CN107202880A - 一种基于电化学阻抗相角分析的微生物检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于电化学阻抗相角分析的微生物检测方法。该检测方法包括：基于待测样品催化产物的电化学阻抗相角谱，通过曲线拟合，得到最大相位角对应的频率值，利用最大相位角对应的频率值与目标微生物浓度的关系曲线，获取待测样品中目标微生物的浓度值。本发明使用PCB电极检测电化学阻抗相角谱，该微生物检测方法可用于微生物的快速定量分析，准确地得到待测样品中特定微生物的浓度。

Description

一种基于电化学阻抗相角分析的微生物检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，更具体地，涉及一种基于电化学阻抗相角分析的微生物检测方法。
背景技术
病原微生物的快速筛查是食品安全和动物疫病防控的关键，现有的检测方法主要包括培养法(对细菌而言)或分离法(对病毒而言)、聚合酶链式反应法(PCR)和免疫分析法。传统的培养或分离法准确性及灵敏度高，但耗时长；PCR法虽然检测时间短，灵敏度高，但是核酸提取操作复杂，而且需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员；免疫分析法虽然操作简单，但其检测灵敏度偏低，假阳性率偏高。
阻抗生物传感器具有检测速度快、操作简单、灵敏度高等优点，在食源性致病菌检测中逐步得到了越来越多的应用。如专利“一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法”(专利申请号：CN201510202501.2)所述，先利用第一生物识别元件修饰的磁性颗粒对目标微生物进行分离和富集，再与由脲酶和第二生物识别元件共同修饰的金颗粒进行免疫结合，然后利用脲酶催化尿素水解，最后利用叉指阵列微电极作为传感器，对阻抗幅值变化进行检测，并利用阻抗幅值变化与待分析物浓度之间的标定曲线来计算得到目标微生物的数量，实现微生物的快速定量检测。这种方法仅仅对电化学阻抗幅值变化进行目标微生物分析，但电化阻抗数据除了幅值信息外，还包含了相角信息，然而目前并无报道利用PCB电极结合电化学阻抗的相角信息进行微生物检测的方法。
发明内容
本发明的第一目的在于提供了一种基于电化学阻抗相角分析的微生物检测方法，包括：
基于待测样品催化产物的电化学阻抗相角谱，通过曲线拟合，得到最大相位角对应的频率值，利用最大相位角对应的频率值与目标微生物浓度的关系曲线，获取待测样品中目标微生物的浓度值；
其中，所述电化学阻抗相角谱是使用PCB电极检测得到。
优选地，所述PCB电极包括PCB电路板和PDMS通道。
优选地，所述最大相位角对应的频率值与目标微生物浓度的关系曲线的建立为：
基于多种含有已知浓度目标微生物的样品催化产物的电化学阻抗相角谱，通过二次曲线拟合，获取最大相位角对应的特征频率，再通过线性拟合，建立所述特征频率与目标微生物浓度之间的关系曲线。
优选地，基于含有多种已知浓度目标微生物的样品催化产物的电化学阻抗相角谱具体为：
S11.利用所述目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件对所述目标微生物进行捕获，通过磁分离得到纯化的磁性元件-目标微生物复合体；
S12.利用脲酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米金与所述磁珠-目标微生物复合体进行反应，形成磁性元件-目标微生物-纳米金-脲酶复合体；
S13.利用所述磁性元件-目标微生物-纳米金-脲酶复合体上的脲酶催化尿素水解，利用所述PCB电极测量得到催化水解后的溶液的电化学阻抗相角谱。
优选地，S11中所述目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件的制备如下：
将链霉亲和素固定在羧基磁性元件上，形成链霉亲和素化磁性元件，再将生物素修饰在所述目标微生物的第一生物识别元件上，形成生物素化第一生物识别元件，然后将所述链霉亲和素化磁性元件和所述生物素化第一生物识别元件进行混合孵育，所述链霉亲和素化磁性元件上的链霉亲和素与所述第一生物识别元件上的生物素偶联，最后通过磁分离除去多余的所述第一生物识别元件，即可得到所述目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件。
优选地，S12中所述脲酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米金的制备如下：
利用柠檬酸三钠还原法制备纳米金，再将含目标微生物第二生物识别元件的溶液与纳米金混合孵育，然后加入含脲酶的溶液与纳米金混合孵育，所述第二生物识别元件和所述脲酶均通过静电方式吸附至纳米金，即得所述脲酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米金。
更优选地，S12中所述脲酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米金的制备具体如下：
先利用柠檬酸三纳还原法制备纳米金；
再利用K2CO3溶液将纳米金的pH调节至7.0；然后将目标微生物的第二生物识别元件逐滴加入纳米金，搅拌孵育；接着再逐滴加入脲酶，搅拌孵育，最后，分别利用PEG和BSA进行封闭，离心除去多余的第二生物识别元件和脲酶，即可得到所述脲酶和所述第二生物识别元件共同修饰的纳米金。
优选地，所述第一生物识别元件和第二生物识别元件与目标微生物的结合位点不同。
优选地，所述通过曲线拟合，获取最大相位角对应的频率与目标微生物浓度的关系曲线具体为：
基于所述电化学阻抗相角谱，通过二次曲线拟合，得到相角谱的拟合函数，求导，获取最大相位角对应的特征频率。
优选地，所述拟合函数为：y＝ax2+bx+c，其中，y为相角，x为频率；
最大相位角对应的特征频率x＝-b/(2a)。
优选地，所述目标微生物为食源性致病菌，优选为单增李斯特菌。
优选地，所述目标微生物为单增李斯特菌，所述第一生物识别元件为单克隆抗体，所述第二生物识别元件为多克隆抗体。
本发明所提供的微生物检测方法通过使用PCB电极检测得到电化学阻抗相角谱，建立样品催化产物的电化学阻抗相角谱中最大相位角对应的频率与目标微生物浓度的关系曲线，可以很准确地得到待测样品中微生物的浓度。另外，通过生物识别元件修饰的免疫磁性元件分离并富集目标微生物，提高了目标微生物的浓度，减少了样本背景中其它分子的干扰影响，之后利用脲酶催化反应改变尿素溶液的盐离子浓度，产生铵根离子和碳酸根离子，有效地放大了检测信号，无需在PCB电极上进行任何修饰即可实现阻抗检测。同时，本发明的方法背景噪声低，系统信噪比高，检测精度高，检测时间短，操作简单，成本低，一致性好。
附图说明
图1为根据本发明一个优选实施例中PCB电极的电路图。
图2为根据本发明一个优选实施例中微生物检测方法中样品前处理过程图；
图3为根据本发明实施例1中不同浓度的碳酸铵溶液的阻抗相角谱图；
图4为根据本发明实施例1中最大相角所对应的特征频率与碳酸铵溶液浓度的曲线图；
图5为根据本发明实施例2中不同浓度的单增李斯特菌的阻抗相角谱图；
图6为根据本发明实施例2中最大相角所对应的特征频率与单增李斯特菌浓度的曲线图；
图7为根据本发明实施例3中使用叉指阵列微电极和PCB电极分别对不同浓度的碳酸铵溶液进行测量得到的阻抗变化值与碳酸铵浓度的曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明提供了一种基于电化学阻抗相角分析的微生物检测方法，包括：
基于待测样品催化产物的电化学阻抗相角谱，通过曲线拟合，得到最大相位角对应的频率值，利用最大相位角对应的频率值与目标微生物浓度的关系曲线，获取待测样品中目标微生物的浓度值；
其中，电化学阻抗相角谱是使用PCB电极检测得到。
本发明通过PCB电极检测并获取数据，检测时间短，检测成本显著低于微电极。
在本发明一个优选实施方式中，PCB电极包括PCB电路板和PDMS通道。
电极的设计具体如下：
利用软件Altium Designer绘制PCB电极的PCB图，利用3D打印机制作通道模具，并浇筑PDMS通道。
该电极主要包括两部分：PCB电路板和PDMS通道。
PCB板的尺寸为4*2*0.1cm，板上包含10对金电极和一个USB接口，每个电极尺寸为6*0.1-6*0.2mm，电极间的间隔为0.1-0.2mm。
PDMS尺寸为3*2cm，通道尺寸为20*2*0.224mm。
本发明的PCB电极的电路图如图1所示。
同时，本发明利用PCB电极测得的阻抗相角信息进行阻抗分析，通过建立最大相角所对应的特征频率与目标微生物浓度的数学模型，可以更准确地测定待测样品中目标微生物的含量。
利用PCB电极检测已知浓度目标微生物和待测样品，成本低，操作简单，清洗方便，一致性较好，可以更快捷，更有效的获取数据并分析结果，为检测细菌浓度提供一种更为简便快捷的工具。
常规检测方法是利用伯德图(Bode)中的阻抗幅值，建立阻抗值与细菌浓度之间的关系，本发明提出一种新的检测方法，即利用伯德图中的相位，建立最大相位角对应的特征频率与细菌浓度之间的关系曲线，为检测细菌浓度提供一种新思路。
较常规使用催化溶液的阻抗幅值或pH值确定目标微生物浓度的方法相比，本发明的方法成本更低，操作更简单，灵敏度更高，检测时间更短，无需额外试剂，也无需额外增加阻抗测量的工作量，检测结果更为精确。
本发明使用PCB电极测得的最大相位角对应的频率的变化代替常规的阻抗幅值进行细菌浓度计算，结合使用放大检测信号的脲酶，检测结果灵敏度更高，使用脲酶催化无需在PCB电极上固定抗体，PCB电极成本低，易于清洗，一致性好，可重复使用。
本发明的方法可以适用于不同微生物的检测，优选为食源性致病菌，更优选为单增李斯特菌。
其中，单增李斯特菌是一种能引起人畜共患病的病原菌，广泛分布于自然界中，适应能力非常强，能在低温、高盐等不利生存条件下存活，而这些条件是保存食物常用的抑菌手段，因此它在食品中的检出率非常高，尤其是在冷藏及生鲜食品中。在本发明的实施例中，以该菌的检测为例详述本发明。
在本发明一个优选实施方式中，“最大相位角对应的频率值与目标微生物浓度的关系曲线”的建立为：
基于多种含有已知浓度目标微生物的样品催化产物的电化学阻抗相角谱，通过二次曲线拟合，获取最大相位角对应的特征频率，再通过线性拟合，建立该特征频率与目标微生物浓度之间的关系曲线。
为了进一步提高目标微生物的浓度，放大检测信号，在本发明一个优选实施方式中，上述步骤中“基于含有多种已知浓度目标微生物的样品催化产物的电化学阻抗相角谱”具体为，如图2所示：
S11.利用目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件对目标微生物进行捕获，通过磁分离得到纯化的磁性元件-目标微生物复合体，并通过磁富集提高目标微生物的浓度，从而提高检测的灵敏度；
S12.利用脲酶和目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米金与磁性元件-目标微生物复合体进行反应，形成磁性元件-目标微生物-纳米金-脲酶复合体；
S13.利用磁性元件-目标微生物-纳米金-脲酶复合体上的脲酶催化尿素水解，产生碳酸铵，利用上述PCB电极测量得到催化水解后的溶液的电化学阻抗相角谱。
在该实施方式中，通过免疫磁性元件捕获得到纯化和富集的磁性元件-目标微生物复合体，通过免疫脲酶纳米金得到磁性元件-目标微生物-纳米金-脲酶复合体，通过脲酶催化尿素得到碳酸铵，有效地放大了检测信号。采用专一性较好的脲酶催化尿素得到碳酸铵，可以降低其它分子的干扰影响。使用PCB电极来测量催化水解后溶液的电化学阻抗相角谱，使得测量结果更准确。
在本发明中，针对不同的微生物，可以选用不同的生物识别元件，如针对单增李斯特菌，第一生物识别元件为单克隆抗体，第二生物识别元件为多克隆抗体。同时，采用抗体等生物识别元件分离目标物，具有较好的检测特异性，可以减少样本背景中其它分子的干扰影响。
优选地，第一生物识别元件和第二生物识别元件与目标微生物的结合位点不同。
在本发明中，磁性元件可以为本领域中用于微生物检测的磁性元件，可以但不限于为磁珠。
在本发明一个优选实施方式中，S11具体为：
S111.利用生物素、链霉亲和素、磁性元件以及所述第一生物识别元件制备所述免疫磁性元件，并将免疫磁性元件溶解于磷酸盐缓冲液中；
S112.将免疫磁性元件与含有目标微生物的样本溶液进行混合孵育，免疫磁性元件捕获目标微生物，形成磁性元件-目标微生物复合体；
S113.利用磁场从免疫磁性元件与样本溶液形成的混合溶液中分离并富集S112中的磁性元件-目标微生物复合体。
在S111中，为了提高目标微生物的检测精确度，目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件的制备通常是先将链霉亲和素固定在羧基磁性元件上，形成链霉亲和素化磁性元件，再将生物素修饰在第一生物识别元件上，形成生物素化第一生物识别元件，然后将链霉亲和素化磁性元件和生物素化第一生物识别元件进行混合孵育。
具体为：先将链霉亲和素化的磁性元件与生物素化的第一生物识别元件进行混合孵育45min，磁性元件上的链霉亲和素与第一生物识别元件上的生物素偶联，再通过磁分离除去多余的第一生物识别元件，即可得到第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件。
在本发明一个优选实施方式中，S12中脲酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的金颗粒的制备如下：
利用柠檬酸三钠还原法制备纳米金，再将含目标微生物第二生物识别元件的溶液与纳米金混合孵育，然后加入含脲酶的溶液与纳米金混合孵育，第二生物识别元件和脲酶均通过静电方式吸附到纳米金上，即可得到脲酶和目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米金。
具体为：先利用柠檬酸三钠还原法制备纳米金；再将利用K2CO3溶液将纳米金的pH调节至7.0；然后将目标微生物的第二生物识别元件(5μg溶于50μL的超纯水中)逐滴加入纳米金(1mL)，搅拌孵育5min；接着逐滴加入脲酶(100μg溶于40μL的超纯水中)，搅拌孵育1h，最后，分别利用1％的PEG20,000和10％的BSA进行封闭30min，再以6950g离心15min除去多余的第二生物识别元件和脲酶，即可得到脲酶和第二生物识别元件共同修饰的纳米金。
在本发明实施方式中，纳米金可以为分散在溶液中的纳米金颗粒。
在本发明一个优选实施方式中，S1中“通过曲线拟合，获取最大相位角对应的频率与目标微生物浓度的关系曲线”具体为：
基于所述电化学阻抗相角谱，通过EXCEL进行二次曲线拟合，得到相角谱的拟合函数，求导，获取最大相位角对应的特征频率。
在本发明一个优选实施方式中，二次拟合函数为：y＝ax2+bx+c，其中，y为相角，x为频率；
在上述二次拟合函数中，对x进行求导，可以得到dy/dx＝2ax+b，根据二次函数的特性，最大相位角(二次函数的奇点)是出现在dy/dx＝0处，也就是2ax+b＝0，即x＝-b/(2a)，即最大相位角对应的特征频率x＝-b/(2a)。
其中，a、b值可以通过Excel软件根据最小二乘法自动计算给出。
在本发明一个实施方式中，S13中“利用PCB电极测量得到催化水解后的溶液的电化学阻抗相角谱”通常为：将催化水解后的溶液注射到PCB电极中，利用电化学工作站测量得到电化学阻抗相角谱。
在本发明中，待测样品催化产物的电化学阻抗相角谱的获取步骤与S1中含有已知浓度目标微生物的样品催化产物的电化学阻抗相角谱的获取步骤相同，如图2所示。
即先利用目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件对待测样品中目标微生物进行捕获，通过磁分离得到纯化的磁性元件-目标微生物复合体；
利用脲酶和目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米金与磁性元件-目标微生物复合体进行反应，形成磁性元件-目标微生物-纳米金-脲酶复合体；
利用磁性元件-目标微生物-纳米金-脲酶复合体中的脲酶催化尿素水解，产生碳酸铵，将水解后的溶液注射到PCB电极中，利用电化学工作站测量得到待测样品催化产物的电化学阻抗相角谱值。
通过曲线拟合，得到相应的最大相位角对应的频率值，根据上述最大相位角对应的频率值与目标微生物浓度的关系曲线，从而得到待测样品中目标微生物的浓度值。
实施例1
本发明实施例中使用碳酸铵溶液进行方法验证，实施过程主要包含以下步骤：
1)将制备好的1M碳酸铵分别稀释到1μM、2.5μM、10μM、25μM、50μM和100μM。
2)分别取200μL不同浓度的碳酸铵溶液注射到PCB电极中，在电化学工作站上扫描电化学阻抗相角谱，如图3所示。
3)通过Excel对相角谱的数据进行二次曲线拟合，得到相角谱的拟合函数(y＝ax2+bx+c，y代表相角，x代表频率)。其中，1μM、2.5μM、10μM、25μM、50μM和100μM的拟合函数分别为：y＝-20.98x2+165.03x–337.42、R2＝0.97，y＝-22.049x2+153.05x–276.27、R2＝0.98，y＝-22.13x2+165.14x–318.21、R2＝0.96，y＝-23.13x2+155.25x–270.68、R2＝0.98，y＝-23.10x2+192.48x–410.29、R2＝0.96。根据上述拟合函数通过求导数得到最大相位角对应的特征频率x＝-b/(2a)；
4)建立特征频率与碳酸铵溶液浓度的标准曲线，如图4所示，该曲线y＝145.23x+860.53、R2＝0.96，可见特征频率与溶液浓度的对数具有很好的线性关系，证明了该方法的可行性。
实施例2
以单增李斯特菌的检测为例，检测方法包括以下步骤：
1)利用单克隆抗体修饰的免疫磁珠对单增李斯特菌进行捕获，通过磁分离得到纯化的磁珠-细菌复合体(磁细菌)，此步骤通过磁富集提高了李斯特菌的浓度，从而提高检测的灵敏度；
其中，免疫磁珠是利用商品化的链霉亲和素磁珠与商品化的生物素化单克隆抗体混合45min后，磁分离除去多余的生物素化单克隆抗体，并复溶在PBS溶液中。对细菌的捕获步骤是：先利用0.2mg单克隆抗体修饰的免疫磁珠与1mL的单增李斯特菌样本在室温下进行旋转混合孵育45min(转速为15rpm)，然后磁分离除去样本背景，再复溶在0.1mL的PBS溶液中，得到磁珠-单增李斯特菌复合体；
2)利用脲酶和多克隆抗体修饰的纳米金颗粒与磁细菌进行反应，形成磁珠-细菌-纳米金-脲酶复合体(酶细菌)；
其中，具体步骤为：用195μL的PBS和5μL的脲酶和多克隆抗体修饰的纳米金颗粒的混合溶液重悬富集的磁珠-单增李斯特菌复合体，之后分别用含有0.5％吐温的PBS及超纯水洗去未结合的胶体金及残留的盐离子，得到磁珠-细菌-纳米金-脲酶复合体(酶细菌)；
其中，利用脲酶和多克隆抗体修饰的纳米金颗粒的制备步骤为：先利用柠檬酸三纳还原法制备纳米金；再利用K2CO3溶液将纳米金的pH调节至7.0；然后将多克隆抗体(5μg溶于50μL的超纯水中)逐滴加入纳米金(1mL)，搅拌孵育5min；接着再逐滴加入脲酶(100μg溶于40μL的超纯水中)，搅拌孵育1h，最后，分别利用1％的PEG20,000和10％的BSA进行封闭30min，再以6950g离心15min除去多余的多克隆抗体和脲酶，即可得到脲酶和多克隆抗体共同修饰的纳米金。
3)利用酶细菌上的脲酶催化尿素溶液水解，产生碳酸铵，改变尿素溶液的盐离子浓度，此步骤中脲酶含量与细菌浓度呈正比，细菌浓度越高即脲酶含量越高，对尿素的催化水解速度越快，在相同催化时间下，尿素溶液中的盐离子浓度越高；
其中，具体步骤为：向步骤2)中得到的酶细菌中加入200μL的1mM尿素溶液，在脲酶的催化作用下，尿素水解为铵根离子及碳酸根离子，从而增加尿素溶液中的盐离子浓度；
4)将催化水解后的溶液注射到PCB电极中，利用电化学工作站测量得到电化学阻抗相角谱；
5)利用Excel对步骤4)中的电化学阻抗相角谱分别进行二次曲线拟合，拟合函数为y＝ax2+bx+c，y代表相角，x代表频率，对每个二次拟合曲线求导数y’＝2ax+b，导数y’为0的点，即x＝-b/(2a)处为最大相角所对应的特征频率，如图5所示，图5中给出了阴性对照样本，102，103，104，105CFU/mL细菌的二次曲线，对应的二次拟合曲线分别为y＝-20.98x2+140.18x-246.14、R2＝0.95，y＝-21.213x2+143.75x-255.22、R2＝0.93，y＝-20.79x2+146.26x-268.2、R2＝0.96，y＝-22.30x2+163.42x-310.93、R2＝0.95，y＝-23.56x2+177.62x-345.13、R2＝0.95；
6)根据步骤5)得到的特征频率，建立特征频率与细菌浓度的数学模型，如图6所示，对于单增李斯特菌来说，f＝1126.50log(C)+135.2、R2＝0.94，可见最大相角所对应的特征频率与细菌浓度的对数具有很好的线性关系，可用于细菌的测定。
实施例3
PCB电极和叉指阵列微电极的对比
使用PCB电极和叉指阵列微电极分别对不同浓度的碳酸铵溶液进行检测。
1)灵敏度对比：由图7可知，PCB电极价格更低，灵敏度明显优于叉指阵列微电极。其中，如图7所示，对于PCB电极：y＝51214ln(x)+34367、R2＝0.9914；对于叉指阵列微电极：y＝6300ln(x)+14088、R2＝0.99。
2)一致性对比：分别由两种电极，检测同一浓度的碳酸铵，PCB电极的重复性好，相对标准偏差为1.08％；叉指阵列微电极的重复性较好，相对标准偏差为2.20％。
3)其他项对比表
最后，本申请的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于电化学阻抗相角分析的微生物检测方法，包括：
基于待测样品催化产物的电化学阻抗相角谱，通过曲线拟合，得到最大相位角对应的频率值，利用最大相位角对应的频率值与目标微生物浓度的关系曲线，获取待测样品中目标微生物的浓度值；
其中，所述电化学阻抗相角谱是使用PCB电极检测得到。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCB电极包括PCB电路板和PDMS通道。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述最大相位角对应的频率值与目标微生物浓度的关系曲线的建立为：
基于多种含有已知浓度目标微生物的样品催化产物的电化学阻抗相角谱，通过二次曲线拟合，获取最大相位角对应的特征频率，再通过线性拟合，建立所述特征频率与目标微生物浓度之间的关系曲线。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基于含有多种已知浓度目标微生物的样品催化产物的电化学阻抗相角谱具体为：
S11.利用所述目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件对所述目标微生物进行捕获，通过磁分离得到纯化的磁性元件-目标微生物复合体；
S12.利用脲酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米金与所述磁性元件-目标微生物复合体进行反应，形成磁性元件-目标微生物-纳米金-脲酶复合体；
S13.利用所述磁性元件-目标微生物-纳米金-脲酶复合体上的脲酶催化尿素水解，利用所述PCB电极测量得到催化水解后的溶液的电化学阻抗相角谱。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S11中所述目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件的制备如下：
将链霉亲和素固定在羧基磁性元件上，形成链霉亲和素化磁性元件，再将生物素修饰在所述目标微生物的第一生物识别元件上，形成生物素化第一生物识别元件，然后将所述链霉亲和素化磁性元件和所述生物素化第一生物识别元件进行混合孵育，所述链霉亲和素化磁性元件上的链霉亲和素与所述第一生物识别元件上的生物素偶联，最后通过磁分离除去多余的所述第一生物识别元件，即可得到所述目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，S12中所述脲酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米金的制备如下：
利用柠檬酸三钠还原法制备纳米金，再将含目标微生物第二生物识别元件的溶液与纳米金混合孵育，然后加入含脲酶的溶液与纳米金混合孵育，所述第二生物识别元件和所述脲酶均通过静电方式吸附至纳米金，即得所述脲酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米金。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一生物识别元件和第二生物识别元件与目标微生物的结合位点不同。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述通过曲线拟合，获取最大相位角对应的频率与目标微生物浓度的关系曲线具体为：
基于所述电化学阻抗相角谱，通过二次曲线拟合，得到相角谱的拟合函数，求导，获取最大相位角对应的特征频率。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述拟合函数为：y＝ax2+bx+c，其中，y为相角，x为频率；
最大相位角对应的特征频率x＝-b/(2a)。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110734853A (zh) * 2019-11-05 2020-01-31 中国农业大学 微生物检测装置及检测方法
CN112798738A (zh) * 2020-12-28 2021-05-14 汉威科技集团股份有限公司 基于传感器特性曲线的响应模型及浓度补偿方法
CN113788502A (zh) * 2021-08-17 2021-12-14 天津大学 一种用于水环境中磷酸根离子浓度判别的材料制备及检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101788515A (zh) * 2010-01-25 2010-07-28 首都医科大学附属北京口腔医院 一种应用电化学阻抗原理检测细菌的方法及微流控芯片
CN102954985A (zh) * 2011-08-31 2013-03-06 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种电阻抗式细菌快速检测传感器的数据分析方法
CN104833802A (zh) * 2015-04-24 2015-08-12 中国农业大学 一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法
CN105861629A (zh) * 2016-03-28 2016-08-17 中国农业大学 基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法
CN106596688A (zh) * 2016-12-21 2017-04-26 三诺生物传感股份有限公司 一种在电化学测试系统中区分质控液和实际样品的方法及识别装置控制器和识别系统

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101788515A (zh) * 2010-01-25 2010-07-28 首都医科大学附属北京口腔医院 一种应用电化学阻抗原理检测细菌的方法及微流控芯片
CN102954985A (zh) * 2011-08-31 2013-03-06 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种电阻抗式细菌快速检测传感器的数据分析方法
CN104833802A (zh) * 2015-04-24 2015-08-12 中国农业大学 一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法
CN105861629A (zh) * 2016-03-28 2016-08-17 中国农业大学 基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法
CN106596688A (zh) * 2016-12-21 2017-04-26 三诺生物传感股份有限公司 一种在电化学测试系统中区分质控液和实际样品的方法及识别装置控制器和识别系统

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QI CHEN ET AL.: "Fast and sensitive detection of foodborne pathogen using electrochemical impedance analysis,urease catalysis and microfluidics", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
崔海霞: "基于GR-5 DNAzyme 的阻抗谱Pb2+检测方法研究", 《万方数据》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110734853A (zh) * 2019-11-05 2020-01-31 中国农业大学 微生物检测装置及检测方法
CN110734853B (zh) * 2019-11-05 2021-07-30 中国农业大学 微生物检测装置及检测方法
CN112798738A (zh) * 2020-12-28 2021-05-14 汉威科技集团股份有限公司 基于传感器特性曲线的响应模型及浓度补偿方法
CN113788502A (zh) * 2021-08-17 2021-12-14 天津大学 一种用于水环境中磷酸根离子浓度判别的材料制备及检测方法
CN113788502B (zh) * 2021-08-17 2023-02-17 天津大学 一种用于水环境中磷酸根离子浓度判别的材料制备及检测方法

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