CN109321456A - 一种微流控芯片细胞培养控制装置与方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微流控芯片细胞培养控制装置与方法，细胞培养采用间歇灌注的方式，首先利用最小二乘支持向量机构建出灌注间隔时间与细胞密度和细胞增殖三代时间的控制模型、细胞阻抗值阻与细胞生长率的模型，微流控芯片基底上刻有进样口、出样口和单通道，进样口与出样口分别与注射泵和废液池连接，上位机控制注射泵将培养液注入微流控芯片中，通过建立的控制模型确定灌注的初始量，避免细胞在初始状态下干死或疯长，微流控芯片的基底上设有叉指电极，通过电极引线端与阻抗分析仪连接，测量出阻抗值并计算出细胞生长率，将计算的细胞生长率与模型得到的生长率进行对比，根据差值实时更改间隔时间，做到反馈调节，实时监测细胞状态变化。

Description

一种微流控芯片细胞培养控制装置与方法

技术领域

本发明涉及动物细胞培养的应用领域，特别是微流控芯片细胞培养控制装置与方法。

背景技术

细胞培养是生物工程必不可少的研究过程，在生物学、医学等各个领域发挥着至关重要的作用。申请号为201210381418.2的专利中提出了一种微流控细胞培养芯片及其实时观测系统，该系统可以及时更新培养液，实时监测细胞的增殖状态。申请号201320697500.6的专利中提出了一种可监测细胞培养液体环境的细胞培养装置，该细胞培养装置可利用传感器电极实时监测培养液中某种特定物质的实时浓度，动态研究培养液体环境对细胞的影响，虽都关于细胞培养，但都没有涉及对培养液参数的控制，在对细胞监测过程中，难以让细胞有规律的培养，无法建立反馈控制环节。

针对上述问题，本发明提出一种微流控芯片细胞培养控制方法与装置，能够设置初始的培养液灌注值，然后采用阻抗分析仪检测细胞阻抗值；以检测计算得到的细胞生长率作为反馈信号，根据细胞生长率控制细胞培养液的灌注，实现细胞培养的闭环控制，提高细胞培养效果和效率。

发明内容

本发明提出了一种利用微流控芯片进行动物细胞培养的控制装置与方法，该方法的目的是为了有效定量的进行细胞培养，确定细胞间歇灌注的初始给定值，同时预测细胞的生长状况，并根据细胞实际生长情况进行反馈调节，实现细胞以不同生长速率有规律地自动培养。

本发明是通过以下技术方案实现上述技术目的的。

一种微流控芯片细胞培养控制装置，包括依次连接的现场控制装置、上位机以及阻抗分析仪，所述现场控制装置包括依次连接的MCU控制器、注射泵和微流控芯片，注射泵上方设置注射器，注射器的注射口和微流控芯片的进样口之间、微流控芯片的出样口与废液池之间均通过PTFE导管连接，所述微流控芯片由长方体状的基底和盖片粘附而成，进样口、出样口均刻在盖片上，且进样口和出样口之间设有单通道，基底上设有若干交叉的叉指电极，叉指电极设有与阻抗分析仪相连的电极引线端。

上述方案中，所述进样口和出样口均是半径为r、高度为c的圆柱孔；所述单通道的长度为a、宽度为b、高度为c，体积为V₁＝a×b×c。

上述方案中，所述叉指电极的每个电极均为矩形，电极的高度为h、宽度为w，电极两两交叉布置，且两电极之间的间隔为d。

一种微流控芯片细胞培养控制方法，包括以下步骤：

步骤1)：选取控制模型的输入量和输出量，并测出输入量的数值范围；

步骤2)：采集输入量和输出量的数值，建立控制模型；

步骤3)：建立阻抗值与细胞生长率之间的模型；

步骤4)：确定输入量和输出量之外的其他影响参数的数值；

步骤5)：于微流控芯片中接种某一细胞密度的悬浮液；

步骤6)：将某一细胞密度确定的输入量的值输入步骤2)中的控制模型中，由此得出相应的输出量，将步骤4)参数的数值输入上位机的控制软件界面；

步骤7)：将步骤6)的相应的输出量传输给MCU控制器，MCU控制器控制注射泵灌注细胞培养液；

步骤8)：细胞培养一段时间，当细胞贴壁之后，由阻抗分析仪测取细胞阻抗，然后上位机计算细胞的实际生长率；

步骤9)：由阻抗值与细胞生长率之间的模型得出细胞的预测生长率，根据细胞的预测生长率与实际生长率的差值，对相应的输出量进行调整。

进一步，所述步骤1)中的输入量和输出量从细胞间歇灌注影响参数中选取。

进一步，所述输入量为细胞密度C、细胞增殖三代时间T₂，所述细胞密度C的数值范围由经验判断，所述细胞增殖三代时间的最小值T_2min为：当细胞为单个细胞时，细胞处于生长的最佳状态，此时细胞增殖三代时间的最小；所述细胞增殖三代时间的最大值T_2max为：前期准备过程中，实验测得一些细胞密度与细胞增殖三代时间最大值的数据，多项式拟合得到分段曲线，后续试验过程中，再根据曲线计算不同的细胞密度对应的细胞增殖三代时间最大值。

进一步，所述控制模型为双输入单输出系统模型T₃＝f(C,T₂)。

进一步，所述阻抗值与细胞生长率之间的模型μ＝f(Z)，由最小二乘支持向量机得到，其中μ是细胞生长率，Z为阻抗值。

进一步，所述计算细胞的实际生长率的公式为：差值其中Z为阻抗值，μ为细胞实际生长率，λ为细胞预测生长率，n为测量的样本量，t为扫描周期。

进一步，所述对相应的输出量进行调整具体为：当差值e小于设置标准误差ε，保持灌注间隔时间不变，若e大于ε，则上位机5根据增量式PID公式u_i＝u_i-1+Δu计算出间歇时间的控制增量，从而得到下一次细胞灌注的间隔时间，则返回步骤7)。

本发明与已有方法和技术相比，具有如下优点：

1、本发明的控制方法是通过离线获取细胞增殖三代时间、细胞接种密度与培养液间歇灌注时间的实验数据，训练和测试实验数据，建立控制模型，利用控制模型给出初始值，避免细胞在初始状态下干死或疯长，比以往的实验相比，更准确地控制相关参数。

2、本发明利用阻抗分析仪测量细胞阻抗值，建立阻抗值与细胞生长速率的模型，将模型的预测值与实际值对比，根据差值更改细胞灌注间隔时间，确保细胞有规律的生长，建立了反馈调节体系，提供了实时监测细胞状态变化的方法。

3、本发明利用注射泵进行细胞灌注，并且所有的给定值均由上位机给出，并传输给MCU控制器，不需要人工参与，自动化程度高，降低成本。

附图说明

图1是本发明所述的一种微流控芯片细胞培养控制的整体装置图；

图2是图1所示的微流控芯片的结构俯视放大示意图；

图3是本发明的一种微流控芯片细胞动物培养系统工作流程图；

图4是灌注培养过程中细胞增殖三代最大值与细胞密度的关系曲线图；

附图中各部件的序号和名称：1.注射泵；2.注射器；3.微流控芯片；4.MCU控制器；5.上位机；6.阻抗分析仪；7.废液池；8.电极引出端；9.电极；10.进样口；11.PTFE导管；12.出样口；13.叉指电极。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的具体内容进行进一步的说明。

参见图1，本发明一种微流控芯片细胞培养控制的整体工作装置图，包括：现场控制装置、上位机5以及阻抗分析仪6。现场控制装置是以MCU控制器4为核心，包括微流控芯片3和注射泵1，本实施例设置12V的电源通过，与MCU控制器4连接，实现给现场控制装置供电。MCU控制器4通过控制线与注射泵1相连，并对其控制，注射泵1上方水平放置注射器2，注射器2里存放的是细胞悬浮液或培养液，PTFE导管11两端分别连接着注射器2的注射口和微流控芯片3的进样口10，微流控芯片3的出样口12通过第二根PTFE导管11与废液池7连接，当注射新的培养液时，需控制注射泵1将废弃的培养液注入废液池7中。若干叉指电极13交叉分布在微流控芯片3的基底上，叉指电极13的电极9两两交叉布置，叉指电极13设有电极引线端8，电极引线端8与阻抗分析仪6连接，用于测量在注入培养液后细胞的阻抗值，阻抗分析仪6经控制线连接上位机5，上位机5接收测量的阻抗值，能简单快速地分析细胞在增加一个小幅度的交流扰动信号后的阻抗变化，利用阻抗值变化进行细胞生长状况分析。上位机5通过USB控制线连接MCU控制器4，MCU控制器4完成阻抗值的采集与装置控制，并通过USB通信方式将结果传输给上位机5。

参见图1、图2，本发明中微流控芯片3的结构俯视图，微流控芯片3是长、宽、高为微米级别的长方体结构，水平放置，由下方的基底和上方盖片组成，基底、盖片均为长方体结构。通过氧离子键合的方法使基底与盖片对齐粘附，从而制成微流控芯片3。盖片中刻有一个进样口10、一个出样口12和位于进样口、出样口的一个单通道，盖片选用PDMS(聚二甲基硅氧烷)材料制作，先用光刻法制作出阳模具，然后浇注液态高分子材料，再将固化的高分子材料剥离，最后形成盖片。进样口10和出样口11都是半径为r、高度为c的圆柱孔，单通道的长度为a、宽度为b、高度为c，体积为V₁＝a×b×c。基底上方设有采用光刻技术制成的叉指电极13，电极9是一种微间距矩形电极，每个电极9的高度为h、宽度为w，两电极9之间的间隔为d；叉指电极13能够覆盖微流控芯片3的50％的面积，从而确保更多数目的细胞落在电极9上，提高阻抗分析仪6检测的准确度。

参见图3，为本发明一种微流控芯片细胞培养控制方法的工作流程图，具体工作流程如下：

步骤1：选取控制模型的输入量和输出量，并测出模型输入量的数值的范围。建立模型的方法有很多，例如BP算法、最小二乘支持向量机算法、神经网络算法、模糊算法等等，本实施例中采用最小二乘支持向量机算法建立控制模型、采用间歇灌注的方法进行细胞培养，细胞间歇灌注有五个影响参数，即细胞密度C、连续灌注时间T₁、细胞增殖三代时间T₂、间隔时间T₃、灌注流速Q，本实施例中的控制模型选取细胞密度C和细胞增殖三代时间T₂两个参数作为控制模型的输入量，而间隔时间T₃作为输出量。

在采集数据之前，需要确定输入量、输出量的范围，保证细胞正常生长，方法如下：在细胞培养研究中，当培养区域中只有单细胞时，细胞密度C达到最小，即C_min＝0.78mm^-2，为了维持细胞正常形态，不影响后续细胞生长规律、细胞活性检测、药物诱导细胞凋亡等研究实验结果，一般当细胞生长至80％时则达到最大密度，即C_max＝62.5mm^-2。细胞密度越高，细胞消耗营养成分越快，培养液灌注更换频率越大。因此，不同细胞密度会影响细胞增殖三代时间，当细胞为单个细胞时，细胞密度最小、细胞处于生长的最佳状态，此时实验测得细胞增殖三代时间最小值，即T_2min＝68h；当灌注不同密度的细胞时，采集细胞增殖三代时间最大值，得到n组的采样样本数据(C₁，T_2max1),(C₂，T_2max2),…,(C_n，T_2maxn)，对测得的数据进行多项式拟合，得到细胞密度与细胞增殖三代时间最大值关系T_2max＝f(C)，曲线图如图4所示，此时根据曲线图即可计算出不同细胞密度C对应的细胞增殖三代时间最大值T_2max。

步骤2：离线采集数据，利用最小二乘支持向量机建立控制模型。分别改变细胞密度C和灌注间隔时间T₃，判断细胞是否已增殖三代，从而得到细胞增殖三代时间T₂。采集到数据如(C₁，T₂₁，T₃₁),(C₁，T₂₂，T₃₂),…,(C_n，T_2n，T_3n)，数据样本采集结束后，对数据样本进行归一化处理，然后将得到的归一化处理后的数据样本分成训练样本和测试样本，以训练样本中的细胞密度C、细胞增殖三代时间T₂作为模型的输入变量，以灌注间隔时间T₃作为输出变量，建立双输入单输出系统模型T₃＝f(C,T₂)。然后，以测试数据样本对该模型进行修正，通过修正该模型相关参数，使模型预测值接近真实值，最终完成整个模型的训练过程。

步骤3：建立阻抗值与细胞生长率之间的模型。上位机5经MCU控制器4控制注射泵1工作，在t₁时刻，在微流控芯片3中注射细胞悬浮液，当细胞贴壁后，上位机5控制阻抗分析仪6测量阻抗值，阻抗分析仪6检测到细胞阻抗值Z₁₁；如此循环往复，直至上位机5分别获得时间为t₁,t₂,t₃,……,t_n的n个采样样本数据Z₁₁,Z₁₂,…,Z_1n，此时第一个采样周期结束；通过公式(1)计算细胞实际生长率μ₁₁,μ₁₂…,μ_1n。

其中Z为阻抗值，μ为细胞实际生长率。然后连续灌注培养液T₁小时，培养一段时间后，采用与第一个采样周期相同的方法，使上位机5获得n个采样样本数据Z₂₁,Z₂₂,…Z_2n，其中，Z₂₁,Z₂₂…,Z_2n分别是在时间t₁,t₂,…,t_n时的细胞阻抗值；根据公式(1)计算细胞生长率μ₂₁,μ₂₂…,μ_2n。

再以此类推，保持连续灌注时间T₁不变，测得第m个采样周期的采样样本数据Z_m1,Z_m2,…,Z_mn，Z_m1,Z_m2…,Z_mn，分别是时间为t₁,t₂,…,t_n时的细胞阻抗值，此时细胞生长率为μ_m1,μ_m2…,μ_mn。至此整个数据样本采集结束，共采集mn组数据。以阻抗值为模型的输入量、而细胞生长率为输出变量，由最小二乘支持向量机得到阻抗值与细胞生长率的数学关系式μ＝f(Z)。

步骤4：确定输入量和输出量之外的其他影响参数Q、T₁的数值。由于培养液灌注会产生剪切力，有时造成细胞损伤甚至脱落，为了让细胞正常生长，灌注培养液的流速不能太大，根据公式(2)判断灌注流速是否适宜。

其中τ是剪切力，Q是灌注流速，μ是培养液动力粘度，w是芯片的宽度，h是芯片高度。在动物细胞培养过程中，假设灌注流速Q＝0.5uL/min，算出剪切力τ，目前已有论文(Aeration in Cell Culture Bioreactors)研究损害贴壁细胞的剪切力为0.5～10N/m²，此时的灌注流速Q小于0.5N/m²，所以本实施例中选取0.5uL/min作为灌注流速。为了充分更换培养液，培养液的灌注量要稍微大于通道的体积，即V＝1.5×V₁。根据公式V＝Q×T₁确定连续灌注时间T₁的值，其中V是培养液的灌注量，Q是灌注流速。

步骤5：接种某一确定的细胞密度的悬浮液。上位机5设计一个控制软件界面，输入在(0.78,62.5)范围内的细胞密度C为3mm^-2，并传输给MCU控制器4，MCU控制器4控制注射泵1注入细胞密度C为3mm^-2的细胞悬浮液，此时细胞悬浮液的注入量小于或等于培养通道体积V₁。

步骤6：在控制软件界面中输入参数值Q、T₁、T₂。在步骤5设计的控制软件界面中输入步骤4确定的灌注流速Q以及连续灌注时间T₁，由步骤1得知T_2min＝68h，根据公式T_2max＝f(C)计算得到增殖三代最大值为68h，然后输入细胞增殖三代时间T₂为68小时，上位机5将设置的参数值Q、T₁、T₂传输给MCU控制器4，同时通过步骤2建立的控制模型，计算出初始的间歇时间T₃。

步骤7：将步骤6计算的细胞灌注间隔时间T₃传输给MCU控制器4。培养一段时间以后，MCU控制器4控制注射泵1以灌注流速0.5uL/min连续灌注培养液T₁小时，此时培养液的灌注量为V。

步骤8：在灌注培养液后，培养一段时间，当细胞贴壁后，上位机5设置阻抗分析仪6的固定频率点4kHz，扫描周期为t，实时测量细胞的阻抗值。扫描结束后，继续重复扫描，直到T₃时刻结束。最终得到阻抗幅值Z₀，Z₁，Z₂，Z₃，……，Z_n-1，Z_n。阻抗分析仪6利用USB通信方式将得到的阻抗数据传输给上位机5，上位机5通过步骤3的公式(1)计算细胞实际生长率μ₁，μ₂，μ₃，......，μ_n。

步骤9：上位机5根据步骤3建立的数学模型μ＝f(Z)，通过阻抗幅值Z₁，Z₂，Z₃，……，Z_n-1，Z_n计算得出预测生长率λ₁，λ₂，λ₃，......，λ_n，上位机5设置了标准误差ε，将生长率的预测值λ跟实际值μ进行比较，根据公式计算差值e，根据差值结果对应的细胞生长状况进行反馈调节，如果差值e小于标准误差ε，则说明细胞生长符合预期规律，保持灌注间隔时间T₃不变，如果大于标准误差ε，则上位机5根据增量式PID公式u_i＝u_i-1+Δu计算出间歇时间的控制增量，其中u是细胞灌注间隔时间T₃，由控制增量得到下一次细胞灌注的间隔时间T₃，并继续执行步骤7，由此控制注射泵1依照求得的间歇时间T₃进行灌注培养液。

步骤10：当T₃结束，细胞培养时间是否已经到T₂时刻，如果没有到T₂时刻，则MCU控制器4控制注射泵1将步骤8灌注的培养液注入废液池7，继续执行步骤8，循环往复，直到细胞培养时间到T₂时刻，代表细胞已增殖三代，则细胞进样结束。

参见图4，本发明的细胞密度和细胞增殖三代时间最大值的关系曲线图。当细胞密度为0.78＜C≤6mm^-2时，细胞增殖三代时间的最大值保持不变，T′_2max＝68h，当细胞密度为6＜C≤34mm^-2时，营养充足，细胞增殖三代时间的最大值随着细胞密度的增加而增加，T″_2max＝0.0136C²+0.3328C+65.6304，当细胞密度为34＜C≤62.5mm^-2时，细胞此时缺乏营养成分，细胞增殖三代时间的最大值随着细胞密度的增加而减小，T″′_2max＝-0.129C+97.2949。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种微流控芯片细胞培养控制装置，其特征在于，包括依次连接的现场控制装置、上位机(5)以及阻抗分析仪(6)，所述现场控制装置包括依次连接的MCU控制器(4)、注射泵(1)和微流控芯片(3)，注射泵(1)上方设置注射器(2)，注射器(2)的注射口和微流控芯片(3)的进样口(10)之间、微流控芯片(3)的出样口(12)与废液池(7)之间均通过PTFE导管(11)连接，所述微流控芯片(3)由长方体状的基底和盖片粘附而成，进样口(10)、出样口(12)均刻在盖片上，且进样口(10)和出样口(12)之间设有单通道，基底上设有若干交叉的叉指电极(13)，叉指电极(13)设有与阻抗分析仪(6)相连的电极引线端(8)。

2.根据权利要求1所述的一种微流控芯片细胞培养控制装置，其特征在于，所述进样口(10)和出样口(11)均是半径为r、高度为c的圆柱孔；所述单通道的长度为a、宽度为b、高度为c，体积为V₁＝a×b×c。

3.根据权利要求1所述的一种微流控芯片细胞培养控制装置，其特征在于，所述叉指电极(13)的每个电极(9)均为矩形，电极(9)的高度为h、宽度为w，电极(9)两两交叉布置，且两电极(9)之间的间隔为d。

4.一种微流控芯片细胞培养控制方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)：选取控制模型的输入量和输出量，并测出输入量的数值范围；

步骤2)：采集输入量和输出量的数值，建立控制模型；

步骤3)：建立阻抗值与细胞生长率之间的模型；

步骤4)：确定输入量和输出量之外的其他影响参数的数值；

步骤5)：于微流控芯片(3)中接种某一细胞密度的悬浮液；

步骤6)：将某一细胞密度确定的输入量的值输入步骤2)中的控制模型中，由此得出相应的输出量，将步骤4)参数的数值输入上位机(5)的控制软件界面；

步骤7)：将步骤6)的相应的输出量传输给MCU控制器(4)，MCU控制器(4)控制注射泵(1)灌注细胞培养液；

步骤8)：细胞培养一段时间，当细胞贴壁之后，由阻抗分析仪(6)测取细胞阻抗，然后上位机(5)计算细胞的实际生长率；

步骤9)：由阻抗值与细胞生长率之间的模型得出细胞的预测生长率，根据细胞的预测生长率与实际生长率的差值，对相应的输出量进行调整。

5.根据权利要求4所述的一种微流控芯片细胞培养控制方法，其特征在于，所述步骤1)中的输入量和输出量从细胞间歇灌注影响参数中选取。

6.根据权利要求4所述的一种微流控芯片细胞培养控制方法，其特征在于，所述输入量为细胞密度C、细胞增殖三代时间T₂，所述细胞密度C的数值范围由经验判断，所述细胞增殖三代时间的最小值T_2min为：当细胞为单个细胞时，细胞处于生长的最佳状态，此时细胞增殖三代时间的最小；所述细胞增殖三代时间的最大值T_2max为：前期准备过程中，实验测得一些细胞密度与细胞增殖三代时间最大值的数据，多项式拟合得到分段曲线，后续试验过程中，再根据曲线计算不同的细胞密度对应的细胞增殖三代时间最大值。

7.根据权利要求6所述的一种微流控芯片细胞培养控制方法，其特征在于，所述控制模型为双输入单输出系统模型T₃＝f(C,T₂)。

8.根据权利要求4所述的一种微流控芯片细胞培养控制方法，其特征在于，所述阻抗值与细胞生长率之间的模型μ＝f(Z)，由最小二乘支持向量机得到，其中μ是细胞生长率，Z为阻抗值。

9.根据权利要求4所述的一种微流控芯片细胞培养控制方法，其特征在于，所述计算细胞的实际生长率的公式为：差值其中Z为阻抗值，μ为细胞实际生长率，λ为细胞预测生长率，n为测量的样本量，t为扫描周期。

10.根据权利要求4所述的一种微流控芯片细胞培养控制方法，其特征在于，所述对相应的输出量进行调整具体为：当差值e小于设置标准误差ε，保持灌注间隔时间不变，若e大于ε，则上位机5根据增量式PID公式u_i＝u_i-1+Δu计算出间歇时间的控制增量，从而得到下一次细胞灌注的间隔时间，则返回步骤7)。