CN104910070A - 快速高选择性次氯酸荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及快速高选择性次氯酸荧光探针及其应用。具体地，本发明的探针为一类4-对苯二酚基萘酰亚胺类化合物，其可作为次氯酸荧光探针用于次氯酸的检测。这类探针可实现如下的技术效果中的至少一个：高选择性地识别次氯酸/次氯酸根；可以快速对次氯酸/次氯酸根实现响应；可以实现对次氯酸/次氯酸根的即时检测；性质稳定，可以长期保存使用；有利于在生理水平条件下对次氯酸进行检测；以及具有较强的抗干扰能力。

Description

快速高选择性次氯酸荧光探针及其应用

技术领域

本发明涉及4-对苯二酚基萘酰亚胺类化合物作为次氯酸荧光探针，其可在生理水平条件下对次氯酸进行快速高选择性识别应用，或者其可测定样品中次氯酸/次氯酸根的浓度。

背景技术

次氯酸盐广泛用于家用漂白剂、饮用水消毒、氰化物处理等，它的使用浓度范围是10-10⁴μM。但是，研究表明高浓度的次氯酸溶液会对人类和动物的健康存在潜在的危害。活性氧(ROS)和活性氮物种(RNS)在细胞代谢过程中是无处不在的，并且对于一些生物学功能是必不可少的。作为一种重要的ROS，次氯酸在生命系统中起着至关重要的作用，参与了许多生理过程。生物体内的次氯酸由过氧化氢和氯离子在白细胞内通过过氧化物酶催化反应生成。当病原体侵入人体组织时，白细胞通过吞噬作用吞噬入侵的病原体。在消灭侵入的病原体时，内源性的次氯酸可以破坏各种生物分子，包括DNA，RNA，脂肪酸，蛋白质等。由于次氯酸的高反应性和非特异性，一旦生命体内的次氯酸含量不能维持在正常的生理水平范围内，将会导致破坏宿主组织，引起一系列的疾病，如：神经衰弱、肾脏疾病、动脉硬化和关节炎等。因此，次氯酸是有关生命体健康与否的重要分子。

鉴于此，发展能够有效检测特别是能够在生理水平条件下检测次氯酸的分析方法是极其重要和有意义的。现如今已报道的检测次氯酸的分析方法包括碘还原滴定法、分光光度法、化学发光分析法、库伦法、荧光探针检测等方法。在这些众多的检测方法中，荧光探针由于其特有的优点而成为研究人员关注的焦点。但是目前报道的荧光探针仍存在一些缺陷，如选择性差、响应速度慢、灵敏度低以及合成复杂等。因此，发展高选择性、合成简单且能够快速响应的荧光探针是本领域技术人员急需解决的问题。

发明内容

本领域急需一种快速高选择性且制备简单的次氯酸荧光探针，从而能够有效检测特别是能够在生理水平条件下检测次氯酸。为此，本发明合成了一类新颖的次氯酸荧光探针，其合成简单、稳定性好、和/或选择性高，和/或能够快速识别次氯酸。本发明的探针可在生理水平条件下进行次氯酸的测定。

具体而言，本发明提供了一种次氯酸荧光探针，其为4-对苯二酚基萘酰亚胺类化合物，其结构如下：

优选的，本发明的荧光探针是：

在本发明的次氯酸荧光探针的制备方法中，反应温度是50～150℃；反应时间是2h～15h；萘酰亚胺类化合物与对苯二酚的摩尔比为1：1至1：10，优选为1：3。

本发明还提供了用于检测样本(例如血液样本)中次氯酸浓度的检测制剂或试剂盒，其包含本发明的探针。优选地，本发明的检测制剂或试剂盒还包含产品的使用说明书。还优选地，本发明的试剂盒还包含用于测定样本中的次氯酸浓度的缓冲剂。

本发明还提供了检测样本(例如血液样本)中次氯酸浓度的方法，其包括将本发明的探针与待测样本接触的步骤。

本发明还提供了本发明的探针在制备用于检测样本(例如血液样本)中次氯酸浓度的制剂中的用途。

本发明还提供了本发明的探针在制备用于检测样本(例如血液样本)中次氯酸浓度的试剂盒中的用途。

本发明的次氯酸荧光探针可与次氯酸进行作用，产生荧光光谱的变化，从而实现对次氯酸的定量检测。

具体而言，本发明的次氯酸荧光探针分别与过氧化氢、过氧化叔丁醇、超氧化钾、氢氧自由基、过氧化叔丁醇自由基以及其他离子进行作用均不能导致荧光光谱的明显改变，从而实现对次氯酸的选择性识别，进而可任选地用于排除这些过氧化氢、过氧化叔丁醇、超氧化钾、氢氧自由基、过氧化叔丁醇自由基以及其他离子的存在对次氯酸的定量测定的干扰。

本发明的次氯酸荧光探针的水溶性较好，从而可有利于生理水平条件下对次氯酸的检测。

可选择地，本发明的次氯酸荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。

进一步的，本发明的次氯酸荧光探针是快速高选择性次氯酸荧光探针，且合成简单，有利于商业化的推广应用。

附图说明

图1a和图1b是不同浓度NaClO(0～500μM)对探针(5μM)荧光光谱的影响。

图2是不同分析物(40μM)对探针(5μM)荧光光谱的影响。

图3是不同分析物(40μM)对探针(5μM)荧光光谱法定量分析NaClO(40μM)的影响。

图4a和图4b是探针(5μM)对NaClO(200μM)响应时间的测试结果。

具体实施方式：

本发明提供了上述快速高选择性次氯酸荧光探针的合成路线、方法及其光谱性能。

本发明的次氯酸荧光探针是一类4-对苯二酚基萘酰亚胺类化合物，其具有以下结构通式

上式中：R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆为氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆可以相同或不同。

该类次氯酸荧光荧光探针的合成路线和方法如下：

具体地，本发明的荧光探针可以通过如下方法制备，将一定摩尔比(例如1：1～1：10)的萘酰亚胺类化合物(例如4-氯-1,8-萘酰亚胺)和对苯二酚溶于二甲基亚砜(DMSO)中，然后高温(例如100℃)下恒温加热一段时间(例如8h)，然后使用有机溶剂(例如二氯甲烷)萃取，旋蒸有机相，得到粗产品。最后将粗产品用二氯甲烷体系进行柱色谱分离获得纯品荧光探针。

因此，本发明还提供了对苯二酚在制备用于检测次氯酸的荧光探针中的用途。

本发明还提供了萘酰亚胺类化合物(例如4-氯-1,8-萘酰亚胺)在制备用于检测次氯酸的荧光探针中的用途。

本发明的快速高选择性识别次氯酸荧光探针的显著特征是能够快速高选择性地识别次氯酸/次氯酸根，和/或在其他高浓度过氧化氢、过氧化叔丁醇、超氧化钾、氢氧自由基、过氧化叔丁醇自由基和其他离子的存在下能够准确对次氯酸/次氯酸根进行定量分析。

下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。

实施例1

(方案1)将285.5mg(1.0mmol)N-丁基4-氯-1,8-萘酰亚胺、220mg(2.0mmol)对苯二酚和552mg(4.0mmol)碳酸钾溶于10mL二甲基亚砜(DMSO)中，然后在80℃的恒温下反应10h。将反应溶液倒入100mL水中，用二氯甲烷萃取，得二氯甲烷相，然后旋蒸得到粗产品，使用二氯甲烷体系进行柱色谱分离，得到黄色纯净产品256mg，产率为71﹪。

(方案2)将285.5mg(1.0mmol)4-氯-1,8-萘酰亚胺、330mg(3.0mmol)对苯二酚和828mg(6.0mmol)碳酸钾溶于10mL二甲基亚砜(DMSO)中，然后在80℃恒温下反应10h，将反应溶液倒入100mL水中，用二氯甲烷萃取，得二氯甲烷相，然后旋蒸得到粗产品，使用二氯甲烷体系进行柱色谱分离，得到黄色纯净产品309mg，产率为86﹪。

(方案3)将285.5mg(1.0mmol)4-氯-1,8-萘酰亚胺、440mg(4.0mmol)对苯二酚和828mg(6.0mmol)碳酸钾溶于10mL二甲基亚砜(DMSO)中，然后在80℃恒温下反应10h，将反应溶液倒入100mL水中，用二氯甲烷萃取，得二氯甲烷相，然后旋蒸得到粗产品，使用二氯甲烷体系进行柱色谱分离，得到黄色纯净产品334mg，产率为93﹪。

(方案4)将285.5mg(1.0mmol)4-氯-1,8-萘酰亚胺、330mg(3.0mmol)对苯二酚和828mg(6.0mmol)碳酸钾溶于10mL二甲基亚砜(DMSO)中，然后在60℃恒温下反应12h，将反应溶液倒入100mL水中，用二氯甲烷萃取，得二氯甲烷相，然后旋蒸得到粗产品，使用二氯甲烷体系进行柱色谱分离，得到黄色纯净产品266mg，产率为74﹪。

(方案5)将285.5mg(1.0mmol)4-氯-1,8-萘酰亚胺、330mg(3.0mmol)对苯二酚和828mg(6.0mmol)碳酸钾溶于10mL二甲基亚砜(DMSO)中，然后在100℃恒温下反应8h，将反应溶液倒入100mL水中，用二氯甲烷萃取，得二氯甲烷相，然后旋蒸得到粗产品，使用二氯甲烷体系进行柱色谱分离，得到黄色纯净产品287mg，产率为80﹪。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ(*10^-6):0.97(t,J＝8.0Hz,3H),1.40-1.49(m,2H),1.68-1.75(m,2H),4.18(t,J＝8.0Hz,2H),6.38(s,1H),6.82(d,J＝8.0Hz,1H),6.98(d,J＝12.0Hz,2H),7.06(d,J＝12.0Hz,2H),7.78(t,J＝8.0Hz,1H),8.42(d,J＝8.0Hz,1H),8.65(d,J＝8.0Hz,1H),8.72(d,J＝8.0Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ(*10^-6):13.88,20.41,30.25,40.30,109.51,115.89,116.96,122.30,122.44,123.61,126.43,128.77,129.63,132.01,133.13,147.53,153.90,160.96,164.14,164.62.ESI-MS计算值C₂₂H₂₀NO₄[M-H]^-362；实测值362.

实施例2

本发明的发明人进行了如下测试：(a)不同浓度NaClO(0～500μM)对探针(5μM)荧光光谱的影响；(b)547nm处的荧光强度与加入的NaClO浓度(0～250μM)之间的线性关系。上述测定是在无水乙醇和水的混合体系(5:5,v/v)，5mM PBS,pH 7.4中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下NaClO加入作用10min后测得的。结果参见图1。

从图1可以看出，伴随着探针溶液中NaClO浓度的增加，荧光光谱逐渐上升，且在0～250μM的NaClO浓度范围内，NaClO的浓度和荧光强度成线性关系。因此借助于本发明中的探针可以对样品中的NaClO进行定量分析。

实施例3

不同分析物(40μM)对探针(5μM)荧光光谱的影响。分析物包括：过氧化氢H₂O₂、过氧化叔丁醇TBHP、超氧化钾KO₂、氢氧自由基·OH、过氧化叔丁醇自由基·TBHP、过氧化亚硝酸盐ONOO^-、次氯酸钠NaClO，它们的浓度均为40μM。所有测试条件是在无水乙醇和水的混合体系(5:5，v/v)，5mM PBS,pH 7.4中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下NaClO加入作用10min后测得的。具体地，移取50μL的探针储备液(1mM)放进10mL比色管中，然后加入5mL无水乙醇，再移取20μL上述分析物储备液(10mM)加入比色管内，然后移取0.5mL的PBS溶液(pH7.4,100mM)，最后用超纯水定容至10mL。摇匀，静置10min，即可测定。结果如图2所示。

从图2可以看出，探针对次氯酸根具有很高的选择性，能够专一性地和次氯酸根进行反应，反应前后，荧光光谱有明显变化，而生物体内存在的常见过氧化氢等氧化性物质与探针作用后荧光强度并不发生明显变化。

实施例4

不同分析物(40μM)对探针(5μM)荧光光谱法定量分析次氯酸(40μM)的影响。分析物包括：过氧化氢H₂O₂、过氧化叔丁醇TBHP、超氧化钾KO₂、氢氧自由基·OH、过氧化叔丁醇自由基·TBHP、过氧化亚硝酸盐ONOO^-、次氯酸钠NaClO，它们的浓度均为40μM。所有测试条件是在无水乙醇和水的混合体系(5:5，v/v)，5mM PBS,pH 7.4中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下分析物加入作用10min后测得的。结果如图3所示。

从图3可以看出，生物体内存在的常见过氧化氢等氧化性物质不会明显干扰探针对次氯酸的定性与定量检测。

实施例5

探针(5μM)对NaClO(200μM)响应时间的测试结果。首先，移取50μL的探针储备液(1mM)放进10mL比色管中，然后加入5mL无水乙醇，向其加入0.5mL的PBS溶液(pH 7.4,100mM)，再移取相应体积的上述分析物的储备液(10mM)，最后用超纯水定容至10mL，快速摇匀，计时测定，其中所使用的探针是实施例1中所制备的探针。结果如图4所示。

从图4中可以看出，NaClO与探针反应1min后荧光强度即发生明显变化，4min后荧光强度趋于稳定。这种荧光强度增强的快速性与明显性说明此探针完全可以用于次氯酸的即时检测。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.化合物，其具有以下结构

其中：R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆独立地选自氢原子，直链或支链烷基，直链或支链烷氧基，磺酸基，酯基，羧基；R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆可以相同或不同。

2.根据权利要求1所述的化合物，其为如下结构的化合物：

3.用于检测样本中次氯酸/次氯酸根含量的制剂，其包含根据权利要求1或2的化合物。

4.根据权利要求3所述的制剂，其中所述的样本是血液样本。

5.用于检测样本中次氯酸/次氯酸根含量的试剂盒，其包含根据权利要求1或2的化合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述的样本是血液样本。

7.根据权利要求5－6中任一项所述的试剂盒，其还包括使用说明书。

8.根据权利要求5－6中任一项所述的试剂盒，其还包括用于检测样本中次氯酸/次氯酸根含量的缓冲剂。

9.检测样本中次氯酸/次氯酸根含量的方法，其包括使用根据权利要求1或2中的化合物作为探针。

10.根据权利要求1或2中的化合物在制备用于检测样本中次氯酸/次氯酸根含量中的用途。