JP3851706B2 - 蛍光性基含有カルボジイミド化合物 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な蛍光性基含有カルボジイミド化合物に関する。詳しくは、本発明は、高感度で且つ標識が容易な検出試薬である新規な蛍光性基含有カルボジイミド化合物及びその製造方法並びにそれを使用した分析法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、種々の生物学的分析においては、検出可能な特定の標識物質を利用して目的物質を検出する分析方法が開発されている。例えば、標識物質で標識した核酸を用いるハイブリダイゼーションによる核酸検出法では、先ず、プローブとして用いる核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を標識し、これをハイブリッド形成条件下で、調べるべき核酸を含む試料と接触させる。試料中に、プローブとして用いた核酸に相補的な塩基配列を有する核酸が存在すれば、これとプローブが結合（ハイブリダイズ）し、核酸−核酸ハイブリッドが形成される。このハイブリッドの標識物質を検出することにより目的の核酸を検出することができる。また、標識物質で標識した抗原又は抗体を用いるイムノアッセイ法においては、例えば測定対象が抗原であるときは、その抗原に特異的に結合する抗体を標識し、次いで抗原−抗体複合体を形成させ、該複合体に含まれる標識物質を検知することによって、測定対象の抗原を検出することができる。
【０００３】
このような核酸検出法やイムノアッセイ法における標識物質としては、放射性物質、ビオチンやジゴキシゲニン化合物等の非放射性の標識物質、蛍光物質等が挙げられる。
【０００４】
蛍光物質を、例えば核酸へ導入する方法としては、次のような方法が知られている。すなわち、蛍光物質が結合したヌクレオチドを用いて酵素等により核酸へ導入する方法（特開平６−２７１５９９号公報）、ビオチン標識した核酸に蛍光物質が結合したストレプトアビジンを結合させる方法、アミノリンカーが結合した核酸にアミン反応性基含有蛍光物質を反応させる、等の方法である。しかしながら、これらの方法においては、蛍光物質を天然由来の核酸に導入することができず、また操作が煩雑であるという欠点がある。
【０００５】
例えば、蛍光物質のうち蛍光希土類金属キレートは、生物学的反応体に結合させる方法として、特開平４−２７８６７号公報に共有結合させる具体的な方法が記載されているが、これらの方法では、天然由来の核酸に直接蛍光希土類金属キレートを共有結合で結合させることはできないという欠点がある。
【０００６】
また、特開平６−９４７２０号公報には、光反応性基と蛍光希土類金属キレートとを同時に持つ化合物を用いて光化学的に標識する方法がある。しかし、この方法では、紫外線を照射する工程が必要であるという煩雑さが問題であった。
【０００７】
さらに、二本鎖核酸に蛍光物質をインターカレートさせる方法があるが、この方法においては、一本鎖核酸の標識ができないという問題があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、核酸検出法又はイムノアッセイ法における測定用標識として、取り扱いが容易で短時間で効率よく標識することができ、また天然由来の核酸にも標識可能であり、且つ高感度な標識物質である新規蛍光性基含有カルボジイミド化合物を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
カルボジイミド化合物が核酸と反応することは知られている。例えば、カルボジイミド化合物は核酸中の水素結合を形成していないグアニン及びチミンと反応して付加体を形成することが報告されている［P. T. Gilham, J. Amer. Chem. Soc., 84, 688(1962)］。
【００１０】
本発明者らは、簡便で効率的な核酸及び蛋白質への蛍光性基導入法に関して鋭意研究を重ねた結果、カルボジイミド基の核酸、蛋白質等への高い反応性を利用して、カルボジイミド化合物に蛍光性基を導入することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【００１１】
すなわち、本発明は、下記一般式（Ｉ）で表される蛍光性基含有カルボジイミド化合物を提供するものである。
【００１２】
【化１６】
Ｂ−Ｙ³−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｙ²−Ｗ−Ｙ¹−［Ａ］_n−Ｆ ・・・（Ｉ）
【００１３】
［式（Ｉ）中、
Ｆは蛍光性基を表す。
Ａは−ＣＨ₂−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（Ｒはアルキル基）、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨＳＯ₂−、及び−ＳＯ₂ＮＨ−からなる群から選ばれる基を表す。ｎは０又は１を表す。
Ｗは直接結合又は４級アンモニウム基を表す。
Ｙ¹、Ｙ²及びＹ³は、各々下記式（Ｌ）で示される基を表す。
【００１４】
【化１７】
−（ＣＨ₂）_p−Ｌ−（ＣＨ₂）_q− ・・・（Ｌ）
【００１５】
（式（Ｌ）中、
Ｌは直接結合又は−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、−Ｎ⁺ＲＲ’−（Ｒ’はアルキル基）、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群から選ばれる基を表す。ｐ及びｑは各々０又は１〜１２の整数を表す。）
Ｂは水素原子又は式（Ｉ）中の−Ｗ−Ｙ¹−［Ａ］_n−Ｆと同一もしくは異なる一価の有機基を表す。］
【００１６】
また、本発明は、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物である前記蛍光性基含有カルボジイミド化合物を提供するものである。
【００１７】
【化１８】

【００１８】
［式（ＩＩ）中、
Ｒ¹及びＲ²は、各々炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐状の飽和もしくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基もしくはアラルキル基、又はＲ¹とＲ²とが相互に結合して形成する含窒素複素環式基を表す。
Ｘ^-はハロゲンイオン又はスルホン酸イオンを表す。
Ｂ、Ｙ¹、Ｙ²、Ｙ³、Ａ及びＦは各々前記一般式（Ｉ）におけるのと同義である。］
【００１９】
また、本発明は、前記一般式（ＩＩ）で表される化合物が、下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物である前記蛍光性基含有カルボジイミド化合物を提供するものである。
【００２０】
【化１９】

【００２１】
［式（ＩＩＩ）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｘ^-、Ｙ¹、Ｙ²、Ａ及びＦは各々前記式（ＩＩ）におけるのと同義である。］
【００２２】
また、本発明は、下記一般式（ＩＶ）で表される化合物である前記蛍光性基含有カルボジイミド化合物を提供するものである。
【００２３】
【化２０】
Ｂ−Ｙ³−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｆ’ ・・・（ＩＶ）
【００２４】
［式（ＩＶ）中、Ｂ及びＹ³は各々前記一般式（Ｉ）におけるのと同義である。Ｆ’はクマリン誘導体、ピレン誘導体、ペリレン誘導体、ローダミン誘導体、ダンシル誘導体、オキサゾール誘導体、及びチアゾールオレンジ誘導体からなる群より選ばれるものである。］
【００２５】
また、本発明は、下記一般式（Ｖ）で表される化合物である前記蛍光性基含有カルボジイミド化合物を提供するものである。
【００２６】
【化２１】
Ｂ−Ｙ³−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｙ²−Ａ−Ｆ ・・・（Ｖ）
【００２７】
［式（Ｖ）中、Ｂ、Ｙ²、Ｙ³、Ａ及びＦは各々前記式（Ｉ）におけるのと同義である。］
【００２８】
また、本発明は、下記一般式（ＶＩ）で表されるカルボジイミド基含有化合物と、下記一般式（ＶＩＩ）で表される蛍光性基含有化合物とを反応させる工程を含む前記一般式（ＩＩ）で表される蛍光性基含有カルボジイミド化合物の製造方法を提供するものである。
【００２９】
【化２２】
Ｂ−Ｙ³−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｙ²−Ｗ’ ・・・（ＶＩ）
【００３０】
［式（ＶＩ）中、Ｗ’は置換されていてもよいアミノ基を表す。Ｂ、Ｙ³、及びＹ²は前記一般式（Ｉ）におけるのと同義である。］
【００３１】
【化２３】
Ｆ−Ａ−Ｙ¹−Ｘ ・・・（ＶＩＩ）
【００３２】
［式（ＶＩＩ）中、Ｆ、Ａ、及びＹ¹は前記一般式（Ｉ）におけるのと同義であり、Ｘはハロゲン原子又はスルホン酸基を表す。］
【００３３】
また、本発明は、下記一般式（ＶＩＩＩ）で表されるアミノ基含有蛍光性化合物と、下記一般式（ＩＸ）で表されるイソシアネート系化合物とを反応させて下記一般式（Ｘ）で表される尿素系化合物を合成する工程を含む前記一般式（ＩＶ）で表される蛍光性基含有カルボジイミド化合物の製造方法を提供するものである。
【００３４】
【化２４】
Ｆ'−ＮＨ₂ ・・・（ＶＩＩＩ）
【００３５】
［式（ＶＩＩＩ）中、Ｆ’は前記一般式（ＩＶ）におけるのと同義である。］
【００３６】
【化２５】
Ｂ−Ｙ³−ＮＣＺ ・・・（ＩＸ）
【００３７】
［式（ＩＸ）中、Ｚは酸素原子又はイオウ原子を表す。Ｂ及びＹ³は前記一般式（ＩＶ）におけるのと同義である。］
【００３８】
【化２６】

【００３９】
［式（Ｘ）中、Ｂ、Ｆ、Ｚ及びＹ³は前記式（ＶＩＩＩ）及び（ＩＸ）におけるのと同義である。］
【００４０】
また、本発明は、下記一般式（ＸＩ）で表されるアミノ基含有蛍光性化合物と、下記一般式（ＸＩＩ）で表されるイソシアネート系化合物とを反応させて下記一般式（ＸＩＩＩ）で表される尿素系化合物を合成する工程を含む前記一般式（Ｖ）で表される蛍光性基含有カルボジイミド化合物の製造方法を提供するものである。
【００４１】
【化２７】
Ｆ−Ａ−Ｙ²−ＮＨ₂ ・・・（ＸＩ）
【００４２】
［式（ＸＩ）中、Ｆ、Ａ及びＹ²は前記一般式（Ｖ）におけるのと同義である。］
【００４３】
【化２８】
Ｂ−Ｙ³−ＮＣＺ ・・・（ＸＩＩ）
【００４４】
［式（ＸＩＩ）中、Ｚは酸素原子又はイオウ原子を表す。Ｂ及びＹ³は前記一般式（Ｖ）におけるのと同義である。］
【００４５】
【化２９】

【００４６】
［式（ＸＩＩＩ）中、Ａ、Ｂ、Ｆ、Ｚ、Ｙ²及びＹ³は前記式（ＸＩ）及び（ＸＩＩ）におけるのと同義である。］
【００４７】
また、本発明は、標識物質で標識した核酸を用いるハイブリダイゼーションによる核酸の検出法において、前記標識物質として、前記蛍光性基含有カルボジイミド化合物を用いることを特徴とする方法を提供するものである。
【００４８】
更に、本発明は、標識物質で標識した抗原又は抗体を用いるイムノアッセイ法において、前記標識物質として、前記蛍光性基含有カルボジイミド化合物を用いることを特徴とする方法を提供するものである。
【００４９】
更に、本発明は、シュウ酸誘導体と過酸化物とを蛍光物質の存在下に反応させて生じる化学発光を用いる過シュウ酸エステル化学発光分析法において、前記蛍光物質として、前記蛍光性基含有カルボジイミド化合物であって該蛍光性基がクマリン誘導体、ピレン誘導体、ペリレン誘導体、ローダミン誘導体、ダンシル誘導体、オキサゾール誘導体、チアゾールオレンジ誘導体、シアニン化合物、ベンゾチアゾール誘導体、ベンゾオキサゾール誘導体、ベンゾオキサジアゾール誘導体、ジピロメテンボロンジフルオライド誘導体、及び蛍光希土類金属キレート化合物からなる群より選ばれるものである化合物を用いることを特徴とする方法を提供するものである。
【００５０】
一般式（Ｉ）で表される本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物は、核酸塩基に対して高い反応性を示すカルボジイミド基と、高感度な検出反応性を示すものとして知られる蛍光性基とを同時に有する化合物であり、核酸検出法、イムノアッセイ法等における標識物質や、化学発光分析法における蛍光物質として有用である。
【００５１】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
【００５２】
（１）本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物
本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物は、上記一般式（Ｉ）で表される構造を有する。すなわち、蛍光性基（Ｆ）が、場合によりリンカー等を介してカルボジイミド基に結合した構造を有するものであればよい。
【００５３】
ここで、式（Ｉ）中の蛍光性基Ｆは、蛍光性を示す物質であれば特に限定されないが、例えばクマリン誘導体、ピレン誘導体、ペリレン誘導体、ローダミン誘導体、ダンシル誘導体、オキサゾール誘導体、シアニン化合物、ベンゾチアゾール誘導体、ベンゾオキサゾール誘導体、ベンゾオキサジアゾール誘導体、ジピロメテンボロンジフルオライド誘導体等から選ぶことができる。また、ＤＮＡ、ＲＮＡと結合又はこれらにインターカレートすることにより蛍光強度が増大するような蛍光物質、例えばチアゾールオレンジ誘導体等からも選ぶことができる。
【００５４】
さらには、蛍光希土類金属キレートを選ぶこともできる。このものは、長期に安定な金属イオンを蛍光種としているために蛍光寿命が長く時間分解測定が可能であるというだけでなく、励起波長と蛍光波長とが離れている上に最大発光線スペクトルが５００ｎｍ以上であるために、バックグラウンドの発生が少なく、微量でも検出しやすいという利点がある。
【００５５】
具体的には、下記式（Ｆ）で表される蛍光性基群から選ばれるものが好ましく用いられる。
【００５６】
【化３０】

【００５７】
［式（Ｆ）中、Ｍ＝Ｅｕ³⁺、Ｓｍ³⁺、又はＴｂ³⁺を表す。］
【００５８】
式（Ｉ）中のＡは−ＣＨ₂−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（Ｒはアルキル基）、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨＳＯ₂−、及び−ＳＯ₂ＮＨ−からなる群から選ばれる基を表し、好ましくは−ＣＨ₂−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−等が挙げられる。アルキル基としては炭素数１〜６の直鎖又は分岐アルキル基が挙げられる。ｎは０又は１を表し、一般式（Ｉ）で表される化合物はＡを有していてもいなくてもよい。
【００５９】
式（Ｉ）中のＷは直接結合又は４級アンモニウム基を表す。
Ｙ¹、Ｙ²及びＹ³は、カルボジイミド基とＢ又は−Ａ−Ｆ等とを結合するリンカー部分であり、各々上記式（Ｌ）で示される基を表し、式（Ｌ）中、Ｌは直接結合又は−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、−Ｎ⁺ＲＲ’−（Ｒ’はアルキル基）、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群から選ばれる基を表し、アルキル基としては炭素数１〜６の直鎖又は分岐アルキル基が挙げられる。ｐ及びｑは各々０又は１〜１２の整数を表す。好ましくはＹ¹、Ｙ²及びＹ³は、直接結合、又は主鎖の炭素数が１〜１２であり且つ場合により分岐鎖としてメチル基を有していてもよいアルキレン基、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、１−メチルトリメチレン、テトラメチレン、１−メチルテトラメチレン、２，２−ジメチルトリメチレン、ペンタメチレン等が挙げられる。また、これらのアルキレン基が−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、−Ｎ⁺ＲＲ’−、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群から選ばれる基を介して相互に結合したものであってもよい。
【００６０】
Ｂは水素原子又は一価の有機基を表し、一価の有機基の場合は式（Ｉ）中の−Ｗ−Ｙ¹−Ａ−Ｆと同一であっても異なっていてもよい。好ましくはアルキル基、３級アミノ基又は４級アンモニウム基であり、好適な基としては以下に述べるものが挙げられる。
【００６１】
（イ）窒素原子が水素原子、飽和もしくは不飽和炭化水素基、アリール基、アラルキル基、又は蛍光性基Ｆを含む有機基で４級化されていてもよい含窒素複素環式基、例えばピリジル基もしくはピリジニウム基、ピロリジル基もしくはピロリジニウム基、ピペリジリル基もしくはピペリジニウム基。特に、窒素原子がＣ₁〜Ｃ₁₀のアルキル基、例えばメチル基で４級化されていてもよい、２−、３−、もしくは４−ピリジル基又はピリジニウム基、２−もしくは３−ピロリジル基又はピロリジニウム基、２−、３−もしくは４−ピペリジリル基又はピペリジニウム基。
【００６２】
（ロ）窒素原子が水素原子、飽和もしくは不飽和の炭化水素基、アリール基、アラルキル基、又は蛍光性基Ｆを含む有機基で４級化されていてもよいアミノ基。特に窒素原子がＣ₁〜Ｃ₁₀のアルキル基を含有する基で４級化されていてもよいアミノ基。具体的にはジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基。
【００６３】
（ハ）下記式で表される複素環式３級アミノ基又は３級もしくは４級アンモニウム基。
【００６４】
【化３１】

【００６５】
［式中、Ｒ³及びＲ⁴は各々水素原子、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ₁〜Ｃ₁₀の脂肪族炭化水素基、又は置換基を有していてもよいアリール基もしくはアラルキル基、特にＣ₁〜Ｃ₁₀のアルキル基又はＣ₁〜Ｃ₁₀のアルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。Ｑはアニオン、例えばサルフェートイオン、アルキルサルフェートイオン、アリールサルフェートイオン、ハロサルフェートイオン、ハライドイオン等を表す。Ｒ⁵は酸素原子、イオウ原子又はメチレン基を表す。ｍは０又は１である。］
【００６６】
具体的には、下記式で示される基：
【００６７】
【化３２】

【００６８】
［式中、Ｒ⁶及びＲ⁷は各々水素原子、Ｃ₁〜Ｃ₁₀のアルキル基又はＣ₁〜Ｃ₁₀のアルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表す。］
【００６９】
（ニ）置換基を有していても良いアルキル基、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などのアルキル基、又はシクロヘキシル基、フェニル基。
【００７０】
このような一般式（Ｉ）で表されるカルボジイミド化合物のうち、好ましいものとして以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）で表される化合物が挙げられる。
【００７１】
（ａ）下記一般式（ＩＩ）で表される化合物：
【００７２】
【化３３】

【００７３】
すなわち、上記一般式（Ｉ）中、Ｗが４級アンモニウム基である化合物である。ここで、式（ＩＩ）中、Ｒ¹及びＲ²は、各々炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐状の飽和もしくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。Ｒ¹とＲ²とは相互に同一であっても異なっていてもよい。脂肪族炭化水素基としてはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びシクロアルキル基が包含され、アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基等が挙げられ、このうちメチル基が好ましい。
【００７４】
アルケニル基としては、例えばビニル、アリル、クロチル、チグリル、プレニル等が挙げられ、特に炭素数２〜５のものが好ましい。アルキニル基としては、エチニル基、プロパルギル基等が挙げられ、特に炭素数２〜５のものが好ましい。シクロアルキル基としては、場合により環上にアルキル基等の置換基を有していてもよく、具体的にはシクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、４−メチルシクロヘキシル、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル、シクロオクチル等が挙げられる。特に炭素数６〜１０のものが好ましい。
【００７５】
アリール基としては、単環式又は多環式のいずれのタイプのものであっても良く、例えば、フェニル、ナフチル等が挙げられる。アラルキル基としては、ベンジル、フェネチル等が挙げられる。また、Ｒ¹とＲ²とが相互に結合して含窒素複素環式基を形成していてもよい。このような含窒素複素環式基としては、例えばピリジニウム基、ピロリジニウム基、ピペリジニウム基、ピペラジニウム基、モルホリノ基等が挙げられる。
【００７６】
式（ＩＩ）中、Ｘ^-はハロゲンイオン又はスルホン酸イオンであり、スルホン酸イオンとしてはアルキル基、アリール基等で置換されていてもよい。Ｘ^-の具体例としてはＢｒ^-、Ｃｌ^-、Ｉ^-、ＭｅＳＯ₃ ^-、ＴｓＯ^-（ｐ−トルエンスルホン酸イオン）等が挙げられる。
【００７７】
Ｂ、Ｙ¹、Ｙ²、Ｙ³、Ｆ及びＡについては、前記一般式（Ｉ）における具体例を挙げることができる。Ｂは、前記一般式（Ｉ）中の−Ｗ−Ｙ¹−Ａ−Ｆで表される一価の有機基（Ｗ、Ｙ¹、Ａ及びＦは各々式（Ｉ）中におけるのと同義である。）と同一の有機基であってもよく、同一の場合は、例えば、下記一般式（ＩＩＩ）で表されるような、カルボジイミド基を中心として対称な形となる対称型カルボジイミド化合物などが挙げられる。
【００７８】
【化３４】

【００７９】
このような一般式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物の具体例を以下に示す。
【００８０】
【化３５】

【００８１】
【化３６】

【００８２】
【化３７】

【００８３】
［上記式中、Ｍｅはメチル基、ＴｓＯ^-はｐ−トルエンスルホン酸イオンを表す。］
【００８４】
（ｂ）下記一般式（ＩＶ）で表される化合物：
【００８５】
【化３８】
Ｂ−Ｙ³−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｆ’ ・・・（ＩＶ）
【００８６】
ここで、式（ＩＶ）中、Ｂ及びＹ³については、具体的には前記一般式（Ｉ）におけるのと同様のものが挙げられる。蛍光性基Ｆ’は前記（ａ）で述べた中から、好ましくはクマリン誘導体、ピレン誘導体、ペリレン誘導体、ローダミン誘導体、ダンシル誘導体、オキサゾール誘導体、チアゾールオレンジ誘導体等から選ぶことができ、具体的には、下記式（Ｆ''）で表される蛍光性基群から選ばれるものが好ましく用いられる。
【００８７】
【化３９】

【００８８】
このような一般式（ＩＶ）で表される化合物の具体例を以下に示す。
【００８９】
【化４０】

【００９０】
［式中、Ｍｅはメチル基、ＴｓＯ^-はｐ−トルエンスルホン酸イオンを表す。］
【００９１】
（ｃ）下記一般式（Ｖ）で表される化合物：
【００９２】
【化４１】
Ｂ−Ｙ³−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｙ²−Ａ−Ｆ ・・・（Ｖ）
【００９３】
ここで、式（Ｖ）中、Ａ、Ｂ、Ｙ²及びＹ³については、具体的には前記一般式（Ｉ）におけるのと同様のものが挙げられ、Ａとしては好ましくは−ＮＨＣＯ−又は−ＣＯＮＨ−が挙げられる。蛍光性基Ｆは前記（ａ）で述べたのと同様に、好ましくはクマリン誘導体、ピレン誘導体、ペリレン誘導体、ローダミン誘導体、ダンシル誘導体、オキサゾール誘導体、チアゾールオレンジ誘導体、シアニン化合物、ベンゾチアゾール誘導体、ベンゾオキサゾール誘導体、ベンゾオキサジアゾール誘導体、ジピロメテンボロンジフルオライド誘導体、蛍光希土類金属キレート化合物等から選ぶことができる。このような一般式（Ｖ）で表される化合物の具体例を以下に示す。
【００９４】
【化４２】

【００９５】
［式中、Ｍｅはメチル基、ＴｓＯ^-はｐ−トルエンスルホン酸イオンを表す。］
【００９６】
（２）本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物の製造方法
本発明の前記一般式（Ｉ）で表されるカルボジイミドの製造方法としては、以下に示す方法が挙げられる。
【００９７】
（ｉ）一般式（ＩＩ）で表される化合物の製造方法
先ず、一般式（Ｉ）で表される蛍光性基含有カルボジイミド化合物が、前記一般式（ＩＩ）で表される化合物である場合の製造方法を以下に示す。
【００９８】
前記一般式（ＩＩ）で表される蛍光性基含有カルボジイミド化合物は、前記一般式（ＶＩ）で表されるカルボジイミド基含有化合物と、前記一般式（ＶＩＩ）で表される蛍光性基含有化合物とを反応させる工程を含む方法により製造される。すなわち、一般式（ＶＩ）で表されるカルボジイミド基含有化合物は、末端にアミノ基（Ｗ’）を有するものであり、一般式（ＶＩＩ）で表される蛍光性基含有化合物の末端のハロゲン原子又はスルホン酸基（Ｘ）と反応して結合する。
【００９９】
一般式（ＶＩ）中のＢ、Ｙ²、及びＹ³並びに一般式（ＶＩＩ）中のＦは、上記一般式（Ｉ）におけるのと同義であり、一般式（ＶＩ）で表されるカルボジイミド基含有化合物及び一般式（ＶＩＩ）で表される蛍光性基含有化合物は、各々所望する蛍光性基含有カルボジイミド化合物の構造に応じて適宜選択することができる。例えば、一般式（ＶＩ）で表されるカルボジイミド基含有化合物の具体例としては、Ｎ−３−ジメチルアミノプロピル−Ｎ’−３（４−モルホリノ）プロピルカルボジイミド、１−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、ビス−（３，３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等が挙げられる。このようなカルボジイミド基含有化合物は、通常１級アミン誘導体等のアミン化合物を出発原料として尿素又はチオ尿素誘導体へと導き、更に脱水あるいは酸化的脱硫によるカルボジイミド化により達成される。対称型カルボジイミド化合物の合成には、イソシアネート化合物からの脱炭酸を伴う縮合反応を用いることもできる。
【０１００】
例えば、以下の反応式に示すように、アミン化合物（ａ）と尿素を縮合させ１置換尿素（ｂ）を得、更に第２の又は同一の１級アミン（ｃ）を反応させることにより２置換尿素中間体（ｄ）を合成することができる。すなわち、アミン化合物（ａ）又はその塩と尿素を水又はその他適当な溶媒中で加熱し数時間反応させ、この時点で１置換尿素（ｂ）を単離した後、あるいは系中に第２の又は同一のアミン化合物（ｃ）を添加し、同様の条件で反応させることにより２置換尿素中間体を合成することができる［T. L. Davis and K. C. Blanchard, Org. Synth. Coll. Vol., 1, 453(1941)］。
【０１０１】
【化４３】

【０１０２】
また、前記１置換尿素（ｂ）はアミン化合物（ａ）とシアン酸又はその塩とを反応させることによっても合成することができる［F. Kurzer, Org. Synth. Coll. Vol., 4, 49(1963)］。
【０１０３】
【化４４】

【０１０４】
このようにして得られる１置換尿素誘導体（ｂ）は、上述の方法により２置換誘導体（ｄ）へと導くことができる。２置換尿素誘導体（ｄ）を直接得る方法としては、アミン化合物とイソシアネート化合物（ｅ）との反応を用いることもできる［J. H. Saunders and R. Slocombe, Chem. Rev., 43, 203(1948)］。
【０１０５】
【化４５】

【０１０６】
一方、チオ尿素誘導体（ｇ）はアミン化合物とイソチオシアネート化合物（ｆ）との反応により合成することが一般的に行われる［N. A. Ivanov, R. V. Viasova, V. A. Gancharava, and L. N. Smirnov, Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim. Tekhnol., 19(7), 1010(1976)］。
【０１０７】
【化４６】

【０１０８】
このほかにアミン化合物（ａ）と二硫化炭素との反応により対称型のチオ尿素化合物を合成することもできる［W. W. Levis, Jr. and E. A. Waipert, U. S. Pat. 3,168,560(1965)］。
【０１０９】
【化４７】

【０１１０】
このようにして合成される２置換尿素誘導体（ｄ）及びチオ尿素誘導体（ｇ）は脱水あるいは酸化的脱硫反応によりカルボジイミド基含有化合物（ＶＩ）へと導くことができる。
【０１１１】
尿素誘導体（ｄ）の脱水反応によるカルボジイミド基含有化合物の合成は、３級アミン中で該尿素誘導体をパラトルエンスルホン酸クロリド（ＴＳＣｌ）と共に加熱することで容易に達成できる［G. Amiard and R. Heymes, Bull. Soc. Chim. Fr., 1360(1956)］。
【０１１２】
【化４８】

【０１１３】
また、２置換尿素誘導体（ｄ）の脱水は、４級アンモニウム塩の存在下でパラトルエンスルホン酸クロリド及び炭酸カリウムを用いて行うこともできる［Zsuzsa M. Jaszay et al., Synthesis, 520(1987)］。
【０１１４】
チオ尿素誘導体（ｇ）の脱硫は一般的に酸化水銀を脱硫剤として使用することにより行われる。この反応で好ましく用いられる溶媒としては、例えば、エーテル、ベンゼン、アセトンなどが挙げられる。
【０１１５】
【化４９】

【０１１６】
脱硫剤としては、酸化水銀以外にも酸化鉛［F. Zetzehe and A. Fredrich, Chem, Ber., 73, 1114(1940)］、酸化亜鉛［R. F. Coles, U. S. Pat. 2,946,819(1960)］、炭酸鉛、硝酸鉛、塩化鉛［J. C. Sheehan, U. S. Pat. 3,135,748(1964)］などを用いることもできる。さらにアルカリ性で次亜塩素酸ナトリウムを作用させることによって合成することもできる［H. Stetter and C. Wulff, Chem. Ber., 95, 2302(1962)］。例えば、チオ尿素誘導体を塩化メチレンなどのような溶媒中で次亜塩素酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化銅と共に０℃以下で一昼夜反応させる。その後一般的に用いられている方法で単離、精製することによりカルボジイミド基含有化合物（ＶＩ）が得られる。
【０１１７】
このようにして得られるカルボジイミド基含有化合物（ＶＩ）を蛍光性基含有化合物（ＶＩＩ）と反応させることにより、前記一般式（Ｉ）で表される蛍光性基含有カルボジイミド化合物を製造することができる。尚、一般式（ＶＩＩ）中、Ｘはハロゲン原子又は置換基を有していてもよいスルホン酸基を表し、好ましくは臭素またはヨウ素である。
【０１１８】
【化５０】

【０１１９】
これらの個々の反応工程は、例えば通常用いられるジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、ベンゼン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジクロロメタン等の溶媒を用いて、公知の方法により行われる。また、前記カルボジイミド基含有化合物（ＶＩ）と蛍光性基含有化合物（ＶＩＩ）との反応は、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、ＤＭＳＯ等の通常用いられる溶媒を用いて行われる。
【０１２０】
更に、得られる蛍光性基カルボジイミド化合物を、ジメチルホルムアミド等の溶媒中でｐ−トルエンスルホン酸メチル（ＴｓＯＭｅ）、ヨウ化メチル、ジメチル硫酸等と反応させて前記Ｂ−部分を４級アンモニウム化することにより、水溶性の向上した蛍光性基含有カルボジイミド化合物が得られる。
【０１２１】
尚、用いられるアミン化合物としては、置換されていてもよいアミノ基を有する化合物が挙げられ、具体的には、４−（３−アミノプロピル）モルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンジアミン等が挙げられる。
【０１２２】
また、イソシアネート化合物としては、シクロヘキシルイソシアネート、ｎ−ブチルイソシアネート等が挙げられる。
また、イソチオシアネート化合物としては、ジアルキルアミノ基含有イソチオシアネート化合物、アルキルアミノイソチオシアネート化合物等が挙げられ、具体的には３−ジメチルアミノプロピルイソチオシアネート、３−ジエチルアミノプロピルイソチオシアネート等が挙げられる。
【０１２３】
次に、蛍光性基含有化合物（ＶＩＩ）としては、４−ブロモメチル−７−メトキシクマリン、Ｎ−（（２−（イオドアセチル）−エチル）−Ｎ−メチル）アミノ−７−ニトロベンズ−オキサ−１，３−ジアゾール、５−イオドアセトアミドテトラメチルローダミン等が挙げられる。
【０１２４】
（ｉｉ）一般式（ＩＶ）で表される化合物の製造方法
次に、一般式（Ｉ）で表される蛍光性基含有カルボジイミド化合物が、前記一般式（ＩＶ）で表される化合物である場合の製造方法を以下に示す。
【０１２５】
蛍光性基含有カルボジイミド化合物（ＩＶ）は、前記一般式（ＶＩＩＩ）で表されるアミノ基含有蛍光性化合物と、前記一般式（ＩＸ）で表されるイソシアネート系化合物とを反応させて前記一般式（Ｘ）で表される尿素系化合物を合成する工程を含む方法により製造される。すなわち、アミン誘導体をイソシアネート系化合物と反応させて尿素又はチオ尿素誘導体へと導き、更に脱水あるいは酸化的脱硫によりカルボジイミド基を形成させる。
この反応を、以下の反応式に示す。
【０１２６】
【化５１】

【０１２７】
尿素誘導体（ｄ）の脱水反応によるカルボジイミド基含有化合物の合成は、前記一般式（ＩＩ）で表される化合物の合成におけるのと同様に、３級アミン中で該尿素誘導体をパラトルエンスルホン酸クロリド（ＴＳＣｌ）と共に加熱することで容易に達成できる。また、４級アンモニウム塩の存在下でパラトルエンスルホン酸クロリド及び炭酸カリウムを用いて行うこともできる。
【０１２８】
チオ尿素誘導体（ｇ）の脱硫についても、前記一般式（ＩＩ）で表される化合物の合成におけるのと同様に、一般的に酸化水銀を脱硫剤として使用することにより行われる。この反応で好ましく用いられる溶媒としては、例えば、エーテル、ベンゼン、アセトンなどが挙げられる。脱硫剤としては、酸化水銀以外にも酸化鉛、酸化亜鉛、炭酸鉛、硝酸鉛、塩化鉛などを用いることもできる。さらにアルカリ性で次亜塩素酸ナトリウムを作用させることによって合成することもできる。例えば、チオ尿素誘導体を塩化メチレンなどのような溶媒中で次亜塩素酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化銅と共に０℃以下で一昼夜反応させる。その後一般的に用いられている方法で単離、精製することによりカルボジイミド化合物（ＩＶ）が得られる。尚、個々の反応工程は、例えば通常用いられるジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、ベンゼン、ジクロロメタン等の溶媒を用いて、公知の方法により行われる。
【０１２９】
更に、得られる蛍光性基カルボジイミド化合物を、ジメチルホルムアミド等の溶媒中でｐ−トルエンスルホン酸メチル（ＴｓＯＭｅ）、ヨウ化メチル、ジメチル硫酸等と反応させて、所望の４級アンモニウム塩とすることができる。
【０１３０】
アミノ基含有蛍光性化合物（ＶＩＩＩ）及びイソシアネート系化合物（ＩＸ）は、各々所望する蛍光性基含有カルボジイミド化合物の構造に応じて適宜選択することができる。例えば、アミノ基含有蛍光性化合物（ＶＩＩＩ）の具体例としては、１−アミノピレン、１−アミノペリレン等が挙げられる。また、イソシアネート系化合物（ＩＸ）の具体例としては、３，３−ジメチルアミノプロピルイソシアネート、３，３−ジエチルアミノプロピルイソシアネート、３−モルホリノプロピルイソシアネート、３，３−ジメチルアミノプロピルイソチオシアネート、３，３−ジエチルアミノプロピルイソチオシアネート、３−モルホリノプロピルイソチオシアネート等が挙げられる。
【０１３１】
アミノ基含有蛍光性化合物（ＶＩＩＩ）とイソシアネート系化合物（ＩＸ）とを反応させて得られる尿素系化合物（Ｘ）としては、Ｎ−ピレニル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノ）プロピル尿素、Ｎ−ペリレニル−Ｎ’−（３，３−ジメチルアミノ）プロピル尿素、Ｎ−ピレニル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノ）プロピルチオ尿素、Ｎ−ペリレニル−Ｎ’−（３，３−ジメチルアミノ）プロピルチオ尿素等が挙げられる。
【０１３２】
（ｉｉｉ）一般式（Ｖ）で表される化合物の製造方法
次に、一般式（Ｉ）で表される蛍光性基含有カルボジイミド化合物が、前記一般式（Ｖ）で表される化合物である場合の製造方法を以下に示す。
【０１３３】
蛍光性基含有カルボジイミド化合物（Ｖ）は、前記一般式（ＸＩ）で表されるアミノ基含有蛍光性化合物と、前記一般式（ＸＩＩ）で表されるイソシアネート系化合物とを反応させて前記一般式（ＸＩＩＩ）で表される尿素系化合物を合成する工程を含む方法により製造される。すなわち、前項（ｉｉ）におけるのと同様に、アミン誘導体をイソシアネート系化合物と反応させて尿素又はチオ尿素誘導体へと導き、更に脱水あるいは酸化的脱硫によりカルボジイミド基を形成させる。この反応を、以下の反応式に示す。
【０１３４】
【化５２】

【０１３５】
尿素誘導体（ｄ）の脱水反応によるカルボジイミド基含有化合物の合成は、前項（ｉｉ）におけるのと同様に、３級アミン中で該尿素誘導体をパラトルエンスルホン酸クロリド（ＴＳＣｌ）と共に加熱することで容易に達成できる。また、４級アンモニウム塩の存在下でパラトルエンスルホン酸クロリド及び炭酸カリウムを用いて行うこともできる。
【０１３６】
チオ尿素誘導体（ｇ）の脱硫についても、一般的に酸化水銀を脱硫剤として使用することにより行われる。この反応で好ましく用いられる溶媒としては、例えば、エーテル、ベンゼン、アセトンなどが挙げられる。脱硫剤としては、酸化水銀以外にも酸化鉛、酸化亜鉛、炭酸鉛、硝酸鉛、塩化鉛などを用いることもできる。さらにアルカリ性で次亜塩素酸ナトリウムを作用させることによって合成することもできる。例えば、チオ尿素誘導体を塩化メチレンなどのような溶媒中で次亜塩素酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化銅と共に０℃以下で一昼夜反応させる。その後一般的に用いられている方法で単離、精製することによりカルボジイミド化合物（Ｖ）が得られる。尚、個々の反応工程は、例えば通常用いられるジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトン、ベンゼン、ジクロロメタン等の溶媒を用いて、公知の方法により行われる。
【０１３７】
更に、得られる蛍光性基カルボジイミド化合物を、ジメチルホルムアミド等の溶媒中でｐ−トルエンスルホン酸メチル（ＴｓＯＭｅ）、ヨウ化メチル、ジメチル硫酸等と反応させて、所望の４級アンモニウム塩とすることができる。
【０１３８】
アミノ基含有蛍光性化合物（ＸＩ）及びイソシアネート系化合物（ＸＩＩ）は、各々所望する蛍光性基含有カルボジイミド化合物の構造に応じて適宜選択することができる。例えば、アミノ基含有蛍光性化合物（ＸＩ）の具体例としては、Ｎ−ピレニル−６−アミノカプリルアミド、Ｎ−ペリレニル−６−アミノカプリルアミド等が挙げられる。このようなアミノ基含有蛍光性化合物は、１−アミノピレン、１−アミノペリレン等の蛍光性化合物と６−アミノカプロン酸等のカルボキシル基含有化合物とを常法に従って反応させることにより得ることができる。
【０１３９】
イソシアネート系化合物（ＸＩＩ）の具体例としては、３，３−ジメチルアミノプロピルイソシアネート、３，３−ジエチルアミノプロピルイソシアネート、３−モルホリノプロピルイソシアネート、３，３−ジメチルアミノプロピルイソチオシアネート、３，３−ジエチルアミノプロピルイソチオシアネート、３−モルホリノプロピルイソチオシアネート等が挙げられる。
【０１４０】
以上述べた方法により得られる本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物は、核酸検出法やイムノアッセイ法において標識物質として好適に使用することができる。その場合は、標識しようとするＤＮＡ等の核酸又は抗原もしくは抗体等のタンパク質とともに、本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物を、溶媒中で混合させる等の方法で接触させることにより、前記核酸又はタンパク質に結合させることができる。すなわち、本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物を、核酸塩基と高い反応性を示すカルボジイミド基において核酸又はタンパク質と結合させることにより、高感度な検出試薬として働く蛍光性物質をこれらに付加し、標識とすることができるのである。よって、本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物と核酸又はタンパク質と結合させる場合には、カルボジイミド基が反応しやすい条件下、例えばｐＨ７．５〜８．５程度のアルカリ性の条件下で両者を接触させるのが好ましい。
【０１４１】
（３）本発明の核酸検出法
本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物は、標識物質で標識した核酸を用いるハイブリダイゼーションによる核酸の検出法において、標識物質として用いることができる。すなわち、蛍光性基含有カルボジイミド化合物で標識された核酸は、ハイブリダイゼーション用のプローブとして用いることができる。測定対象である核酸にプローブをハイブリダイズさせて、核酸−核酸ハイブリッドを形成させ、系から遊離のプローブを除去した後にハイブリッドに含まれる標識物質を検知することによって、測定対象の核酸を検出することができる。本発明においては、標識物質である蛍光性基含有カルボジイミド化合物は、蛍光分光光度計、９６穴マイクロタイタープレート用蛍光分光光度計、蛍光顕微鏡等を用いて蛍光強度等を測定することにより直接的に検知することができる。測定対象である核酸は、通常、ナイロンメンブレン、ニトロセルロース等の膜又はマイクロタイタープレート上に固定化されて用いられる。
【０１４２】
本発明の核酸の検出法におけるハイブリダイゼーションは、核酸プローブの標識に蛍光性基含有カルボジイミド化合物を用いる以外は、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション等の、通常の核酸のハイブリダイゼーションと特に変わるところはない。測定対象である核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、プローブに用いる核酸もまたＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【０１４３】
プローブに用いる核酸の標識は、上記の方法によってポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを標識することによって行うことが好ましいが、標識されたヌクレオチドをポリメラーゼ反応によってポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに取り込ませることによって行うこともできる。
【０１４４】
（４）本発明のイムノアッセイ法
本発明の前記蛍光性基含有カルボジイミド化合物は、標識物質で標識した抗原又は抗体を用いるイムノアッセイ法において、前記標識物質として用いることができる。
【０１４５】
測定対象が抗原であるときは、その抗原に特異的に結合する抗体を標識し、抗原−抗体複合体を形成させ、系から遊離の抗体を除去した後に複合体に含まれる標識物質を検知することによって、測定対象の抗原を検出することができる。本発明においては、標識物質である蛍光性基含有カルボジイミド化合物は、蛍光分光光度計、９６穴マイクロタイタープレート用蛍光分光光度計、蛍光顕微鏡等を用いて蛍光強度等を測定することにより直接的に検知することができる。また、抗原に特異的に結合する第１の抗体を固相化しておき、これに抗原を結合させ、抗原に特異的に結合する第２の抗体を標識したものを結合させてもよい。この場合、第１の抗体と第２の抗体は、同一のポリクローナル抗体を用いてもよく、異なるモノクローナル抗体を用いてもよい。さらに、一方をポリクローナル抗体とし、他方をモノクローナル抗体としてもよい。各々の方法において、標識した抗体の代わりに未標識の抗体を用い、これを抗原に結合させた後に、前記抗体に結合する二次抗体を標識したものをさらに結合させてもよい。二次抗体は、抗体の調製に用いた動物のイムノグロブリンで前記動物と異なる動物を免疫することによって得られる。
【０１４６】
測定対象が抗体であるときは、その抗体に特異的に結合する抗原を標識し、抗原−抗体複合体を形成させ、系から遊離の抗原を除去した後に複合体に含まれる標識物質を検知することによって、測定対象の抗体を検出することができる。また、測定対象である抗体に特異的に結合する抗体が得られる場合には、その抗体を標識したものを用い、抗体−抗体複合体を形成させてもよい。
【０１４７】
本発明のイムノアッセイ法は、抗原又は抗体の標識に蛍光性基含有カルボジイミド化合物を用いる以外は、通常のイムノアッセイ法と特に変わるところはなく、抗原又は抗体の固相化、抗原抗体反応、洗浄操作等は、通常行われているのと同様にして行えばよい。また、イムノアッセイ法の態様も、直接法、間接法、競合法等、いずれの態様も適用され得る。
【０１４８】
（５）本発明の化学発光分析法
本発明の化学発光分析法は、シュウ酸誘導体と過酸化物とを蛍光物質の存在下に反応させて生じる化学発光を用いる分析法である。具体的には、シュウ酸誘導体と過酸化物と蛍光物質との発光反応における発光強度を測定することにより過酸化物又は蛍光物質の定量等を行うことができ、本発明の前記蛍光性基含有カルボジイミド化合物、特に蛍光性基がクマリン誘導体、ピレン誘導体、ペリレン誘導体、ローダミン誘導体、ダンシル誘導体、オキサゾール誘導体、チアゾールオレンジ誘導体、シアニン化合物、ベンゾチアゾール誘導体、ベンゾオキサゾール誘導体、ベンゾオキサジアゾール誘導体、ジピロメテンボロンジフルオライド誘導体、及び蛍光希土類金属キレート化合物からなる群より選ばれるものである前記蛍光性基含有カルボジイミド化合物は、前記蛍光物質として用いることができる。
【０１４９】
化学発光を生じる機構としては、シュウ酸誘導体と過酸化物との反応により生じた過シュウ酸誘導体が転移により置換１，２−ジオキセタンとなり、これと酸化されやすい蛍光物質との間に電荷移動錯体が形成され、電子移動による励起が生じて蛍光物質が励起され、これが基底状態に戻るときに発光すると推定される。用いるシュウ酸誘導体としては、アリールオキザレート等のシュウ酸エステルが挙げられる。また、過酸化物としては、過酸化水素が好ましく用いられる。このような化学発光は過シュウ酸エステル化学発光とも称され、従来の化学発光と比べて発光効率が優れていることから各種の分析化学に応用されている。
【０１５０】
本発明の化学発光分析法は、発光効率が高く、且つ蛍光物質を励起させるための光源を必要としないことからノイズが少なく、従って微少な発光の検出が可能となり、優れた高感度性を有する。発光量は蛍光物質及び過酸化物の濃度にそれぞれ依存して増加するため、この性質を利用して蛍光物質又は過酸化物を定量することができる。例えば蛍光物質を適宜選択して、微量の過酸化物を定量することができる。過酸化水素を生成させるような酵素反応において、生じた過酸化水素を測定することで基質を定量することもできる。このような系を利用してグルコース、ラクトース、ＮＡＤＨ、尿酸、ホルムアルデヒド、コレステロール、α−アミノ酸、アセチルコリン等を定量することができる。
【０１５１】
また、アミノ酸等の分析対象物質に蛍光性基を導入し、これを本発明の化学発光分析法を用いて分析対象物質を高感度に検出することができる。例えば、大過剰のシュウ酸誘導体及び過酸化物を用いると、１分子の蛍光物質が励起発光を繰り返し次々と光を放出することができるため、従来の蛍光分析法よりも更に高感度な定量が可能となる。このような系を利用して、アミノ酸の他、アミン類、医薬品、ステロイド等の蛍光誘導体を定量することができる。
【０１５２】
また、本発明の化学発光分析法は、イムノアッセイ法と組み合わせて高感度で且つ特異性の高い分析を行うことができる。例えば、酵素標識抗原と標準抗原を競合的に抗体と結合させ、結合した酵素標識抗原を用いて基質との反応により生成する過酸化水素を化学発光反応により測定し、標準抗原の量に対応する化学発光量の関係（検量線）を作成し、これを用いて定量することができる。
【０１５３】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を説明する。
【０１５４】
【実施例１】
以下に示す方法で、本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物を合成した。尚、この反応を下記反応式（１）に示す。
【０１５５】
（１）チオ尿素化合物の合成
３−（ジメチルアミノプロピル）イソチオシアネート１．４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を、乾燥塩化メチレン１５ｍｌに溶解し、氷浴で冷却した。これにＮ−（３−アミノプロピル）モルホリン１．４ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物に水を加えた後、塩化メチレンで抽出し（５ｍｌ×３回）、無水炭酸カリウムで乾燥した後、濃縮してＮ−［３−（ジメチルアミノ）］プロピル−Ｎ’−（３−モルホリノ）プロピルチオ尿素（下記反応式（１）中の化合物(1)。以下同様。）２．７ｇを得た（収率９８％）。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ(CDCl₃)：δ＝1.70-1.80(m,4H)、2.24(s,6H)、2.40-2.50(m,8H)、3.30-3.70(m,4H)、3.73(t,4H)、6.6-9.5(m,2H)。
【０１５６】
（２）カルボジイミド基含有化合物の合成
Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）］プロピル−Ｎ’−（３−モルホリノ）プロピルチオ尿素（化合物(1)）２．７ｇ（１０ｍｍｏｌ）をアセトン３５ｍｌに溶解し、酸化水銀４．２ｇ（２０ｍｍｏｌ）を加えて、還流下、２時間撹拌した。放冷後、反応混合物をろ過した後、溶媒を留去して粗生成物を得た。減圧蒸留により、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）］プロピル−Ｎ’−（３−モルホリノ）プロピルカルボジイミド（下記反応式（１）中の化合物(2)）１．５ｇを得た（収率６０％）。このものの沸点（ｂ．ｐ．）は１２５〜１２８℃／０．２ｍｍＨｇであった。この化合物(2)のＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ(CDCl₃)：δ＝1.70-1.80(m,4H)、2.22(s,6H)、2.30-2.50(m,8H)、3.27(t,2H)、3.29(t,2H)、3.71(t,4H)。
【０１５７】
（３）蛍光性基含有カルボジイミド化合物の合成
Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）］プロピル−Ｎ’−（３−モルホリノ）プロピルカルボジイミド（化合物(2)）を無水ジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、これに４−ブロモ−メチル−７−メトキシクマリン（（株）同人化学製）１３５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一昼夜撹拌した。ジメチルホルムアミドを減圧留去し、得られた淡黄色粉末をメタノール３ｍｌに溶解した。これにジエチルエーテルを加えて再沈殿させ、蛍光性基含有カルボジイミド化合物（下記反応式（１）中の化合物(3)）２５０ｍｇを得た（収率９４％）。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝1.60-1.70(m,2H)、1.90-2.10(m,2H)、2.30-2.40(m,6H)、3.09(s,6H)、3.20-3.40(m,6H)、3.56(t,4H)、3.89(s,3H)、4.72(s,2H)、6.66(s,1H)、7.01(dd,1H)、7.10(d,1H)、8.13(d,1H)。
【０１５８】
（４）蛍光性基含有カルボジイミド化合物の４級塩の合成
蛍光性基含有カルボジイミド化合物（化合物(3)）１９０ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド５ｍｌに溶解した。これに、ｐ−トルエンスルホン酸メチル５６ｍｇ（Ｏ．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で一昼夜撹拌した。ジメチルホルムアミドを減圧留去し、得られた淡黄色粉末をメタノール３ｍｌに溶解した。これにジエチルエーテルを加えて再沈殿させ、蛍光性基含有カルボジイミド化合物の４級塩（下記反応式（１）中の化合物−１）２３０ｍｇ（収率９３％）を得た。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝1.80-2.10(m,4H)、2.29(s,3H)、3.08(s,6H)、3.14(s,3H)、3.30-3.60(m,14H)、3.89(s,3H)、4.72(s,2H)、6.65(s,1H)、6.98(dd,1H)、7.10-7.13(m,3H)、7.49(d,2H)、8.12(d,1H)。
【０１５９】
【化５３】

【０１６０】
【実施例２】
以下に示す方法で、本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物を合成した。尚、この反応を下記反応式（２）に示す。
【０１６１】
（１）蛍光性基含有チオ尿素化合物の合成
１−アミノピレン０．５ｇ（２．３ｍｍｏｌ）と３−（ジメチルアミノ）プロピル−イソチオシアネート１．７ｇ（１２ｍｍｏｌ）を１２０℃で３０分間撹拌した。放冷後、酢酸エチル２０ｍｌを加え、析出した結晶をろ取して蛍光性基含有チオ尿素化合物（下記反応式（２）中の化合物(1)）０．５ｇ（収率５４％）を得た。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝0.82(s,6H)、1.40-1.50(m,2H)、1.90-2.00(m,2H)、3.68-3.73(m,2H)、7.90-8.20(m,8H)、8.70(bs,1H)。
【０１６２】
（２）蛍光性基含有カルボジイミド化合物の合成
蛍光性基含有チオ尿素化合物（化合物(1)）０．２ｇ（０．５５ｍｍｏｌ）をアセトン２５ｍｌに溶解した。さらに酸化水銀０．２４ｇ（１．１ｍｍｏｌ）を加え、還流下、２時間撹拌した。放冷後、反応混合物をろ過して無機物を取り除いた。濾液に、さらに酸化水銀０．２４ｇ（１．１ｍｍｏｌ）を加え、１．５時間撹拌、還流した。放冷後、反応混合物をろ過した後、濾液を濃縮し、残った粘性液体に石油エーテルを加えて可溶物を分取した。石油エーテルを減圧留去し、蛍光性基含有カルボジイミド（下記反応式（２）中の化合物(2)）を得た。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝1.90-2.00(m,2H)、2.24(s,6H)、2.47(t,2H)、3.62(t,2H)、7.80-8.20(m,8H)、8.48(d,1H)。
【０１６３】
（３）蛍光性基含有カルボジイミド化合物の４級塩の合成
蛍光性基含有カルボジイミド化合物（化合物(2)）１００ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド２ｍｌに溶解した。これに、ｐ−トルエンスルホン酸メチル１００ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で一昼夜撹拌した。ジメチルホルムアミドを減圧留去し、得られた淡黄色粉末をメタノール２ｍｌに溶解した。これにジエチルエーテルを加えて再沈殿させ、蛍光性基含有カルボジイミド化合物の４級塩（下記反応式（２）中の化合物−２）１３０ｍｇ（収率８７％）を得た。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝2.10-2.20(m,2H)、2.28(s,3H)、3.13(s,9H)、3.40-3.50(m,2H)、3.78(t,2H)、7.11(d,2H)、7.50(d,2H)、8.00-8.40(m,9H)。
【０１６４】
【化５４】

【０１６５】
【実施例３】
以下に示す方法で、本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物を合成した。尚、この反応を下記反応式（３）に示す。
【０１６６】
（１）Ｎ−Ｆｍｏｃ−６−アミノカプロン酸の合成
６−アミノカプロン酸１．３１ｇ（１０ｍｍｏｌ）をアセトン５０ｍｌに溶解し、これに炭酸水素ナトリウム０．８４ｇ（１０ｍｍｏｌ）の溶解した水５０ｍｌを加えた。撹拌しつつ、この反応液に炭酸９−フルオレニルメチルスクシンイミジル（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）３．３７ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間反応させた。アセトンを減圧留去した後、この反応液に塩化メチレンを加え、抽出を行った。この操作を２階繰り返した後、有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去し、下記反応式（３）中の化合物(1)を２．９６ｇ得た（収率８４％）。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝1.20-1.75(m,6H)、2.40(t,2H)、3.10-3.25(m,2H)、4.20(t,1H)、4.45(d,2H)、7.25-7.50(m,4H)、7.70(d,2H)、7.90(d,2H)、8.05-8.40(m,9H)、10.30(s,1H)。
【０１６７】
（２）アミノ基含有蛍光性化合物の合成
得られた化合物(1)１．０６ｇ（３ｍｍｏｌ）に塩化チオニル１０ｍｌを加え溶解した後、還流下３０分間反応させた。室温まで放冷後、塩化チオニルを減圧留去した。残留分を塩化メチレン２０ｍｌに溶解し、エチルジイソプロピルアミン０．５２ｍｌ（３ｍｍｏｌ）を加えた。この反応液に無水塩化メチレン２０ｍｌに溶解した１−アミノピレン０．６５ｇ（３ｍｍｏｌ）を滴下しながら加えた。滴下終了後、撹拌を室温で１８時間続けた。反応液に水を加え、塩化メチレンで抽出を２回行った。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒留去し、反応混合物約２．５ｇを得た。この反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝５０／１）により精製し、下記反応式（３）中の化合物(2)を０．８９ｇ（収率５４％）得た。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝1.35-1.60(m,4H)、1.60-1.80(m,2H)、2.55(t,2H)、2.05(t,2H)、4.20-4.35(m,3H)、7.25-7.50(m,4H)、7.70(d,2H)、7.90(d,2H)、8.05-8.40(m,9H)、10.30(s,1H)。
【０１６８】
得られた化合物(2)０．６６ｇ（１．２ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン含有無水ジメチルホルムアミドに溶解し、室温で３０分間撹拌した。その後、溶媒を加熱しながら減圧留去した。残留物に塩化メチレンを加え、しばらく撹拌した。不溶分を濾別し、濃縮後同様の操作を２回繰り返して行い、アミノ基含有蛍光性化合物（下記反応式（３）中の化合物(3)）０．３８ｇ（収率９５％）を得た。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝1.35-1.50(bs,4H)、1.70(t,2H)、2.55(bs,4H)、8.05-8.40(m,9H)、10.30(s,1H)。
【０１６９】
（３）蛍光性基含有チオ尿素化合物の合成
得られた化合物(3)０．３３ｇ（１．０ｍｍｏｌ）を無水塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、３−（ジメチルアミノプロピル）イソチオシアネート０．１６ｇ（１．１ｍｍｏｌ）を加え、３時間室温で撹拌した。その後、反応液に水を加えて塩化メチレンで抽出を３回行った。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去し反応混合物約０．５ｇを得た。この反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝９／１〜１／１）により精製し、蛍光性基含有チオ尿素化合物（下記反応式（３）中の化合物(4)）０．３８ｇ（収率８０％）を得た。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝1.40-1.50(m,2H)、1.50-1.60(m,4H)、1.60-1.75(m,2H)、2.05(s,6H)、2.10(t,2H)、2.50(bs,2H)、7.50(bs,2H)、8.05-8.40(m,9H)、10.30(s,1H)。
【０１７０】
（４）蛍光性基含有カルボジイミド化合物の合成
得られた化合物(4)０．３５ｇ（０．８ｍｍｏｌ）をアセトン１０ｍｌに加熱しながら溶解し、酸化水銀０．３５ｇ（１．６ｍｍｏｌ）を加えた。還流下４時間反応させた後、氷冷し不溶分を濾別した。反応液を濃縮した後石油エーテルを加え、再び不溶分を濾別した。濾液を濃縮し、カルボジイミド化合物（下記反応式（３）中の化合物(5)）０．３２ｇ（収率９０％）を得た。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃-d₆）：δ＝1.40-1.80(m,8H)、2.20(s,6H)、2.25(t,2H)、2.45(t,2H)、3.10-3.30(m,4H)、7.75-8.10(m,9H)、8.50(s,1H)。
【０１７１】
得られた化合物(5)０．２５ｇ（０．５７ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド３ｍｌに溶解し、これにｐ−トルエンスルホン酸メチル０．１８ｍｌ（１．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた溶媒を残留分が乾固しない程度まで減圧留去した後、ジエチルエーテルを加えて、粘性の黄色固体（蛍光性基含有カルボジイミド化合物：下記反応式（３）中の化合物−３）０．３４ｇ（収率９６％）を得た。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝1.40-1.85(m,8H)、2.55(t,2H)、3.05(s,9H)、3.05-3.10(bs,2H)、3.25-3.40(m,4H)、7.10(d,2H)、7.50(d,2H)、8.00-8.40(m,9H)、10.30(s,1H)。
【０１７２】
【化５５】

【０１７３】
【実施例４】
以下に示す方法で、本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物を合成した。尚、この反応を下記反応式（４）に示す。
【０１７４】
（１）チオ尿素化合物の合成
３−（ジメチルアミノプロピル）イソチオシアネート１．４４ｇ（１０ｍｍｏｌ）に無水塩化メチレン１０ｍｌを加え、室温で撹拌しつつＮ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン１．２ｍｌ（１０ｍｍｏｌ）を加えた。このまま、室温で一晩撹拌した。反応液に水を加えた後、塩化メチレンで３回抽出を行った。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮して下記反応式（４）中の化合物(1)を２．０６ｇ（収率８４％）得た。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃-d₆）：δ＝1.75(t,4H)、2.25(s,12H)、2.30(t,4H)、3.20-3.80(bs,4H)、8.00-9.40(bs,2H)。
【０１７５】
（２）カルボジイミド基含有化合物の合成
得られた化合物(1)１．０ｇ（４ｍｍｏｌ）をアセトン１２ｍｌに溶解し、酸化水銀１．７３ｇ（８ｍｍｏｌ）を加えた。還流下３時間反応させた後、氷冷し不溶分を濾別した。反応液を濃縮した後石油エーテルを加え、再び不溶分を濾別した。濾液を濃縮し、カルボジイミド基含有化合物（下記反応式（４）中の化合物(2)）０．７５ｇ（収率８９％）を得た。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃-d₆）：δ＝1.65-1.80(m,4H)、2.25(s,12H)、2.35(t,4H)、3.25(t,4H)。
【０１７６】
（３）蛍光性基含有カルボジイミド化合物の合成
得られた化合物(2)０．２ｇ（１ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド５ｍｌに溶解し、これに４−ブロモ−メチル−７−メトキシクマリン０．５４ｇ（２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間撹拌した。ジメチルホルムアミドを減圧留去し、得られた黄色粉末を少量のメタノールに溶解した。これにジエチルエーテルを加えて再沈殿させ、蛍光性基含有カルボジイミド化合物（下記反応式（４）中の化合物−４）０．６９ｇ（収率９２％）を得た。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝2.00-2.10(m,4H)、3.10(s,12H)、3.35-3.40(t,4H)、3.55-3.70(m,4H)、3.90(s,6H)、4.80(s,4H)、6.70(s,2H)、7.00(dd,2H)、7.10(d,2H)、8.20(d,2H)。
【０１７７】
【化５６】

【０１７８】
【実施例５】
以下に示す方法で、本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物（チアゾールオレンジ基含有カルボジイミド化合物）を合成した。この反応を下記反応式（５）に示す。尚、反応式（５）中、Ｅｔはエチル基を表す。
【０１７９】
（１）反応式（５）中の化合物(1)の合成
２−メチルチアゾール３．０ｍｌ（２４ｍｍｏｌ）にｐ−トルエンスルホン酸メチル３．６ｍｌ（２４ｍｍｏｌ）を加え、１６０℃で１時間反応させた。室温まで冷却し、生成した結晶をクロロホルム−メタノール混合溶媒に溶解した。この溶液を大量のジエチルエーテル中に注ぎ、析出してきた結晶を濾別し、下記反応式（５）中の化合物(1)を７．８ｇ得た。得られた化合物(1)のＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝3.05(s,3H)、4.10(s,3H)、6.95(d,2H)、7.35(d,2H)、7.70(t,1H)、7.75(t,1H)、8.15(d,1H)、8.35(d,1H)。
【０１８０】
（２）反応式（５）中の化合物(2)の合成
４−クロロキノリン１．０ｇ（６．１ｍｍｏｌ）に１，３−ジイオドプロパン５ｍｌ（４３ｍｍｏｌ）を加え、１２０℃で１時間反応させた。室温まで冷却し、生成した結晶をクロロホルムを加えて粉状に砕き、減圧濾過した。さらにこの結晶を塩化エチレンで洗浄し、風乾して下記反応式（５）中の化合物(2)を２．４ｇ得た。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝2.40-2.60(m,2H)、3.40(t,2H)、5.05(t,2H)、8.15(t,1H)、8.35(t,1H)、8.45(d,1H)、8.60(d,1H)、8.90(d,1H)、9.15(d,1H)。
【０１８１】
（３）反応式（５）中の化合物(3)の合成
化合物(1)１．０ｇ（３．０ｍｍｏｌ）と化合物(2)１．３７ｇ（３．０ｍｍｏｌ）に塩化メチレン３０ｍｌを加え懸濁させたものに、トリエチルアミン０．４２ｍｌ（３．０ｍｍｏｌ）を加えた。１晩反応させた後、未溶解の結晶を濾別し、濾液に水を加えしばらく撹拌した。析出した結晶を濾別し、クロロホルム−メタノール混合溶媒に溶解した。この溶液を大量のジエチルエーテル中に注ぎ、析出してきた結晶を濾別し、下記反応式（５）中の化合物(3)を０．５ｇ得た。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝2.30-2.50(m,2H)、4.00(s,3H)、4.65(t,2H)、6.90(s,1H)、7.35(d,1H)、7.40(t,1H)、7.60(t,1H)、7.70-7.80(m,2H)、7.95-8.15(m,3H)、8.60(d,1H)、8.80(d,1H)。
【０１８２】
（４）チアゾールオレンジ基含有カルボジイミド化合物の合成
化合物(3)０．２０ｇ（０．３４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド７ｍｌに溶解した。これに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド０．２０ｇ（１．４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド３ｍｌに溶解したものを加え、１晩撹拌した。減圧下溶媒留去した後、再び少量のジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液を大量のジエチルエーテル中に注ぎ、析出してきた結晶を濾別し、目的物であるチアゾールオレンジ基含有カルボジイミド化合物（下記反応式（５）中の化合物−５）を０．２４ｇ得た。このもののＮＭＲスペクトルデータを以下に示す。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝1.05(t,3H)、1.80-1.95(m,2H)、2.15-2.30(m,2H)、3.00(s,6H)、3.15(q,2H)、3.45-3.60(m,2H)、3.90(s,3H)、4.45-4.60(m,2H)、6.80(s,1H)、7.15(d,1H)、7.30(t,1H)、7.45(t,1H)、7.45-7.70(m,2H)、7.80-7.95(m,2H)、8.05(d,1H)、8.55(d,1H)、8.70(d,1H)。
【０１８３】
【化５７】

【０１８４】
【実施例６】
以下に示す方法で、本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物（蛍光希土類金属キレート含有カルボジイミド化合物）を合成した。この反応を下記反応式（６）に示す。尚、反応式（６）中、Ｅｔはエチル基を表す。
【０１８５】
（１）５−ニトロ−１，１０−フェナントロリン（化合物(1)）の合成
１，１０−フェナントロリン−水和物３．１ｇ（１７ｍｍｏｌ）に濃硫酸０．８４ｍｌ、発煙硫酸３．６ｍｌを入れ加熱溶解した。溶液の温度を１７０℃にした後、濃硝酸８．２ｍｌを滴下し、そのまま、１７０℃で一晩撹拌した。得られた溶液を水酸化ナトリウム水溶液を用い、ｐＨ３にし、析出した沈澱をろ過して黄色の固体（化合物(1)）１．４９ｇ（４２％）を得た。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝7.75-7.85(m,2H)、8.43(d,1H)、8.68(s,1H)、9.02(d,1H)、9.30(d,1H)、9.35(d,1H)
【０１８６】
（２）５−アミノ−１，１０−フェナントロリン（化合物(2)）の合成
５−ニトロ−１，１０−フェナントロリン１．３７ｇ（５．８ｍｍｏｌ）を酢酸３．０ｍｌに溶解し、これに、塩化すず（II）・二水和物１．０８ｇ（４．８ｍｍｏｌ）を濃塩酸２．２ｍｌに溶解させた溶液を滴下した。その後、１００℃で２時間撹拌した。反応後をＮａＯＨ水溶液でアルカリ性にして、クロロホルムで抽出した。クロロホルムを減圧留去し、黄色固体を得た。これをテトラヒドロフラン−ヘキサンで再結晶し、化合物(2)を０．７５ｇ（６６％）得た。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝6.95(s,1H)、7.50(m,1H)、7.65(m,1H)、7.98(d,1H)、8.28(d,1H)、8.95(d,1H)、9.20(d,1H)
【０１８７】
（３）化合物(3)の合成
６−ブロモヘキサン酸０．５４ｇ（２．８ｍｍｏｌ）に塩化チオニル１３ｍｌを加え、室温で４時間撹拌した。塩化チオニルを減圧留去し、透明な液体を得た。これに塩化メチレン５ｍｌを加えた溶液を調製した。これをアルゴン雰囲気下、５−アミノ−１，１０−フェナントロリン０.３３ｇ（１．７ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン０．４５ｍｌ（３．３ｍｍｏｌ）の塩化メチレン２５ｍｌ溶液に加えた。室温で４時間撹拌した。反応液に蒸留水２０ｍｌを加えて抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。ろ過後、溶媒を減圧留去し、油状分を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロフィルム−メタノール系）で精製し、化合物(3)を０．５３ｇ（８４％）得た。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝1.36-1.44(m,2H)、1.63-1.70(m,2H)、1.73-1.80(m,2H)、2.43(t,2H)、3.33(t,2H)、7.28-7.32(m,1H)、7.37-7.42(m,1H)、7.70(s,1H)、7.84(d,1H)、8.31(d,1H)、8.87(s,1H)、9.44(s,1H)
【０１８８】
（４）化合物(4)の合成
乾燥エーテル１０ｍｌ中にナトリウムメトキシド２ｇ（３７ｍｍｏｌ）を加え、トリフルオロ酢酸エチル１．５ｇ（１０ｍｍｏｌ）を滴下する。これに２−アセチルチオフェン１.３ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加え、１２時間撹拌を行った。溶媒留去後、乾燥させ、１０％硫酸９．３ｍｌを加え撹拌し、目的物を沈澱させた。結晶をろ別し、エタノールから２回再結晶を行い、２−テノイルトリフルオロアセトンを無色の針状結晶として１．１ｇ（４９％）得た。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝6.45(s,2H)、7.20(t,1H)、7.75(d,1H)、7.83(d,1H)
【０１８９】
２−テノイルトリフルオロアセトン０．６７ｇ（３ｍｍｏｌ）と化合物(3)０．３７ｇ（１ｍｍｏｌ）に９５％エタノール２０ｍｌを加え、加熱溶解し、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液３ｍｌを加えて中和した。これを約６０℃に加熱しながらユウロピウム塩化物六水和物０．３７ｇ（１ｍｍｏｌ）の水溶液１０ｍｌを加えた。冷却後、精製した錯体を分別し、少量のエタノールを含む水で数回洗浄した。その後、これをエタノール−アセトン混合溶液に加熱溶解、ろ過後、溶媒を約１／５位まで濃縮した。これを一晩放置し、析出した結晶をろ別し、エタノール水溶液で洗浄、乾燥後、さらに五酸化二リンの入ったデシケーター中で一日放置し、化合物(4)を０．７６（６４％）得た。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝1.36-1.44(m,2H)、1.63-1.70(m,2H)、1.73-1.80(m,2H)、2.43(t,2H)、3.33(t,2H)、3.42(s,3H)、7.22(t,3H)、7.80(d,3H)、7.88(d,3H)、8.43-8.47(m,1H)、8.57-8.62(m,1H)、8.90(s,1H)、9.05(d,1H)、9.50(d,1H)、10.28(s,1H)、10.40(s,1H)
【０１９０】
（５）蛍光希土類金属キレート含有カルボジイミド化合物（化合物−６）の合成化合物(4)０．４８ｇ（０．４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解した。これに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド０．１０ｇ（０．７ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１ｍｌに溶解したものを加え、１晩撹拌した。減圧下溶媒留去した後、再び少量のジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液を大量のジエチルエーテル中に注ぎ、析出してきた結晶を櫨別し、目的物である蛍光希土類金属キレート含有カルボジイミド化合物（下記反応式（６）中の化合物−６）を０．４３ｇ（８０％）得た。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝1.10(t,3H)、1.36-1.44(m,2H)、1.63-1.70(m,2H)、1.73-1.80(m,2H)、1.90-2.00(m,2H)、2.43(t,2H)、3.20-3.60(m,17H)、7.22(t,3H)、7.80(d,3H)、7.88(d,3H)、8.43-8.47(m,1H)、8.57-8.62(m,1H)、8.90(s,1H)、9.05(d,1H)、9.50(d,1H)、10.28(s,1H)、10.40(s,1H)
【０１９１】
【化５８】

【０１９２】
【実施例７】
以下に示す方法で、本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物を合成した。なお、この反応を下記反応式（７）に示す。
【０１９３】
（１）化合物(1)の合成
ダンシルクロライド１．０ｇ（３．７ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、１−アミノヘキサノール０．４７ｇ（４０ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。この混合物にさらにエチルジイソプロピルアミン０．７０ｍｌ（４．０ｍｍｏｌ）を加えて室温で得２０分間撹拌を続けた。反応液に水を加えた後、有機層を採取し、炭酸カリウムで乾燥させた。濾過後、溶媒を減圧留去し、得られた反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物(1)を１．４０ｇ得た。このもののＮＭＲスペクトル分析結果は以下の通りである。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝1.05-1.25(m,4H)、1.25-1.45(m,4H)、2.30(s,1H)、2.80(s,6H)、2.80(t,2H)、3.30(t,2H)、5.40(t,1H)、7.10(d,1H)、7.55(dd,2H)、8.20(d,1H)、8.35(d,1H)、8.55(d,1H)
【０１９４】
（２）化合物(2)の合成
化合物(1)０．２２ｇ（０．６ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、メチルトリフェノキシフォスホニウムアイオダイド０．９ｇ（２．０ｍｍｏｌ）を加え、容器を遮光下終夜撹拌した。メタノール５ｍｌを加えて１０分間撹拌した後、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物(2)を０．１２ｇ得た。このもののＮＭＲスペクトル分析結果は以下の通りである。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝1.05-1.25(m,4H)、1.35(t,2H)、1.60(t,2H)、2.90(s,6H)、2.90(t,2H)、3.05(t,2H)、4.95(t,1H)、7.10(d,1H)、7.55(dd,2H)、8.25(d,1H)、8.35(d,1H)、8.55(d,1H)
【０１９５】
（３）化合物−７の合成
化合物(2)０．１１ｇ（０．２４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド５ｍｌに溶解し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド０．１０ｇ（０．６４ｍｍｏｌ）を加え、終夜撹拌した。溶媒を減圧留去し、残留物を少量の塩化メチレンに溶解し、これを大量のヘキサン中へ徐々に滴下した。生成した結晶を濾別後乾燥し、目的物である化合物−７を０．１１ｇ得た。このもののＮＭＲスペクトル分析結果は以下の通りである。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝1.10(t,3H)、1.10-1.55(m,6H)、1.70(t,2H)、1.95(t,2H)、2.85(s,6H)、3.10-3.60(m,16H)、6.40(t,1H)、7.20(d,1H)、7.55(dd,2H)、8.20(d,1H)、8.40(d,1H)、8.50(d,1H)
【０１９６】
【化５９】

【０１９７】
【実施例８】
以下に示す方法で、本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物を合成した。なお、この反応を下記反応式（８）に示す。
【０１９８】
（１）化合物(1)の合成
２−メルカプトオキサゾール５．０ｇ（３３ｍｍｏｌ）をメタノール５０ｍｌに溶解し、ヨウ化メチル１０ｍｌ、炭酸カリウム４．５６ｇ（３３ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間半撹拌を行った。反応液に塩化メチレン、水を加えた後、塩化メチレンで抽出を行った。有機層を炭酸カリウムで乾燥、濾過後、溶媒を減圧留去し、化合物(1)を５．２７ｇ得た。このもののＮＭＲスペクトル分析結果は以下の通りである。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝2.75(s,3H)、7.20(t,1H)、7.25(t,1H)、7.45(d,1H)、7.60(d,1H)
【０１９９】
（２）化合物(2)の合成
化合物(1)５．２７ｇ（３２ｍｍｏｌ）にｐ−トルエンスルホン酸メチル４．８ｍｌを加え、１５０℃に加熱し、撹拌を５時間行った。室温で放冷後、固化した反応物にメタノールを加えて細かく砕き固体を濾別した。得られた固体をメタノール−塩化メチレン混合溶媒に溶解し、ジエチルエーテルを加えて結晶化させた。得られた結晶を濾別、乾燥し、化合物(2)を６．０ｇ得た。このもののＮＭＲスペクトル分析結果は以下の通りである。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝2.25(s,3H)、3.05(s,3H)、3.95(s,3H)、7.10(d,2H)、7.45(d,2H)、7.60-7.75(m,2H)、8.00-8.10(m,2H)
【０２００】
（３）化合物(3)の合成
４−メチルキノリン１．０ｇ（７．０ｍｍｏｌ）に１，３−ジイオドプロパン５ｍｌを加え１２０℃で１時間撹拌した。室温まで放冷後、固体の生じた反応混合物に酢酸エチル２０ｍｌを加えてしばらく撹拌した後、上澄みを廃棄した。残留物にクロロホルムを加えてしばらく撹拌を行ったところ、一旦全て溶解した。さらに撹拌を続けたところ、１時間後には黄色結晶が生成した。これに酢酸エチルを加えしばらく撹拌した後、結晶を濾別、乾燥し、化合物(3)を２．７４ｇ得た。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝2.50(t,2H)、3.00(s,3H)、3.30(s,3H)、3.35(t,2H)、5.00(t,2H)、8.05(m,2H)、8.25(t,1H)、8.60(t,2H)、9.35(d,1H)
【０２０１】
（４）化合物(4)の合成
化合物(2)１．０ｇ（２．８ｍｍｏｌ）、化合物(3)１．３ｇ（３．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン８ｍｌに溶解し、これにトリエチルアミン０．４ｍｌ（２．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物にメタノールを加えてしばらく撹拌し、残った結晶を濾別し、化合物(4)をオレンジ色の結晶として０．９１ｇ得た。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝2.40(t,2H)、3.35(s,3H)、3.35(t,2H)、3.95(s,3H)、4.60(t,2H)、6.25(s,1H)、7.35-8.10(m,8H)、8.40(d,1H)、8.75(d,1H)
【０２０２】
（５）化合物−８の合成
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド０．１７ｇ（１．１ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド２０ｍｌ溶液に、化合物(4)０．５０ｇ（０．９ｍｍｏｌ）を加え、終夜撹拌した。減圧下溶媒を留去した後、再び少量のジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液を大量のジエチルエーテル中に注ぎ、析出した結晶を濾別し、目的物である化合物−８を０．３６ｇ得た。このもののＮＭＲスペクトル分析結果は以下の通りである。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝1.15(t,2H)、1.95(t,2H)、2.30(t,2H)、3.05(s,6H)、3.25(q,2H)、3.30-3.40(m,4H)、3.45-3.60(m,2H)、3.90(s,3H)、6.30(s,1H)、7.40-8.20(m,8H)、8.45(d,1H)、8.80(d,1H)
【０２０３】
【化６０】

【０２０４】
【実施例９】
以下に示す方法で、本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物を合成した。なお、この反応を下記反応式（９）に示す。
【０２０５】
（１）化合物(2)の合成
化合物(1)［４−（５，６−ジメトキシベンゾチアゾリル）安息香酸］０．２６ｇ（０．８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド２０ｍｌに溶解し、イソブチルクロロホルメート０．１２ｍｌ（０．９ｍｍｏｌ）、エチルジイソプロピルアミン０．１６ｍｌ（０９ｍｍｏｌ）を加え１時間室温で撹拌した。その後、６−アミノヘキサノール０．１０ｇ（０．９ｍｍｏｌ）を投入し、さらに１時間半撹拌を続けた。溶媒を減圧留去し、残留分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物(2)を０．１５ｇ得た。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝1.25-1.60(m,8H)、3.25-3.45(m,4H)、3.89(s,3H)、3.90(s,3H)、4.40(t,1H)、7.60(s,1H)、7.70(s,1H)、8.00(d,2H)、8.10(d,2H)、8.60(t,1H)
【０２０６】
（２）化合物(3)の合成
化合物(2)０．１２ｇ（０．３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド５ｍｌに溶解し、メチルトリフェノキシフォスホニウムアイオダイド０．２６ｇ（０．６ｍｍｏｌ）を加え、容器を遮光下終夜撹拌した。メタノール５ｍｌを加えて１０分間撹拌した後、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物(3)を０．１３ｇ得た。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝1.35-1.55(m,4H)、1.60-1.75(m,2H)、1.80-1.95(m,2H)、3.20(t,2H)、3.45(q,2H)、3.95(s,6H)、6.25(t,1H)、7.35(s,1H)、7.55(s,1H)、7.85(d,2H)、8.05(d,2H)
【０２０７】
（３）化合物−９の合成
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド０．０４ｇ（０．２５ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド３ｍｌ溶液に、化合物(3)０．１０ｇ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、終夜撹拌した。減圧下溶媒を留去した後、再び少量のジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液を大量のジエチルエーテル中に注ぎ、析出した結晶を濾別し、目的物である化合物−９を０．０５ｇ得た。このもののＮＭＲスペクトル分析結果は以下の通りである。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝1.20(t,3H)、1.30-2.00(m,10H)、3.25(q,2H)、3.30(s,26H)、3.40-3.60(m,8H)、3.92(s,3H)、3.95(s,3H)、7.20(s,1H)、7.45(s,1H)、7.55(t,1H)、8.05(dd,4H)
【０２０８】
【化６１】

【０２０９】
【実施例１０】
以下に示す方法で、本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物を合成した。なお、この反応を下記反応式（１０）に示す。
【０２１０】
（１）化合物(1)の合成
市販のＢＯＤＩＰＹ・ＦＬ・Ｃ₃−ＳＥ（フナコシ社）０．０５ｇ（０．１３ｍｍｏｌ）の塩化メチレン１ｍｌ溶液に６−アミノヘキサノール０．０２ｇ（０．１７ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。溶媒留去後、残った反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物(1)を０．０５ｇ得た。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝1.20-1.60(m,8H)、2.10(s,1H)、2.25(s,3H)、2.55(s,3H)、2.60(t,2H)、3.10-3.30(m,4H)、3.60(t,2H)、5.95(bs,1H)、6.10(s,1H)、6.30(d,1H)、6.90(d,1H)、7.10(s,1H)
【０２１１】
（２）化合物(2)の合成
化合物(1)０．０５ｇ（０．１３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド２ｍｌに溶解し、メチルトリフェノキシフォスホニウムアイオダイド０．１２ｇ（０．２８ｍｍｏｌ）を加え、容器を遮光下終夜撹拌した。メタノール１ｍｌを加えて１０分間撹拌した後、溶媒を減圧留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して化合物(2)を０．０５ｇ得た。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝1.20-1.50(m,6H)、1.70-1.80(m,2H)、2.25(s,3H)、2.55(s,3H)、2.60(t,3H)、3.10-3.30(m,6H)、5.75(bs,1H)、6.15(s,1H)、6.35(d,1H)、6.90(d,1H)、7.10(s,1H)
【０２１２】
（３）化合物−１０の合成
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド０．０４ｇ（０．２５ｍｍｏｌ）に化合物(2)０．０５ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド３ｍｌ溶液を加え、終夜撹拌した。減圧下溶媒を留去した後、再び少量のジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液を大量のジエチルエーテル中に注ぎ、析出した結晶を濾別し、目的物である化合物−１０を０．０４ｇ得た。このもののＮＭＲスペクトル分析結果は以下の通りである。
¹Ｈ−ＮＭＲ（CDCl₃）：δ＝1.20(t,3H)、1.20-1.50(m,6H)、1.70-1.80(m,2H)、1.80-2.05(m,4H)、2.25(s,3H)、2.55(s,3H)、2.65(t,3H)、3.10-3.30(m,10H)、3.40-3.60(m,6H)、6.10(s,1H)、6.35(d,1H)、6.60(t,1H)、6.90(d,1H)、7.20(s,1H)
【０２１３】
【化６２】

【０２１４】
【実施例１１】
以下に示す方法で、本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物を合成した。なお、この反応を下記反応式（１１）に示す。
【０２１５】
（１）化合物−１１の合成
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド０．１０ｇ（０．６ｍｍｏｌ）に、市販のＩＡＮＢＤｅｓｔｅｒ（フナコシ社）０．１７ｇ（０．４ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド５ｍｌ溶液を加え、遮光して終夜撹拌した。減圧下溶媒を留去した後、再び少量のジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液を大量のジエチルエーテル中に注ぎ、析出した結晶を濾別し、目的物である化合物−１１を０．０４ｇ得た。このもののＮＭＲスペクトル分析結果は以下の通りである。
¹Ｈ−ＮＭＲ（DMSO-d₆）：δ＝1.20(t,3H)、1.80-1.95(m,2H)、3.15(s,6H)、3.20-3.60(m,9H)、4.35(s,2H)、4.40-4.60(m,4H)、6.50(d,1H)、8.50(d,1H)
【０２１６】
【化６３】

【０２１７】
【実施例１２】
前記実施例１〜１１において合成された化合物−１〜化合物−１１を用いて、以下に示す方法により、ＤＮＡに蛍光性基を導入してＤＮＡを蛍光標識し、蛍光標識ＤＮＡ−１〜１１を得た。
【０２１８】
先ず、反応溶液［ファージＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８複製型：宝酒造株式会社）１μｇ；０．１Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）；０．１Ｍの蛍光性基含有カルボジイミド化合物（化合物−１〜化合物１１）］を８５℃で１分間インキュベートした。次に、未反応のカルボジイミド化合物を除去するために、試料の１／９倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５倍量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃で４５分間静置した。遠心機（国産社製、Ｈ−１５００ＦＲ）により、４℃、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心して上層を除去し、７０％エタノール５００μｌを加えて、更に４℃、１２０００ｒｐｍで１分３０秒間遠心した。上層を除去した後、１００μｌの滅菌水に沈殿を溶解し、−２０℃で保存した。このようにして蛍光標識ＤＮＡ−１〜１１を得た。
【０２１９】
【実施例１３】
実施例１２で得られた蛍光標識ＤＮＡ−１〜１１を用いて、以下に述べるようにしてマイクロタイタープレートによりハイブリダイゼーションを行った。
【０２２０】
（１）核酸のプレート上への固定
制限酵素（HindIII）で直鎖化したファージＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８複製型）を用いて、２Ｍ ＮａＣｌ中で４８０ｎｇ〜４．８ｐｇ／１００μｌの１０倍希釈系列を作成し、１００℃で１０分間熱処理し、氷上で５分間急冷させて熱変性核酸を得た。発光発色用黒色マイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）の各ウェルに、得られた各濃度の熱変性核酸を加え、プレートシールをして３７℃で１２時間固定化した。
【０２２１】
（２）プレハイブリダイゼーション
前記（１）で熱変性核酸を固定化したプレートを、蒸留水で洗浄後、プレハイブリダイゼーション溶液１００μｌを各ウェルに加え、プレートシールをし、６０℃で１．５時間インキュベートした。尚、用いたプレハイブリダイゼーション溶液の組成は、［５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）、５×デンハーツ（Denhardt's）溶液（０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡ）、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、５０％ホルムアミド、０．５ｍｇ／ｍｌ酵母トランスファーＲＮＡ］である。
【０２２２】
（３）ハイブリダイゼーション
プレート中のプレハイブリダイゼーション溶液を捨て、ハイブリダイゼーション溶液を各ウェルに１００μｌ加え、４２℃で１２時間インキュベートした。用いたハイブリダイゼーション溶液の組成は、［５×ＳＳＣ、１×デンハーツ溶液、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、４５％ホルムアミド、０．２ｍｇ／ｍｌ 酵母トランスファーＲＮＡ、２μｇ／ｍｌ蛍光標識ＤＮＡ］である。尚、蛍光標識ＤＮＡは、実施例１２において、化合物−１〜化合物−１１を用いてＭ１３一本鎖ＤＮＡに蛍光性基を各々導入して得られたもので、あらかじめ７５℃で１０分間熱処理し、氷上で５分間急冷したものを用いた。
【０２２３】
（４）未反応の蛍光標識ＤＮＡの除去
プレート上に固定した熱変性核酸とハイブリッドを形成しなかった蛍光標識ＤＮＡを、以下の方法で除去した。
各ウェルのハイブリダイゼーション溶液を除去した後、２×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１５０μｌ加え、室温で５分間プレートミキサーで振盪させた。同操作を更に２回行った。ウェル中の溶液を捨て、２×ＳＳＣを３００μｌ加え、室温で５分間放置した。
【０２２４】
（５）ハイブリッド核酸の検出
各ウェルに５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１．５Ｍ・ＮａＣｌを１００μｌ入れ、蛍光プレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｉｔｅ１０００：ダイナテック社製）を用いてそれぞれ蛍光強度を測定し、検出に必要な各化合物の量（ｎｇ／ウェル）を求めた。
フィルターにはそれぞれの蛍光物質の励起波長、及び蛍光波長に適したものを使用した。下記表１に結果を示す。
【表１】

【０２２５】
【実施例１４】
本発明の蛍光標識ＤＮＡを用いたマイクロタイタープレートによるハイブリダイゼーションの別の例を以下に述べる。
【０２２６】
（１）核酸のプレート上への固定
制限酵素（HindIII）で直鎖化したファージＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８複製型）を用いて、２Ｍ・ＮａＣｌ中で４８０ｎｇ〜４．８ｐｇ／１００μｌの１０倍希釈系列を作成し、１００℃で１０分間熱処理し、氷上で５分間急冷させて熱変性核酸を得た。発光発色黒色マイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）の各ウェルに、得られた各濃度の熱変性核酸を加え、プレートシールをして３７℃で１２時間固定化した。
【０２２７】
（２）プレハイブリダイゼーション
前記（１）で熱変性核酸を固定化したプレートを、蒸留水で洗浄後、プレハイブリダイゼーション溶液１００μｌを各ウェルに加え、プレートシールをし、６０℃で１．５時間インキュベートした。尚、用いたプレハイブリダイゼーション溶液の組成は、［５×ＳＳＣ、５×デンハーツ溶液、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、５０％ホルムアミド、０．５ｍｇ／ｍｌ 酵母トランスファーＲＮＡ］である。
【０２２８】
（３）ハイブリダイゼーション
プレート中のプレハイブリダイゼーション溶液を捨て、ハイブリダイゼーション溶液を各ウェルに１００μｌ加え、４２℃で１２時間インキュベートした。用いたハイブリダイゼーション溶液の組成は、［５×ＳＳＣ、１×デンハーツ溶液、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、４５％ホルムアミド、０．２ｍｇ／ｍｌ 酵母トランスファーＲＮＡ、２μｇ／ｍｌ蛍光標識ＤＮＡ］である。
【０２２９】
尚、ここで用いた蛍光標識ＤＮＡは、蛍光性基含有カルボジイミド化合物を下記式で表される蛍光性基含有カルボジイミド化合物に変えた他は実施例１２と同様の方法でＭ１３一本鎖ＤＮＡに蛍光性基を導入して得られたものである。この蛍光性基含有カルボジイミド化合物は、実施例２において蛍光性基含有チオ尿素を変えた他は同様の方法で合成して得られたものである。
【０２３０】
【化６４】

【０２３１】
また、この蛍光標識ＤＮＡは、あらかじめ７５℃で１０分間熱処理し、氷上で５分間急冷したものを用いた。
【０２３２】
（４）未反応の蛍光標識ＤＮＡの除去
プレート上に固定した熱変性核酸とハイブリッドを形成しなかった蛍光標識ＤＮＡを、以下の方法で除去した。
【０２３３】
各ウェルのハイブリダイゼーション溶液を除去した後、２×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１５０μｌ加え、室温で５分間プレートミキサーで振盪させた。同操作を更に２回行った。ウェル中の溶液を捨て、２×ＳＳＣを３００μｌ加え、室温で５分間放置した。
【０２３４】
（５）ハイブリッド核酸の検出
各ウェルに５０ｍＭのイミダゾール硝酸緩衝液（ｐＨ７．６）、及び０．５ｍＭのＴＰＰＯアセトニトリル１００μｌを入れ、発光プレートリーダー（ＬＵＣＹ１：アロカ（Aloka）社製）中で２５ｍＭの過酸化水素水２５μｌを注入し、発光強度を測定した。４．８ｐｇ／ウェルまで測定可能であった。
また、蛍光標識ＤＮＡとして、実施例１２と同様の方法で化合物−７を標識したＭ１３一本鎖ＤＮＡを用い、実施例１４と同様の方法で核酸検出を行ったところ、４８０ｐｇ／ウェルまで測定可能であった。
【０２３５】
【実施例１５】
本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物（前記実施例２において合成された化合物−２）を標識物質として、以下に示す方法で、メンブレンを用いた抗原抗体反応を用いてタンパク質の検出を行った。
【０２３６】
（１）タンパク質への蛍光標識
タンパク質を蛍光標識するために、反応溶液［抗ウサギＩｇＧ抗体（ヤギ）（Anti-RABBIT-IgG(goat)、VECTER LABORATORIES社製）１００μｇ；０．１Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）；０．１Ｍの蛍光性基含有カルボジイミド化合物（実施例２で得られた化合物−２）］を氷上で１０分間静置した。全量の０．３％になるように１０％ＳＤＳを加え、マイクロ遠心チューブ（商品名ウルトラフリーＣ３ＬＧＣ；ミリポア(MILLIPORE)社製）を用いて、５０００ｒｐｍで１５分間遠心し、未反応のカルボジイミド化合物を取り除いた。さらに、フィルターカップに１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）及び５０ｍＭのＮａＣｌを各々５０μｌ加え、５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。同様の操作を再度行い、残渣をエッペンドルフチューブに移し、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）と５０ｍＭのＮａＣｌで０．１Ｍの溶液に調整した後、４℃で保存した。
【０２３７】
（２）ＩｇＧのメンブレン上への固定
ウサギＩｇＧ（RABBIT-IgG）を用いて、バッファーＡ溶液中で１００ｎｇ〜１ｐｇ／μｌの１０倍希釈系列を作成した。得られた各濃度のＩｇＧ溶液をミリポア社製ＰＶＤＦ（polyvinylidene fluoride）メンブレン上に各１μｌをドットブロットし、３７℃で１０分間乾燥してメンブレン上にＩｇＧを固定した。次に、ＩｇＧを固定したメンブレンをバッファーＢ溶液に浸漬し、３０分間静置してブロッキングを行った。
【０２３８】
尚、バッファーＡ溶液の組成は、［０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００］である。また、バッファーＢ溶液は、３％ＢＳＡを含むバッファーＡ溶液である。
【０２３９】
（３）抗原抗体反応
メンブレンをバッファーＢ溶液から取り出し、反応溶液に浸して室温で３０分間シェーカーでゆっくり振盪した。用いた反応溶液の組成は、［バッファーＡ溶液：１０ｍｌ、４μｇ／μｌ蛍光標識抗ウサギＩｇＧ抗体：１０μｌ］であった。尚、蛍光標識抗ウサギＩｇＧ抗体は、上記（１）項に示した方法で得られたものである。
【０２４０】
（４）未反応の蛍光標識抗ウサギＩｇＧ抗体の除去
固定した抗体と反応しなかった蛍光標識抗ウサギ抗体を、次の方法で除去した。すなわち、反応させたメンブレンをバッファーＡ溶液に浸し５分間室温で振盪する洗浄操作を３回行った。
【０２４１】
（５）蛍光によるウサギＩｇＧの検出
バッファーＡ溶液で湿らせたメンブレンをＵＶボックスに入れ紫外光（２５４ｎｍ）を照射したところ、１ｐｇのウサギＩｇＧが検出された。
【０２４２】
【発明の効果】
本発明の蛍光性基含有カルボジイミド化合物を用いれば、簡便な操作で高感度な核酸検出及びイムノアッセイ法を行うことができる。

Claims (11)

1. 下記一般式（Ｉ）で表される蛍光基含有カルボジイミド化合物。
   

   

   ［式（Ｉ）中、
   Ｆは、下記式（Ｆ）で示される蛍光基群から選ばれる蛍光基を表す。
   

   

   （式（Ｆ）中、Ｍ＝Ｅｕ³⁺、Ｓｍ³⁺、又はＴｂ³⁺を表す。）
   Ａは−ＣＨ₂−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−（Ｒはアルキル基）、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨＳＯ₂−、及び−ＳＯ₂ＮＨ−からなる群から選ばれる基を表す。
   ｎは０又は１を表す。
   Ｙ¹、Ｙ²及びＹ³は、各々下記式（Ｌ）で示される基を表す。
   

   

   （式（Ｌ）中、
   Ｌは直接結合又は−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、−Ｎ⁺ＲＲ’−（Ｒ’はアルキル基）、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群から選ばれる基を表す。
   ｐ及びｑは各々０又は１〜１２の整数を表す。）
   Ｂは（イ）窒素原子が水素原子、飽和もしくは不飽和炭化水素基、アリール基、アラルキル基、又は蛍光基Ｆを含む有機基で４級化されている含窒素複素環式基、（ロ）窒素原子が水素原子、飽和もしくは不飽和炭化水素基、アリール基、アラルキル基、又は蛍光基Ｆを含む有機基で４級化されているアミノ基、（ハ）下記式で表される複素環式４級アンモニウム基を表す。
   

   

   （式中、
   Ｒ^３及びＲ^４は各々水素原子、直鎖状もしくは分岐鎖状のＣ_１〜Ｃ_１０の脂肪族炭化水素基、又は置換基を有していてもよいアリール基もしくはアラルキル基を表す。
   Ｑはアニオンを表す。
   Ｒ^５は酸素原子、イオウ原子又はメチレン基を表す。
   ｍは０又は１である。）
   Ｗは、直接結合又は４級アンモニウム基を表す。］
2. 下記一般式（ＩＩ）で表される化合物である、請求項１記載の蛍光基含有カルボジイミド化合物。
   

   

   ［式（ＩＩ）中、
   Ｒ¹及びＲ²は、各々炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐状の飽和もしくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基もしくはアラルキル基、又はＲ¹とＲ²とが相互に結合して形成する含窒素複素環式基を表す。
   Ｘ^-はハロゲンイオン又はスルホン酸イオンを表す。
   Ｂ、Ｙ¹、Ｙ²、Ｙ³、Ａ及びＦは各々前記一般式（Ｉ）におけるのと同義である。］
3. 前記一般式（ＩＩ）で表される化合物が、下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物である、請求項２記載の蛍光基含有カルボジイミド化合物。
   

   

   ［式（ＩＩＩ）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｘ^-、Ｙ¹、Ｙ²、Ａ及びＦは各々前記式（ＩＩ）におけるのと同義である。］
4. 下記一般式（ＩＶ）で表される化合物である、請求項１記載の蛍光基含有カルボジイミド化合物。
   

   

   ［式（ＩＶ）中、Ｂ、Ｙ ³ 及びＦは前記一般式（Ｉ）におけるのと同義である。］
5. 下記一般式（Ｖ）で表される化合物である、請求項１記載の蛍光基含有カルボジイミド化合物。
   

   

   ［式（Ｖ）中、
   Ｂ、Ｙ²、Ｙ³、Ａ及びＦは各々前記式（Ｉ）におけるのと同義である。］
6. 下記一般式（ＶＩ）で表されるカルボジイミド基含有化合物と、下記一般式（ＶＩＩ）で表される蛍光基含有化合物とを反応させる工程を含む、請求項２記載の蛍光基含有カルボジイミド化合物の製造方法。
   

   

   ［式（ＶＩ）中、Ｗ’は置換されていてもよいアミノ基を表す。Ｂ、Ｙ³、及びＹ²は前記一般式（Ｉ）におけるのと同義である。］
   

   

   ［式（ＶＩＩ）中、Ｆ、Ａ、及びＹ¹は前記一般式（Ｉ）におけるのと同義であり、Ｘはハロゲン原子又はスルホン酸基を表す。］
7. 下記一般式（ＶＩＩＩ）で表されるアミノ基含有蛍光化合物と、下記一般式（ＩＸ）で表されるイソシアネート系化合物とを反応させて下記一般式（Ｘ）で表される尿素系化合物を合成する工程を含む、請求項４記載の蛍光基含有カルボジイミド化合物の製造方法。
   

   

   ［式（ＶＩＩＩ）中、Ｆは前記一般式（ＩＶ）におけるのと同義である。］
   

   

   ［式（ＩＸ）中、Ｚは酸素原子又はイオウ原子を表す。Ｂ及びＹ³は前記一般式（ＩＶ）におけるのと同義である。］
   

   

   ［式（Ｘ）中、Ｂ、Ｆ、Ｚ及びＹ³は前記式（ＶＩＩＩ）及び（ＩＸ）におけるのと同義である。］
8. 下記一般式（ＸＩ）で表されるアミノ基含有蛍光化合物と、下記一般式（ＸＩＩ）で表されるイソシアネート系化合物とを反応させて下記一般式（ＸＩＩＩ）で表される尿素系化合物を合成する工程を含む、請求項５記載の蛍光基含有カルボジイミド化合物の製造方法。
   

   

   ［式（ＸＩ）中、Ｆ、Ａ及びＹ²は前記一般式（Ｖ）におけるのと同義である。］
   

   

   ［式（ＸＩＩ）中、Ｚは酸素原子又はイオウ原子を表す。Ｂ及びＹ³は前記一般式（Ｖ）におけるのと同義である。］
   

   

   ［式（ＸＩＩＩ）中、Ａ、Ｂ、Ｆ、Ｚ、Ｙ²及びＹ³は前記式（ＸＩ）及び（ＸＩＩ）におけるのと同義である。］
9. 標識物質で標識した核酸を用いるハイブリダイゼーションによる核酸の検出法において、前記標識物質として、請求項１〜５のいずれかに記載の蛍光基含有カルボジイミド化合物を用いることを特徴とする方法。
10. 標識物質で標識した抗原又は抗体を用いるイムノアッセイ法において、前記標識物質として、請求項１〜５のいずれかに記載の蛍光基含有カルボジイミド化合物を用いることを特徴とする方法。
11. シュウ酸誘導体と過酸化物とを蛍光物質の存在下に反応させて生じる化学発光を用いる過シュウ酸エステル化学発光分析法において、前記蛍光物質として、請求
    項１〜５のいずれかに記載の蛍光基含有カルボジイミド化合物を用いることを特徴とする方法。