CN105911278A - 一种基于具有过氧化氢酶活性的纳米酶的elisa检测方法 - Google Patents

一种基于具有过氧化氢酶活性的纳米酶的elisa检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105911278A
CN105911278A CN201610347565.6A CN201610347565A CN105911278A CN 105911278 A CN105911278 A CN 105911278A CN 201610347565 A CN201610347565 A CN 201610347565A CN 105911278 A CN105911278 A CN 105911278A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen
detection
gold nano
nano grain
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610347565.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105911278B (zh
Inventor
杨朝勇
李久兴
刘芳
何梦逸
朱志
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xiamen University
Original Assignee
Xiamen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xiamen University filed Critical Xiamen University
Priority to CN201610347565.6A priority Critical patent/CN105911278B/zh
Publication of CN105911278A publication Critical patent/CN105911278A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105911278B publication Critical patent/CN105911278B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/908—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于具有过氧化氢酶活性的纳米酶的ELISA检测方法，适用于双抗体夹心法或双抗原夹心法，先在金纳米颗粒上修饰检测抗体/检测抗原；再进行ELISA检测形成捕获抗体/捕获抗原‑待测抗原/待测抗体‑检测抗体/检测抗原‑金纳米颗粒复合物；然后进行银铂染，在金纳米颗粒表面包裹银壳层和铂壳层，得到具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒，再利用其在密闭体系中催化过氧化氢分解产生氧气，使密闭体系中气压增强，检测气压变化即可检测得到待测抗原/待测抗体的量。本发明采用先修饰后成酶的方法，具有简单、快捷的优点和很好的稳定性，能够有效避免非特异性吸附及修饰导致的纳米酶颗粒催化活性下降，为环境监测和疾病诊断提供新的平台。

Description

一种基于具有过氧化氢酶活性的纳米酶的ELISA检测方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种基于纳米酶的ELISA检测方法，更具体地是涉及一种基于具有过氧化氢酶活性的纳米酶的ELISA检测方法。
背景技术
过氧化氢酶是一种能够催化过氧化氢分解产生氧气的蛋白酶。目前，过氧化氢酶已经被广泛的应用于化学传感、环境检测和疾病诊断。然而，蛋白酶具有易失活、不易保存和难制备等不足，极大的限制了过氧化氢酶的应用范围。
纳米酶是具有类似于蛋白酶催化能力的纳米材料，它们有合成简单、成本低廉和催化活性强的优点，能够很好的弥补蛋白酶的不足。在各种纳米酶中，铂纳米颗粒由于极强的过氧化氢酶活性而被广泛的应用于环境监测与疾病诊断。然而铂纳米颗粒催化活性不稳定、容易发生团聚，并且会由于表面修饰而使催化活性下降，限制了具有过氧化氢酶活性的纳米酶在分析检测中的应用。
因此，发展简单、快捷、稳定且能够避免由于修饰导致催化活性下降的方法，制备具有强过氧化氢酶活性的纳米酶具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种基于纳米酶的ELISA检测方法，该种纳米酶通过银铂染的方法制备，具有过氧化氢酶活性，本发明能够解决现有技术中纳米酶催化活性不稳定，容易由于修饰导致催化活性降低的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种基于具有过氧化氢酶活性的纳米酶的ELISA检测方法，适用于双抗体夹心法或双抗原夹心法，其中双抗体夹心法的检测步骤包括：
a)根据待测样品中待测抗原的种类选择相应的捕获抗体和检测抗体；
b)在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰步骤a)所述的检测抗体，得到修饰有检测抗体的金纳米颗粒；
c)进行ELISA检测：包被捕获抗体→加入待测样品使待测抗原与捕获抗体结合→加入步骤b)得到的修饰有检测抗体的金纳米颗粒并使待测抗原与其中的检测抗体结合，形成捕获抗体-待测抗原-检测抗体-金纳米颗粒复合物；
d)对步骤c)得到的捕获抗体-待测抗原-检测抗体-金纳米颗粒复合物进行银铂染：加入Ag+溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～5mM，利用对苯二酚还原Ag+以在复合物中的金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl6 2-溶液和抗坏血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl6 2-以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，得到具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒，形成捕获抗体-待测抗原-检测抗体-Au@AgPt颗粒复合物；
e)在0.1～10M过氧化氢存在条件下，利用步骤d)得到的捕获抗体-待测抗原-检测抗体-Au@AgPt颗粒复合物中具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒在密闭体系中催化过氧化氢分解产生氧气，使密闭体系中气压增强，检测气压变化量以得到待测抗原的量。
双抗原夹心法的检测步骤包括：
a’)根据待测样品中待测抗体的种类选择相应的捕获抗原和检测抗原；
b’)在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰步骤a’)所述的检测抗原，得到修饰有检测抗原的金纳米颗粒；
c’)进行ELISA检测：包被捕获抗原→加入待测样品使待测抗体与捕获抗原结合→加入步骤b’)得到的修饰有检测抗原的金纳米颗粒并使待测抗体与其中的检测抗原结合，形成捕获抗原-待测抗体-检测抗原-金纳米颗粒复合物；
d’)对步骤c’)得到的捕获抗原-待测抗体-检测抗原-金纳米颗粒复合物进行银铂染：加入 Ag+溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～5mM，利用对苯二酚还原Ag+以在复合物中的金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl6 2-溶液和抗坏血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl6 2-以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，得到具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒，形成捕获抗原-待测抗体-检测抗原-Au@AgPt颗粒复合物；
e’)在0.1～10M过氧化氢存在条件下，利用步骤d’)得到的捕获抗原-待测抗体-检测抗原-Au@AgPt颗粒复合物中具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒在密闭体系中催化过氧化氢分解产生氧气，使密闭体系中气压增强，检测气压变化量以得到待测抗体的量。
一实施例中：所述步骤b)或b’)中，金纳米颗粒粒径为13～20nm。
一实施例中：所述步骤d)或d’)中，Ag+溶液的终浓度为100～150μM。
一实施例中：所述步骤d)或d’)中，对苯二酚的终浓度为0.2～1mM。
一实施例中：所述步骤d)或d’)中，PtCl6 2-溶液的终浓度为0.4～0.6mM。
一实施例中：所述步骤d)或d’)中，抗坏血酸的终浓度为10～20mM。
一实施例中：所述步骤e)或e’)中，过氧化氢的浓度为1～5M。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
一种具有过氧化氢酶活性的纳米酶制备方法，其特征在于：包括：
1)在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰蛋白质，得到修饰有蛋白质的金纳米颗粒；或直接选用粒径5～30nm的金纳米颗粒，不修饰蛋白质；
其中，所述蛋白质可以为抗体或抗原，相应地制备得到的修饰后的金纳米颗粒可应用于ELISA的双抗体夹心法或双抗原夹心法；当然，所述蛋白质也可以为其他种类；
2)对步骤1)得到的修饰有蛋白的金纳米颗粒进行银铂染，或直接对不修饰蛋白质的金纳米颗粒进行银铂染：加入Ag+溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～5mM，利用对苯二酚还原Ag+以在金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl6 2-溶液和抗坏 血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl6 2-以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，得到Au@AgPt颗粒，即为所述之具有过氧化氢酶活性的纳米酶。
其中，当所述蛋白质为抗体或抗原时，得到的纳米酶可以用于ELISA检测中，作用于过氧化氢并用于检测。当所述蛋白质为其他种类时，可以相应地用于其他用途。若直接对未修饰蛋白质的金纳米颗粒进行银铂染，则得到的纳米酶也可以单纯地作为过氧化氢酶使用。
本发明还提供了根据上述制备方法所制备的具有过氧化氢酶活性的纳米酶。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
首先，本发明利用金纳米颗粒表面与蛋白的强吸附作用，可以有效避免检测抗体或检测抗原修饰的金纳米颗粒发生非特异性吸附；其次，本发明先将检测抗体或检测抗原修饰在金纳米颗粒上，进行ELISA检测反应后，再利用银铂染形成具有强过氧化氢酶活性的纳米颗粒，即先修饰再成酶，从而避免了传统先成酶再修饰技术中修饰过程导致的酶催化活性下降；然后，本发明制备的具有过氧化氢酶活性的纳米酶具有催化活性强、稳定且重现性好的优点，其催化形成的产物是环境友好的氧气与水，并且能够通过手持式的气压计测定靶标浓度。综上所述，与基于铂纳米颗粒的ELISA方法相比，本发明的方法简单、快捷、稳定性好，且能够避免非特异性吸附及修饰导致的催化活性降低，为具有过氧化氢酶活性的纳米酶在生物分析和生物医学中的应用提供新的平台。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为本发明的ELISA检测原理图(双抗体夹心法)。
图2为实施例2中银铂染条件优化的实验结果示意图，(A)为不同浓度硝酸银，(A)为不同浓度氯铂酸，(C)为不同浓度对苯二酚，(D)为不同浓度抗坏血酸。
图3为实施例3中Au/BSA颗粒、Au/BSA@Ag颗粒和Au/BSA@AgPt颗粒的照片(A)， 紫外可见光谱示意图(B)，扫描电镜表征银铂染前后的对比示意图(C)，高分辨透射电镜表征银铂染后的元素分布示意图(D)。
图4为实施例5中利用本发明的ELISA检测方法检测待测抗原CRP的检测结果示意图(A)和选择性示意图(B)，以及利用本发明的ELISA检测方法检测待测抗原H5N1的检测结果示意图(C)和选择性示意图(D)。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
实施例1：金纳米颗粒的制备
在圆底烧瓶中加入100mL 0.01wt％氯金酸，在连续搅拌下煮沸回流，匀速加入1mL 3wt％柠檬酸钠，继续搅拌煮沸30min，合成粒径为16nm的金纳米颗粒(AuNPs)。通过调整氯金酸和柠檬酸钠的比例，可以得到不同粒径大小的金纳米颗粒。
实施例2：银铂染条件的对比试验
本实施例之中，采用牛血清白蛋白BSA修饰金纳米颗粒。当然，也可以不用BSA修饰，直接对实施例1得到的金纳米颗粒进行银铂染，同样可得到具有过氧化物酶活性的纳米酶。
首先，向96孔板中加入100μL 2wt％BSA/PBS溶液，37℃下孵育1h，300μL PBS洗涤三遍。随后加入100μL 2.5nM实施例1中制备的16nm AuNPs(对照组不加AuNPs)，37℃孵育1h，300μL PBS洗涤三遍。然后加入300μL Blocking Buffer(含2wt％BSA和0.1wt％Tween20的PBS溶液)，37℃孵育1h，300μL PBS洗涤三遍，得到BSA修饰的金纳米颗粒Au/BSA，其包裹吸附在96孔板表面。
随后，向上述96孔板中加入50μL不同浓度硝酸银(AgNO3)溶液和50μL不同浓度对苯二酚，使Ag+的终浓度分别为0、31.25、62.5、125、250、500μM而对苯二酚的终浓度分别为0、0.008、0.04、0.2、1、5mM，37℃反应20min，300μL水洗涤三遍。然后加入50μL不同浓度氯铂酸(H2PtCl6)溶液和50μL不同浓度抗坏血酸，使PtCl6 2-的终浓度分别为0、0.125、 0.25、0.5、1、2mM而抗坏血酸的终浓度分别为0、0.08、0.4、2、10、50mM，37℃反应20min，300μL水洗涤三遍，得到具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au/BSA@AgPt颗粒。
最后，向96孔板中加入100μL 1M过氧化氢，用盖子封闭96孔板，利用具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au/BSA@AgPt颗粒在37℃催化过氧化氢，反应20min，利用气压计测定反应后的96孔板内的压强。
结果如图2所示(图中BSA即为不加AuNPs的对照组)，Ag+的终浓度以100～150μM为佳，对苯二酚的终浓度以0.2～1mM为佳，PtCl6 2-的终浓度以0.4～0.6mM为佳，抗坏血酸的终浓度以10～20mM为佳，效果较好。
实施例3：银铂染后得到的具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒的表征
向1mL 2.5nM实施例1中得到的金纳米颗粒AuNPs中加入AgNO3溶液和对苯二酚并使Ag+和对苯二酚的终浓度分别为125μM和0.2mM，37℃反应20min。300μL水洗涤三遍，得到Au@Ag颗粒。随后加入H2PtCl6溶液和抗坏血酸并使PtCl6 2-和抗坏血酸的终浓度分别为0.5mM和10mM，37℃反应20min，300μL水洗涤三遍，得到具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒。利用相机、紫外可见吸收光谱仪、扫描电镜和高分辨透射电镜对银染前后的金纳米颗粒进行表征。
结果如图3所示，得到的具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒中，金纳米颗粒外依次包裹有银壳层和铂壳层。
实施例4：在金纳米颗粒上修饰检测抗体
取1mL实施例1得到的粒径为16nm的金纳米颗粒AuNPs于1.5mL离心管中，向其中加入10μL 1mg/mL检测抗体和50μL 0.2M Na2HPO4，在37℃孵育20min。随后向其中加入50μL 2％BSA/PBS溶液，混匀后在37℃孵育20min，然后将其在14000rpm下离心10min，用1mL 0.1％BSA/10mM Na2HPO4重悬，该离心/重悬过程重复2遍，最后将其分散于250μL 0.1％BSA/10mM Na2HPO4溶液中，得到修饰有检测抗体的金纳米颗粒；4℃保存备用。
实施例5：ELISA检测反应(双抗体夹心法)
a)根据待测样品中待测抗原的种类选择相应的捕获抗体和检测抗体；本实施例之中，待测抗原为CRP和H5N1，根据两种待测抗原分别选择各自相应的捕获抗体和检测抗体；
b)采用实施例4的方法得到两种分别修饰有CRP和H5N1对应的检测抗体的金纳米颗粒；
c)进行ELISA检测：
在96孔板中加入100μL 2μg/mL捕获抗体，4℃孵育过夜，300μL Wash Buffer(含有0.1wt％Tween 20PBS溶液)洗涤三遍。随后，加入300μL Block Buffer(含有2wt％BSA的Wash Buffer)，37℃孵育1h，300μL Wash Buffer洗涤三遍；
加入100μL待测样品，25℃孵育1h使待测抗原与捕获抗体结合，300μL Wash Buffer洗涤三遍；
加入100μL 2.5nM步骤b)得到的修饰有检测抗体的金纳米颗粒，37℃孵育1h，使待测抗原与其中的检测抗体结合，300μL Wash Buffer洗涤两遍，300μL水洗涤一遍，在96孔板中得到捕获抗体-待测抗原-检测抗体-金纳米颗粒复合物；
d)对步骤c)得到的捕获抗体-待测抗原-检测抗体-金纳米颗粒复合物进行银铂染：在96孔板中加入50μL AgNO3溶液和50μL对苯二酚并使Ag+和对苯二酚的终浓度分别为125μM和0.2mM，37℃反应20min，利用对苯二酚还原Ag+以在复合物中的金纳米颗粒表面包裹银壳层；300μL水洗涤三遍；随后加入50μL H2PtCl6溶液和50μL抗坏血酸并使PtCl6 2-和抗坏血酸的终浓度分别为0.5mM和10mM，37℃反应20min，利用抗坏血酸还原PtCl6 2-以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，300μL水洗涤三遍，分别得到具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au/CRP@AgPt颗粒和Au/H5N1@AgPt颗粒，即在96孔板中分别形成捕获抗体-待测抗原-检测抗体Au/CRP@AgPt颗粒复合物和捕获抗体-待测抗原-检测抗体Au/H5N1@AgPt颗粒复合物；
e)向96孔板中加入100μL 1M过氧化氢，用盖子封闭96孔板，37℃反应20min，利用步骤d)得到的捕获抗体-待测抗原-检测抗体Au/CRP@AgPt颗粒复合物和捕获抗体-待测抗原- 检测抗体Au/H5N1@AgPt颗粒复合物中具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au/CRP@AgPt颗粒和Au/H5N1@AgPt颗粒催化过氧化氢分解产生氧气，引起密闭的96孔板内压强改变，利用气压计测定反应后的96孔板内的压强，以分别计算得到待测抗原CRP和H5N1的量。
结果如图4所示，利用本发明的方法对待测抗原CRP和H5N1分别进行检测，线性和选择性良好。
上述实施例提供了双抗体夹心法的ELISA检测，但本发明同样适用于双抗原夹心法的ELISA检测：
a’)根据待测样品中待测抗体的种类选择相应的捕获抗原和检测抗原；
b’)参照实施例4的方法，在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰步骤a’)所述的检测抗原，得到修饰有检测抗原的金纳米颗粒；
c’)参照实施例5的具体参数进行ELISA检测：包被捕获抗原→加入待测样品使待测抗体与捕获抗原结合→加入步骤b’)得到的修饰有检测抗原的金纳米颗粒并使待测抗体与其中的检测抗原结合，形成捕获抗原-待测抗体-检测抗原-金纳米颗粒复合物；
d’)参照实施例5的具体参数对步骤c’)得到的捕获抗原-待测抗体-检测抗原-金纳米颗粒复合物进行银铂染：加入Ag+溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～50mM，利用对苯二酚还原Ag+以在复合物中的金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl6 2-溶液和抗坏血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl6 2-以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，得到具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒，形成捕获抗原-待测抗体-检测抗原-Au@AgPt颗粒复合物；
e’)参照实施例5的具体参数，利用步骤d’)得到的捕获抗原-待测抗体-检测抗原-Au@AgPt颗粒复合物中具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒在密闭体系中催化过氧化氢分解产生气体，引起密闭体系的压强改变，利用气压计测定反应后的96孔板内的压强，以计算得到待测抗体的量。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (9)

1.一种基于具有过氧化氢酶活性的纳米酶的ELISA检测方法，其特征在于：适用于双抗体夹心法或双抗原夹心法，包括：
a)根据待测样品中待测抗原的种类选择相应的捕获抗体和检测抗体；
b)在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰步骤a)所述的检测抗体，得到修饰有检测抗体的金纳米颗粒；
c)进行ELISA检测：包被捕获抗体→加入待测样品使待测抗原与捕获抗体结合→加入步骤b)得到的修饰有检测抗体的金纳米颗粒并使待测抗原与其中的检测抗体结合，形成捕获抗体-待测抗原-检测抗体-金纳米颗粒复合物；
d)对步骤c)得到的捕获抗体-待测抗原-检测抗体-金纳米颗粒复合物进行银铂染：加入Ag+溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～5mM，利用对苯二酚还原Ag+以在复合物中的金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl6 2-溶液和抗坏血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl6 2-以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，得到具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒，形成捕获抗体-待测抗原-检测抗体-Au@AgPt颗粒复合物；
e)在0.1～10M过氧化氢存在条件下，利用步骤d)得到的捕获抗体-待测抗原-检测抗体-Au@AgPt颗粒复合物中具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒在密闭体系中催化过氧化氢分解产生氧气，使密闭体系中气压增强，检测气压变化量以得到待测抗原的量；
或，
a’)根据待测样品中待测抗体的种类选择相应的捕获抗原和检测抗原；
b’)在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰步骤a’)所述的检测抗原，得到修饰有检测抗原的金纳米颗粒；
c’)进行ELISA检测：包被捕获抗原→加入待测样品使待测抗体与捕获抗原结合→加入步骤b’)得到的修饰有检测抗原的金纳米颗粒并使待测抗体与其中的检测抗原结合，形成捕获抗原-待测抗体-检测抗原-金纳米颗粒复合物；
d’)对步骤c’)得到的捕获抗原-待测抗体-检测抗原-金纳米颗粒复合物进行银铂染：加入Ag+溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～5mM，利用对苯二酚还原Ag+以在复合物中的金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl6 2-溶液和抗坏血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl6 2-以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，得到具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒，形成捕获抗原-待测抗体-检测抗原-Au@AgPt颗粒复合物；
e’)在0.1～10M过氧化氢存在条件下，利用步骤d’)得到的捕获抗原-待测抗体-检测抗原-Au@AgPt颗粒复合物中具有过氧化氢酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒在密闭体系中催化过氧化氢分解产生氧气，使密闭体系中气压增强，检测气压变化量以得到待测抗体的量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤b)或b’)中，金纳米颗粒粒径为13～20nm。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤d)或d’)中，Ag+溶液的终浓度为100～150μM。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤d)或d’)中，对苯二酚的终浓度为0.2～1mM。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤d)或d’)中，PtCl6 2-溶液的终浓度为0.4～0.6mM。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤d)或d’)中，抗坏血酸的终浓度为10～20mM。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤e)或e’)中，过氧化氢的浓度为1～5M。
8.一种具有过氧化氢酶活性的纳米酶制备方法，其特征在于：包括：
1)在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰蛋白质，得到修饰有蛋白质的金纳米颗粒；或直接选用粒径5～30nm的金纳米颗粒，不修饰蛋白质；
2)对步骤1)得到的修饰有蛋白的金纳米颗粒进行银铂染，或直接对不修饰蛋白质的金纳米颗粒进行银铂染：加入Ag+溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～5mM，利用对苯二酚还原Ag+以在金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl6 2-溶液和抗坏血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl6 2-以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，得到Au@AgPt颗粒，即为所述之具有过氧化氢酶活性的纳米酶。
9.一种根据权利要求8的制备方法所制备的具有过氧化氢酶活性的纳米酶。
CN201610347565.6A 2016-05-23 2016-05-23 一种基于具有过氧化氢酶活性的纳米酶的elisa检测方法 Active CN105911278B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610347565.6A CN105911278B (zh) 2016-05-23 2016-05-23 一种基于具有过氧化氢酶活性的纳米酶的elisa检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610347565.6A CN105911278B (zh) 2016-05-23 2016-05-23 一种基于具有过氧化氢酶活性的纳米酶的elisa检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105911278A true CN105911278A (zh) 2016-08-31
CN105911278B CN105911278B (zh) 2017-11-17

Family

ID=56741525

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610347565.6A Active CN105911278B (zh) 2016-05-23 2016-05-23 一种基于具有过氧化氢酶活性的纳米酶的elisa检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105911278B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106568956A (zh) * 2016-11-15 2017-04-19 福州大学 一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法
MD4522B1 (ro) * 2016-12-22 2017-10-31 Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы Procedeu de evaluare a toxicităţii nanoparticulelor oxizilor de metale cu utilizarea levurilor
CN111007244A (zh) * 2019-11-15 2020-04-14 中国农业科学院油料作物研究所 二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器及检测方法
CN112881585A (zh) * 2021-01-12 2021-06-01 赣南师范大学 一种基于纳米酶催化驱动的银源检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101623762A (zh) * 2008-07-09 2010-01-13 国家纳米科学中心 金核/银铂合金壳结构的岛状多孔三金属纳米棒及其制法
US20120238442A1 (en) * 2008-08-27 2012-09-20 Korea University Research And Business Foundation Nanoparticles including metal oxide having catalytic activity
US20140106260A1 (en) * 2012-10-11 2014-04-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Core-shell nanoparticulate compositions and methods
CN103878365A (zh) * 2014-03-11 2014-06-25 上海交通大学 一种铂包覆银核壳结构纳米颗粒的制备方法
CN104634695A (zh) * 2014-06-09 2015-05-20 厦门大学 一种基于气压检测靶标的定量检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101623762A (zh) * 2008-07-09 2010-01-13 国家纳米科学中心 金核/银铂合金壳结构的岛状多孔三金属纳米棒及其制法
US20120238442A1 (en) * 2008-08-27 2012-09-20 Korea University Research And Business Foundation Nanoparticles including metal oxide having catalytic activity
US20140106260A1 (en) * 2012-10-11 2014-04-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Core-shell nanoparticulate compositions and methods
CN103878365A (zh) * 2014-03-11 2014-06-25 上海交通大学 一种铂包覆银核壳结构纳米颗粒的制备方法
CN104634695A (zh) * 2014-06-09 2015-05-20 厦门大学 一种基于气压检测靶标的定量检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEI LIU等: "A label-free amperometric immunosensor for detection of zearalenone based on trimetallic Au-coreAgPt-shell nanorattles and mesoporous carbon", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 *
王宁寰: "《点石成金 神奇的新材料与纳米技术》", 28 February 2010, 山东教育出版社 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106568956A (zh) * 2016-11-15 2017-04-19 福州大学 一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法
CN106568956B (zh) * 2016-11-15 2018-07-17 福州大学 一种基于温度变化定量检测目标物的分析方法
MD4522B1 (ro) * 2016-12-22 2017-10-31 Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы Procedeu de evaluare a toxicităţii nanoparticulelor oxizilor de metale cu utilizarea levurilor
CN111007244A (zh) * 2019-11-15 2020-04-14 中国农业科学院油料作物研究所 二乙酸镳草镰刀菌烯醇竞争型气压免疫传感器及检测方法
CN112881585A (zh) * 2021-01-12 2021-06-01 赣南师范大学 一种基于纳米酶催化驱动的银源检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105911278B (zh) 2017-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tian et al. An electrochemical dual-aptamer biosensor based on metal-organic frameworks MIL-53 decorated with Au@ Pt nanoparticles and enzymes for detection of COVID-19 nucleocapsid protein
Zhao et al. Prussian blue nanoparticles based lateral flow assay for high sensitive determination of clenbuterol
Zhao et al. Recent improvements in enzyme-linked immunosorbent assays based on nanomaterials
CN105911278A (zh) 一种基于具有过氧化氢酶活性的纳米酶的elisa检测方法
Gao et al. High-index {hk 0} faceted platinum concave nanocubes with enhanced peroxidase-like activity for an ultrasensitive colorimetric immunoassay of the human prostate-specific antigen
Atar et al. A novel QCM immunosensor development based on gold nanoparticles functionalized sulfur-doped graphene quantum dot and h-ZnS-CdS NC for Interleukin-6 detection
Song et al. Sandwich-type electrochemical immunosensor for CEA detection using magnetic hollow Ni/C@ SiO2 nanomatrix and boronic acid functionalized CPS@ PANI@ Au probe
CN106018819A (zh) 一种基于具有过氧化物酶活性的纳米酶的elisa检测方法
Ehzari et al. Label-free electrochemical immunosensor for sensitive HER2 biomarker detection using the core-shell magnetic metal-organic frameworks
Yao et al. A new dual-mode SERS and RRS aptasensor for detecting trace organic molecules based on gold nanocluster-doped covalent-organic framework catalyst
Wu et al. Highly sensitive enzyme-free immunosorbent assay for porcine circovirus type 2 antibody using Au-Pt/SiO2 nanocomposites as labels
Lv et al. The label-free immunosensor based on rhodium@ palladium nanodendrites/sulfo group functionalized multi-walled carbon nanotubes for the sensitive analysis of carcino embryonic antigen
Zhang et al. Gold/platinum bimetallic nanomaterials for immunoassay and immunosensing
CN106442994B (zh) 一种基于Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法及应用
Zheng et al. Microfluidic paper-based analytical device by using Pt nanoparticles as highly active peroxidase mimic for simultaneous detection of glucose and uric acid with use of a smartphone
Quintero-Jaime et al. Carbon nanotubes modified with Au for electrochemical detection of prostate specific antigen: Effect of au nanoparticle size distribution
Moses Phiri et al. Facile immobilization of glucose oxidase onto gold nanostars with enhanced binding affinity and optimal function
Dong et al. “Gold-plated” IRMOF-3 and sea cucumber-like Pd@ PtRh SNRs based sandwich-type immunosensor for dual-mode detection of PCT
Wang et al. An ultrasensitive peroxydisulfate electrochemiluminescence immunosensor for Streptococcus suis serotype 2 based on l-cysteine combined with mimicking bi-enzyme synergetic catalysis to in situ generate coreactant
Huang et al. Thi-Au-Fe3O4 confined in ZIF-8 nanoreactor as signal-amplifying tag for constructing high-efficiency electrochemical platform
Shao et al. Recent advances in enzyme-enhanced immunosensors
Tang et al. Multienzyme mimetic activities of holey CuPd@ H–C3N4 for visual colorimetric and ultrasensitive fluorometric discriminative detection of glutathione and glucose in physiological fluids
Li et al. Horseradish peroxidase-loaded nanospheres attached to hollow gold nanoparticles as signal enhancers in an ultrasensitive immunoassay for alpha-fetoprotein
Shu et al. Enzyme-Mimetic nano-immunosensors for amplified detection of food hazards: Recent advances and future trends
Chanarsa et al. A bifunctional nanosilver-reduced graphene oxide nanocomposite for label-free electrochemical immunosensing

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant