CN102798675A

CN102798675A - 即食海产品中游离甲醛的检测方法

Info

Publication number: CN102798675A
Application number: CN2012102863054A
Authority: CN
Inventors: 王恒; 王建跃; 方力; 秦英
Original assignee: ZHOUSHAN CITY DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTER
Current assignee: ZHOUSHAN CITY DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTER
Priority date: 2012-08-13
Filing date: 2012-08-13
Publication date: 2012-11-28

Abstract

本发明提供的即食海产品中游离甲醛的检测方法，以中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1547-2011《进出口食品中甲醛含量测定液相色谱法》为基础，其中衍生液为磷酸盐缓冲液与2，4-二硝基苯肼溶液按6︰4比例混合，而磷酸盐缓冲液的pH值为3.5；高效液相色谱法检测时流动相为乙腈+水，两者体积各占50%。与现有技术相比，本发明方法中提取和衍生一步进行，步骤少，检测过程快速、简便，重复性好，尤其是避免了衍生过程中衍生试剂分层现象的出现，能够保证检测的顺利进行。方法检测低限为1.0mg/kg，亦优于上述《进出口食品中甲醛含量测定液相色谱法》的5.0mg/kg。

Description

即食海产品中游离甲醛的检测方法

技术领域

本发明涉及的是一种即食海产品中游离甲醛的检测方法。

背景技术

即食海产品，如鱿鱼丝、鱼片、烤鳗干等海产小零食因味美、营养丰富而深受消费者欢迎，然而这类产品中甲醛含量往往较高，对产业发展造成了严重影响。有包括“鱿鱼及其制品加工贮存过程中甲醛的消长规律研究”《食品科学，2010，31（05）》、“Effect of processing steps on the physico-chemical properties of dried-seasoned squid”《Food Chem，2007，103（2）》和“鱿鱼及制品中甲醛来源与产生规律探索”《中国公共卫生管理，2007，22（3）》等文献报道显示，即食海产品中的甲醛并非一定为外源性添加，大多为内源性生成。因此，建立快速准确的检测方法对科学地评价此类产品中的甲醛有着重要的科学和现实意义。

传统的海产品中甲醛检测方法多为蒸馏法或水浸法，但这些方法检测的是产品中游离态和结合态甲醛的总量。而食品中对健康造成危害的仅为游离甲醛，因此游离甲醛的检测更有意义。为此，有“液相色谱法测定水产品中游离甲醛含量的研究”《浙江海洋学院学报，2006，25（4）》公开了通过采用三氯乙酸浸泡提取水产品中的游离甲醛对水产品中游离甲醛的检测方法。但由于三氯乙酸溶液为强酸性，所得提取液无法直接使用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）进行分析，只能使用分光光度法或通过二氯甲烷萃取等方法，转移至中性或弱酸性溶液中进行分析，操作略显繁琐。又有“高效液相色谱直接测定甲醛衍生物反应条件的研究”《分析化学，2004，32（11）》公开了一种在弱酸性条件下直接反应衍生甲醛的方法，反应产物可以直接使用HPLC进行分析。在此基础上，有“衍生液提取-高效液相色谱法快速测定香菇中的游离甲醛”《色谱，2010，28（10）》公开了对香菇中游离甲醛的快速测定方法。香菇和鱿鱼丝中的游离甲醛均来自前体物的分解，该方法通过降低提取溶液pH值、提高提取温度和控制提取液中乙腈浓度来抑制酶活性，从而达到测定游离甲醛的目的。鱿鱼等海产品中的甲醛来源虽然也是来自于前体物的分解，但是酶学途径并非是其主要的生成途径，温度也会促进甲醛的生成，并且是海产品内源性甲醛生成的重要来源。所以，对于即食海产品，不能简单地通过提高温度抑制酶活性的方法来抑制其中游离甲醛的生成。

此外，有中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1547-2011《进出口食品中甲醛含量测定液相色谱法》规定了用液相色谱法对银鱼、香菇、面粉、奶粉、奶糖、奶油、乳饮品、啤酒等产品中甲醛含量的测定办法。主要过程是用衍生液提取试样中的甲醛，反应生成甲醛衍生物。甲醛衍生物经液液萃取净化后，在365nm波长处用液相色谱法（HPLC）测定，按外标法定量。对于固体类试样的具体过程是：

提取——称取粉碎均匀的样品2.0g，置于50mL具塞塑料离心管中，加衍生液20.0mL，涡旋混匀后置于60℃恒温振荡器中，150r/min振摇，间隔20min取出混匀一次，摇振1h后取出冷却至室温。

净化——以不低于4000r/min离心5。如离心后溶液浑浊或分层，在提取液中加入8g硫酸铵混匀，以不低于4000r/min离心5min。移取上清液于20mL具塞塑料离心管中，下层溶液用10mL乙腈重复萃取1次，合并上清液，用乙腈定容至20.0mL，混匀后过0.45μm微孔滤膜，得样本。

液相色谱条件——色谱柱： C₁₈柱，250mm×4.6mm（内径），5μm，或者相当者；流动相：甲醇-水（70+30，V₁+V₂）；流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；检测波长：365nm；进样量：10μL。

其中：甲醛衍生物标准溶液——移取20μL、50μL、100μL、200μL、500μL甲醛标准溶液，置于10mL具塞比色管或刻度试管中，补加缓冲溶液至5.0mL再用2，4-二硝基苯肼溶液定容至10.0mL，盖上塞后混匀，60℃水溶加热1h，取出冷却至室温，过0.45μm微孔滤膜，得标准。

缓冲溶液（pH 5）——称取2.64g乙酸钠，以适量水溶解，加入1.0mL冰乙酸，用水定容至500mL。

2，4-二硝基苯肼溶液（0.6g/L）——称取2，4-二硝基苯肼300mg，用乙腈溶解定容至500mL。衍生液：量取100 mL缓冲溶液和100mL2，4-二硝基苯肼溶液，混匀。

根据样液中甲醛衍生物浓度的情况选定峰面积相近的标准溶液系列。标准溶液和样液中甲醛衍生物的响应值均应在食品检测的线性范围内。标准溶液和样液等体积参插进样测定。以峰面积为纵坐标，甲醛衍生物标准溶液对应的甲醛浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。用保留时间定性，外标法定量。在上述色谱条件下甲醛衍生物的保留时间为6.5min。

检测结果以公式X=（c×V）/m计算，其中：X—试样中甲醛的残留量，单位为mg/kg；c—从本标准工作曲线得到的样液对应的甲醛浓度，单位为mg/L；V—样液最终定容体积，单位为mL；m—样液所代表的试样质量，单位为g。结果中扣除经空白试验获得的空白值。

在直接引用上述《进出口食品中甲醛含量测定液相色谱法》（SN/T1547-2011）对即食海产品，如鱿鱼丝等进行甲醛含量测定时，会因为食盐的存在而出现有机相和水相分层的现象，以致无法完成测定。

因此，目前尚无一种符合即食海产品中甲醛生成特点的、检测其游离甲醛含量的方法。

发明内容

针对上述不足，本发明就是要通过选择合适的反应条件，抑制即食海产品中甲醛前体物的分解，建立一种即食海产品中游离甲醛的检测方法。

本发明提供的即食海产品中游离甲醛的检测方法，先进行空白试验样本准备、被检样品的衍生液提取和甲醛标准溶液制备，再使用高效液相色谱分别对空白试验样本、被检样本的提取液和甲醛标准溶液进行检测，绘制标准工作曲线，最后用公式X=（c×V）/m计算，并在结果中扣除经空白试验获得的空白值，式中：X—试样中游离甲醛的含量，单位为mg/kg；c—从标准工作曲线得到的样液对应的甲醛浓度，单位为mg/L；V—样液最终定容体积，单位为mL；m—样液所代表的试样质量，单位为g；

其中：衍生液提取为先称取粉碎均匀的样品2.0g，置于50mL具塞塑料离心管中，加衍生液20.0mL，涡旋混匀后在60℃水浴中静置反应2h，其间振摇2~3次，取出后冷却至室温，再作涡旋混匀，静置后取上清液，最后用0.45μm有机相微孔滤膜过滤得提取液；所用衍生液为磷酸盐缓冲液与2，4-二硝基苯肼溶液按6︰4比例混合，其中2，4-二硝基苯肼溶液以称取2，4-二硝基苯肼60mg加入乙腈并定容至100mL获得，磷酸盐缓冲液是以浓度为0.05mol/L的磷酸二氢钠溶液用磷酸调节pH值至3.5所得；高效液相色谱法检测的条件是：色谱柱为Thermo Hypersil GOLD aQ-c18色谱柱；流动相为乙腈+水，两者体积各占50%；流速为1.0mL/min；柱温为40℃；检测波长为365nm；进样体积为10μL。

本发明提供的即食海产品中游离甲醛的检测方法，以中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1547-2011《进出口食品中甲醛含量测定液相色谱法》为基础，其中衍生液为磷酸盐缓冲液与2，4-二硝基苯肼溶液按6︰4比例混合，而磷酸盐缓冲液的pH值为3.5；高效液相色谱法检测时流动相为乙腈+水两者体积各占50%。即本发明通过选择合适的缓冲液pH和提取温度，抑制了即食海产品中游离甲醛的产生，同时通过优化缓冲溶液盐浓度和提取衍生液中有机相的含量，避免了提取衍生过程中分层现象的产生。与现有技术相比，本发明方法中提取和衍生一步进行，步骤少，检测过程快速、简便，重复性好，尤其是避免了衍生过程中衍生试剂分层现象的出现，能够保证检测的顺利进行。方法检测低限为1.0mg/kg，亦优于中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1547-2011《进出口食品中甲醛含量测定液相色谱法》的5.0mg/kg。

具体实施方式

以鱿鱼丝中游离甲醛的检测为例，其检测步骤是：

1、缓冲溶液配制：

取浓度为0.05mol/L的磷酸二氢钠溶液用磷酸调节至pH值等于3.5；

2、2，4-二硝基苯肼溶液配制：

称取2，4-二硝基苯肼60mg加入乙腈并定容至100mL；

3、衍生液配制：

pH为3.5、浓度为0.05M的磷酸盐缓冲液与2，4-二硝基苯肼溶液按6︰4的体积比进行混合；

4、提取：

将鱿鱼丝粉碎均匀后称取2.0g，置于50mL具塞塑料离心管中，加衍生液20.0mL，涡旋混匀后置于60℃恒温振荡器中静置反应2h，其间振摇2~3次，取出后冷却至室温，再作涡旋混匀，静置后取上清液，最后用0.45μm有机相微孔滤膜过滤得提取液；

5、甲醛标准溶液制备：

移取20μL、50μL、100μL、200μL、500μL甲醛标准溶液，置于10mL刻度试管中，以衍生液定容至10.0mL，盖上塞后混匀，60℃水浴加热1h，取出冷却至室温，过0.45μm有机相微孔滤膜，得甲醛标准溶液。

6、空白样本准备：

于10mL刻度试管中，以衍生液定容至10.0mL，盖上塞后混匀，60℃水浴加热1h，取出冷却至室温，过0.45μm有机相微孔滤膜，得空白样本；

7、高效液相色谱法检测：

分别对提取液、甲醛标准溶液和空白样本进行进行液相色谱分析，其中液相色谱条件——色谱柱： C₁₈柱，250mm×4.6mm（内径），5μm，或者相当者；流动相：乙腈-水（V_乙腈+V_水=50%+50%）；流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；检测波长：365nm；进样量：10μL。

根据提取液中甲醛衍生物浓度的情况选定峰面积相近的标准溶液系列。标准溶液和提取液中甲醛衍生物的响应值均应在食品检测的线性范围内。标准溶液和提取液等体积参插进样测定。以峰面积为纵坐标，甲醛衍生物标准溶液对应的甲醛浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。用保留时间定性，外标法定量。在上述色谱条件下甲醛衍生物的保留时间为 6.5min。

检测结果以公式X=（c×V）/m计算，其中：X—试样中游离甲醛的含量，单位为mg/kg；c—从标准工作曲线得到的样液对应的甲醛浓度，单位为mg/L；V—样液最终定容体积，单位为mL；m—样液所代表的试样质量，单位为g。结果中扣除经空白试验获得的空白值。

在选定的条件下，本方法的仪器检测限为0.1mg/kg。以取样2.0g计，方法检出限为1.0mg/kg。在0~20mg/kg范围内线性关系良好，相关系数r=0.9996，回归方程Y=14.81630X+3.73822。

分别添加不同含量的甲醛，每个添加重复6次，计算其平均回收率及相对标准偏差。结果显示，平均回收率均大于70%，相对标准偏差均小于3%。

检测实例：

样品为“现烤特级生鱼片”。取粉碎后的均匀样品2.01g，置于50mL塑料具塞离心管，加提取衍生液20.0mL，涡旋混匀后60℃水浴静置反应2h，其间振摇2~3次，取出冷却至室温后涡旋混匀，稍静置，取上清液过0.45μm有机相滤膜待测定。同时做空白试验。

标准系列为：分别取甲醛标准使用液（浓度为21.675mg/l）20μL，40μL，60μL，80μL，120μL置于10mL比色管中，加提取衍生液至50mL，与样品同法衍生，冷却至室温后涡旋混匀，过0.45μm有机相滤膜待测定。

色谱条件：色谱柱：Thermo Hypersil GOLD aQ c18色谱柱（250×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈+水（50+50）；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；检测波长：365nm；进样体积：10μL。

测定结果如下：

标准曲线：Y=14.81630X+3.73822，r=0.9996

样品中甲醛衍生物峰面积为225.10449mAU*s，空白试验中甲醛未检出。则根据标准曲线计算得出样品衍生液中甲醛浓度为0.2988mg/L，根据公式X=（c×V）/m计算得出，样品中游离甲醛含量X为7.43mg/kg。

Claims

1.一种即食海产品中游离甲醛的检测方法，先进行空白试验样本准备、被检样品的衍生液提取和甲醛标准溶液制备，再使用高效液相色谱分别对空白试验样本、被检样本的提取液和甲醛标准溶液进行检测，绘制标准工作曲线，最后用公式X=（c×V）/m计算，并在结果中扣除经空白试验获得的空白值，式中：X—试样中游离甲醛的含量，单位为mg/kg；c—从标准工作曲线得到的样液对应的甲醛浓度，单位为mg/L；V—样液最终定容体积，单位为mL；m—样液所代表的试样质量，单位为g；其特征是：

衍生液提取为先称取粉碎均匀的样品2.0g，置于50mL具塞塑料离心管中，加衍生液20.0mL，涡旋混匀后在60℃水浴中静置反应2h，其间振摇2~3次，取出后冷却至室温，再作涡旋混匀，静置后取上清液，最后用0.45μm有机相微孔滤膜过滤得提取液；所用衍生液为磷酸盐缓冲液与2，4-二硝基苯肼溶液按6︰4比例混合，其中2，4-二硝基苯肼溶液以称取2，4-二硝基苯肼60mg加入乙腈并定容至100mL获得，磷酸盐缓冲液是以浓度为0.05mol/L的磷酸二氢钠溶液用磷酸调节pH值至3.5所得；高效液相色谱法检测的条件是：色谱柱为Thermo Hypersil GOLD aQ-c18色谱柱；流动相为乙腈+水，两者体积各占50%；流速为1.0mL/min；柱温为40℃；检测波长为365nm；进样体积为10μL。