CN104833802A - 一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法 - Google Patents
一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法，本发明通过生物识别元件修饰的免疫磁珠分离并富集目标微生物，提高了目标微生物的浓度，通过脲酶催化反应改变尿素溶液的盐离子浓度，有效地放大了检测信号，大幅度提高检测灵敏度；并且脲酶催化反应属于液-液相反应，该反应模式效率高于传统的固-液相反应，可以大幅度提高检测速度，实现在2小时内得到少量微生物的定量检测结果。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，更具体涉及一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法。
背景技术
近年来，食品安全事故处于多发期，食品安全已成为我国面临的最突出问题之一。其中因病原微生物引起的食品安全事件由于具有危害大、预防控制困难等特点，日益受到政府及科研人员的关注，而病原微生物的早期筛查是预防和控制此类食品安全事件的关键，由于现有的常规检测方法仍无法兼顾检测微生物的高灵敏性和快速性，因此迫切需要发展病原微生物高灵敏快速检测技术。
阻抗生物传感器方法是一种新型生物检测技术，具有检测速度较快、灵敏度较高和操作较简单等优点，已在农业、食品、环境和卫生等领域的科研工作中得到了密切关注。目前，阻抗生物传感器方法通常是在叉指阵列微电极表面修饰上生物识别元件，进行目标物的特异性捕获，再通过测量目标物捕获引起的阻抗变化来测定目标物含量，然而这种方法主要存在两方面的缺陷：(1)在电极上修饰生物识别元件通常存在需要复杂冗长的生物修饰过程、系统重复性不理想和电极很难重复使用等问题，从而限制了它的实际应用；(2)电极表面修饰的生物识别元件对目标物的捕获是固-液相反应过程，造成目标物的捕获效率通常较低，很大程度降低了系统检测灵敏度。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明要解决的技术问题是如何提高检测微生物的灵敏度、降低检测成本和缩短检测时间。
(二)技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法，所述方法包括以下步骤：
S1、利用目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁珠对所述目标微生物进行捕获，通过磁分离得到纯化的和富集的磁珠-目标物复合体；
S2、利用脲酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的免疫胶体金与所述磁珠-目标物复合体进行结合，形成磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体；
S3、利用所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体中的脲酶催化尿素溶液水解，改变所述尿素溶液的盐离子浓度；
S4、利用叉指阵列微电极检测所述尿素溶液中的盐离子浓度，得到所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体中的脲酶的浓度，从而得到所述免疫胶体金的浓度，根据所述免疫胶体金的浓度得到目标微生物的浓度。
优选地，所述步骤S1具体包括以下步骤：
S11、利用生物素、链霉亲和素、磁珠以及所述第一生物识别元件制备所述免疫磁珠，将所述免疫磁珠溶解于磷酸盐缓冲液；
S12、将所述免疫磁珠与含有所述目标微生物的样本溶液进行混合孵育，所述免疫磁珠捕获所述目标微生物，形成所述磁珠-目标物复合体；
S13、利用磁场从所述免疫磁珠与所述样本溶液形成的混合溶液中分离并富集所述磁珠-目标物复合体。
优选地所述步骤S11中制备所述免疫磁珠具体包括以下步骤：
S111、将所述链霉亲和素与磁珠偶联；
S112、将所述生物素与所述第一生物识别元件偶联；
S113、将所述链霉亲和素修饰的磁珠与所述生物素修饰的第一生物识别元件进行偶联形成所述免疫磁珠。
优选地，所述步骤S2具体包括以下步骤：
S21、利用柠檬酸三纳还原法制备胶体金；
S22、对所述胶体金进行所述脲酶和所述第二生物识别元件的修饰，形成所述免疫胶体金，将所述免疫胶体金溶解于超纯水；
S23、将所述免疫胶体金与所述磁珠-目标物复合体的溶液进行混合孵育，形成所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体；
S24、利用磁场从所述免疫胶体金与所述磁珠-目标物复合体形成的混合溶液中分离出所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体。
优选地，所述步骤S24之后还包括以下步骤：
S25、依次使用含有吐温的磷酸盐缓冲液和超纯水洗涤以除去所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体溶液中未与所述目标微生物结合的所述免疫胶体金以及残存的盐离子。
优选地，所述步骤S23中，首先利用磁场捕获所述磁珠-目标物复合体并除去上清液，再利用所述免疫胶体金溶解所述磁珠-目标物复合体，之后进行混合孵育，形成所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体。
优选地，所述步骤S3具体包括以下步骤：
S31、利用磁场捕获所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体并除去上清液，之后用所述尿素溶液溶解所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体；
S32、利用所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体中的脲酶催化尿素水解反应后，利用磁场捕获所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体并分离得到上清液。
优选地，所述步骤S31中，利用超纯水溶解尿素形成所述尿素溶液。
优选地，所述步骤S4中，利用所述叉指阵列微电极检测所述上清液的阻抗，并计算与所述尿素溶液的阻抗的差，作为阻抗变化值，根据所述阻抗变化值得到所述尿素溶液的盐离子浓度。
优选地，所述第一生物识别元件和第二生物识别元件与目标微生物的结合位点不同。
(三)有益效果
本发明提供了一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法，利用本发明的方法可以大幅度提高检测灵敏度，本发明首先通过生物识别元件修饰的免疫磁珠分离并富集目标微生物，提高了目标微生物的浓度，之后利用脲酶催化反应改变尿素溶液的盐离子浓度，有效地放大了检测信号，且该脲酶催化反应属于液-液相反应，反应效率高于传统的固-液相反应；
利用本发明的方法可以大幅度提高检测速度，可在2小时内得到极少量微生物的定量检测结果；
利用本发明的方法可以大幅度降低检测成本，通过脲酶催化尿素水解改变尿素溶液的盐离子浓度，无需在电极上进行任何修饰即可实现阻抗检测，并且电极经过简单清洗后，可重复使用；
利用本发明的方法具有较好的检测特异性，采用抗体等生物识别元件特异性分离目标物，可以减少样本背景中其它分子的干扰影响；采用专一性较好的脲酶催化尿素产生铵根离子和碳酸根离子，可以降低其它分子的干扰影响；
另外，本发明通过磁分离及不同溶液洗涤除去未结合的胶体金和残留的盐离子，降低了背景噪声，提高了系统信噪比，提高了检测精度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法的流程图；
图2为本发明中一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法的工作原理示意图。
图3为本发明中胶体金的电镜图；
图4a为本发明中免疫磁珠对不同浓度(101-104CFU/mL)纯培养及人工污染样本溶液中单增李斯特菌的捕获效率；
图4b为本发明中免疫磁珠对相同浓度(104CFU/mL)纯培养单增李斯特菌及大肠杆菌O157：H7(作为干扰细菌)的捕获效率；
图5a为本发明中无抗体修饰胶体金与单增李斯特菌的结合情况；
图5b为本发明中抗体和脲酶修饰胶体金与单增李斯特菌的结合情况；
图6a为本发明中磁珠-单增李斯特菌-胶体金-脲酶复合体的电镜图；
图6b为本发明中不同浓度(101-104CFU/mL)纯培养的单增李斯特菌的阻抗谱；
图6c为本发明中检测不同浓度(101-104CFU/mL)的单增李斯特菌人工污染生菜样本的阻抗谱；
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
图1为本发明中一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法的流程图，图2为本发明中一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法的工作原理示意图，所述方法包括以下步骤：
S1、利用目标微生物的第一抗体修饰的免疫磁珠对所述目标微生物进行捕获，通过磁分离得到纯化和富集的磁珠-目标物复合体；此步骤通过富集提高了目标微生物的浓度，从而提高检测的灵敏度；
S2、利用脲酶和所述目标微生物的第二抗体共同修饰的免疫胶体金与所述磁珠-目标物复合体进行结合，形成磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体；
S3、利用所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体中的脲酶催化尿素溶液水解，改变所述尿素溶液的盐离子浓度；
S4、利用叉指阵列微电极检测所述尿素溶液中的盐离子浓度，得到所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体中的脲酶的浓度，从而得到所述免疫胶体金的浓度，根据所述免疫胶体金的浓度得到目标微生物的浓度。
进一步地，所述步骤S1具体包括以下步骤：
S11、利用生物素、链霉亲和素、磁珠以及所述第一抗体制备所述免疫磁珠，将所述免疫磁珠溶解于磷酸盐缓冲液，具体为：
S111、将所述链霉亲和素与羧基化磁珠偶联；
S112、将所述生物素与所述第一抗体偶联；
S113、将所述链霉亲和素修饰的磁珠与所述生物素修饰的第一抗体进行偶联形成所述免疫磁珠；
此步骤中形成的免疫磁珠是通过链霉亲和素-生物素系统进行介导，此方案不仅能提高磁珠上结合抗体的数量，也能更好地保持第一生物识别元件(例如抗体)的活性，从而提高所述免疫磁珠对所述目标微生物的捕获效率，进而提高检测的灵敏度；
S12、将所述免疫磁珠与含有所述目标微生物的样本溶液进行混合孵育，所述免疫磁珠捕获所述目标微生物，形成所述磁珠-目标物复合体；
S13、利用磁场从所述免疫磁珠与所述样本溶液形成的混合溶液中分离并富集所述磁珠-目标物复合体。
进一步地，所述步骤S2具体包括以下步骤：
S21、利用柠檬酸三纳还原法制备胶体金；
S22、对所述胶体金进行所述脲酶和所述第二抗体的修饰，形成所述免疫胶体金，将所述免疫胶体金溶解于超纯水；
S23、将所述免疫胶体金与所述磁珠-目标物复合体的溶液进行混合孵育，形成所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体；
S24、利用磁场从所述免疫胶体金与所述磁珠-目标物复合体形成的混合溶液中分离出所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体。
进一步地，所述步骤S24之后还包括以下步骤：
S25、依次使用含有吐温的磷酸盐缓冲液和超纯水洗涤以除去所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体溶液中未与所述目标微生物结合的所述免疫胶体金以及残存的盐离子。
进一步地，所述步骤S23中，首先利用磁场捕获所述磁珠-目标物复合体并除去上清液，再利用所述免疫胶体金溶解所述磁珠-目标物复合体，之后进行混合孵育，形成所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体。
进一步地，所述步骤S3具体包括以下步骤：
S31、利用磁场捕获所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体并除去上清液，之后用所述尿素溶液溶解所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体；
S32、利用所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体中的脲酶催化尿素水解反应后，利用磁场捕获所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体并分离得到上清液。
进一步地，所述步骤S31中，利用超纯水溶解尿素形成所述尿素溶液，保证了溶解所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体的尿素溶液中不会被引入其它盐离子。
进一步地，所述步骤S4中，利用所述叉指阵列微电极检测所述上清液的阻抗，并计算与所述尿素溶液的阻抗的差，作为阻抗变化值，根据阻抗变化值与目标微生物浓度的关系模型得到所述目标微生物的浓度。上述阻抗变化值与目标物浓度的关系模型包括：阻抗变化值与盐离子浓度对应关系，盐离子浓度与脲酶浓度的对应关系，脲酶浓度与免疫胶体金浓度的对应关系以及免疫胶体金浓度与目标微生物浓度的对应关系。此步骤中，叉指阵列微电极没有进行修饰，因此可重复利用，并且通过液-液相反应代替常规的固-液相反应，提高了反应的效率。
进一步地，所述第一抗体和第二抗体是配对的，与目标微生物的结合位点不同，因此不影响免疫磁珠和免疫胶体金与目标微生物的结合。上述抗体也可用核酸适配体、噬菌体、凝集素等其它生物识别元件进行代替。
实施例：
本实施例以单增李斯特菌作为目标微生物，单增李斯特菌是一种能引起人畜共患病的病原菌，广泛分布于自然界中，适应能力非常强，能在低温、高盐等不利生存条件下存活，而这些条件是保存食物常用的抑菌手段，因此它在食品中的检出率非常高，尤其是在冷藏及生鲜食品中。人或畜食用单增李斯特菌污染的食物后，容易导致李斯特菌病，其主要表现为败血症，也可能引起脑膜炎、脑炎、心内膜炎、流产、脓肿和局部脓性损伤等严重疾病，单增李斯特菌主要感染免疫力低下的个体，包括孕妇、新生儿及老年人等，在高危人群中其死亡率可高达30％。因此，为了有效预防和控制单增李斯特菌引发的食源性疾病，迫切需要建立一种快速、灵敏的单增李斯特菌检测方法，下面实施例提供了解决问题的方法。
本实施例中所用的材料主要有：
180nm羧基磁珠(MP)；链霉亲和素(SA)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)；脲酶(Urease)；2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(MES)；聚乙二醇20,000(PEG)；Luria-Bertani培养基(LB)；牛血清蛋白(BSA)；磷酸盐缓冲液(PBS)等。
本实施例中首先对实验材料进行制备：
单增李斯特菌人工污染生菜样本的制备：在无菌操作下，取1g生菜叶，加入9mL的无菌PBS浸泡样本，离心，取上清得到生菜浸出液，再加入不同浓度的单增李斯特菌，得到不同浓度的单增李斯特菌人工污染生菜样本。
免疫磁珠的制备：取200μL的MP(10mg/mL)加入到事先用1％BSA封闭的离心管中，利用磁场(强度：～1T，梯度：～90T/m)磁分离1min，弃上清，分别用0.5mL的1M盐酸和超纯水洗涤一次，之后用0.47mL的超纯水复溶，涡旋混匀10s；称取2mg的EDC·HCl，加入到另一离心管中，用30μL的超纯水溶解，并立刻加入到MP中，涡旋混匀10s，然后室温下旋转混匀10min(15rpm)；磁分离2min，弃上清，用500μL的超纯水洗涤一次后，用400μL的PBS复溶；加入100μL的SA(1mg/mL)，涡旋混匀5s，然后室温下旋转混匀120min(15rpm)；磁分离2min，弃上清；再加入500μL的PBS洗涤2次，之后用1.5mL的包含1.33mg的抗单增李斯特菌单克隆抗体的PBS溶液重悬磁珠，涡旋混匀10s，然后孵育45min(15rpm)；磁分离2min，弃上清，用1.5mL的PBS洗涤2次，并用2mL的PBS溶解磁珠制备1mg/mL的免疫磁珠溶液，并置于冰箱(4℃)中备用。
胶体金的合成：20nm胶体金是通过柠檬酸三纳还原法制备的，具体方法如下：首先将100mL 0.01％的HAuCl4·3H2O溶液加热至沸腾，之后加入1.5mL 1％的柠檬酸三纳，并持续加热使胶体金的颜色从红色变为紫色，即得到胶体金溶液，如图3所示，并置于冰箱(4℃)中保存备用。
胶体金的修饰：脲酶及抗单增李斯特菌多克隆抗体通过静电吸附的方式结合到胶体金上，具体方法如下：取1mL的胶体金溶液加入到5mL的事先用酸液浸泡的小烧杯中并置于磁力搅拌器上；在搅拌的情况下加入10μL 0.2M的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH至7.0，再将含5μg抗体的50μL超纯水逐滴加入胶体金溶液中，在搅拌的情况下孵育5min；之后再将含100μg脲酶(10mg/mL，溶于10mM MES)的50μL超纯水逐滴加入到胶体金溶液中，在室温下孵育1h；之后分别用100μL 1％(w/v)的PEG和10％的BSA各孵育30min进行封闭；之后进行离心(6950g，15min)除去未结合的抗体及脲酶，再用100μL的超纯水溶解及再次离心洗涤一次，并用100μL的超纯水复溶，并置于冰箱(4℃)中备用。
上述洗涤的过程均包括磁分离和溶解的步骤。
以下说明本发明对单增李斯特菌的具体检测步骤如下：
(a)免疫磁分离目标菌：分别取1mL不同浓度(101-104CFU/mL)单增李斯特菌人工污染生菜样本溶液，加入150μg免疫磁珠，37℃下混匀孵育45min，形成磁珠-单增李斯特菌复合体，并用PBS清洗两遍；
图4a为本发明中免疫磁珠对不同浓度(101-104CFU/mL)纯培养及人工污染样本溶液中单增李斯特菌的捕获效率；图4b为本发明中免疫磁珠对相同浓度(104CFU/mL)纯培养单增李斯特菌及大肠杆菌O157：H7(作为干扰细菌)的捕获效率，可以看出：利用本发明制备的免疫磁珠能够高效特异地捕获单增李斯特菌，但对于大肠杆菌O157：H7仅有微弱的非特异性结合。
(b)免疫结合胶体金：用195μL的PBS和5μL的免疫胶体金的混合溶液重悬富集的磁珠-单增李斯特菌复合体，孵育10min，通过抗原抗体结合形成磁珠-单增李斯特菌-胶体金-脲酶复合体，之后分别用含有0.5％吐温的PBS及超纯水洗去未结合的胶体金及残留的盐离子。
图5a和图5b分别为本发明中无抗体修饰胶体金及抗体和脲酶修饰胶体金与单增李斯特菌的结合情况，可以看出：利用本发明制备的抗体和脲酶修饰胶体金可以特异地结合单增李斯特菌，而无抗体修饰胶体金不会与单增李斯特菌结合。
(c)脲酶催化尿素水解：加入200μL的1mM尿素溶液，在脲酶的催化作用下，尿素水解为铵根离子及碳酸根离子，从而增加尿素溶液中的盐离子浓度；
(d)阻抗分析测定：脲酶催化完成后，通过磁分离取上清液转移到叉指阵列微电极上进行阻抗分析，通过比较上清液的阻抗谱和对照(尿素溶液)的阻抗谱，得到特征频率处的阻抗变化值，并通过阻抗变化值与单增李斯特菌浓度的关系模型，进行单增李斯特菌浓度的测定。
图6a为本发明中磁珠-单增李斯特菌-胶体金-脲酶复合体的电镜图；图6b和图6c为本发明中不同浓度的纯培养单增李斯特菌和单增李斯特菌人工污染生菜样本的阻抗谱，可以看出：免疫磁珠、单增李斯特菌和免疫胶体金可以结合为磁珠-单增李斯特菌-胶体金-脲酶复合体，当单增李斯特菌浓度增加时，尿素水解产生的盐离子浓度也增加，从而使得尿素溶液的阻抗呈减小趋势。
以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、利用目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁珠对所述目标微生物进行捕获，通过磁分离得到纯化的和富集的磁珠-目标物复合体；
S2、利用脲酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的免疫胶体金与所述磁珠-目标物复合体进行结合，形成磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体；
S3、利用所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体中的脲酶催化尿素溶液水解，改变所述尿素溶液的盐离子浓度；
S4、利用叉指阵列微电极检测所述尿素溶液中的盐离子浓度，得到所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体中的脲酶的浓度，从而得到所述免疫胶体金的浓度，根据所述免疫胶体金的浓度得到目标微生物的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括以下步骤：
S11、利用生物素、链霉亲和素、磁珠以及所述第一生物识别元件制备所述免疫磁珠，将所述免疫磁珠溶解于磷酸盐缓冲液；
S12、将所述免疫磁珠与含有所述目标微生物的样本溶液进行混合孵育，所述免疫磁珠捕获所述目标微生物，形成所述磁珠-目标物复合体；
S13、利用磁场从所述免疫磁珠与所述样本溶液形成的混合溶液中分离并富集所述磁珠-目标物复合体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S11中制备所述免疫磁珠具体包括以下步骤：
S111、将所述链霉亲和素与磁珠偶联；
S112、将所述生物素与所述第一生物识别元件偶联；
S113、将所述链霉亲和素修饰的磁珠与所述生物素修饰的第一生物识别元件进行偶联形成所述免疫磁珠。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括以下步骤：
S21、利用柠檬酸三纳还原法制备胶体金；
S22、对所述胶体金进行所述脲酶和所述第二生物识别元件的修饰，形成所述免疫胶体金，将所述免疫胶体金溶解于超纯水；
S23、将所述免疫胶体金与所述磁珠-目标物复合体的溶液进行混合孵育，形成所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体；
S24、利用磁场从所述免疫胶体金与所述磁珠-目标物复合体形成的混合溶液中分离出所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S24之后还包括以下步骤：
S25、依次使用含有吐温的磷酸盐缓冲液和超纯水洗涤以除去所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体溶液中未与所述目标微生物结合的所述免疫胶体金以及残存的盐离子。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S23中，首先利用磁场捕获所述磁珠-目标物复合体并除去上清液，再利用所述免疫胶体金溶解所述磁珠-目标物复合体，之后进行混合孵育，形成所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括以下步骤：
S31、利用磁场捕获所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体并除去上清液，之后用所述尿素溶液溶解所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体；
S32、利用所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体中的脲酶催化尿素水解反应后，利用磁场捕获所述磁珠-目标物-胶体金-脲酶复合体并分离得到上清液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S31中，利用超纯水溶解尿素形成所述尿素溶液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中，利用所述叉指阵列微电极检测所述上清液的阻抗，并计算与所述尿素溶液的阻抗的差，作为阻抗变化值，根据所述阻抗变化值得到所述尿素溶液的盐离子浓度。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一生物识别元件和第二生物识别元件与目标微生物的结合位点不同。
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| CN201510202501.2A CN104833802B (zh) | 2015-04-24 | 2015-04-24 | 一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN105861629A (zh) * | 2016-03-28 | 2016-08-17 | 中国农业大学 | 基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法 |
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2015
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