのシグナルがプローブの蛍光偏光のシフトとして測定される。
本発明の別の実施態様は本明細書に記載された一般式Ｉのプローブを使用するアッセイを提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記載された一般式IIのプローブを使用するアッセイを提供する。
本発明の別の実施態様は本明細書に記載された一般式IIIのプローブを使用するアッセイを提供する。
本発明の別の実施態様において、活性部位プローブはSTK12キナーゼドメインを含む6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-N-〔6-(5-ニトロ-2-フェニルアミノ-ピリミジン-4-イルアミノ)-ヘキシル〕-イソフタラミン酸である。
本発明はタンパク質キナーゼ遺伝子ファミリーの員のインヒビターの検出及び評価のためのキナーゼアッセイに関する。その新しいアッセイフォーマットは酵素インヒビターと競合するための活性部位プローブを使用し、それにより酵素活性化及び基質の必要を省く。このアッセイ方法の使用はインヒビター結合データが触媒アッセイとは独立に得られることを可能にし、それにより、HTSアッセイが基質を使用しないで未活性化タンパク質を使用して行なわれることを可能にする。そのアッセイはほんのわずかのコストでつくられる以下に特定される、標識されたプローブの特定の組を使用する。
I. 蛍光プローブ
本発明の蛍光プローブはキナーゼの活性部位に結合し、下記の一般式(I)：
R1-L-X-Y (I)
（式中、
R1はキナーゼの活性部位に結合する化合物の基であり、Ｙは蛍光標識であり、ＬはR1とＸの間の１個以上の原子のリンカーであり、かつＸはＬ及び蛍光標識、Ｙを結合する官能基である）
を有する。
本発明のアッセイはキナーゼファミリー員のインヒビターを検出するのに有益であると予想される。それ故、本発明の蛍光プローブ中の部分R1はそれが部位特異的様式で種々のキナーゼの活性部位（ATP部位）に結合するように選ばれるであろう。それ故、この基は数種のキナーゼに結合すると知られている構造を有するであろう。好ましいR1の例は下記の式(II)及び(III)（式中、R3及びR4は以下に本明細書に記載される）のインドリノン構造及び2,4-ジアミノ-5-ニトロピリミジン構造である。
I. 蛍光プローブ
本発明の蛍光プローブはキナーゼの活性部位に結合し、下記の一般式(I)：
R1-L-X-Y (I)
（式中、
R1はキナーゼの活性部位に結合する化合物の基であり、Ｙは蛍光標識であり、ＬはR1とＸの間の１個以上の原子のリンカーであり、かつＸはＬ及び蛍光標識、Ｙを結合する官能基である）
を有する。
本発明のアッセイはキナーゼファミリー員のインヒビターを検出するのに有益であると予想される。それ故、本発明の蛍光プローブ中の部分R1はそれが部位特異的様式で種々のキナーゼの活性部位（ATP部位）に結合するように選ばれるであろう。それ故、この基は数種のキナーゼに結合すると知られている構造を有するであろう。好ましいR1の例は下記の式(II)及び(III)（式中、R3及びR4は以下に本明細書に記載される）のインドリノン構造及び2,4-ジアミノ-5-ニトロピリミジン構造である。
本発明に有益な蛍光標識の例として、ローダミン及びローダミン誘導体、例えば、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン、リサミンTMローダミンＢ、テキサス・レッド（登録商標）、カルボキシ-X-ローダミン及びローダミン・レッドTM-X、並びに当業界で知られているその他のローダミン誘導体、フルオレセイン及びフルオレセイン誘導体、例えば、フッ素化フルオレセイン、例えば、オレゴン・グリーン（登録商標）及びその誘導体、フルオレセインアミン、カルボキシフルオレセイン、α-ヨードアセトアミドフルオレセイン、4'-アミノメチルフルオレセイン、4'-N-アルキルアミノメチルフルオレセイン、5-アミノメチルフルオレセイン、6-アミノメチルフルオレセイン、2,4-ジクロロ-1,3,5-トリアジン-2-イル-アミノフルオレセイン(DTAF)、4-クロロ-6-メトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル-アミノフルオレセイン、及びフルオレセインイソチオシアネート、並びに当業界で知られているその他のフルオレセイン誘導体、4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン及びその誘導体、シアニン色素、並びにアレキサ・フルオル（登録商標）色素が挙げられる。
更に好ましい蛍光標識として、フルオレセイン及びフルオレセイン誘導体、例えば、フッ素化フルオレセイン、例えば、オレゴン・グリーン（登録商標）及びその誘導体、フルオレセインアミン、カルボキシフルオレセイン、α-ヨードアセトアミドフルオレセイン、4'-アミノメチルフルオレセイン、4'-N-アルキルアミノメチルフルオレセイン、5-アミノメチルフルオレセイン、6-アミノメチルフルオレセイン、2,4-ジクロロ-1,3,5-トリアジン-2-イル-アミノフルオレセイン(DTAF)、4-クロロ-6-メトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル-アミノフルオレセイン、及びフルオレセインイソチオシアネート、並びに当業界で知られているその他のフルオレセイン誘導体が挙げられる。
更に好ましい蛍光標識として、フルオレセイン及びフルオレセイン誘導体、例えば、フッ素化フルオレセイン、例えば、オレゴン・グリーン（登録商標）及びその誘導体、フルオレセインアミン、カルボキシフルオレセイン、α-ヨードアセトアミドフルオレセイン、4'-アミノメチルフルオレセイン、4'-N-アルキルアミノメチルフルオレセイン、5-アミノメチルフルオレセイン、6-アミノメチルフルオレセイン、2,4-ジクロロ-1,3,5-トリアジン-2-イル-アミノフルオレセイン(DTAF)、4-クロロ-6-メトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル-アミノフルオレセイン、及びフルオレセインイソチオシアネート、並びに当業界で知られているその他のフルオレセイン誘導体が挙げられる。
一実施態様において、本発明の蛍光プローブは下記の一般式(I)：
R1-L-X-Y (I)
（式中、
R1はキナーゼの活性部位に結合する化合物の基であり、
Ｌは直接結合又はC1-C16アルキレン基、C2-C16アルケニレン基もしくはC2-C16アルキニレン基であり、そのC1-C16アルキレン基、C2-C16アルケニレン基又はC2-C16アルキニレン基中に存在する利用できる-CH2-基の一つ以上が必要により、また独立に-O-、-C(O)-、-S(O)p-（式中、ｐは０〜２である）、又は-N(R2)-で置換されていてもよく、
ＸはＯ、Ｓ、-N(R2)C(O)-、-C(O)N(R2)-、-N(R2)C(S)-、-C(S)N(R2)-、-N(R2)C(S)NH-、-NHC(S)N(R2)-、-N(R2)C(O)NH-、-NHC(O)N(R2)、-SO2NR2-、-NR2SO2-、-CH2N(R2)-、-N(R2)CH2-、-CH2-S-、-SCH2-、-C(O)CH2S-、-SC(O)CH2-、-NHCH2CH2S-、-SCH2CH2NH-、-NC(O)O-、-ONC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NH-N=C(R2)-、-C(R2)=N-NH-、-NHCH(R2)-、及び-CH(R2)NH-からなる群から選ばれ、
R2はＨ又はC1-3アルキルであり、かつ
Ｙは蛍光標識である）
を有する。
好ましい蛍光プローブは
R1が式(II)のインドリノン又は式(III)のニトロピリミジンであり、
R1-L-X-Y (I)
（式中、
R1はキナーゼの活性部位に結合する化合物の基であり、
Ｌは直接結合又はC1-C16アルキレン基、C2-C16アルケニレン基もしくはC2-C16アルキニレン基であり、そのC1-C16アルキレン基、C2-C16アルケニレン基又はC2-C16アルキニレン基中に存在する利用できる-CH2-基の一つ以上が必要により、また独立に-O-、-C(O)-、-S(O)p-（式中、ｐは０〜２である）、又は-N(R2)-で置換されていてもよく、
ＸはＯ、Ｓ、-N(R2)C(O)-、-C(O)N(R2)-、-N(R2)C(S)-、-C(S)N(R2)-、-N(R2)C(S)NH-、-NHC(S)N(R2)-、-N(R2)C(O)NH-、-NHC(O)N(R2)、-SO2NR2-、-NR2SO2-、-CH2N(R2)-、-N(R2)CH2-、-CH2-S-、-SCH2-、-C(O)CH2S-、-SC(O)CH2-、-NHCH2CH2S-、-SCH2CH2NH-、-NC(O)O-、-ONC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NH-N=C(R2)-、-C(R2)=N-NH-、-NHCH(R2)-、及び-CH(R2)NH-からなる群から選ばれ、
R2はＨ又はC1-3アルキルであり、かつ
Ｙは蛍光標識である）
を有する。
好ましい蛍光プローブは
R1が式(II)のインドリノン又は式(III)のニトロピリミジンであり、
ＸがＯ、Ｓ、-N(R2)C(O)-、-C(O)N(R2)-、-N(R2)C(S)-、-C(S)N(R2)-、-N(R2)C(S)NH-、-NHC(S)N(R2)-、-N(R2)C(O)NH-、-NHC(O)N(R2)、-SO2NR2-、-NR2SO2-、-CH2N(R2)-、-N(R2)CH2-、-CH2-S-、-SCH2-、-C(O)CH2S-、-SC(O)CH2-、-NHCH2CH2S-、-SCH2CH2NH-、-NC(O)O-、-ONC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NH-N=C(R2)-、-C(R2)=N-NH-、-NHCH(R2)-、及び-CH(R2)NH-からなる群から選ばれ、
R2がＨ又はC1-3アルキルであり、
R3がC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ヒドロキシC1-6アルキル、Cl、Ｆ、Br、Ｉ、-CN、-CO2H、-CO2C1-6アルキル、-S(O)2C1-6アルキル、-S(O)2フェニル、SC1-6アルキル、-NO2、-OH、-CF3、-N(R2)(R2)、-NHC(O)NHC1-6アルキル及び-C(O)N(R2)(R2)からなる群から選ばれ、かつ
R4がフェニル及びナフチルから選ばれ、必要によりCl、Ｆ、Br、Ｉ、-CH3、-CN、-CO2CH3、-C(O)NR5R6、-NO2、-OH、-NH2、及び-CF3から選ばれた１個から３個までの基で置換されていてもよい、上記式(I)を有するものである。
以下は本発明の範囲内に入る蛍光プローブの特別な例であり、何ら限定であると意図されない。
R3がC1-6アルキル、C1-6アルコキシ、ヒドロキシC1-6アルキル、Cl、Ｆ、Br、Ｉ、-CN、-CO2H、-CO2C1-6アルキル、-S(O)2C1-6アルキル、-S(O)2フェニル、SC1-6アルキル、-NO2、-OH、-CF3、-N(R2)(R2)、-NHC(O)NHC1-6アルキル及び-C(O)N(R2)(R2)からなる群から選ばれ、かつ
R4がフェニル及びナフチルから選ばれ、必要によりCl、Ｆ、Br、Ｉ、-CH3、-CN、-CO2CH3、-C(O)NR5R6、-NO2、-OH、-NH2、及び-CF3から選ばれた１個から３個までの基で置換されていてもよい、上記式(I)を有するものである。
以下は本発明の範囲内に入る蛍光プローブの特別な例であり、何ら限定であると意図されない。
１個以上の不斉炭素原子を含む本発明のあらゆる蛍光プローブはラセミ体及びラセミ体混合物、単一鏡像体、ジアステレオマー混合物及び個々のジアステレオマーとして生じてもよい。これらの化合物の全てのこのような異性体形態が本発明に明らかに含まれる。夫々の立体中心炭素はＲもしくはＳ配置、又はこれらの配置の組み合わせであってもよい。
本発明の蛍光プローブの幾つかは一種より多い互変異性体形態で存在し得る。本発明は全てのこのような互変異性体を含む。
本発明の蛍光プローブは当業者により認められるように“化学的に安定である”と意図されているもののみである。例えば、“ダングリング原子価”、又は“カルバニオン”を有する化合物は本発明により意図されている化合物ではない。
蛍光プローブの合成のための方法が合成実施例部分に示される。
本発明の蛍光プローブの幾つかは一種より多い互変異性体形態で存在し得る。本発明は全てのこのような互変異性体を含む。
本発明の蛍光プローブは当業者により認められるように“化学的に安定である”と意図されているもののみである。例えば、“ダングリング原子価”、又は“カルバニオン”を有する化合物は本発明により意図されている化合物ではない。
蛍光プローブの合成のための方法が合成実施例部分に示される。
II. 蛍光偏光アッセイ
蛍光偏光アッセイは面偏光を有する蛍光体の溶液の励起が励起光に対し平行に配向される励起双極子モーメントでこれらの蛍光体を光選択するという原理に基づいている。これらの蛍光体の蛍光放出は励起状態寿命中に生じる拡散の速度を含む幾つかの因子により決められる程度まで脱分極されるであろう。この速度は、順に、回転している種の体積を含む、幾つかの因子により決められる。それ故、蛍光偏光は蛍光体と一層大きい分子の間の相互作用の測定に適用し得る。
本明細書に開示された新規蛍光プローブはキナーゼのATPポケットに結合する化合物を検出し、評価するための蛍光偏光アッセイに使用し得る。また、本発明の方法は完全長キナーゼだけでなく、キナーゼの末端切断型バージョン並びにキナーゼドメイン及びキナーゼ活性を保持するハイブリッドキナーゼで実施し得ることが理解される。本発明は幾つかの異なるキナーゼに対する候補インヒビターを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイに使用し得る蛍光標識されたプローブを含む。換言すれば、同じ蛍光プローブがキナーゼＡ、キナーゼＢ等の候補インヒビターを同定するための別々のハイスループットアッセイに使用し得る。新規蛍光プローブはキナーゼ遺伝子ファミリーにわたって交差反応性であるとともに、ヒトキノームから選ばれたキナーゼのATP結合ポケットへのそれらの結合において特異性であるように設計される。プローブの蛍光偏光はキナーゼドメインへの結合を変化し、その結果、インヒビターにより競合された場合に、プローブ偏光が測定可能に減少する。この偏光変化がこのアッセイで観察可能なものとして利用できる。本明細書に特に明記されない限り、本発明の蛍光偏光アッセイを実施するのに使用し得る条件（例えば、圧力、温度、pH、溶媒、時間）は当業者により容易に決められてもよい。
蛍光偏光アッセイは面偏光を有する蛍光体の溶液の励起が励起光に対し平行に配向される励起双極子モーメントでこれらの蛍光体を光選択するという原理に基づいている。これらの蛍光体の蛍光放出は励起状態寿命中に生じる拡散の速度を含む幾つかの因子により決められる程度まで脱分極されるであろう。この速度は、順に、回転している種の体積を含む、幾つかの因子により決められる。それ故、蛍光偏光は蛍光体と一層大きい分子の間の相互作用の測定に適用し得る。
本明細書に開示された新規蛍光プローブはキナーゼのATPポケットに結合する化合物を検出し、評価するための蛍光偏光アッセイに使用し得る。また、本発明の方法は完全長キナーゼだけでなく、キナーゼの末端切断型バージョン並びにキナーゼドメイン及びキナーゼ活性を保持するハイブリッドキナーゼで実施し得ることが理解される。本発明は幾つかの異なるキナーゼに対する候補インヒビターを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイに使用し得る蛍光標識されたプローブを含む。換言すれば、同じ蛍光プローブがキナーゼＡ、キナーゼＢ等の候補インヒビターを同定するための別々のハイスループットアッセイに使用し得る。新規蛍光プローブはキナーゼ遺伝子ファミリーにわたって交差反応性であるとともに、ヒトキノームから選ばれたキナーゼのATP結合ポケットへのそれらの結合において特異性であるように設計される。プローブの蛍光偏光はキナーゼドメインへの結合を変化し、その結果、インヒビターにより競合された場合に、プローブ偏光が測定可能に減少する。この偏光変化がこのアッセイで観察可能なものとして利用できる。本明細書に特に明記されない限り、本発明の蛍光偏光アッセイを実施するのに使用し得る条件（例えば、圧力、温度、pH、溶媒、時間）は当業者により容易に決められてもよい。
本発明の方法を利用するアッセイは下記の様式で設計し得る。
(a)遊離蛍光プローブ及びキナーゼに結合された蛍光プローブの偏光値を測定することにより好適な活性部位プローブ-キナーゼ対を選択する。
(b)蛍光活性部位プローブ-キナーゼ対についてのKdを測定する。
(c)ADP、スタウロスポリン又はプローブのキナーゼ結合部分（R1）に近似するインヒビターを使用して蛍光プローブがATP結合ポケットから競合されることを実証する。
予備工程として、蛍光励起スペクトル及び蛍光放出スペクトルが夫々の蛍光プローブについて測定される。吸光度スペクトルが内部フィルター効果を避けるために測定される。蛍光励起スペクトル及び蛍光放出スペクトルがプローブを検出するのに適した励起波長及び発光波長を選ぶために収集される。これらのスペクトルは好適なアッセイ緩衝液中のプローブを用いてあらゆる通常の分光光度計及び蛍光光度計を使用して測定し得る。
関係するキナーゼ又はキナーゼドメインに適したプローブを同定するために（工程(a)）、初期の４点滴定スキームが開発された。夫々のキナーゼが蛍光プローブのパネルに対しスクリーニングされる。そのアッセイのこの工程における陽性選択についての基準は、
i) 許容し得るプローブ蛍光強さ、
ii) キナーゼへの結合の際の許容し得る偏光変化、
iii)プローブ結合が生じる許容し得るキナーゼ濃度範囲
である。
(a)遊離蛍光プローブ及びキナーゼに結合された蛍光プローブの偏光値を測定することにより好適な活性部位プローブ-キナーゼ対を選択する。
(b)蛍光活性部位プローブ-キナーゼ対についてのKdを測定する。
(c)ADP、スタウロスポリン又はプローブのキナーゼ結合部分（R1）に近似するインヒビターを使用して蛍光プローブがATP結合ポケットから競合されることを実証する。
予備工程として、蛍光励起スペクトル及び蛍光放出スペクトルが夫々の蛍光プローブについて測定される。吸光度スペクトルが内部フィルター効果を避けるために測定される。蛍光励起スペクトル及び蛍光放出スペクトルがプローブを検出するのに適した励起波長及び発光波長を選ぶために収集される。これらのスペクトルは好適なアッセイ緩衝液中のプローブを用いてあらゆる通常の分光光度計及び蛍光光度計を使用して測定し得る。
関係するキナーゼ又はキナーゼドメインに適したプローブを同定するために（工程(a)）、初期の４点滴定スキームが開発された。夫々のキナーゼが蛍光プローブのパネルに対しスクリーニングされる。そのアッセイのこの工程における陽性選択についての基準は、
i) 許容し得るプローブ蛍光強さ、
ii) キナーゼへの結合の際の許容し得る偏光変化、
iii)プローブ結合が生じる許容し得るキナーゼ濃度範囲
である。
プローブ濃度は夫々のプローブについて測定される必要がある許容し得る蛍光強さを生じる必要がある。何とならば、異なる蛍光体の量子収量が変化するからである。96又は384ウェルプレートの型がウェルの壁へのプローブの非特異的吸着を最小にするために慎重に決められる必要がある。プローブ吸着は測定される偏光の人工的な増大を生じ得る。また、キュベットが使用されてもよい。サンプルが混合され、偏光測定の前に時間の前もって決められた期間にわたってインキュベートされる。装置セッティングはプローブの蛍光特性（励起スペクトル、発光スペクトル、量子収量）により特定される。必要とされる偏光の変化はスクリーンに使用される装置により特定される。本発明者らはこの工程における変更の最小の変化が100ミリ偏光単位（mP）であることを測定した。キナーゼのためのプローブの必要とされるおよそのアフィニティーはスクリーニングプロセス中のタンパク質供給及び算出消費により特定される。プローブ／キナーゼ対が工程(a)に記載された方法により同定される場合、充分な平衡結合滴定が相互作用を記載する平衡解離定数（Kd）を測定するために行なわれる（工程(b)）。プローブは96又は384ウェルプレート中の夫々のウェルについて前もって決められた一定濃度で一定に保たれる。また、キュベットが使用されてもよい。関係するキナーゼが連続希釈されてプレートにわたって広い濃度範囲をカバーする。濃度範囲はプローブが工程ａでキナーゼを結合することが示された濃度をカバーすべきである。加えて、幾つかのウェルがプローブ単独又は最高濃度のキナーゼとともにプローブを含むべきである。これはプローブ／キナーゼ対についてQb/Qf比を計算するために行なわれる。これは遊離プローブ（Qf）の合計の強さにより割られた結合されたプローブ（Qb）の合計の強さの目安であり、これはKdを正確に測定するためにデータ分析に含まれるのに必要である。Kdは通常の方法（例えば、回帰分析）を使用して得られる。
アッセイのこの工程における陽性選択についての基準は、
i. キナーゼへのプローブ結合の際の許容し得る偏光変化
ii. プローブ結合が生じる許容し得るキナーゼ濃度範囲
である。
再度、これらの値は装置だけでなく、タンパク質供給により特定される。
次の工程(c)において、相互作用が特異的であり、キナーゼのATP結合部位で生じているのかを測定することが必要である。これはKdが測定された後にのみ生じ得る（工程(b)）。何とならば、キナーゼ濃度の選択はプローブを結合する際に生じる合計の偏光変化に依存するからである。部位特異的結合（ATPポケット）を実証するために、プローブのコアー化学（キナーゼ結合部分）に近似するインヒビターが使用される。また、ADP又はスタウロスポリンがこの適用に使用されてもよい。この工程において、ADP、スタウロスポリン又はインヒビターが工程(b)で得られた蛍光プローブ-キナーゼ複合体混合物と混合され、蛍光プローブ、キナーゼ及びADPの得られる混合物が競合又はその他の相互作用を促進するためにインキュベートされる。試験化合物が水不溶性である場合、最初に試験化合物を適当な有機溶媒、例えば、DMSOに溶解し、その後にそれを緩衝水溶液中で希釈することが必要であるかもしれない。この工程についてのインキュベーション条件は変化し得るが、一般にインキュベーションは約25℃の温度で約30分間にわたって行なわれる。工程(c)で得られた蛍光偏光値の差が陰性であり、即ち、ADP、スタウロスポリン又は試験化合物の存在下で偏光の減少がある場合、これは蛍光プローブがキナーゼのATPポケット部位に結合していることを示し得る。
i. キナーゼへのプローブ結合の際の許容し得る偏光変化
ii. プローブ結合が生じる許容し得るキナーゼ濃度範囲
である。
再度、これらの値は装置だけでなく、タンパク質供給により特定される。
次の工程(c)において、相互作用が特異的であり、キナーゼのATP結合部位で生じているのかを測定することが必要である。これはKdが測定された後にのみ生じ得る（工程(b)）。何とならば、キナーゼ濃度の選択はプローブを結合する際に生じる合計の偏光変化に依存するからである。部位特異的結合（ATPポケット）を実証するために、プローブのコアー化学（キナーゼ結合部分）に近似するインヒビターが使用される。また、ADP又はスタウロスポリンがこの適用に使用されてもよい。この工程において、ADP、スタウロスポリン又はインヒビターが工程(b)で得られた蛍光プローブ-キナーゼ複合体混合物と混合され、蛍光プローブ、キナーゼ及びADPの得られる混合物が競合又はその他の相互作用を促進するためにインキュベートされる。試験化合物が水不溶性である場合、最初に試験化合物を適当な有機溶媒、例えば、DMSOに溶解し、その後にそれを緩衝水溶液中で希釈することが必要であるかもしれない。この工程についてのインキュベーション条件は変化し得るが、一般にインキュベーションは約25℃の温度で約30分間にわたって行なわれる。工程(c)で得られた蛍光偏光値の差が陰性であり、即ち、ADP、スタウロスポリン又は試験化合物の存在下で偏光の減少がある場合、これは蛍光プローブがキナーゼのATPポケット部位に結合していることを示し得る。
本発明のこの工程がADP、スタウロスポリン又は試験化合物の多重希釈液を使用して行なわれる場合、得られた試験蛍光偏光値の範囲が適当なグラフにプロットし得る。所望により、その後に通常の方法（例えば、回帰分析）を使用してキナーゼへの結合について試験化合物の平衡解離定数を計算してもよい。
また、本発明は試験化合物が蛍光プローブドメイン活性部位と競合する能力について評価し得るアッセイを具体化する。これは以下の実施例３に更に記載される。
本発明の好ましい方法は蛍光プローブ又は環境感受性蛍光プローブを使用することである。環境感受性プローブを使用する場合、フルオレセンス強さの変化ではなく、蛍光強さの変化が測定されるであろう。
また、本発明は試験化合物が蛍光プローブドメイン活性部位と競合する能力について評価し得るアッセイを具体化する。これは以下の実施例３に更に記載される。
本発明の好ましい方法は蛍光プローブ又は環境感受性蛍光プローブを使用することである。環境感受性プローブを使用する場合、フルオレセンス強さの変化ではなく、蛍光強さの変化が測定されるであろう。
一般合成方法
本発明の蛍光プローブは以下に記載される方法により調製し得る。以下に記載される方法及びスキームの夫々において、基R1、Ｌ及びＸ（示される場合）は、特に言及される以外は、一般式Ｉ、II及びIIIについて先に定義されたとおりである。最適の反応条件及び反応時間は使用される特別な反応体に応じて変化してもよい。特に明記されない限り、溶媒、温度、圧力及びその他の反応条件は当業者により容易に選択し得る。特別な操作が合成実施例部分に示される。典型的には、反応進行は所望により薄層クロマトグラフィー(TLC)により監視されてもよい。中間体及び生成物はシリカゲルによるクロマトグラフィー及び／又は再結晶により精製されてもよい。出発物質及び試薬は市販されており、又は化学文献に記載された方法を使用して当業者により調製されてもよい。
先に説明したように、式ＩのR1部分はキナーゼの活性部位に結合する構造、例えば、式II及びIIIに示された構造に相当し得る。例えば、R1がIIである式Ｉの化合物は下記のスキームＩに示されるように合成されてもよい。
スキームＩ
本発明の蛍光プローブは以下に記載される方法により調製し得る。以下に記載される方法及びスキームの夫々において、基R1、Ｌ及びＸ（示される場合）は、特に言及される以外は、一般式Ｉ、II及びIIIについて先に定義されたとおりである。最適の反応条件及び反応時間は使用される特別な反応体に応じて変化してもよい。特に明記されない限り、溶媒、温度、圧力及びその他の反応条件は当業者により容易に選択し得る。特別な操作が合成実施例部分に示される。典型的には、反応進行は所望により薄層クロマトグラフィー(TLC)により監視されてもよい。中間体及び生成物はシリカゲルによるクロマトグラフィー及び／又は再結晶により精製されてもよい。出発物質及び試薬は市販されており、又は化学文献に記載された方法を使用して当業者により調製されてもよい。
先に説明したように、式ＩのR1部分はキナーゼの活性部位に結合する構造、例えば、式II及びIIIに示された構造に相当し得る。例えば、R1がIIである式Ｉの化合物は下記のスキームＩに示されるように合成されてもよい。
スキームＩ
先に示されるように、4-ニトロ安息香酸をＬ及びX'を有するアミンとカップリングして中間体IVを得る。当業界で知られている通常のカップリング条件、例えば、塩化メチレンの如き好適な溶媒中のカップリング剤、例えば、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)の存在下の塩化メチレンの如き好適な溶媒中の反応が使用されてもよい。次いでIVのニトロ基を、例えば、エタノールの如き好適な溶媒中でパラジウム／カーボンの如き好適な触媒の存在下で水素又は水素源、例えば、ギ酸アンモニウムによる処理により還元する。ＶをDMFの如き溶媒中で約75℃〜120℃で加熱しながら中間体VIと反応させて中間体VIIを得る。中間体VIはW. Grellらの米国特許第6,043,254号に記載されたように必要により置換されていてもよい1-アセチル-2-インドリノンから無水酢酸中でトリエチルオルトベンゾエートとともに還流し、続いてアセチル基を加水分解することにより調製されてもよい。VIIをX'と反応する官能基を有するY'、蛍光標識と反応させて式Ｉの所望の化合物を得る。X'及びY'並びにX-Yを生成するための化学が以下に更に記載される。
R1がIIIである式Ｉの化合物はスキームIIに記載されるように調製されてもよい。
スキームII
R1がIIIである式Ｉの化合物はスキームIIに記載されるように調製されてもよい。
スキームII
先に示したように、チオシアネート中間体VIIIを塩化メチレンの如き好適な溶媒中でH2N-L-X'と反応させて中間体IXを得る。中間体VIIIは市販の4,6-ジクロロ-5-ニトロピリミジンからEtOHの如き好適な溶媒中でチオシアン酸塩、例えば、チオシアン酸カリウムと反応させ、続いて得られる中間体をEtOHの如き好適な溶媒中で、かつトリエチルアミンの如き塩基の存在下でR4NH2と反応させることにより調製されてもよい。IXをY'と反応させて式Ｉの所望の化合物を得る。
Ｙとして好適な種々の蛍光標識が市販されている（例えば、モレキュラー・プローブス社（www.probes.com）を参照のこと）。これらの標識は所望のR1-L-X-Yを生成するためにR1-L-X'にカップリングし得る種々の反応性官能基で利用できる。得られた連結部分Ｘは選ばれたX'及びＹの反応性官能基に依存するであろう。例えば、上記スキームＩの最後の工程において、CO2H基を有する蛍光標識Ｙ、即ち、化合物Y-CO2H（Y'）がX'についてアミン官能基を有するR1-L-X'、即ち、化合物R1-L-NH2と反応させられて式(I)、R1-L-X-Y（式中、Ｘは-NHC(O)-である）の化合物を得てもよい。
下記の表１は市販されている蛍光プローブのその他の反応性官能基及び官能基X'との反応により生成し得るＸ基の例を示す。反応条件は当業者に知られている。一般にそれらは反応性官能基（Y'）を含む蛍光標識を好適な溶媒、例えば、塩化メチレン、酢酸エチル、THF又はDMF中で、必要により当業界で知られているような適当な触媒、例えば、トリエチルアミンの如き塩基、又はカップリング試薬の存在下で、約-10℃〜溶媒の還流温度の好適な温度、好ましくは約０℃〜室温で所望のR1-L-X'と合わせることを伴う。特別な反応条件及び反応時間はY'及びR1-L-X'の性質に応じて変化し得る。反応進行は当業界で知られている方法、例えば、薄層クロマトグラフィーにより容易に監視される。
Ｙとして好適な種々の蛍光標識が市販されている（例えば、モレキュラー・プローブス社（www.probes.com）を参照のこと）。これらの標識は所望のR1-L-X-Yを生成するためにR1-L-X'にカップリングし得る種々の反応性官能基で利用できる。得られた連結部分Ｘは選ばれたX'及びＹの反応性官能基に依存するであろう。例えば、上記スキームＩの最後の工程において、CO2H基を有する蛍光標識Ｙ、即ち、化合物Y-CO2H（Y'）がX'についてアミン官能基を有するR1-L-X'、即ち、化合物R1-L-NH2と反応させられて式(I)、R1-L-X-Y（式中、Ｘは-NHC(O)-である）の化合物を得てもよい。
下記の表１は市販されている蛍光プローブのその他の反応性官能基及び官能基X'との反応により生成し得るＸ基の例を示す。反応条件は当業者に知られている。一般にそれらは反応性官能基（Y'）を含む蛍光標識を好適な溶媒、例えば、塩化メチレン、酢酸エチル、THF又はDMF中で、必要により当業界で知られているような適当な触媒、例えば、トリエチルアミンの如き塩基、又はカップリング試薬の存在下で、約-10℃〜溶媒の還流温度の好適な温度、好ましくは約０℃〜室温で所望のR1-L-X'と合わせることを伴う。特別な反応条件及び反応時間はY'及びR1-L-X'の性質に応じて変化し得る。反応進行は当業界で知られている方法、例えば、薄層クロマトグラフィーにより容易に監視される。
1 市販のアシルアジドから有機溶媒中で加熱すること（クルチウス転位）により容易に調製される 2 ホウ水素化ナトリウムの如き好適な還元剤による中間体イミンの還元後
上記方法を使用して、当業者は本発明の範囲内に入る種々の蛍光プローブ(I)を容易に調製し得る。
上記方法を使用して、当業者は本発明の範囲内に入る種々の蛍光プローブ(I)を容易に調製し得る。
合成実施例
以下の実施例は蛍光プローブが合成し得る方法を説明する。
実施例１：6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-N-{6-〔4-（{〔2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン〕-フェニル-メチル}-アミノ）-ベンゾイルアミノ〕-ヘキシル}-イソフタラミン酸（化合物Ａ）の合成（方法Ａ）
以下の実施例は蛍光プローブが合成し得る方法を説明する。
実施例１：6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-N-{6-〔4-（{〔2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン〕-フェニル-メチル}-アミノ）-ベンゾイルアミノ〕-ヘキシル}-イソフタラミン酸（化合物Ａ）の合成（方法Ａ）
p-ニトロ安息香酸（500mg、2.99ミリモル）、N-Boc-ヘキサンジアミン（834mg、3.3ミリモル）、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)（699mg、3.65ミリモル）、及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(HOBT)（493mg、3.65mL）をジクロロメタン（15mL）中で合わせ、周囲温度で16時間撹拌した。その反応液をEtOAc（50mL）で希釈し、水、飽和重炭酸ナトリウム、及び食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した。有機層を回転蒸発により濃縮して〔6-(4-ニトロ-ベンゾイルアミノ)-ヘキシル〕-カルバミン酸tert-ブチルエステル1.01gを白色の固体（収率92％）として回収した。
上記アミド（265mg、0.750ミリモル）をEtOH（25mL）に溶解した。その反応混合物にギ酸アンモニウム（500mg）及び10％のパラジウム／カーボン（100mg）を仕込み、周囲温度で４日撹拌した。その反応液をケイソウ土で濾過し、濃縮して〔6-(4-アミノ-ベンゾイルアミノ)-ヘキシル〕-カルバミン酸tert-ブチルエステル265mgを白色の結晶性固体（定量的収率）として回収した。
上記アミド（265mg、0.750ミリモル）をEtOH（25mL）に溶解した。その反応混合物にギ酸アンモニウム（500mg）及び10％のパラジウム／カーボン（100mg）を仕込み、周囲温度で４日撹拌した。その反応液をケイソウ土で濾過し、濃縮して〔6-(4-アミノ-ベンゾイルアミノ)-ヘキシル〕-カルバミン酸tert-ブチルエステル265mgを白色の結晶性固体（定量的収率）として回収した。
1-アセチル-3-〔1-エトキシ-1-フェニル-メチリデン(Z)〕-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン（50mg、0.163ミリモル）及び〔6-(4-アミノ-ベンゾイルアミノ)-ヘキシル〕-カルバミン酸tert-ブチルエステル（65mg、0.195ミリモル）をDMF（1mL）中で合わせ、110℃で24時間撹拌した。DMFを高真空下で回転蒸発により除去した。残渣をMeOH（1mL）に再度溶解し、0.5Mのナトリウムメトキシドの溶液を添加し（0.5mL）、その反応液を周囲温度で１時間撹拌した。ジオキサン（1mL）中の4NのHClを添加し、その反応液を一夜撹拌した。その反応液を回転蒸発により濃縮した。〔20％の（MeOH中10％の水酸化アンモニウム）及び80％のジクロロメタン〕の極性勾配のフラッシュクロマトグラフィーにかけてN-(6-アミノ-ヘキシル)-4-（{〔2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン〕-フェニル-メチル}-アミノ）-ベンズアミド60mg（収率82％）を得た。
N-(6-アミノ-ヘキシル)-4-（{〔2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン〕-フェニル-メチル}-アミノ）-ベンズアミド（5mg、0.01ミリモル）及びオレゴン・グリーン488カルボン酸スクシンイミジルエステル“5-異性体”（5mg、0.01ミリモル）をDMF（1mL）に溶解し、周囲温度で16時間振とうした。その反応液を高真空下で回転蒸発により濃縮した。残渣を分取TLCプレートに装填し、〔30％の（MeOH中10％の水酸化アンモニウム）及び70％のジクロロメタン〕の移動相で溶離した。標題化合物（2mg）を明るいオレンジ色の固体（収率20％）として得た。
方法Ａにより調製されたその他のプローブの例を以下に示す。
化合物Ｂ：N-{6-〔4-（{〔6-クロロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン〕-フェニル-メチル}-アミノ）-ベンゾイルアミノ〕-ヘキシル}-6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-イソフタラミン酸
N-(6-アミノ-ヘキシル)-4-（{〔2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン〕-フェニル-メチル}-アミノ）-ベンズアミド（5mg、0.01ミリモル）及びオレゴン・グリーン488カルボン酸スクシンイミジルエステル“5-異性体”（5mg、0.01ミリモル）をDMF（1mL）に溶解し、周囲温度で16時間振とうした。その反応液を高真空下で回転蒸発により濃縮した。残渣を分取TLCプレートに装填し、〔30％の（MeOH中10％の水酸化アンモニウム）及び70％のジクロロメタン〕の移動相で溶離した。標題化合物（2mg）を明るいオレンジ色の固体（収率20％）として得た。
方法Ａにより調製されたその他のプローブの例を以下に示す。
化合物Ｂ：N-{6-〔4-（{〔6-クロロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン〕-フェニル-メチル}-アミノ）-ベンゾイルアミノ〕-ヘキシル}-6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-イソフタラミン酸
化合物Ｃ：N-{6-〔4-（{〔5-ベンゼンスルホニルアミノ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン〕-フェニル-メチル}-アミノ）-ベンゾイルアミノ〕-ヘキシル}-6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-イソフタラミン酸
方法Ｂにより調製されたその他のプローブの例を以下に示す。
化合物Ｈ：N-{6-〔2-（4-クロロ-フェニルアミノ）-5-ニトロ-ピリミジン-4-イルアミノ〕-ヘキシル}-6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-イソフタラミン酸
化合物Ｊ：6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-N-{2-〔2-（5-ニトロ-2-フェニルアミノ-ピリミジン-4-イルアミノ）-エチルカルバモイル〕-エチル}-イソフタラミン酸
工程１：蛍光プローブの特性決定
吸光度スペクトルを最初に夫々のプローブについて評価する。次いでプローブを検出するのに適した励起波長及び発光波長を同定するために励起スペクトル及び発光スペクトルを測定する。このようなプローブの例は6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-N-〔6-(5-ニトロ-2-フェニルアミノ-ピリミジン-4-イルアミノ)-ヘキシル〕-イソフタラミン酸であり、この場合、励起最大及び発光最大は夫々496nm及び524nmである。アッセイ緩衝液（50mM HEPES, pH 7.4、100mM NaCl、5mM MgCl2、５％のグリセロール、200mM TCEP及び0.01%(w/v)のCHAPS、２％のDMSO）に溶解されたプローブを用いて、これらの蛍光スペクトルをSLM-8100蛍光光度計で測定した。
次いでSTK12キナーゼドメインについてのプローブのアフィニティーを滴定実験で測定した。偏光アッセイをコーニング・コスターNBS 96ウェルソリッドブラック平底プレート中で行なう。この実験において、LJLアナリストを蛍光プローブの励起／発光特性に適したフィルターとともに使用した。STK12キナーゼドメインを25nMのプローブを含むウェルに連続希釈してプレートにわたる広い濃度範囲をカバーした。加えて、幾つかのウェルがプローブ単独又はプローブとともに最高濃度のSTK12キナーゼドメインを含む。プローブ／キナーゼドメイン対についてのQb/Qf比を計算するためにこれを行なう。これは遊離プローブ（Qf）の合計の強さにより割られた結合されたプローブ（Qb）の合計の強さの目安であり、これはKdを正確に測定するためにデータ分析に含まれることが必要である。非線形最小自乗回帰分析を使用してプローブに結合するSTK12キナーゼドメインについて得られた偏光値からプローブの平衡解離定数を計算した。図１はこの滴定実験からの結果を示す。
工程２：プローブ結合のインヒビターについてのスクリーニング
最初にSTK12キナーゼドメインとSTK12キナーゼドメインの活性部位に結合する蛍光プローブ6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-N-〔6-(5-ニトロ-2-フェニルアミノ-ピリミジン-4-イルアミノ)-ヘキシル〕-イソフタラミン酸との間の複合体をつくることによりプレートをセットアップする。この実施例において、プローブとSTK12との間の複合体を、アッセイ緩衝液（50mM HEPES, pH 7.4、100mM NaCl、5mM MgCl2、５％のグリセロール、200mM TCEP及び0.01%(w/v)のCHAPS、２％のDMSO）中で予備生成した。この溶液中のSTK12キナーゼドメイン及びプローブの濃度を、アッセイにおける最終濃度が200nM STK12キナーゼドメイン及び25nM プローブであるように構成した。次いで試験化合物をプレートにわたってアッセイ緩衝液中で連続希釈した。次いで予備生成されたSTK12キナーゼドメイン-プローブ複合体を全てのウェルに添加し、室温で30分間インキュベートした。次いで蛍光プローブに適した波長にセットされた蛍光偏光プレートリーダーを使用して蛍光偏光を測定した。この実施例において、LJLアナリストを蛍光プローブの励起／発光特性に適したフィルターとともに使用した。非線形最小自乗回帰分析を使用して試験化合物の存在下でSTK12キナーゼドメインに結合するプローブについての偏光値からSTK12キナーゼに結合する、試験化合物、ニトロピリミジン誘導体についての平衡解離定数を計算した。
図２は200nM STK12キナーゼドメイン、25nM プローブ及び種々の連続希釈における競合分子を用いる競合アッセイの結果を示す。これらの結果は試験化合物の存在下のプローブ-STK12キナーゼドメイン複合体の蛍光偏光の減少を示し、これはこの試験化合物がSTK12キナーゼドメイン活性部位について蛍光プローブ6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-N-〔6-(5-ニトロ-2-フェニルアミノ-ピリミジン-4-イルアミノ)-ヘキシル〕-イソフタラミン酸と競合するSTK12キナーゼドメインの競合インヒビターであるという証拠である。
最初にSTK12キナーゼドメインとSTK12キナーゼドメインの活性部位に結合する蛍光プローブ6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-N-〔6-(5-ニトロ-2-フェニルアミノ-ピリミジン-4-イルアミノ)-ヘキシル〕-イソフタラミン酸との間の複合体をつくることによりプレートをセットアップする。この実施例において、プローブとSTK12との間の複合体を、アッセイ緩衝液（50mM HEPES, pH 7.4、100mM NaCl、5mM MgCl2、５％のグリセロール、200mM TCEP及び0.01%(w/v)のCHAPS、２％のDMSO）中で予備生成した。この溶液中のSTK12キナーゼドメイン及びプローブの濃度を、アッセイにおける最終濃度が200nM STK12キナーゼドメイン及び25nM プローブであるように構成した。次いで試験化合物をプレートにわたってアッセイ緩衝液中で連続希釈した。次いで予備生成されたSTK12キナーゼドメイン-プローブ複合体を全てのウェルに添加し、室温で30分間インキュベートした。次いで蛍光プローブに適した波長にセットされた蛍光偏光プレートリーダーを使用して蛍光偏光を測定した。この実施例において、LJLアナリストを蛍光プローブの励起／発光特性に適したフィルターとともに使用した。非線形最小自乗回帰分析を使用して試験化合物の存在下でSTK12キナーゼドメインに結合するプローブについての偏光値からSTK12キナーゼに結合する、試験化合物、ニトロピリミジン誘導体についての平衡解離定数を計算した。
図２は200nM STK12キナーゼドメイン、25nM プローブ及び種々の連続希釈における競合分子を用いる競合アッセイの結果を示す。これらの結果は試験化合物の存在下のプローブ-STK12キナーゼドメイン複合体の蛍光偏光の減少を示し、これはこの試験化合物がSTK12キナーゼドメイン活性部位について蛍光プローブ6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-N-〔6-(5-ニトロ-2-フェニルアミノ-ピリミジン-4-イルアミノ)-ヘキシル〕-イソフタラミン酸と競合するSTK12キナーゼドメインの競合インヒビターであるという証拠である。
Claims (7)
- 下記の一般式(I)を有し、キナーゼへの結合活性を有する蛍光プローブ。
R1-L-X-Y (I)
（式中、
R1はキナーゼの活性部位に結合する化合物の基であり、
Ｌは直接結合又はC1-C16アルキレン基、C2-C16アルケニレン基もしくはC2-C16アルキニレン基であり、そのC1-C16アルキレン基、C2-C16アルケニレン基又はC2-C16アルキニレン基中に存在する利用できる-CH2-基の一つ以上が必要により、また独立に-O-、-C(O)-、-S(O)p-（式中、ｐは０〜２である）、又は-N(R2)-で置換されていてもよく、
ＸはＯ、Ｓ、-N(R2)C(O)-、-C(O)N(R2)-、-N(R2)C(S)-、-C(S)N(R2)-、-N(R2)C(S)NH-、-NHC(S)N(R2)-、-N(R2)C(O)NH-、-NHC(O)N(R2)、-SO2NR2-、-NR2SO2-、-CH2N(R2)-、-N(R2)CH2-、-CH2-S-、-SCH2-、-C(O)CH2S-、-SC(O)CH2-、-NHCH2CH2S-、-SCH2CH2NH-、-NC(O)O-、-ONC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NH-N=C(R2)-、-C(R2)=N-NH-、-NHCH(R2)-、及び-CH(R2)NH-からなる群から選ばれ、
R2はＨ又はC1-3アルキルであり、かつ
Ｙは蛍光標識であり、
R1が式(III)のニトロピリミジンである。）
-
- プローブが候補インヒビターにより置換でき、かつ活性部位プローブが前記キナーゼのATP結合ドメインに結合し、かつ前記活性部位プローブが請求項１又は２記載の活性部位プローブである条件下で、
a)ATP結合部位のための活性部位プローブのKdを実証する工程、
b)活性部位プローブをキナーゼドメインを含むタンパク質と接触させ、前記プローブからのシグナルを測定して基準線レベルシグナルを実証する工程、
c)活性部位プローブ：キナーゼ複合体を候補インヒビター薬剤とともにインキュベートし、前記プローブからのシグナルを測定する工程、
d)工程b)からのシグナルを工程c)からのシグナルと比較する工程、
e)そのATP結合部位のためのプローブのKd及び候補インヒビター薬剤の用量応答に基づいて候補インヒビター薬剤についてのKdを誘導する工程
を含むことを特徴とするキナーゼインヒビター薬剤の同定のための方法。 - キナーゼドメインを含むタンパク質が完全長キナーゼである、請求項３記載の方法。
- プローブが蛍光プローブであり、シグナルがプローブの蛍光偏光のシフトとして測定される、請求項３記載の方法。
- キナーゼドメインがSTK12である、請求項３記載の方法。
- 活性部位プローブがSTK12キナーゼドメインへの結合活性を有する6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-N-〔6-(5-ニトロ-2-フェニルアミノ-ピリミジン-4-イルアミノ)-ヘキシル〕-イソフタラミン酸である、請求項３記載の方法。
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