JP2007509845A5 - - Google Patents
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Description
本発明はタンパク質キナーゼに対するインヒビターのアフィニティーを測定するための結合アッセイを提供する。その結合アッセイは蛍光偏光フォーマットで使用され、検出される以下に記載される一連の標識された、活性部位プローブについてつくられた。インヒビターによる標識されたプローブの置換は酵素に対するインヒビターについてのKdを生じるのに使用し得る。
また、本発明はタンパク質キナーゼに対するインヒビターの結合アッセイにおける使用のための新規プローブを提供する。
本発明の一実施態様は、プローブが候補インヒビターにより置換でき、かつ活性部位プローブが前記キナーゼのATP結合ドメインに結合する条件下で、
a)ATP結合部位のための活性部位プローブのKdを実証する工程、
b)活性部位プローブをキナーゼドメインを含むタンパク質と接触させ、前記プローブからのシグナルを測定して基準線レベルシグナルを実証する工程、
c)活性部位プローブ：キナーゼ複合体を候補インヒビター薬剤とともにインキュベートし、前記プローブからのシグナルを測定する工程、
d)工程b)からのシグナルを工程c)からのシグナルと比較する工程、
e)そのATP結合部位のためのプローブのKd及び候補インヒビター薬剤の用量応答に基づいて候補インヒビター薬剤についてのKdを誘導する工程
を含むことを特徴とするキナーゼインヒビター薬剤の同定のためのアッセイを提供する。
また、本発明はタンパク質キナーゼに対するインヒビターの結合アッセイにおける使用のための新規プローブを提供する。
本発明の一実施態様は、プローブが候補インヒビターにより置換でき、かつ活性部位プローブが前記キナーゼのATP結合ドメインに結合する条件下で、
a)ATP結合部位のための活性部位プローブのKdを実証する工程、
b)活性部位プローブをキナーゼドメインを含むタンパク質と接触させ、前記プローブからのシグナルを測定して基準線レベルシグナルを実証する工程、
c)活性部位プローブ：キナーゼ複合体を候補インヒビター薬剤とともにインキュベートし、前記プローブからのシグナルを測定する工程、
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を含むことを特徴とするキナーゼインヒビター薬剤の同定のためのアッセイを提供する。
Claims (7)
- 下記の一般式(I)を有し、キナーゼへの結合活性を有する蛍光プローブ。
R1-L-X-Y (I)
（式中、
R1はキナーゼの活性部位に結合する化合物の基であり、
Ｌは直接結合又はC1-C16アルキレン基、C2-C16アルケニレン基もしくはC2-C16アルキニレン基であり、そのC1-C16アルキレン基、C2-C16アルケニレン基又はC2-C16アルキニレン基中に存在する利用できる-CH2-基の一つ以上が必要により、また独立に-O-、-C(O)-、-S(O)p-（式中、ｐは０〜２である）、又は-N(R2)-で置換されていてもよく、
ＸはＯ、Ｓ、-N(R2)C(O)-、-C(O)N(R2)-、-N(R2)C(S)-、-C(S)N(R2)-、-N(R2)C(S)NH-、-NHC(S)N(R2)-、-N(R2)C(O)NH-、-NHC(O)N(R2)、-SO2NR2-、-NR2SO2-、-CH2N(R2)-、-N(R2)CH2-、-CH2-S-、-SCH2-、-C(O)CH2S-、-SC(O)CH2-、-NHCH2CH2S-、-SCH2CH2NH-、-NC(O)O-、-ONC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NH-N=C(R2)-、-C(R2)=N-NH-、-NHCH(R2)-、及び-CH(R2)NH-からなる群から選ばれ、
R2はＨ又はC1-3アルキルであり、かつ
Ｙは蛍光標識であり、
R 1 が式(III)のニトロピリミジンである。）
-
- プローブが候補インヒビターにより置換でき、かつ活性部位プローブが前記キナーゼのATP結合ドメインに結合し、かつ前記活性部位プローブが請求項１又は２記載の活性部位プローブである条件下で、
a)ATP結合部位のための活性部位プローブのKdを実証する工程、
b)活性部位プローブをキナーゼドメインを含むタンパク質と接触させ、前記プローブからのシグナルを測定して基準線レベルシグナルを実証する工程、
c)活性部位プローブ：キナーゼ複合体を候補インヒビター薬剤とともにインキュベートし、前記プローブからのシグナルを測定する工程、
d)工程b)からのシグナルを工程c)からのシグナルと比較する工程、
e)そのATP結合部位のためのプローブのKd及び候補インヒビター薬剤の用量応答に基づいて候補インヒビター薬剤についてのKdを誘導する工程
を含むことを特徴とするキナーゼインヒビター薬剤の同定のためのアッセイ。 - キナーゼドメインを含むタンパク質が完全長キナーゼである、請求項３記載のアッセイ。
- プローブが蛍光プローブであり、シグナルがプローブの蛍光偏光のシフトとして測定される、請求項３記載の方法。
- キナーゼドメインがSTK12である、請求項３記載の方法。
- 活性部位プローブがSTK12キナーゼドメインを含む6-(2,7-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-N-〔6-(5-ニトロ-2-フェニルアミノ-ピリミジン-4-イルアミノ)-ヘキシル〕-イソフタラミン酸である、請求項３記載の方法。
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