CN105738327B - 基于小分子荧光探针的新型荧光偏振传感器构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于小分子荧光探针的新型荧光偏振传感器构建及其应用，具体涉及式I的化合物及其制备方法、含有所述化合物的检测组合物和检测试剂盒。本发明还涉及使用式I的化合物检测生物体系中CD44蛋白含量的方法。

Description

基于小分子荧光探针的新型荧光偏振传感器构建及其应用

技术领域

本发明属于蛋白质生物检测技术领域，具体涉及生物体系中的CD44蛋白含量测定和肿瘤细胞定量检测技术，是一种可用于活细胞中CD44蛋白荧光成像和肿瘤细胞的高灵敏度荧光偏振测定探针。

背景技术

CD44蛋白是一种分布极为广泛的多分子形式的细胞表面跨膜糖蛋白，属于粘附分子家族，具有一系列生理学功能，包括：(1)作为导向性受体，调节淋巴细胞在血液和淋巴液间的运行，即淋巴细胞归巢或再循环；(2)在淋巴细胞自溶、离体淋巴细胞的活化中发挥作用；(3)促进成纤维细胞和淋巴细胞与胞外基质成分如透明质酸、硫酸软骨素、纤维素、糖原等的粘附；(4)参与信号传递蛋白可影响蛋白在细胞间的位置，刺激其分泌特异的生长因子具有不同的传导作用；(5)结合并中和透明质酸，该作用类似于清除间质组织；(6)调节药物的吸收及细胞对药物的敏感性。选择性剪切过程中的多样性CD44蛋白与细胞结合的多种性也表明其中有着重要的协同或调节功能。有研究认为，跨膜的CD44糖蛋白，其膜外成分的变异与细胞粘附及导向作用有关，而胞内的分子尾部则与活化T淋巴细胞的潜在作用有关，而且胞内分子长度可调节蛋白激酶A/C的位置，影响细胞的信号传递。

在癌症方面，一些研究表明，CD44蛋白具有促进侵袭性肿瘤细胞存活的能力，CD44蛋白的过量表达与癌性血管形成和肿瘤的恶化与扩散具有一定的相关性。肿瘤细胞在淋巴结中通过位于其细胞膜上的CD44蛋白的各种拼接变异体而适应淋巴结中的周围环境，使其在增殖过程中及再循环入血后能避开免疫系统的识别及攻击，此外CD44蛋白还可能参与了肿瘤细胞自血管内向周围组织间的外渗及增殖，从而构成肿瘤细胞的侵袭性和易转移性。Lu等发现在宫颈腺癌，无论是原位癌还是浸润癌均有CD44S(标准CD44)弥漫表达，且浸润癌比原位癌明显高表达CD44S。在癌症诊断方面，常规的物理诊断和组织病理学检查通常只能发现中晚期病例，难以达到早期发现的目的。如果利用基于与细胞肿瘤发生、发展有关的标志物的生物化学方法就可以从分子水平对癌变细胞进行识别，从而为癌症的快速、灵敏的早期诊断提供有力支持。

综合上述因素，发展一种特异性好、灵敏度高的检测CD44蛋白含量以及能较好用于CD44蛋白成像的方法将有利于实现医学工作者探究CD44蛋白分子表达与肿瘤的发生、生长和发展的相关性研究，也有利于关于癌症早期诊断工作的推动。

当前，已尝试将染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂(Lowry)法及紫外吸收法等应用于蛋白质的检测。但是这些方法对某一特定蛋白(例如：CD44蛋白)均无选择性。唯一有效的特异性定量检测CD44蛋白的方法是酶联免疫法(ELISA)，该方法利用抗原-抗体特异性识别作用对靶标蛋白进行检测，但是由于其的缺点是反应过程易受环境因素影响，稳定性和重复性较差，且抗原、抗体较为昂贵。基于荧光探针分子的荧光传感技术由于其高选择性、高时空分辨率和灵敏度以及可视性检测等优点，在生理学、分子生物学、环境检测和临床诊断领域广泛应用。然而，目前发展出的荧光分子很多是基于荧光强度变化进行的检测。而基于强度变化的测试过程中极容易受到一些环境因素的干扰，例如：pH变化，荧光自淬灭和生物背景自吸收和自发荧光等。这些因素使得基于荧光强度变化的检测在定量检测方面存在较大的不足。因此，设计出具备自校准功能的荧光传感器将极大提高对于靶标分子检测的精确度和可靠性。

荧光偏振检测技术是一种带有自校准功能的荧光传感技术。将光偏振技术和荧光分子相结合形成的荧光偏振技术在生物医学诊断中显示出了较好的应用价值。相对于传统研究方法，荧光偏振技术可在溶液中最大程度的模拟真实生命环境进行测试；可以实时跟踪监测分子间结合/分离的变化。

发明内容

本发明基于一种化合物1，8-萘二甲酰亚胺作为荧光团设计、合成一种新型的荧光偏振生物传感器，以实现对恶性肿瘤细胞(如Hela细胞)的灵敏、特异性定量检测。该生物传感器具有较长的荧光寿命，这使得其相比于具有较短荧光寿命的比如花菁染料探针在荧光偏振检测中有更快的时间响应。其自校准功能使得检测在复杂溶液、高度模拟生物环境下进行成为可能，背景信噪比高。识别基团透明质酸生物相容性高、水溶性良好。因此，以1，8-萘二甲酰亚胺修饰的透明质酸高分子衍生物，可作为一种基于小分子荧光探针的新型CD44蛋白荧光偏振传感器得到应用。

本发明第一方面提供下式I所示的化合物：

式I中，

R为C₁-C₆烷基；

m为1-10的整数；并且

n为1或大于1的整数。

在一个具体实施例中，n为1-100000的整数。

在一个具体实施例中，n小于25的整数(HA寡聚糖)。

在一个具体实施例中，n为25-2480的整数(低分子量的HA)。

在一个具体实施例中，n为大于2480的整数(高分子量的HA)。

在一个具体实施方式中，所述式I化合物为：

本发明第二方面提供下式II所示的化合物：

式II中，

L₁和L₂独立地是-(CH₂)_n-O-(CH₂)_m-，其中n和m独立地是1-6的整数。

在一个具体实施方式中，所述式II化合物为：

本发明第三方面提供式I化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)在反应溶剂中，使下式III与下式IV反应，获得下式V的化合物：

(2)在反应溶剂中，使式V与下式VI反应，获得下式VII的化合物：

(3)在反应溶剂中，使式VII与透明质酸(HA)反应，获得式I的化合物：

其中，上述式IV和式V中，R为C₁-C₆烷基；

上述式VI和式VII中，m为1-10的整数；

n为1或大于1的整数。

在一个具体实施例中，n为1-100000的整数。

在一个具体实施例中，n小于25的整数(HA寡聚糖)。

在一个具体实施例中，n为25-2480的整数(低分子量的HA)。

本发明第四方面提供本发明式I化合物作为荧光偏振探针在的灵敏、特异性定量检测恶性肿瘤细胞(如Hela细胞)和表达CD44蛋白的生物活细胞内CD44蛋白的荧光成像测试。

在具体实施方式中，恶性肿瘤细胞(如Hela细胞)的检测首先确定测试体系中Hela细胞的浓度为10⁵细胞mL^-1，改变探针的浓度，选取合适的探针浓度再进行下面的选择性和竞争性、pH、紫外-小分子修饰率和反应动力学测试。同样的实验方案每组至少进行三次，所得到数据Origin软件进行处理。荧光偏振测试采用荧光光谱仪中的Eclipse ADL模块进行。利用测得荧光偏振光差值的对数对Hela细胞浓度的对数作图得到的曲线即可以实现定量检测Hela细胞。生物活细胞内成像测试以三种不同CD44蛋白表达水平的贴壁细胞：Hela细胞、ROS1728细胞和MCF-7细胞为考察对象，所用仪器为奥林巴斯(Olympus)的荧光倒置显微镜和莱卡(Leica)激光共聚焦显微镜优化荧光成像的合适条件和相关参数(包括激发波长、时间和光强)。实现荧光偏振探针BIO对活细胞内CD44蛋白荧光成像。

在一个具体实施例中，本发明检测组合物的pH值在3-11的范围内。

此外，如前文所述，CD44蛋白是一种分布极为广泛的多分子形式的细胞表面跨膜糖蛋白，属于粘附分子家族，具有一系列生理学功能。因此，本发明也包括本发明化合物在检测CD44蛋白水平以研究、检测其一系列生理学功能中的应用。

本发明的荧光偏振探针与现有技术相比，其有益效果是：

(1)稳定性好，能够长期保存使用，对检测生物体系环境要求低；

(2)具有较高的CD44蛋白检测灵敏度；

(3)有很好的选择性；

(4)与CD44蛋白反应前后荧光偏振响应迅速，适合于生物体系内高CD44蛋白的即时测定；

(5)细胞毒性小，可用于活细胞内CD44蛋白原位荧光检测；

(6)背景荧光弱，信噪比高；

(7)操作简便，检测时不需要将未反应的游离探针分子除去，可在溶液中最大程度的模拟真实生命环境进行测试。

本发明的荧光偏振探针为CD44蛋白的定量检测、相关的化学反应的实时监测和机理研究以及CD44蛋白分子表达与肿瘤的发生、生长和发展的相关性研究提供了一种高效、准确的研究方法。

附图说明

图1：荧光偏振探针BIO选择性，上图是荧光偏振探针BIO(浓度为14.56μg mL^-1)的荧光偏振响应图，A为荧光偏振探针BIO的空白对照组的荧光偏振值，B为荧光偏振探针BIO的实验组的荧光偏振值；下图是对照探针CBIO(浓度为3μM)的荧光偏振响应图，A为对照探针CBIO的空白对照组的荧光偏振值，B为对照探针CBIO的实验组的荧光偏振值。Hela细胞的浓度为10⁵细胞mL^-1，PBS缓冲液pH为7.4。

图2：pH对荧光偏振探针BIO荧光强度的影响。左：是pH值的范围是3～11时PBS缓冲液中荧光偏振探针BIO在460～650nm波长范围的荧光光谱图，右：是不同pH值对λ_em＝546nm处的荧光强度影响，λ_ex＝450nm。

图3：荧光偏振探针BIO的时间响应曲线。

图4：荧光偏振探针BIO的细胞毒性测试。

图5：荧光偏振探针BIO定量检测Hela细胞的偏振光差值的对数-细胞浓度的对数(双对数)曲线，插图：是荧光偏振探针BIO对细胞浓度范围为0-1×10⁶细胞mL^-1的Hela细胞的荧光偏振响应图。荧光偏振探针BIO的浓度是14.56μg mL^-1。

图6：探针对于细胞成像照片和荧光强度三维表面分析图。从上到下依次为：荧光偏振探针BIO对于Hela细胞、ROS1728细胞、MCF-7细胞以及对照探针CBIO对于Hela细胞中CD44蛋白的荧光成像照片。

图7：荧光偏振探针BIO与商业探针Red DND-99的溶酶体共定位荧光成像照片(左)和荧光强度线性分析图(右)。

以下流程显示了制备本发明两个具体化合物的具体实施例：

应理解，上述制备方案虽然只提供化合物BIO和CBIO的制备，但本领域技术人员可通过改变反应物的基团而制备得到本发明的式II以及式I化合物。

下面通过实施例具体地说明本发明。实施例中所使用的所有化学试剂和溶剂都购自商业途径，并不需要进一步纯化即可使用。在硅胶板上进行薄层层析(TLC)。使用200～300目的硅胶(Hailang，青岛)进行柱层析。用以ppm表示化学位移的Bruker AV-400光谱仪(在氘氯仿中，用Me4Si作为内标)上记录¹H和¹³C NMR。

实施例1：荧光偏振探针BIO的合成路线

(1)N-丁基-4-溴-1，8-萘二甲酰亚胺(BIO1)的制备

BIO1的合成是在文献(Lou，Z.R.；Li，P.；Pan，Q.；Han，K.L.Chem Commun 2013，49，2445)的基础上改进进行的。具体操作为：称取7～9g的4-溴-1，8-萘二甲酸酐溶解于100～200mL的无水乙醇(EtOH)中，在氮气保护条件下加入70～80mL的正丁胺，然后将上述反应混合液升温至80℃，回流，搅拌4h，薄层色谱法(TLC)跟踪反应，反应结束后混合液冷却至室温，抽滤，用乙醇洗三次后取滤液，溶剂用旋转蒸发仪蒸干，柱层析硅胶分离，二氯甲烷∶甲醇＝50∶1作为展开剂，得到淡黄色固体产物BIO1。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ8.83(d，J＝8.7Hz，1H)，8.74(d，J＝7.3Hz，1H)，8.69(d，J＝8.0Hz，1H)，8.41(d，J＝8.0Hz，1H)，7.99(t，J＝8.0Hz，1H)，7.28(s)，4.23-4.17(m，2H)，1.79-1.69(m，2H)，1.52-1.42(m，2H)，1.00(t，J＝7.4Hz，3H)；¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δ163.28(s)，162.45(s)，149.53(s)，132.38(s)，129.91(s)，129.74(s)，129.23(s)，129.07(s)，127.04(s)，123.88(s)，123.66(s)，123.06(s)，77.35(s)，77.03(s)，76.71(s)，40.65(s)，30.09(s)，20.33(s)，13.79(s)。

(2)N-丁基-4-(6-氨基己基)氨基-1，8-萘二甲酰亚胺(BIO2)的制备

称取1～2g的BIO1溶解于50～100mL的乙二醇单甲醚(EGME)中，再加入2～4mL的1，6-己二胺，反应烧瓶外用铝箔纸包覆，然后将上述反应混合液升温至120℃，回流，继续搅拌12h，TLC跟踪反应(二氯甲烷∶甲醇＝5∶1作为展开剂，R_f＝0.3)，直至反应物BIO1反应完全。将反应混合液冷却至室温，用旋转蒸发仪蒸干溶剂，得到粗产物，再用柱层析硅胶进行分离，二氯甲烷∶甲醇＝5∶1作为展开剂，得到橘黄色固体产物BIO2。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ8.55(d，J＝7.3Hz，1H)，8.43(d，J＝8.4Hz，1H)，8.13(d，J＝8.4Hz，1H)，7.65-7.53(m，1H)，6.69(d，J＝8.5Hz，1H)，5.49(t，J＝4.9Hz，1H)，4.91(d，J＝1.3Hz，2H)，4.22-4.10(m，2H)，3.39(dd，J＝12.4，7.0Hz，2H)，2.72(t，J＝6.8Hz，2H)，1.89-1.74(m，2H)，1.70(dd，J＝12.3，4.8Hz，2H)，1.51(d，J＝6.5Hz，2H)，1.45-1.37(m，4H)，1.30(dd，J＝24.0，8.4Hz，2H)，0.96(t，J＝7.3Hz，3H)；¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δ164.74(s)，164.21(s)，149.54(s)，134.47(s)，131.07(s)，129.81(s)，125.97(s)，124.61(s)，123.12(s)，120.20(s)，110.13(s)，104.27(s)，77.38(s)，77.06(s)，76.74(s)，63.64(s)，43.61(s)，41.85(s)，39.99(s)，33.18(s)，30.33(s)，28.87(s)，26.98(s)，20.44(s)，13.90(s).IR(KBr，cm-1)：3382，2932，2859，1679，1639，1614，1580，1550，1466，1430，1397，1382，1360，1301，1245，1107，1078，775，759；HRMS(ES⁺)：计算值C₂₂H₃₀N₃O₂[M+H]⁺368.2338，实际值368.2338。

(3)荧光偏振探针(BIO)的制备

BIO的合成是参照文献(Byeon，H.J.；Choi，S.H.；Choi，J.S.；Kim，I.；Shin，B.S.；Lee，E.S.；Park，E.S.；Lee，K.C.；Youn，Y.S.Acta Biomater 2014，10，142)进行的。具体操作为：称取40～60mg的BIO2溶解于5～10mL的二甲基亚砜(DMSO)中作为试剂1。在另一个圆底烧瓶中，在冰浴的条件下将70～80mg的透明质酸溶于30～50mL的PBS缓冲液(pH＝7.4)中，搅拌至透明质酸完全溶解呈无色凝胶状，再加入100～120mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和30～40mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，用盐酸(HCl)调pH至6.8，继续活化30min，随后在混合液中加入试剂1，撤去冰浴，升至室温搅拌过夜。反应结束后，将混合液在水中透析直至透析液为无色，最后低温干燥，得到橘黄色固体目标产物BIO。

IR(KBr，cm^-1)：3389，2923，1640，1575，1545，1401，1384，1316，1154，1078，1039，947，772。

(4)N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]-4-溴-1，8-萘二甲酰亚胺(CBIO1)的制备

将1～2g的4-溴-1，8-萘二甲酸酐溶解于30～50mL的无水乙醇中，再加入0.4～0.6mL的2-(2-氨基乙氧基)乙醇，升温至80℃，回流，混合液在氮气保护下继续搅拌1h。TLC跟踪反应，反应结束后冷却至室温，淡黄色晶体析出，抽滤，用乙醇洗三次后，取滤饼得到淡黄色固体目标产物。

(5)2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)-6-((2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基)-1，8-萘二甲酰亚胺(CBIO)的制备

将400～600mg的CBIO1和0.1～0.2mL的2-(2-氨基乙氧基)乙醇溶解于10～15mL的乙二醇单甲醚中，混合液升温至120℃，回流，在氮气保护下继续搅拌过夜。TLC跟踪反应(二氯甲烷∶石油醚(沸程为∶60～90℃)＝2∶1作为展开剂，R_f＝0.3)。反应结束后，溶剂用旋转蒸发仪蒸干，用柱层析硅胶进行分离，二氯甲烷∶甲醇＝2∶1作为展开剂，得到黄色固体产物CBIO。

¹H NMR(CD₃SOCD₃，400MHz)δ8.65(d，J＝8.3Hz，1H)，8.40(d，J＝7.2Hz，1H)，8.23(d，J＝8.6Hz，1H)，7.72(t，J＝5.1Hz，1H)，7.69-7.61(m，1H)，6.80(d，J＝8.7Hz，1H)，4.20(t，J＝6.6Hz，2H)，3.73(t，J＝5.7Hz，2H)，3.62(t，J＝6.6Hz，2H)，3.56(dd，J＝11.2，5.8Hz，2H)，3.51(dt，J＝7.6，3.4Hz，4H)，3.33(ddd，J＝17.3，10.8，5.7Hz，4H)；¹³C NMR(CD₃SOCD₃，100MHz)δ164.48(s)，163.58(s)，151.33(s)，134.89(s)，131.38(s)，130.09(s)，129.25(s)，124.96(s)，122.46(s)，120.77(s)，108.39(s)，104.64(s)，73.00(s)，72.78(s)，68.80(s)，67.81(s)，60.92(d，J＝5.3Hz)，43.55(s)，39.06(s)；HRMS(ES⁺)：计算值C₂₀H₂₄N₂O₆Na[M+Na]⁺411.1532，实际值411.1530。

实施2：荧光偏振探针BIO选择性

Hela细胞以含有10％胎牛血清的DMEM培养基，5％CO2，37℃条件下进行培养。将荧光偏振探针BIO和对照探针CBIO分别溶于水和DMSO中，配成1.2mg mL^-1探针母液和10^-3M的对照探针母液。向比色皿中加入探针母液和2mL的PBS缓冲液(pH＝7.4)，使探针的终浓度为14.56μg mL^-1作为探针的空白对照组，利用荧光光谱仪的荧光偏振模块测定荧光偏振光值(Ex.Slit Width＝10nm，Em.Slit Width＝10nm，Slow)，发射波长范围为540～560nm，激发波长为450nm。探针空白对照组测定结束后，取出比色皿，加入Hela细胞，使体系中细胞浓度为10⁵细胞mL^-1作为探针实验组，测定荧光偏振光值。重新在新的比色皿中配制含3μM的对照探针CBIO的2mL的PBS缓冲液检测体系，作为对照探针的空白对照组，测定荧光偏振光值，之后加入同样浓度的Hela细胞，作为对照探针的实验组，测定荧光偏振光值。处理数据后结果如图1所示。

从图1可以看出，对照探针CBIO不具有CD44受体，在测试体系中以游离状态存在，无荧光偏振响应，而荧光偏振探针BIO有较高荧光偏振响应，选择性良好，因此，该探针可以用于CD44的检测和成像。

实施例3：pH值对荧光偏振探针BIO荧光强度的影响

在PBS缓冲液(pH＝7.4)中进行pH滴定。在PBS缓冲液体系中，加入1.2mg mL^-1的探针水溶液母液得到14.56μg mL^-1的探针缓冲溶液，利用盐酸和氢氧化钠水溶液调节获得不同pH下的探针水溶液，分别测定响应的荧光光谱。可得到荧光偏振探针BIO在460～650nm波长范围的荧光光谱图以及λ_em＝546nm处的pH滴定曲线图，λ_ex＝450nm。从而确定测试体系的最适pH条件。

结果如图2所示。在3～11的pH范围内探针BIO的荧光强度无明显变化。因此，探针BIO荧光信号在较宽的pH范围内受pH影响小，选用pH为7.4的PBS缓冲液作为测试介质。

实施例4：荧光偏振探针BIO的时间响应曲线

将荧光偏振探针BIO溶于水中，配成探针母液。向比色皿中加入探针母液和2mL的PBS缓冲液(pH＝7.4)，使探针的终浓度为14.56μg mL^-1，再加入Hela细胞，使体系中Hela细胞浓度为10⁵细胞mL^-1，立刻测定荧光偏振光值(Ex.Slit Width＝10nm，Em.Slit Width＝10nm，Slow)，发射波长范围为540～560nm，激发波长为450nm。每隔一段时间测定一次荧光偏振光值，60min后结束测试，结果如图3所示。

从图3可看出探针BIO与细胞作用时间为20min时基本反应完全，到30min时，荧光偏振光值达到稳定。荧光偏振光信号响应快速且明显，说明探针BIO适合用于肿瘤细胞的快速检测。

实施例5：荧光偏振探针BIO的细胞毒性测试

采用MTT法测试荧光偏振探针BIO的细胞毒性，配制1mg/mL MTT溶液，收集对数期Hela细胞，细胞计数后铺板，96孔板每孔加入含8000个细胞的100μL完全培养基(10％胎牛血清和90％DMEM培养基)，5％CO2，37℃孵育12h，至细胞单层贴壁，加入浓度梯度的荧光偏振探针BIO，孵育12h，去掉上清液，每孔加入100μL的MTT溶液，孵育4h，弃去上清液，每孔加入100μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，用酶标仪测吸光度，得到第一组数据(12h)；将细胞与不同浓度梯度荧光偏振探针BIO共同孵育时间改为24h，重复其它操作，得到第二组数据(24h)。以上每组测试均作三组平行实验。Origin软件处理两组数据得到图4。

从图4可以得出，当荧光偏振探针BIO的浓度达到150μg mL^-1，且共同孵育时间为24h时，细胞存活率仍然在94％以上，说明该探针生物相容性高，利于探针在后续生物样品测试中的应用。

实施例6：荧光偏振探针BIO对Hela细胞(CD44高表达)的定量检测

Hela细胞以含有10％胎牛血清的DMEM培养基，5％CO₂，37℃条件下进行培养。将荧光偏振探针BIO溶于水中，配成探针母液。向比色皿中加入探针母液和2mL的PBS缓冲液(pH＝7.4)，使探针的终浓度为14.56μg mL^-1作为探针的空白对照组，利用荧光光谱仪的荧光偏振模块测定荧光偏振光值(Ex.Slit Width＝10nm，Em.Slit Width＝10nm，Slow)，发射波长范围为540～560nm，激发波长为450nm。配制含有不同Hela细胞浓度梯度、14.56μg mL^-1的探针BIO和2mL PBS缓冲液的实验组，分别测定荧光偏振光值。每组测试均作三组平行实验。对偏振光差值和细胞浓度均取对数后利用Origin软件作图，结果如图5所示。

从图5可以看出，荧光偏振光差值的对数与细胞浓度的对数呈线性关系，探针BIO对Hela细胞的检测限(LOD)为84细胞mL^-1，线性范围是：2.5×10²～10⁶细胞mL^-1，线性相关系数的平方为0.9918。表明该探针的灵敏度较高，可用于Hela细胞的定量分析。

实施例7：荧光偏振探针BIO和对照探针CBIO对于细胞中CD44蛋白的荧光成像

Hela细胞、ROS1728细胞和MCF-7细胞均以含有10％胎牛血清的DMEM培养基，5％CO₂，37℃条件下进行培养。实验一共分为4组，分别为探针BIO与Hela细胞实验组(第1组)、探针BIO与ROS1728细胞实验组(第2组)、探针BIO与MCF-7细胞实验组(第3组)以及对照探针CBIO与Hela细胞实验组(第4组)。将荧光偏振探针BIO和对照探针CBIO分别溶于水和DMSO中，配成探针母液和对照探针母液。将探针母液分别加入已单层贴壁的含Hela细胞、ROS1728细胞和MCF-7细胞的共聚焦培养皿中，作为第1组、第2组和第3组，探针终浓度均为14.56μg mL^-1；对照探针母液加入含Hela细胞的共聚焦培养皿中，作为第4组，对照探针终浓度为3μM。4组细胞分别在5％CO₂，37℃条件下孵育30min，置于激光共聚焦显微镜下观测。得到荧光成像照片经过Image-Pro Plus软件处理可得荧光强度三维表面分析图，细胞中CD44蛋白的荧光成像的结果如图6所示。

由图6可观察出，Hela细胞、ROS1728细胞和MCF-7细胞的细胞成像照片具有不同的荧光强度和分布，说明三种细胞具有不同水平的CD44蛋白表达。而对照探针CBIO与Hela细胞孵育组无荧光表达，即对照探针CBIO与Hela细胞孵育后无法结合，无特异性。从而证明，探针BIO作为检测CD44蛋白的荧光偏振探针可以应用于活细胞，即时反应活细胞中CD44蛋白的浓度变化情况，所得结果可靠。

实施例8：荧光偏振探针BIO与商业探针Red DND-99的溶酶体共定位荧光成像

Hela细胞以含有10％胎牛血清的DMEM培养基进行培养。将荧光偏振探针BIO和商业探针Red DND-99分别溶于水和DMSO中，配成探针母液和商业探针母液。将探针母液加入含已单层贴壁的Hela细胞的共聚焦培养皿中，终浓度均为14.56μg mL^-1，5％CO₂，37℃孵育30min后加入商业探针母液，终浓度为50nM，同样37℃孵育30min，去掉上清液，用培养基清洗三次，置于激光共聚焦显微镜下观测。得到荧光成像照片利用Image-Pro Plus软件进行荧光强度线性分析，结果如图7所示。

观察图7可得，探针BIO荧光通道和商业溶酶体探针荧光通道的叠加图上溶酶体区域的皮尔森相关系数为0.815，说明探针BIO到达细胞后一部分停留在细胞膜上，另一部分通过细胞的内吞作用进入细胞基质被运输到溶酶体上。该探针对于探究生物膜运转物质的作用方式和机制有一定的参考价值。

虽然已以具体实施例的方式描述了本发明，但应理解的是，本发明并不限于上述具体实施方式。在不偏离本发明精神和范围的情况下对本发明作出的任何改动都落入本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.下式I所示的化合物：

其中，

R为C₁-C₆烷基；

m为1-10的整数；并且

n为1-100000的整数。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R为正丁基；m为6。

3.一种制备式I的化合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)在反应溶剂中，使下式III与下式IV反应，获得下式V的化合物：

(2)在反应溶剂中，使式V与下式VI反应，获得下式VII的化合物：

(3)在反应溶剂中，使式VII与透明质酸反应，获得式I的化合物：

其中，上述式IV和式V中，R为C₁-C₆烷基；

上述式VI和式VII中，m为1-10的整数；并且n为1-100000的整数。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，R为正丁基，m为6。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)的反应在无水乙醇的存在下在80℃的温度下进行；步骤(2)的反应在乙二醇单甲醚的存在下在120℃的温度下进行；步骤(3)的反应在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的存在下在pH＝5.5下进行。

6.权利要求1或2所述的化合物作为荧光偏振探针在制备用于检测生物体系中CD44蛋白含量的检测组合物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生物体系是恶性肿瘤细胞或表达CD44蛋白的生物活细胞。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤细胞是Hela细胞。

9.一种检测组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1或2所述的化合物。

10.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述的化合物或权利要求9所述的检测组合物。