CN101788515A - 一种应用电化学阻抗原理检测细菌的方法及微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种应用电化学阻抗原理检测细菌的方法及微流控芯片。其步骤包括：1)设置一微流控芯片，利用标准品确定系统阻抗值与细菌浓度之间的函数关系；2)在所述微流控芯片的样品进样口内注入待测细菌样本；然后冲洗去除多余样本；3)连接阻抗分析仪与微流控芯片检测区的导电电极，读取所述阻抗分析仪中显示的数据，并记录测量出的细菌样本的阻抗值。4)根据所述确立的系统阻抗值与细菌浓度之间的函数关系式，推算出细菌样本中靶细菌的量。本发明不需要对样本尤其是厌氧菌样本做复杂的处理，所需设备简单，检测迅速，节约成本且易于集成化和微型化，为实现细菌检测的个人化和细菌的实时在体检测以更好地促进和维护人体健康创造了有利条件。

Description

一种应用电化学阻抗原理检测细菌的方法及微流控芯片

技术领域

本发明涉及一种细菌检测方法及装置，特别是关于一种应用电化学阻抗原理检测细菌的方法及微流控芯片。

背景技术

电化学阻抗谱(electrochemicalimpedance spectroscopy，缩写为EIS)在早期的文献中被称为交流阻抗。阻抗测量原本是电学中研究线性电路网络频率响应特性的一种方法，在引用到研究电极的过程中，成了电化学研究的一种实验方法，在一些著名的专著中都有介绍。

电化学阻抗谱方法是一种以小振幅的正弦波电位(或电流)为扰动信号的电化学测量方法。由于是以小振幅的电信号对体系扰动，一方面可避免对体系产生大的影响，另一方面也使得扰动与体系的响应之间近似呈线性关系，这就使得测量结果的数学处理变得简单。同时，电化学阻抗谱方法又是一种频率域的测量方法，它以测量得到的频率范围很宽的阻抗谱来研究电极系统，因而能比其他常规的电化学方法得到更多的动力学信息及电极界面结构的信息。

当一个电极系统的电位或流经电极系统的电流变化时，对应的流过电极系统的电流或电极系统的电位也相应的变化，这种情况正如一个电路受到电压或电流扰动信号作用时有相应的电流或电压响应一样。当我们用一个角频率为ω振幅足够小的正弦波电流信号对一个稳定的电极系统进行扰动时，相应地电极电位就做出角频率为ω的正弦波响应，从被测电极系统输出一个角频率是ω的电压信号，此时电极系统的频响函数，就是电化学阻抗。在一系列不同角频率下测得的一组这种频响函数值则就是电极系统的电化学阻抗谱。

电化学阻抗检测方法由于具有测定选择性好，灵敏度高，可在有色甚至浑浊试液中进行测量并且容易微型化和集成化等优点而备受研究者青睐，与其它的电化学检测方法相比，可以不需要标记物，在与疾病相关的致病菌尤其是难以培养成活的厌氧菌的快速检测过程中，在速度和操作简易性以及实现现场检测方面有着令人向往的优势，从而可在疾病的有效预防、及时诊断和治疗，以及流行病学调查和日常卫生监督过程中均起到重要作用。

随着电子计算机集成电路的高度发展，超微加工技术水平获得了迅速提高，近些年基于微流控芯片的微流控分析技术取得了突飞猛进的进展，微流控分析技术在微米级结构中执行样品预处理、分离与检测等步骤，具有体积小、比表面积大、试剂和样品用量少、分析速度快、工作效率高，自动化程度高等优点，与基于抗原抗体反应的免疫分析相结合，在保留免疫分析的高特异性的基础上，不仅可在一定程度上克服传统常规免疫分析的局限，缩短反应时间，提高检测效率，还可大大节约昂贵的免疫试剂用量。目前，国内外基于微流控芯片和免疫分析进行细菌电阻抗检测的方法还处于探索和实验阶段。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是通过提供一种微流控芯片，利用电化学阻抗原理对细菌进行检测。采用该微流控芯片和检测方法进行的检测，其操作方便，灵敏度高，选择性强，样品用量少、分析速度快、工作效率高。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种应用电化学阻抗原理检测细菌的方法，其步骤包括：

1)设置一微流控芯片，将其与阻抗分析仪相连，根据电化学阻抗原理公式(1)，利用单一标准菌株悬液获得系统阻抗谱：

$Z=\frac{V\left(t\right)}{I\left(t\right)}=\frac{V_0\sin \left(2\mathrm{\πft}\right)}{I_0\sin (2\mathrm{\πft}+\mathrm{\Φ})}---\left(1\right)$

其中，Z为系统阻抗，V₀和I₀分别为系统最大电压和最大电流，f为频率，t为时间，Φ为相位角；

2)选择一个能够鲜明反映出不同浓度样本差异的某一固定频率，在该频率下测量不同浓度的单一标准菌株悬液的电化学阻抗值，通过对获得的系列不同浓度菌液的阻抗值采用最小二乘法进行直线拟合，计算出直线的斜率k和直线的截距b，从而获得该频率下系统阻抗值Z与细菌浓度C的对数之间的线性关系式(2)：

Z(kΩ)＝klogC+b    (2)；

3)在所述微流控芯片的进样口内注入细菌样本，然后冲洗去除多余样本；

4)读取所述阻抗分析仪中显示的数据，并记录测量出的细菌样本的阻抗值，根据所述确立的关系式(2)，推算出细菌样本中靶细菌的量。

所述步骤1)中选取的频率范围为10²Hz～10⁶Hz。

一种应用电化学阻抗原理检测细菌的微流控芯片，它包括一微通道，在所述微通道的一端设置有进样口，另一端设置有出样口，所述微通道高度为200μm；两端的宽度为300～400μm，长度无限制；中间段的宽度为600～800μm，长度无限制；在所述微通道的内底面整合有交叉指型导电电极，所述导电电极的表面修饰有细菌特异性抗体。

所述交叉指型导电电极共包括50对分支电极，各分支电极间的间隙为40～50μm。就每一分支电极来讲，其宽度为40～50μm，长度为400～500μm。所述导电电极的钛层为20nm，金层为150～200nm。

所述微通道采用聚二甲基硅氧烷材料制备。

所述细菌特异性抗体为抗细菌菌体表面蛋白抗体。

本发明由于采取以上技术方案，本发明具有以下优点：1、本发明方法不需要对样本尤其是厌氧菌样本做复杂的预处理，检测时间短，易于满足细菌快速检测需要。2、本发明的细菌电化学阻抗检测方法实现过程只需要注射泵和阻抗分析仪即可完成，所需设备简单、易于操作。3、所需试剂少，节约了成本。4、本发明的检测装置易于集成化和微型化，为实现细菌检测的个人化和细菌的实时在体检测以更好地促进和维护人体健康创造了有利条件。

附图说明

图1是本发明的微流控芯片平面结构示意图

图2是本发明的微流控芯片局部立体结构示意图

图3是利用本发明获得的系列标准品的电化学阻抗谱示意图

图4是利用本发明在一特定频率下测得的系统阻抗值与细菌浓度对数之间的线性关系示意图

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。

如图1所示，本发明提供了一种能够应用于电化学阻抗谱方法的微流控芯片，该微流控芯片包括一微通道1，在微通道1的一端设置有进样口11，另一端设置有出样口12。微通道1高度为200μm；微通道1两端部分的宽度为300～400μm，长度无限制；中间段的宽度为600～800μm，长度无限制。在微通道1中间段的内底面整合有导电电极2。导电电极2通过导线3与一阻抗分析仪4相连接，将电极界面电化学性质的变化转化为系统阻抗值的变化。

本发明中微通道1采用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsilicone，PDMS)材料制备。

本发明中微通道1底部整合的导电电极2由两个叉指型微电极交叉组合而成，共包括50对分支电极，各分支电极间的间隙为40～50μm。就每一分支电极来讲，其宽度为40～50μm，长度为400～500μm。

导电电极2的制备采用标准的光刻技术，首先通过在玻片上甩胶，前烘，曝光，显影的方法得到做好电极图形的玻片；接着在做好图形的玻片上先后通过磁控溅射上钛和金的薄层，溅射的钛金属层为20nm，金层为150～200nm，这样的金电极能更牢固的固定在玻片表面上；用丙酮溶液将光刻胶去除后，导电电极2就制备好了。

在微流控芯片中，导电电极2的表面还要修饰有细菌特异性抗体，本发明中所述的细菌特异性抗体为抗细菌菌体表面蛋白抗体。修饰的方法是采用自组装单分子层膜技术将细菌特异性抗体间接固定在导电电极2的表面，首先将整合有交叉指型导电电极2的玻片浸入70℃piranha溶液(1∶3v/v，30％H₂O₂/浓H₂SO₄)5～10分钟，然后用乙醇和去离子水充分洗涤整合电极的玻片，N₂气干燥。接着将玻片浸入到含有10mM二硫醇类化合物的乙醇溶液中一定时间，以形成末端为羧基的自组装膜(self-assembled monolayers，SAM)，然后用乙醇、去离子水充分洗涤玻片。再接着将玻片置于0.2M EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐)-50mM NHS(N一羟基琥珀酰亚胺)的偶联剂混合溶液中活化，使自组装膜末端的羧基转化为活性NHS酯基，然后用去离子水洗涤并在氮气中干燥。最后在玻片整合微电极的表面滴加细菌的特异性抗体溶液，4℃孵育一定时间，然后用磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗去除电极表面未结合的抗体分子，再将电极浸入到1％BSA(牛血清白蛋白)-PBS(磷酸盐缓冲液)溶液中封闭电极表面的非活性位点，最后用PBS及去离子水清洗电极，并N₂气干燥，抗体固定就完成了。

将整合修饰有细菌特异性抗体的导电电极2的玻片和制备好的微通道1通过显微镜对位粘到一起，微流控芯片就集成好了。

因此，整个微流控芯片就分成了三个功能区，第一部分为进样区A，由进样口11和微通道1的前段构成；第二部分为检测区B，由带有导电电极2的中间一段微通道1构成；第三部分为出样区C，由出样口12和微通道1的最后一段构成。

以口腔厌氧细菌检测为例，利用上述芯片进行电化学阻抗谱方法检测的过程是：

一、被测电极系统阻抗谱的建立

1)设定阻抗分析仪的交流电压信号以及测量频率范围，将导电电极2与阻抗分析仪4相连；

2)在微通道1中分次注入不同浓度的单一标准菌株牙龈卟啉单胞菌ATCC33277菌悬液，由于细菌本身具有一定的导电性，根据阻抗测量原理：

$Z=\frac{V\left(t\right)}{I\left(t\right)}=\frac{V_0\sin \left(2\mathrm{\πft}\right)}{I_0\sin (2\mathrm{\πft}+\mathrm{\Φ})}---\left(1\right)$

其中，Z为系统阻抗，V₀和I₀分别为系统最大电压和最大电流，f为频率，t为时间，Φ为相位角。

可知，给被测电极系统施加一个正弦波交流电压V后，如果工作电极界面特征发生改变如电导率，则会引起相应的系统响应电流I以及相位角Φ发生改变，阻抗分析仪4即会显示系统阻抗值的变化，细菌浓度越高，电导率越大，阻抗值越小。

针对某一浓度的标准菌株牙龈卟啉单胞菌菌悬液来讲，当其流过微通道1时，被导电电极2表面修饰的抗体捕获后，细菌在导电电极2表面和间隙沉积，从而改变电极界面的电导率，通过阻抗分析仪4通过施加一个特定频率的交流电压并记录系统反馈回的交流电流以及相位差，从而可计算出系统的阻抗值。这样，在给定的一系列频率下通常是10²Hz～10⁶Hz范围内测得的单一浓度标准菌株悬液的阻抗值联合起来就可获得该样本浓度下被测电极系统的电化学阻抗谱。同理，采用同样的方法获得该标准菌株多个浓度下的电极系统电化学阻抗谱(如图3所示)。

二、被测电极系统阻抗值与细菌浓度之间函数关系式的建立

然后根据步骤一建立的单一标准菌株多种浓度下的系统电化学阻抗谱，就能够选择一个能够鲜明反映出不同浓度样本差异的某一固定频率，再在该频率下测量不同浓度的单一标准菌株悬液的电化学阻抗值，通过对获得的系列不同浓度菌液的阻抗值采用最小二乘法进行直线拟合，计算出直线的斜率k和直线的截距b，从而获得该频率下系统阻抗值Z与细菌浓度C的对数之间的线性关系式(如图4所示)：

Z(kΩ)＝klogC+b    (2)

三、样本检测

1)被测电极系统阻抗值与细菌浓度对数之间的线性关系式建立完后，进行样本检测。在微通道1中注入待检测的样本，样本溶液以10μl/min的流速经进样口11通过注射泵注入微通道1内，样本流经检测区B时，通过抗原抗体反应，使得样本中的靶细菌被导电电极2表面修饰的特异性抗体捕获，细菌在导电电极2的表面和间隙沉积；

2)样本完全注入后，用0.1M的甘露醇溶液以1ml/min的流速通过注射泵注入微通道1内，目的为冲洗去除未与导电电极表面修饰抗体结合的多余样本；

3)阻抗分析仪4通过给导电电极2施加一个特定频率的交流电压并记录系统反馈回的交流电流以及相位差，从而获得系统的阻抗值，然后根据公式(2)即可求得样本中靶细菌的浓度。

Claims (10)

1.一种应用电化学阻抗原理检测细菌的方法，其步骤包括：

1)设置一微流控芯片，将其与阻抗分析仪相连，根据电化学阻抗原理公式(1)，利用单一标准菌株悬液获得系统阻抗谱：

$Z=\frac{V\left(t\right)}{I\left(t\right)}=\frac{V_0\sin \left(2\mathrm{\πft}\right)}{I_0\sin (2\mathrm{\πft}+\mathrm{\Φ})}---\left(1\right)$

其中，Z为系统阻抗，V₀和I₀分别为系统最大电压和最大电流，f为频率，t为时间，Φ为相位角；

2)选择一个能够鲜明反映出不同浓度样本差异的某一固定频率，在该频率下测量不同浓度的单一标准菌株悬液的电化学阻抗值，通过对获得的系列不同浓度菌液的阻抗值采用最小二乘法进行直线拟合，计算出直线的斜率k和直线的截距b，从而获得该频率下系统阻抗值Z与细菌浓度C的对数之间的线性关系式(2)：

Z(kΩ)＝klogC+b              (2)；

3)在所述微流控芯片的进样口内注入细菌样本，然后冲洗去除多余样本；

4)读取所述阻抗分析仪中显示的数据，并记录测量出的细菌样本的阻抗值，根据所述确立的关系式(2)，推算出细菌样本中靶细菌的量。

2.如权利要求1所述的一种应用电化学阻抗原理检测细菌的方法，其特征在于：所述步骤1)中选取的频率范围为10²Hz～10⁶Hz。

3.一种应用电化学阻抗原理检测细菌的微流控芯片，其特征在于：它包括一微通道，在所述微通道的一端设置有进样口，另一端设置有出样口，所述微通道高度为200μm；两端的宽度为300～400μm，长度无限制；中间段的宽度为600～800μm，长度无限制；在所述微通道的内底面整合有交叉指型导电电极，所述导电电极的表面修饰有细菌特异性抗体。

4.如权利要求3所述的一种应用电化学阻抗原理检测细菌的微流控芯片，其特征在于：所述交叉指型导电电极共包括50对分支电极，各分支电极间的间隙为40～50μm。就每一分支电极来讲，其宽度为40～50μm，长度为400～500μm。

5.如权利要求3或4所述的一种应用电化学阻抗原理检测细菌的微流控芯片，其特征在于：所述微通道采用聚二甲基硅氧烷材料制备。

6.如权利要求3或4所述的一种应用电化学阻抗原理检测细菌的微流控芯片，其特征在于：所述导电电极的钛层为20nm，金层为150～200nm。

7.如权利要求5所述的一种应用电化学阻抗原理检测细菌的微流控芯片，其特征在于：所述导电电极的钛层为20nm，金层为150～200nm。

8.如权利要求3或4或7所述的一种应用电化学阻抗原理检测细菌的微流控芯片，其特征在于：所述细菌特异性抗体为抗细菌菌体表面蛋白抗体。

9.如权利要求5所述的一种应用电化学阻抗原理检测细菌的微流控芯片，其特征在于：所述细菌特异性抗体为抗细菌菌体表面蛋白抗体。

10.如权利要求6所述的一种应用电化学阻抗原理检测细菌的微流控芯片，其特征在于：所述细菌特异性抗体为抗细菌菌体表面蛋白抗体。

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