CN113354618A - 一种可靶向细胞溶酶体的次氯酸荧光探针、制备方法与应用 - Google Patents

一种可靶向细胞溶酶体的次氯酸荧光探针、制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种可靶向细胞溶酶体的次氯酸荧光探针，具体地，本发明的探针本发明可用于测量、检测或筛选次氯酸及活细胞荧光成像，尤其可应用于细胞溶酶体次氯酸测量、检测以及成像，这类探针可实现如下的技术效果中的至少一个：可以快速地响应次氯酸；可以高选择性地识别次氯酸；可以灵敏地分析次氯酸的浓度；性质稳定，可以应用生物细胞中的次氯酸成像，可以特异性靶向到细胞中的溶酶体，可以长期保存使用。

Description

一种可靶向细胞溶酶体的次氯酸荧光探针、制备方法与应用
技术领域
本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种基于吡啶功能团的可靶向细胞溶酶体的次氯酸荧光探针及其在测量、检测或筛选次氯酸及活细胞荧光成像方法中的应用；本发明还提供了制备所述荧光探针的方法。
背景技术
生命系统中，活性氧物种在维持氧化还原平衡和信号传导等方面起着重要作用。次氯酸(HOCl)作为活性氧的一种，是由髓过氧化物酶催化氯离子和过氧化氢产生的，因其具有极高的反应活性，在细胞抵抗病原体的免疫防御中起关键作用。另一方面，溶酶体作为真核细胞中的一种重要的细胞器，内含多种水解酶，负责细胞内外的大分子的分解、清除衰老细胞器和控制细胞凋亡等。然而，细胞内高浓度的次氯酸会对氨基酸、脂类和DNA等物质造成氧化损伤。此外，有研究表明溶酶体中异常积累的次氯酸会导致溶酶体膜破裂并释放内含的水解酶，导致细胞功能紊乱；次氯酸还与许多疾病相关，包括炎症性疾病、心血管疾病、神经退行性疾病以及一些癌症。现如今，由于缺乏能检测细胞内溶酶体中次氯酸的可靠方法，溶酶体中的次氯酸的作用机制还未完全阐明。因此，开发一种强有力的化学工具来检测溶酶体中的次氯酸是至关重要的。
由于高灵敏度，高选择性，显著的时空分辨率和能够实时监测等优势，小分子荧光探针作为一种非侵入性的工具被广泛应用于生物样品中的分析物测定。近年来，已报道的荧光探针靶向溶酶体的策略大都是在探针的主要框架上引入弱碱性基团(例如吗啉基团和二甲氨基团)，利用溶酶体中的弱酸性环境，从而达到靶向的目的。但由于弱碱性功能团较为单一，限制了荧光探针在靶向溶酶体方面的发展，且已报道的可检测细胞内溶酶体中次氯酸的荧光探针相对缺乏，并存在一些缺陷，比如合成复杂、响应时间较长和溶酶体标记性能差等。因此，开发一种易于合成的具有优秀的溶酶体靶向性能的能快速响应的次氯酸荧光探针成为本领域技术人员亟需解决的课题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是在于提供一类可靶向细胞溶酶体的次氯酸荧光探针，以及它们的制备方法和用途，具有合成简单、选择性好、灵敏度高、溶酶体靶向性能优秀且能快速响应次氯酸等特点，并且能够在生理水平条件下对次氯酸进行有效测量、检测或筛选，同时，其对内源性和外源性次氯酸进都够有效测量、检测或筛选。
具体而言，本发明提供了一种化合物，具有式(Ⅰ)所示的结构：
Figure BDA0003097850160000021
式(I)中，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9和R10为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9和R10可以相同或不同。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的化合物是R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9和R10均为氢原子的式(Ⅴ)化合物，其结构式如下：
Figure BDA0003097850160000031
本发明还提供了式(Ⅰ)化合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)：使式(Ⅱ)化合物与4-氨基吡啶反应制备得式(Ⅲ)化合物，其反应式如下：
Figure BDA0003097850160000032
步骤(2)：使式(Ⅲ)化合物与式(Ⅳ)化合物反应制备得式(Ⅰ)化合物，其反应式如下：
Figure BDA0003097850160000041
式(Ⅰ)-(Ⅳ)中：R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9和R10为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9和R10可以相同或不同。
具体而言：将式(Ⅱ)化合物与4-氨基吡啶溶在乙醇中加热回流反应，反应结束后，回流反应，待反应完毕后，减压抽滤得到固体，从而获得含有式(Ⅲ)化合物的粗产物。粗产品进一步通过色谱柱进行分离，二氯甲烷和甲醇的混合体系为洗脱剂，可得到纯净的式(Ⅲ)化合物。将式(Ⅲ)化合物和式(Ⅳ)化合物与碳酸铯在乙腈中加热回流一段时间，反应结束后，通过减压抽滤得到滤液，然后，减压旋蒸，得固体，用二氯甲烷混合溶剂清洗固体，从而获得含有式(I)化合物的粗产物。粗产品进一步通过色谱柱进行分离，二氯甲烷和甲醇的混合体系为洗脱剂，可得到纯净的式(I)化合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述式(Ⅱ)化合物与4-氨基吡啶的摩尔比为1:1-1:10，所述式(Ⅲ)化合物与式(Ⅳ)化合物的摩尔比为1:1-1:10。
在本发明的一些具体实施方案中，式(I)化合物制备方法步骤(1)和步骤(2)所述反应时间为3-10小时。
本发明还提供了用于测量、检测或筛选次氯酸的荧光探针组合物，其包含本发明的所述式(I)化合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述式(I)化合物具有以下结构：
Figure BDA0003097850160000051
在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
本发明还提供了用于检测样品中次氯酸的存在或测量样品中的次氯酸含量的方法，其包括：
a)使所述式(I)或式(Ⅴ)化合物与样品接触以形成荧光化合物；
b)测定所述荧光化合物的荧光性质。
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是化学样品或生物样品。
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是包括水、血液、微生物或者动物细胞或组织在内的生物样品。
本发明还提供了检测样品中次氯酸的存在或区分检测内、外源性次氯酸或测定样品中的次氯酸含量的试剂盒，其包含所述式(I)或式(Ⅴ)化合物。
本发明还提供了所述式(I)或式(Ⅴ)化合物在细胞荧光成像中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
(1)靶向溶酶体性能优秀
能够靶向细胞溶酶体便于可靠的检测细胞内溶酶体中次氯酸，有利于溶酶体中的次氯酸的作用机制的研究。
(2)内源性和外源性次氯酸均可检测
本发明的次氯酸荧光探针对外源性和内源性次氯酸都可以有限检测、测量或筛选。
(3)选择性高，抗干扰能力强
本发明的次氯酸荧光探针可选择性的与次氯酸发生特异性反应，生成荧光变化的产物，相较于常见的其他金属离子及生命体内的其他物质，包括但不限于钾离子、钙离子、钠离子、镁离子、锌离子、三价铁离子、二价铁离子、铜离子、硝酸根、亚硝酸根、碘离子、碳酸根、锰离子、溴离子、硫酸根、氯离子、半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽、硫离子、羟基自由基、过氧化叔丁醇自由基、一氧化氮、单线态氧、过氧化叔丁醇、超氧阴离子、过氧化氢、过氧化亚硝酸盐等，本发明荧光探针显示出了较高的选择性。
(4)灵敏度高
本发明的次氯酸荧光探针与次氯酸反应非常灵敏，从而有利于对次氯酸的检测。
(5)可生理水平条件下应用
本发明的次氯酸荧光探针可在生理水平条件下应用，并且，生物体内常见的金属离子和其他物质对其干扰较小，可以应用于活细胞荧光成像。
(6)稳定性好
本发明的次氯酸荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。
(7)合成简单
本发明的次氯酸荧光探针合成简单，有利于商业化的推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是探针(20μM)加入次氯酸(30μM)前后的吸收光谱；
图2是探针(5μM)对次氯酸(5μM)在560nm处的时间动力学谱，其中，激发波长为468nm，激发光狭缝和发射光狭缝均为5nm；
图3(a)是探针(5μM)加入次氯酸(0-5μM)前后的荧光光谱，其中，激发波长为468nm，激发光狭缝和发射光狭缝均为5nm；
图3(b)是探针(5μM)在560nm处的荧光强度和次氯酸(0-1μM)的线性关系图；
图4是不同离子分析物(除特殊表明外，都为100μM)对探针(5μM)的荧光强度的影响；
图5是各个探针浓度对HeLa细胞的毒性分析，浓度分别为：0μM，10μM，20μM，30μM；
图6是探针(5μM)在HeLa细胞中对外源性和内源性次氯酸的荧光成像，比例尺为20μm，激发波长为472nm,收集的发射波长为510-610nm。；
图7是探针(10μM)与商用溶酶体红色染料(Lyso-TrackerRedDND-99)在三种细胞中的荧光共定位显微成像；A：HeLa细胞；B：HepG2细胞；C：RAW264.7细胞；A1-C1：探针的绿色通道；A2-C2：商用红色染料的红色通道；A3-C3：叠加通道；A4-C4：绿色通道和红色通道的强度散点图；A5-C5：A3-C3图中黑线部分的绿色通道和红色通道的强度曲线图；比例尺为20μm，绿色通道的激发波长为472nm,收集的发射波长为510-610nm，红色通道的激发波长为559nm,收集的发射波长为585-620nm。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应该用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1式(Ⅴ)化合物的合成
合成路线如下：
Figure BDA0003097850160000081
具体操作步骤如下：
实施方案1：将464mg(2mmol)4-氯-1,8-萘二甲酸酐和4-氨基吡啶(282mg，3mmol)溶于40mL乙醇溶液中，加热回流10h，待反应完毕后，减压抽滤得固体，进一步将粗产品用二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行色谱柱分离得到纯品。得到纯净产品约490mg，产率为79.5％。
实施方案2：将464mg(2mmol)4-氯-1,8-萘二甲酸酐和4-氨基吡啶(376mg，4mmol)溶于40mL乙醇溶液中，加热回流10h，待反应完毕后，减压抽滤得固体，进一步将粗产品用氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行色谱柱分离得到纯品。得到纯净产品约400mg，产率为65％。
实施方案3：将928mg(4mmol)4-氯-1,8-萘二甲酸酐和4-氨基吡啶(376mg，4mmol)溶于40mL乙醇溶液中，加热回流10h，待反应完毕后，减压抽滤得固体，进一步将粗产品用氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行色谱柱分离得到纯品。得到纯净产品约640mg，产率为52％。
实施方案4：将464mg(2mmol)4-氯-1,8-萘二甲酸酐和4-氨基吡啶(282mg，3mmol)溶于40mL乙醇溶液中，加热回流10h，待反应完毕后，减压抽滤得固体，进一步将粗产品用二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行色谱柱分离得到纯品。得到纯净产品约240mg，产率为39％。
Figure BDA0003097850160000091
具体操作步骤如下：
实施方案1：将萘酰亚胺类化合物(Ⅵ)308mg(1mmol)溶于12mL乙腈溶液中，再加入327mg(3mmol)对氨基酚和977mg(3mmol)碳酸铯，加热回流3h，待反应完毕后，通过减压抽滤得到滤液，然后，减压旋蒸，得固体，用二氯甲烷混合清洗固体，得粗产品，进一步将粗产品用二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行色谱柱分离得到纯品。得到纯净产品约242mg，产率为63.5％。
实施方案2：将萘酰亚胺类化合物(Ⅵ)308mg(1mmol)溶于12mL乙腈溶液中，再加入654mg(6mmol)对氨基酚和1.95g(3mmol)碳酸铯，加热回流3h，待反应完毕后，通过减压抽滤得到滤液，然后，减压旋蒸，得固体，用二氯甲烷混合清洗固体，得粗产品，进一步将粗产品用二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行色谱柱分离得到纯品。得到纯净产品约150mg，产率为39％。
实施方案3：将萘酰亚胺类化合物(Ⅵ)308mg(1mmol)溶于12mL乙腈溶液中，再加入218mg(2mmol)对氨基酚和1.95g(6mmol)碳酸铯，加热回流3h，待反应完毕后，通过减压抽滤得到滤液，然后，减压旋蒸，得固体，用二氯甲烷溶剂清洗固体，得粗产品，进一步将粗产品用二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行色谱柱分离得到纯品。得到纯净产品约242mg，产率为63.5％。
实施方案4：将萘酰亚胺类化合物(Ⅵ)308mg(1mmol)溶于12mL乙腈溶液中，再加入327mg(3mmol)对氨基酚和977mg(3mmol)碳酸铯，加热回流1.5h，待反应完毕后，通过减压抽滤得到滤液，然后，减压旋蒸，得固体，用二氯甲烷溶剂清洗固体，得粗产品，进一步将粗产品用二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行色谱柱分离得到纯品。得到纯净产品约100mg，产率为26％。
实施例2式荧光探针加入次氯酸前后的吸光光谱
配制两个4mL的测试体系，标号为A和B。测试体系B作为对照组，不进行任何操作。在测试体系A中加入探针(20μM)后，用紫外吸收光谱仪进行测定，然后加入次氯酸(30μM)，用紫外吸收光谱仪进行测定。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mMPBS,pH5.0)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且吸收光谱测试是在25℃下测得的。
从图1可以清晰的看出，当次氯酸(30μM)加入后，探针的吸收峰发生明显的变化。
实施例3：测试荧光探针的时间动力学
配制一个探针浓度为5μM的10mL的测试体系，然后将5μM的次氯酸加入到测试体系中，摇晃均匀后立即用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mMPBS,pH5.0)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的。
由图2可以清楚地看到，当次氯酸加入后，荧光强度瞬间达到最大值并保持不变，这说明该探针与次氯酸反应迅速，能够为次氯酸的测定提供快速的分析方法。
实施例4：测试荧光探针对于次氯酸的浓度梯度
配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同浓度的次氯酸加入到测试体系中，摇晃均匀后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mMPBS,pH5.0)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的。
从图3(a)可以清晰的看出，随着次氯酸浓度的增加，560nm处的荧光强度逐渐增强。并且，由图3(b)可以看出探针(5μM)加入次氯酸(0-1μM)之后，其560nm处的荧光强度的与次氯酸浓度之间呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对次氯酸进行定量分析。
实施例5：测试荧光探针的选择性
配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同的分析物(分析物分别是空白、钾离子、钙离子、钠离子、镁离子、锌离子、三价铁离子、二价铁离子、铜离子、硝酸根、亚硝酸根、碘离子、碳酸根、锰离子、溴离子、硫酸根、氯离子、半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽、硫离子、羟基自由基、过氧化叔丁醇自由基、一氧化氮、单线态氧、过氧化叔丁醇、超氧阴离子、过氧化氢、过氧化亚硝酸盐、次氯酸；除特殊标明外，其他分析物浓度均为100μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mMPBS,pH5.0)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的。
从图4可以清晰的看出，只有次氯酸加入的时候才能引起探针荧光强度的强烈变化，而其他分析物的影响几乎可以忽略不计。实验证明，该探针对次氯酸具有较高的选择性，有利于对次氯酸的检测分析。
实施例6：应该探针对HeLa细胞的毒性测试
用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测不同浓度的探针对HeLa细胞的细胞毒性。探针孵育细胞的时间为10h。
从图5可以清晰的看出，探针具有低毒性的特点，可以将其长时间应用于细胞样品中次氯酸的实时检测。
实施例7:荧光探针对HeLa细胞中外源性和内源性次氯酸的荧光显微成像将HeLa细胞分成四组，A组用探针(10μM)孵育30min；B组先用ABAH(200μM，一种髓过氧化物酶的抑制剂，可抑制细胞内HOCl的产生)处理2h，再用探针(10μM)孵育30min；C组先用探针(10μM)孵育30min，再加次氯酸(10μM)孵育30min；D组先用LPS(1.0μgmL-1；一种炎症刺激剂，可刺激细胞内HOCl的产生)处理10h，再加探针(10μM)孵育30min。最后对四组细胞分别进行共聚焦显微成像。
从图6可以清晰的看出，该探针可以检测HeLa中内源性和外源性的次氯酸。实验证明，该探针可以应用于生物样品中的次氯酸检测。
实施例8：荧光探针溶酶体靶向性能测试
将A：HeLa细胞；B：HepG2细胞；C：RAW264.7细胞这三种细胞用探针(10μM)和Lyso-TrackerRedDND-99(100nM，一种商用溶酶体红色染料)孵育30min，然后再加次氯酸(50μM)孵育30min。最后对这三种细胞分别进行共聚焦显微成像。
从图7可以清晰的看出，该探针与商用溶酶体红色染料的共定位溶酶体的效果非常突出，三种细胞的重叠系数都在0.9以上。实验证明，该探针具有靶向细胞内溶酶体的性能。
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.化合物，其具有以下结构：
Figure FDA0003097850150000011
其中：R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9和R10为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9和R10可以相同或不同。
2.按照权利要求1的化合物，其中R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9和R10均为氢原子。
3.一种制备权利要求1或2所述化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：使式(Ⅱ)化合物与4-氨基吡啶反应制备得式(Ⅲ)化合物，式(Ⅲ)化合物与式(Ⅳ)化合物反应制备得式(Ⅰ)化合物，其反应式分别如下：
步骤1:
Figure FDA0003097850150000012
步骤2：
Figure FDA0003097850150000021
其中：R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9和R10为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9和R10可以相同或不同。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：将式(Ⅱ)化合物与4-氨基吡啶溶在乙醇中加热回流反应，反应结束后，回流反应，待反应完毕后，减压抽滤得到固体，从而获得含有式(Ⅲ)化合物的粗产物。粗产品进一步通过色谱柱进行分离，二氯甲烷和甲醇的混合体系为洗脱剂，可得到纯净的式(Ⅲ)化合物。
步骤(2)：将式(Ⅲ)化合物和式(Ⅳ)化合物与碳酸铯在乙腈中加热回流一段时间，反应结束后，通过减压抽滤得到滤液，然后，减压旋蒸，得固体，用二氯甲烷或二氯甲烷/甲醇的混合溶剂清洗固体，从而获得含有式(I)化合物的粗产物。粗产品进一步通过色谱柱进行分离，二氯甲烷和甲醇的混合体系为洗脱剂，可得到纯净的式(I)化合物。
5.一种用于测量、检测或筛选次氯酸的荧光探针组合物，其包含权利要求1-2中任一项所述化合物。
6.如权利要求5所述的荧光探针组合物，所述化合物是：
Figure FDA0003097850150000031
7.如权利要求5或6所述荧光探针组合物，其特征在于，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
8.一种用于检测样品中次氯酸的存在或测定样品中的次氯酸含量的方法，其包括：
a)使权利要求1-2中任一项的化合物与样品接触以形成荧光化合物；
b)测定所述荧光化合物的荧光性质。
9.如权利要求8所述方法，所述样品是化学样品或生物样品。
10.权利要求1-2任一项所述化合物在细胞荧光成像。
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