CN110878085A - 一种快速高选择性次溴酸荧光探针、制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速高选择性次溴酸荧光探针、制备方法与应用，具体地，本发明的探针是一类1‑(2‑氨乙基)哌啶类化合物的荧光探针，可作为次溴酸盐荧光探针，用于测量、检测或筛选次溴酸盐及活细胞荧光成像。这类探针可实现如下技术效果中的至少一个：高选择性识别次溴酸盐、可以快速对次溴酸盐实现响应、可以实现对次溴酸盐的超灵敏分析、可生理水平条件下检测次溴酸盐、具有较强的抗干扰能力、合成简单以及性质稳定。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种1-(2-氨乙基)哌啶类化合物的荧光探针及其在测量、检测或筛选次溴酸及活细胞荧光成像方法中的应用；本发明还提供了制备所述荧光探针的方法。
背景技术
次溴酸(HBrO)是生物宿主防御系统中不可或缺的一部分，具有与次氯酸非常相似的化学和物理特性。内源性次溴酸是由H2O2与Br－在嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)催化下反应形成的。在体内，次溴酸是一种具有有效抗菌活性的强氧化剂，然而，过量产生的次溴酸会损伤生物体并导致组织损伤，而且可导致许多疾病，如关节炎、心血管疾病、癌症和哮喘等。哮喘患者血清中EPO与临床严重程度的相关性提供了主要证据，表明哮喘患者血清中EPO水平比健康人增加300％。另外，由于Br－的低血浆水平，比Cl－低至少1000倍，极大地限制了HOBr检测方法的建立。因此，鉴于HBrO在这些疾病中的潜在作用，探讨HBrO在生物组织中的生理功能具有重要意义。
由于其高灵敏度和显著的时空分辨率，荧光探针作为一种非侵入性工具应用于生物成像中分析物测定。到目前为止，用于检测生物体中次溴酸的荧光探针相对缺乏，而且由于次溴酸在生理条件下氧化反应时间短、浓度低，探索一种新型高效荧光探针快速检测次溴酸仍然是一个热点问题。此外，用于检测次溴酸的选择性好、灵敏度高的荧光探针还相对较少。因此，发展高选择性、超灵敏、快速检测次溴酸荧光探针成为本领域技术人员亟待解决的课题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是在于提供一类快速超灵敏高选择性次溴酸荧光探针，以及它们的制备方法和用途，具有合成简单、选择性好、灵敏度高的特点，并且能够在生理水平条件下对次溴酸进行有效测量、检测或筛选。
具体而言，本发明提供了一种化合物，具有式(Ⅰ)所示的结构：
式(I)中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10可以相同或不同。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的化合物是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10均为氢原子的式(I)化合物，其结构式如下：
本发明还提供了式(Ⅰ)化合物的制备方法，包括如下步骤：使式(III)化合物与(Ⅳ)化合物反应制备得式(I)化合物，其反应式如下：
式(Ⅰ)、(Ⅲ)和(Ⅳ)中：R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10为氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10可以相同或不同。
在本发明的一些具体实施方案中，将式(Ⅲ)和(Ⅳ)化合物溶于乙二醇甲醚中，然后加入N,N-二异丙基乙胺，加热回流反应，待反应完毕后，旋蒸干有机溶剂得到粗产品，柱色谱分离提纯，得到纯品。
在本发明的一些具体实施方案中，所述式(III)化合物与式(Ⅳ)化合物的摩尔比为1:1-1:5。
在本发明的一些具体实施方案中，所述回流反应时间为10-48小时。
在本发明的一些具体实施方案中，所述洗脱剂中，二氯甲烷和甲醇的的体积比为100:1。
在本发明的一些具体实施方案中，将N-丁基-4-氯-1,8-萘酰亚胺与1-(2-氨乙基)哌啶类化合物溶于乙二醇甲醚中，然后加入N,N-二异丙基乙胺，加热回流反应，待反应完毕后，旋蒸干有机溶剂得到粗产品，柱色谱分离提纯，得到纯品。
本发明还提供了用于测量、检测或筛选次溴酸的荧光探针组合物，其包含本发明的所述式(I)化合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述式(I)化合物具有以下结构：
在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
本发明还提供了检测样品中次溴酸的存在或测定样品中的次溴酸含量的方法，其包括：
a)使所述式(I)或式(Ⅱ)化合物与样品接触以形成荧光化合物；
b)测定所述荧光化合物的荧光性质。
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是化学样品或生物样品。
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是包括水、血液、微生物或者动物细胞或组织在内的生物样品。
本发明还提供了检测样品中次溴酸的存在或测定样品中的次溴酸含量的试剂盒，其包含所述式(I)或式(II)化合物。
本发明还提供了所述式(I)或式(II)化合物在细胞荧光成像中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
(1)选择性高，抗干扰能力强
本发明的次溴酸荧光探针可选择性的与次溴酸发生特异性反应，生成荧光变化的产物，相较于常见的其他金属离子及生命体内的其他物质，包括但不限于钾离子、钙离子、钠离子、镁离子、铜离子、锌离子、二价铁、三价铁、硝酸根、亚硝酸根、一氧化氮、过氧化亚硝酸盐、硫化钠、同型半胱氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、过氧化氢、羟基自由基、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁醇自由基、超氧化钾、单线态氧、溴离子、次氯酸等，本发明荧光探针显示出了较高的选择性，并且抗干扰能力强。
(2)灵敏度高
本发明的次溴酸荧光探针与次溴酸反应非常灵敏，从而有利于对次溴酸的检测。
(3)可生理水平条件下应用
本发明的次溴酸荧光探针可在生理水平条件下应用，并且，生物体内常见的金属离子和其他物质对其干扰较小，可以应用于活细胞荧光成像。
(4)稳定性好
本发明的次溴酸荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。
(5)合成简单
本发明的次溴酸荧光探针合成简单，有利于商业化的推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是探针(5μM)加入次溴酸(20μM)后，荧光光谱随时间的变化情况。
图2是探针(5μM)加入次溴酸(0-30μM)前后的荧光光谱；
图3是探针(5μM)定量分析不同浓度次溴酸(0-20μM)的工作曲线。
图4是人体内常见的物质对探针(5μM)的荧光强度的影响。其中编号1-26分别为空白、钾离子、钙离子、钠离子、镁离子、铜离子、锌离子、二价铁、三价铁、硝酸根、亚硝酸根、一氧化氮、过氧化亚硝酸盐、硫化钠、同型半胱氨酸(500μM)、半胱氨酸(500μM)、谷胱甘肽(5mM)、过氧化氢、羟基自由基、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁醇自由基、超氧化钾、单线态氧、溴离子、次氯酸(20μM)和次溴酸(20μM)(除特殊标明外，其他分析物浓度均为100μM)。柱状图代表的是不同分析物存在下探针在505nm处的荧光强度值；
图5是探针(10μM)被成功应用于生物细胞中的次溴酸的检测。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应该用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1：式(II)化合物的合成
合成设计路线如下：
实施方案1：将431.5mg(1.5mmol)N-丁基-4-氯-1,8-萘酰亚胺溶于8mL乙二醇甲醚中，再加入301.5mg(1.5mmol)1-(2-氨乙基)哌啶二盐酸盐，然后加入N,N-二异丙基乙胺回流10h，然后利用旋转蒸发仪进行旋蒸，得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以进行色谱柱分离得到纯品，得到纯净产品284mg，产率为50％。
实施方案2：将431.5mg(1.5mmol)N-丁基-4-氯-1,8-萘酰亚胺溶于8mL乙二醇甲醚中，再加入603mg(3mmol)1-(2-氨乙基)哌啶二盐酸盐，然后回流10h，然后利用旋转蒸发仪进行旋蒸，得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以进行色谱柱分离得到纯品，得到纯净产品370mg，产率为65％。
实施方案3：将431.5mg(1.5mmol)N-丁基-4-氯-1,8-萘酰亚胺溶于8mL乙二醇甲醚中，再加入904.5mg(4.5mmol)1-(2-氨乙基)哌啶二盐酸盐，然后回流10h，然后利用旋转蒸发仪进行旋蒸，得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以进行色谱柱分离得到纯品，得到纯净产品398mg，产率为70％。
实施方案4：将431.5mg(1.5mmol)N-丁基-4-氯-1,8-萘酰亚胺溶于8mL乙二醇甲醚中，再加入904.5mg(4.5mmol)1-(2-氨乙基)哌啶二盐酸盐，然后回流15h，然后利用旋转蒸发仪进行旋蒸，得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以进行色谱柱分离得到纯品，得到纯净产品426mg，产率为75％。
实施方案5：将431.5mg(1.5mmol)N-丁基-4-氯-1,8-萘酰亚胺溶于8mL乙二醇甲醚中，再加入904.5mg(4.5mmol)1-(2-氨乙基)哌啶二盐酸盐，然后回流24h，然后利用旋转蒸发仪进行旋蒸，得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以进行色谱柱分离得到纯品，得到纯净产品460mg，产率为81％。
实施例2：测试荧光探针的时间动力学
首先，从探针母液(1mM)中取出50μL置于10mL的测试体系，然后将20μM的次溴酸加入到测试体系中，摇晃均匀后立即用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(20mM PBS,pH 7.4,10％EtOH)中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下测得的。
由图可以清楚地看到，当次溴酸加入后，经检测1min左右荧光强度达到最大值并保持不变，这说明该探针与次溴酸反应迅速，能够为次溴酸的测量、检测或筛选提供快速的分析方法。
实施例3：测试荧光探针对于次溴酸的浓度梯度
配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同浓度的次溴酸(0-30μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后静置1分钟。上述测定是在PBS缓冲溶液(20mMPBS,pH 7.4,10％EtOH)中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下测得的。
用荧光光谱仪测试其荧光强度变化，从图2可以清晰的看出，随着加入次溴酸浓度的增加，505nm处的荧光强度逐渐增强。并且，由图3可以看出，在505nm处，次溴酸荧光探针(5μM)加入次溴酸(0-20μM)之后荧光强度呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对次溴酸进行定量分析。
实施例4：测试荧光探针对于次溴酸的选择性
分析物分别空白、钾离子、钙离子、钠离子、镁离子、铜离子、锌离子、二价铁、三价铁、硝酸根、亚硝酸根、一氧化氮、过氧化亚硝酸盐、硫化钠、同型半胱氨酸(500μM)、半胱氨酸(500μM)、谷胱甘肽(5mM)、过氧化氢、羟基自由基、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁醇自由基、超氧化钾、单线态氧、溴离子、次氯酸(20μM)和次溴酸(20μM)(除特殊标明外，其他分析物浓度均为100μM)。柱状图代表的是不同分析物存在下探针在505nm处的荧光强度值。上述测定是在纯水(20mM PBS,pH 7.4,10％EtOH)中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下测得的。具体地，配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后加入一定量的分析物，摇匀，待5分钟后测定。
从图4可以看出，生物体内存在的常见离子和物质不会明显干扰探针对次溴酸的响应，因此探针具有良好的选择性。
实施例5：荧光探针对宫颈癌细胞中亚铁离子的荧光成像
A1-A3是对照细胞，B1-B3是细胞孵育探针(10μM)，C1-C3是细胞孵育探针(10μM)，然后再孵育溴离子(100μM)，D1-D3是细胞细胞经乙酰半胱氨酸NAC(100μM)和溴离子(100μM)预处理之后再孵育探针(10μM)，E1-E3是细胞经探针(10μM)孵育之后再加入次溴酸(20μM)。F是A-E相对A的荧光强度。
从图5可以看出，探针可以成功应用于生物细胞中次溴酸的检测，因此探针具有潜在的生物应用价值。
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.化合物，其具有以下结构：
其中：R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10为氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10可以相同或不同。
2.如权利要求1所述化合物，其特征在于，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10均为氢原子。
3.一种制备权利要求1或2所述化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：使式(III)化合物与(Ⅳ)化合物反应制备得式(I)化合物，其反应式如下：
其中：R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10为氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10可以相同或不同。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将N-丁基-4-氯-1,8-萘酰亚胺与1-(2-氨乙基)哌啶类化合物溶于乙二醇甲醚中，然后加入N,N-二异丙基乙胺，加热回流反应，待反应完毕后，旋蒸干有机溶剂得到粗产品，柱色谱分离提纯，得到纯品。
5.一种用于测量、检测或筛选次溴酸的荧光探针组合物，其包含权利要求1-2中任一项所述化合物。
6.如权利要求5所述的荧光探针组合物，其特征在于，所述化合物是：
7.如权利要求5或6所述荧光探针组合物，其特征在于，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
8.一种用于检测样品中次溴酸的存在或测定样品中的次溴酸含量的方法，其包括：
a)使权利要求1-2中任一项的化合物与样品接触以形成荧光化合物；
b)测定所述荧光化合物的荧光性质。
9.如权利要求8所述方法，所述样品是化学样品或生物样品。
10.权利要求1-2任一项所述化合物在细胞荧光成像中的应用。
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