CN106568956A - 一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法 - Google Patents

一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法，可用于癌症标记物的高灵敏定量检测。所述方法是在密闭的体系中，对目标物进行特异性的识别，在目标物检测抗体上面修饰上信号放大分子，该信号放大分子能够催化底物分解释放出气体，导致该密闭体系内气压变化，从而推动储液器中的液体进入热反应器中，随即热反应器中的热反应试剂与所述液体混合后释放出大量的热，利用热量所致的温度变化实现对目标物的高灵敏定量检测。本发明能够准确高效地定量测定目标物浓度，并且目标物的浓度信号可以通过目视法直接获取，无需借助大型仪器，该方法解决了目前大部分高灵敏地定量检测靶标都需要借助于昂贵的仪器及专业技术人员等不足。

Description

一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法，可用于癌症标记物的高灵敏定量检测。
背景技术
定量分析检测对于食品安全以及医学检测等领域有着至关重要的意义，快速灵敏的分析检测能够及时甄别食品安全危害以及重大传染性疾病，为健康和谐的社会发展提供了保障。现有的定量检测分析方法，例如光谱仪、质谱仪、色谱仪、电泳等，已经被广泛应用于生物、化学、医学、食品等众多领域的样品检测和分析中。然而，使用这些仪器大多数需要专业的训练，并且他们造价昂贵，维护成本高。因此发展新颖、灵敏、高选择性、廉价、方便的定量检测分析方法，一直是科研工作中最为热门的课题。
综上所述，在未来的科学研究中，发展一种既不影响实验方法高灵敏度、高选择性、高准确性等优点，又能显著降低检测仪器和实验成本，既能实现实验室中高灵敏、高准确性的实验要求，又具有微型化、便携低能耗等优点，可应用于即时诊断的的定量检测分析方法是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法，能够准确高效地定量测定靶标浓度，并且待测物的浓度信号可以通过目视法直接获取，无需借助大型仪器。该方法解决了目前大部分高灵敏地定量检测靶标都需要借助于昂贵的仪器及专业技术人员等不足，仅依靠家用常见的温度计就可以对癌症标记物进行快速灵敏可视化检测。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法，所述方法是在密闭的体系中，采用抗原抗体三明治结构，对目标物(例如癌胚抗原CEA)进行特异性的识别，在目标物(例如CEA)检测抗体上面修饰上的信号放大分子能够催化底物分解释放出气体，导致该密闭体系内气压变化，从而推动储液器中的液体进入热反应器中，随即热反应器中的热反应试剂与所述液体混合后释放出大量的热，利用热量所致的温度变化实现对(CEA)目标物的高灵敏定量检测。
所述特异性识别分子对靶标进行识别，如抗原/抗体特异性检测系统。
所述信号放大分子包括过氧化氢酶、铂纳米颗粒、金铂纳米颗粒等具有催化活性的纳米材料、纳米材料复合物或酶等，其能够催化底物(例如双氧水)分解释放出大量的气体，且释放出的气体无毒无害(例如氧气)。
所述储液器中存在大量的能够与热反应器中的热反应试剂进行反应的液体。
所述热反应器中的热反应试剂可以和储液器中的液体混合释放出热量，例如，氧化钙/水、氢氧化钠/水等。
所述热反应器中产生的热量变化能够被热量感应仪器检测出来。
所述热量感应仪器为温度计或便携式红外温度检测器等。
进一步，在酶联免疫吸附法体系中，基于温度变化定量检测靶标的分析方法，具体包括如下步骤：
(1)在信号放大分子上面修饰有能够与CEA检测抗体特异性共价键合的识别单元，实现信号输出的目的；
(2)将CEA捕获抗体修饰在固体基质上面，然后对空白位点进行封堵，随后加入待检测物质，再加入CEA检测抗体，孵育一段时间后，洗涤、拍干、待用；
(3)将信号放大分子特异性结合到CEA检测抗体上；
(4)在密闭体系中，加入反应底物，信号放大分子能够分解底物生成大量的气体，使得整体环境气压增加；
(5)气压的变化导致储液器中的液体能够被定量的推动；
(6)从储液器中推送出来的液体与热反应器中的热反应试剂相互反应并产生热量，所产生的热量变化能够通过热量感应仪器检测出来，从而实现靶标分子的可视化定量检测。
其中热量变化能够通过简便的温度检测器检测出来，且能够通过目视法对信号进行读取。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、本发明突破了传统定量检测装置需要昂贵的仪器以及专业培训人员的限制，将抗原抗体的生物识别信号转换为热信号，并采用温度计作为信号读取装置，通过检测温度的变化，就能够对待测靶标的浓度进行定量检测，具有高效灵敏等优势。
2、本发明所制备的铂纳米颗粒作为模拟酶进行信号放大，能够对双氧水进行高效、稳定的催化，其催化效率不会因为反应时间的延长而降低，通过延长酶促反应时间能够对目标物进行高灵敏检测。
3、本发明将链霉亲和素修饰到铂纳米颗粒上，能够通过生物素/亲和素高效特异的结合，将铂纳米颗粒标记到检测抗体上。
4、本发明选用氧化钙与水的放热反应体系，能够在反应的过程中产生大量的热，所产生的热量能够通过温度计检测出来，并且温度的变化值与水的加入量呈线性关系。
5、本发明结合模拟酶催化信号放大以及热信号放大的双重信号放大模式，具有高灵敏度，且操作简单、价格低廉、不需要对样品进行复杂的前处理，通用性好，能够对癌症标记物等物质进行高灵敏的定量检测。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地说明：
图1为PtNPs-SA的紫外表征图；
图2为PtNPs-SA的透射电镜图；
图3为不同浓度的PtNPs-SA在30wt％H2O2存在下催化推动储液瓶中的水所排出的体积；
图4为终浓度为2.5nM的PtNPs-SA在不同浓度的H2O2存在下催化推动储液瓶中的水所排出的体积；
图5为氧化钙与不同体积的水反应后的温度变化曲线；
图6为在ELISA反应体系中，以癌胚抗原(CEA)为例，采用温度变化可视化定量方法进行检测时，不同浓度的CEA与温度变化曲线。
具体实施方式
一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法，所述方法是在密闭的体系中，采用抗原抗体三明治结构，对目标物进行特异性的识别，在目标物检测抗体上面修饰上的信号放大分子能够催化底物分解释放出气体，导致该密闭体系内气压变化，从而推动储液器中的液体进入热反应器中，随即热反应器中的热反应试剂与所述液体混合后释放出大量的热，利用热量所致的温度变化实现对目标物的高灵敏定量检测。
实施例1
铂纳米颗粒的合成
在1.5mL的Eppendorf离心管中，加入100μL 0.4M抗坏血酸和1mL 1mM H2PtCl6，混合均匀之后，放置于80℃的金属浴中孵育30min。反应过程中，溶液的颜色由浅黄色逐渐变深，所得到的棕黄色溶液即为铂纳米颗粒。
实施例2
链霉亲和素-铂纳米颗粒复合物(PtNPs-SA)的制备
取1mL上述制备得到的铂纳米颗粒，在4℃下以13000r/min高速离心5min，移去上清液，并用含有30μg/mL链霉亲和素的1mL 0.1M H3BO3(pH＝7.5)的缓冲液重新分散，随后放置于37℃旋转温育1h，随后加入100μL 10wt％BSA继续温育1h。待温育结束之后，将溶液重新放置于4℃下以13000r/min高速离心5min。移去上清液，用1mL 0.1M H3BO3(pH＝7.5),0.1wt％BSA缓冲液重新分散得到链霉亲和素-铂纳米颗粒复合物(PtNPs-SA)，并放置于4℃冷藏备用。采用紫外吸收光谱仪(UV-vis)，场发射透射电镜(TEM)对所合成的PtNPs-SA进行表征，结果如图1和2所示。
实施例3
测定链霉亲和素-铂纳米颗粒复合物的催化活性
取1mL 30wt％双氧水放置于5mL的色谱进样瓶A中，用导管将其与另外一个装有4mL水的色谱进样瓶B相互连接，此时这根导管均不与色谱进样瓶A或B中的溶液相接触。再将一根导管插入色谱进样瓶橡胶隔片中且导管尖端伸入色谱进样瓶B的底部，导管的另外一头与大气相通且整根导管均已充满水。将1μL所合成的PtNPs-SA加入到色谱进样瓶A中，并迅速旋紧盖好，经过一段时间的反应可以观察到色谱进样瓶A中有大量的气泡冒出，所产生的气体推动色谱进样瓶B中的水前进。采用分析天平对所排出的水的质量进行称量，以水的密度为1g/mL进行计算即可以得到所排出水的体积。如图3和4所示，通过对酶促反应时间以及所排出水的体积进行作图，就可以得到该模拟酶的酶催化活性。所合成的链霉亲和素-铂纳米颗粒复合物能够对双氧水进行高效、稳定的催化，其催化效率不会反应时间的延长而降低，因此可以通过延长酶促反应时间能够对目标物进行高灵敏检测。
实施例4
氧化钙与水放热实验
首先，分别称取1.5g干燥的氧化钙固体粉末并放置于热反应瓶中，再将不同体积的水加入到热反应瓶内，通过温度计监测反应体系中的温度变化。热反应瓶中的温度随着水的加入而开始不断的上升，并且可以通过温度计直接地观察到温度变化数值。如图5所示，随着水加入量的逐渐增加，反应瓶内的温度也逐渐上升，并且具有线性相关。
实施例5
ELISA检测反应(双抗夹心法)
在固体基底(如96孔板)上面进行CEA捕获抗体的包被，其浓度为0.5μg/mL，体积为100μL，封膜，4℃静置过夜。然后用洗涤液洗涤3-4次，随后加入300μL封闭液37℃封闭2h。然后加入不同浓度的CEA孵育2h，再用洗涤液反复洗涤3-4次，加入100μL，1.5μg/mL的CEA检测抗体，室温孵育1h。重复洗涤3-4次，拍干，随后加入100μL 1nM的链霉亲和素-铂纳米颗粒复合物(PtNPs-SA)，室温孵育30min。在固体基底中加入1mL 30wt％H2O2，迅速将反应瓶密封。铂纳米颗粒复合物不断催化分解双氧水分解生成氧气，使得反应瓶内的压强不断的增加。反应一段时间之后，松开反应瓶中的止气阀，大量的气体一次性的涌出，推动储液器中的水前进，一次性排出大量的水。所排出的水与氧化钙反应放出大量的热，并导致温度的变化。根据温度计所显示的示数，记录检测结果。如图6所示，CEA的浓度与温度的变化值呈线性关系，其线性方程为y＝0.1464x+0.1828，r2＝0.994，线性范围为7.8～500pg/mL，检测限为0.6pg/mL(S/N＝3)。
本实施例利用纳米颗粒作为模拟酶，催化分解双氧水生成大量的氧气，所产生的氧气使得反应体系中整体气压升高，从而推动储液器中的水进入热反应瓶中，随即在热反应瓶中的氧化钙与水混合后释放出大量的热。本实施例成功的将检测靶标的分子信号转换为热信号，并且可以通过温度计来检测热量的变化，从而实现了可视化定量检测的目的。采用温度计作为信号输出器件，具有便宜方便、简单易用等优点，为疾病诊断提供了新的平台。

Claims (7)

1.一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法，其特征在于：在密闭的体系中，对目标物进行特异性的识别，在目标物检测抗体上面修饰上信号放大分子，所述信号放大分子能够催化底物分解释放出气体，导致该密闭体系内气压变化，从而推动储液器中的液体进入热反应器中，随即热反应器中的热反应试剂与所述液体混合后释放出大量的热，利用热量所致的温度变化实现对目标物的高灵敏定量检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法，其特征在于：所述信号放大分子包括可以催化底物分解释放出气体的纳米颗粒、纳米颗粒复合物或酶，所释放的气体能够产生较大的气压且无毒无害。
3.根据权利要求1所述的一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法，其特征在于：所述储液器中存在能够与热反应器中的热反应试剂进行反应的液体。
4.根据权利要求1所述的一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法，其特征在于：所述热反应器中的热反应试剂可以和储液器中的液体混合释放出热量。
5.根据权利要求1所述的一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法，其特征在于：所述热反应器中产生的热量变化能够被热量感应仪器检测出来。
6.根据权利要求1所述的一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法，其特征在于：所述热量感应仪器为温度计或红外温度检测器。
7.根据权利要求1所述的一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法，其特征在于：所述分析方法应用于酶联免疫吸附法体系中，所述目标物为癌胚抗原CEA，具体包括如下步骤：
（1）在信号放大分子上面修饰上能够与CEA检测抗体特异性共价键合的识别单元，实现信号输出的目的；
（2）将CEA捕获抗体修饰在固体基质上面，然后对空白位点进行封堵，随后加入待检测物质，再加入CEA检测抗体，孵育一段时间后，洗涤、拍干、待用；
（3）将信号放大分子特异性结合到检测抗体上；
（4）在密闭体系中，加入反应底物，信号放大分子能够分解底物生成大量的气体，使得整体环境气压增加；
（5）气压的变化导致储液器中的液体能够被定量的推动；
（6）从储液器中推送出来的液体与热反应器中的热反应试剂相互反应并产生热量，所产生的热量变化能够通过热量感应仪器检测出来，从而实现目标物的可视化定量检测。
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