CN110988048A - 一种基于粘附强度的细胞活性评估装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种一种基于粘附强度的细胞活性评估装置及方法,采用粘附强度来描述粘附力,即分离75%的细胞所需要的剪切力大小,通过含有浓度为aμmol/L H2O2的培养基诱导形成异质性分布的贴壁细胞,阻抗分析仪定量监测细胞在不同剪切力下的粘附状况,使用Logistic函数拟合出归一化阻抗受剪切力影响的响应曲线来计算粘附强度,定量监测细胞在不同剪切力作用下粘附的动态过程,利用粘附强度实现了在考虑细胞群的异质性情况下细胞活性的准确评估,考虑到细胞群的个体异质性,有效地提高了细胞活性评估的准确性,对细胞具有无标签、无损伤的实时监测作用,不会对细胞形态产生影响。
Description
技术领域
本发明属于细胞活性评估领域,涉及一种利用粘附强度来间接评估细胞活性的技术。
背景技术
细胞活性评估对抗癌药物的剂量试验、细胞毒理学研究和其他生化刺激具有重要意义。中国专利申请号为CN201610474265.4的文献中公开了一种基于电子显微镜下自动检测细胞活性的系统,通过显微镜实时计算活细胞占总细胞的百分比作为细胞活性评估标准。该方法未能考虑到细胞群的个体异质性,由于细胞群的个体异质性,细胞对药物的反应能力是有差异的,通过计数总细胞中的活细胞的细胞活性的传统评估方法对于药物的剂量反应测定是非常不准确的。中国专利申请号为CN200610165274.1的文献中公开了一种中性红染色法检测藻细胞活性的方法,利用死细胞和活细胞对染料不同的亲和力,检查细胞活性。但该方法使用的是普通生物显微镜观察计数,会产生较大的误差,且化学染色法如若染色时间太长,活细胞也会被染色,对细胞具有一定损伤,会影响细胞活性评估。
发明内容
针对上述问题,本发明提出了一种基于粘附强度评估细胞活性的装置与方法,考虑到细胞群的个体异质性,有效地提高了细胞活性评估的准确性。
本发明所述的一种基于粘附强度的细胞活性评估装置采用的技术方案是:包括一个微流控芯片,微流控芯片具有微流道入口和微流道出口,微流道入口经一根导管连接到注射器的针头前端,注射器的后端连接注射泵的输出端,微流道出口经另一根导管连接废液池,微流控芯片具有PDMS层和载玻片,PDMS层的下表面叠放在载玻片的上表面上,PDMS层的底部设有微流道,微流道的一端连通微流道入口,微流道的另一端连通微流道出口,载玻片的上表上分布叉指电极,微流道的下底面与叉指电极的上表面对齐且键合在一起,叉指电极通过信号线连接阻抗分析仪,注射泵和阻抗分析仪通过控制线连接MCU控制器,MCU控制器通过串行通信接口连接到上位机。
本发明所述的一种基于粘附强度的细胞活性评估装置的细胞活性评估方法采用的技术方案是是依次按以下步骤:
步骤1:将不含有细胞的培养基注入注射器中,MCU控制器控制注射泵工作,将培养基以剪切力下限值F1全部注入微流道中,阻抗分析仪测量到叉指电极上无细胞粘附的阻抗值Zno-cell,阻抗值Zno-cell经MCU控制器传送至上位机中;
步骤2:将每mL含有106个细胞的培养基以剪切力下限值F1注入微流道中培养,使细胞贴壁;
步骤3:将浓度为0μmol/LH2O2的培养基作为控制组以剪切力下限值F1注入微流道中培养,阻抗分析仪测量到叉指电极上的阻抗值Z1并上传到上位机中;
步骤4:将含有106个细胞的培养基以剪切力F2=F1+△F注入微流道中,△F是剪切力步长,阻抗分析仪测量到叉指电极上的阻抗值Z2并上传到上位机中;如此重复n次,依序地,施加的剪切力均在前一次基础上增加相同的步长△F,上位机得到浓度为0μmol/L H2O2的培养基在每个剪切力F1,F2,……,Fn下分别对应的阻抗值Z1,Z2,……,Zn;
步骤5:上位机先对阻抗值Z1、Z2……Zn作归一化处理得到归一化阻抗值:再使用Logistic函数拟合每一个剪切力下所对应的归一化阻抗值,得到S型函数y=f(x),然后根据S型函数的反函数计算出控制组的细胞粘附强度τ25(0μmol/L):
步骤6:重复步骤1-2,之后将浓度为50μmol/L H2O2的培养基作为样本组,以剪切力下限值F1注入微流道中,阻抗分析仪采集阻抗值C1并上传到上位机中;
步骤7:重复步骤4-5,得到相对应的S型函数y=g(x);
步骤8:重复步骤6-7,所不同的仅是改变含有H2O2的培养基浓度,将浓度分别为200μmol/L、500μmol/L的H2O2的培养基作为样本组注入,分别得到相对应的S型函数y=g(x);
步骤9:分离75%细胞的归一化阻抗值为原来的25%,即为0.25NI0,利用S型函数y=g(x)的反函数计算出样本组的细胞粘附强度τ25(aμmol/L):
步骤10:将样本组的细胞粘附强度τ25(aμmol/L)除以控制组的细胞粘附强度τ25(0μmol/L)得到细胞活性值。
本发明与已有方法和技术相比,具有如下优点:
1、粘附力被认为是反映细胞状态的重要物理指标,本发明采用粘附强度来描述粘附力,即分离75%的细胞所需要的剪切力大小。通过含有浓度为aμmol/L H2O2的培养基诱导形成异质性分布的贴壁细胞,阻抗分析仪定量监测细胞在不同剪切力下的粘附状况,使用Logistic函数拟合出归一化阻抗受剪切力影响的响应曲线来计算粘附强度,利用粘附强度实现了在考虑细胞群的异质性情况下细胞活性的准确评估。
1、本发明采用粘附强度的方法评估细胞活性,与传统的通过计数活细胞占总细胞的百分比作为细胞活性的评估方法相比,这种方法考虑到细胞群的个体异质性,有效地提高了细胞活性评估的准确性。
2、本发明通过阻抗分析仪定量监测细胞在不同剪切力作用下粘附的动态过程,与传统的染色法、比色法相比,该方法对细胞具有无标签,无损伤的实时监测作用,不会对细胞形态产生影响。
3、本发明实现了细胞活性的自动化评估,与药物反应等方法相比,减少了人工操作以及人工操作带来的误差,大大加强了细胞活性评估的准确性。
附图说明
图1是本发明所述的一种基于粘附强度的细胞活性评估装置的结构示意图;
图2是图1中微流控芯片结构的分解放大图;
图3是图1所示装置的工作流程图;
图4是归一化阻抗受剪切力影响的响应曲线图;
图5是试验例中细胞活性的相对误差受H2O2浓度影响的关系曲线图。
附图中各部件的序号和名称:1、微流控芯片;2、微流道入口;3、微流道出口;4、注射器;5、注射泵;6、废液池;7、叉指电极;8、外接电极引出端;9、外接对电极引出端;10、阻抗分析仪;11、MCU控制器;12、连接端口;13、串行通信接口;14、上位机;15、微流道;16、载玻片;17、PDMS;18、导管。
具体实施方式
参见图1,本发明所述的一种基于粘附强度的细胞活性评估装置,包括一个微流控芯片1,微流控芯片1具有两个微流道口,分别是微流道入口2和微流道出口3,微流道入口2经一根导管18连接到注射器4的针头前端,注射器4的后端连接注射泵5的输出端,由注射泵5推动工作。微流道出口3经另一根导管18连接废液池6。
参见图2,微流控芯片1具有PDMS(聚二甲基硅氧烷)层17和载玻片16,PDMS层17的下表面叠放在载玻片16的上表面上,PDMS层17的底部设有微流道15,微流道15为无底的长方体通道。微流道15的一端连通微流道入口2,微流道15的另一端连通微流道出口3。载玻片16的上表上分布叉指电极7,叉指电极7由若干个电极交叉组成。叉指电极7上设有外接电极引出端8和外接对电极引出端9,微流道15的下底面与叉指电极7的上表面对齐在一起键合,形成微流控芯片1。
微流道入口2和微流道出口3的直径均为2mm,微流道15的长方体通道的长度为30mm,长方体通道的宽度为800μm,长方体通道的上下高度为120μm。
参见图1和图2,外接电极引出端8和外接对电极引出端9各自通过信号线连接阻抗分析仪10,注射泵5和阻抗分析仪10通过控制线连接MCU控制器11,经连接端口12接入MCU控制器11,MCU控制器11通过串行通信接口13连接到上位机14上。
参见图1-3所示,基于粘附强度的细胞活性评估装置工作时,对细胞活性评估具体方法如下:
步骤1:将不含有细胞的培养基注入注射器4中,MCU控制器11控制注射泵5工作,将注射器4中的不含有细胞的培养基以剪切力下限值F1全部从微流道入口2注入微流道15中,阻抗分析仪10测量到叉指电极7上无细胞粘附的阻抗值Zno-cell,阻抗值Zno-cell经MCU控制器11传送至上位机14。
步骤2:将每mL含有106个细胞的培养基注入注射器4中,MCU控制器11控制注射泵5工作,将注射器4中的含有106个细胞的培养基基以剪切力下限值F1全部从微流道入口2注入微流道15中。然后,培养8h,使细胞贴壁。
步骤3:待细胞贴壁后,将浓度为0μmol/L H2O2的培养基作为控制组注入注射器4中,MCU控制器11控制注射泵5工作,将注射器4中的浓度为0μmol/L H2O2的培养基作为控制组以剪切力下限值F1从微流道入口2注入微流道15中,此时,剪切力下限值F1是第一次施加的剪切力。然后,培养3h,诱导形成异质性分布的贴壁细胞。之后,阻抗分析仪10测量到叉指电极7上的阻抗值Z1,将采集到的阻抗值Z1经MCU控制器11上传到上位机14中。阻抗值Z1上传到上位机14后,再对细胞培养2min。
步骤4:MCU控制器11再次控制注射泵5工作,将注射器4中的含有106个细胞的培养基以剪切力F2从微流道入口2注入微流道15中。第二次施加的剪切力F2是在剪切力下限值F1的基础上增加一个递增的剪切力,即剪切力步长△F,即F2=F1+△F。之后,阻抗分析仪10测量到叉指电极7上的阻抗值Z2,将采集到的阻抗值Z2经MCU控制器11上传到上位机14中。
如此循环重复步骤4,MCU控制器11便依序地控制注射泵5施加递增的剪切力△F,MCU控制器每次控制注射泵5施加的剪切力均在前一次施加的剪切力基础上增加相同的步长△F。如此循环n次,直到MCU控制器11控制注射泵5施加的剪切力Fn等于剪切力的上限值Fmax。最终,上位机14得到浓度为0μmol/L H2O2的培养基在每个剪切力F1,F2,……,Fn下分别对应的阻抗值Z1,Z2,……,Zn。
步骤5:上位机14先对阻抗值Z1、Z2……Zn作归一化处理,得到归一化阻抗值NI1、NI2、……NIn:
然后,使用Logistic函数拟合每一个剪切力下所对应的归一化阻抗值(Fn,NIn),得到如图4中所示的归一化阻抗受剪切力影响的曲线A1以及相应的S型函数y=f(x):
式中,x为剪切力,y为归一化阻抗值,B1、B2、x0、p是用origin2016拟合Logistic函数得到的最优系数。
由于归一化阻抗值与贴附在电极上的细胞数近似成正比,分离75%细胞的归一化阻抗值为原来的25%,即为0.25NI0。因此,先求出S型函数反函数x=f-1(0.25NI0),再根据S型函数反函数计算出控制组的细胞粘附强度τ25(0μmol/L):
τ25(0μmol/L)=f-1(0.25NI0)。
步骤6:重复步骤1-2,也就是第二次将不含有细胞的培养基注入微流道15,阻抗分析仪10测量叉指电极7上无细胞粘附的阻抗值,再将含有106个/mL细胞的培养基注入微流道15,培养8h使细胞贴壁。
待细胞贴壁后,将浓度为aμmol/L H2O2的培养基作为样本组注入注射器4中,a=50,MCU控制器11控制注射泵5以剪切力下限值F1将样本组注入微流道15中,培养3h,诱导形成异质性分布的贴壁细胞,阻抗分析仪10采集阻抗值C1,MCU控制器11提取阻抗值C1上传到上位机14中。上传到上位机14后,再对细胞培养2min。
步骤7:重复步骤4-5,得到相对应的S型函数y=g(x)以及得到如图4所示的归一化阻抗受剪切力影响的曲线A2。
步骤8:如此重复步骤6-7,所不同的仅是改变含有H2O2的培养基浓度,即将浓度分别为200μmol/L、500μmol/L的H2O2的培养基作为样本组注入注射器4中,即a=200、a=500。分别得到如图5中所示的归一化阻抗受剪切力影响的曲线A3、A4以及相应的S型函数y=f(x):。
步骤9:由于归一化阻抗值与贴附在电极上的细胞数近似成正比,分离75%细胞的归一化阻抗值为原来的25%,即为0.25NI0。利用S型函数的反函数x=g-1(0.25NI0)计算出样本组的细胞粘附强度τ25(aμmol/L):
τ25(aμmol/L)=g-1(0.25NI0)
步骤10:在上位机14中,将步骤9得到的样本组的细胞粘附强度τ25(aμmol/L)除以步骤5中得到的控制组的细胞粘附强度τ25(0μmol/L),计算出细胞活性CV(%):
CV(%)=τ25(aμmol/L)/τ25(0μmol/L)×100%,
通过细胞活性CV(%)值就能评估出当前的细胞活性。
试验例:
选取三种不同浓度(50μmol/L、200μmol/L和500μmol/L)H2O2的培养基做了三组对比试验,依次计算出在三种不同浓度H2O2的培养基下的细胞活性,与IC50法测定的细胞活性进行比较,计算出本发明试验的相对误差。将本发明试验的相对误差与传统计数试验的相对误差进行比较,结果如图5所示,本发明试验的相对误差明显低于传统计数试验的相对误差。因此,通过本发明试验评估的细胞活性比使用传统的细胞计数试验测定的细胞活性更准确。
Claims (6)
1.一种基于粘附强度的细胞活性评估装置,包括一个微流控芯片(1),微流控芯片(1)具有微流道入口(2)和微流道出口(3),微流道入口(2)经一根导管连接到注射器(4)的针头前端,注射器(4)的后端连接注射泵(5)的输出端,微流道出口(3)经另一根导管连接废液池(6),其特征是:微流控芯片(1)具有PDMS层(17)和载玻片(16),PDMS层(17)的下表面叠放在载玻片(16)的上表面上,PDMS层(17)的底部设有微流道(15),微流道(15)的一端连通微流道入口(2),微流道(15)的另一端连通微流道出口(3),载玻片(16)的上表上分布叉指电极(7),微流道(15)的下底面与叉指电极(7)的上表面对齐且键合在一起,叉指电极(7)通过信号线连接阻抗分析仪(10),注射泵(5)和阻抗分析仪(10)通过控制线连接MCU控制器(11),MCU控制器(11)通过串行通信接口连接到上位机(14)。
2.一种如权利要求1所述的基于粘附强度的细胞活性评估装置的细胞活性评估方法,其特征是依次按以下步骤:
步骤1:将不含有细胞的培养基注入注射器(4)中,MCU控制器(11)控制注射泵(5)工作,将培养基以剪切力下限值F1全部注入微流道(15)中,阻抗分析仪(10)测量到叉指电极(7)上无细胞粘附的阻抗值Zno-cell,阻抗值Zno-cell经MCU控制器(11)传送至上位机(14)中;
步骤2:将每mL含有106个细胞的培养基以剪切力下限值F1注入微流道(15)中培养,使细胞贴壁;
步骤3:将浓度为0μmol/L H2O2的培养基作为控制组以剪切力下限值F1注入微流道(15)中培养,阻抗分析仪(10)测量到叉指电极(7)上的阻抗值Z1并上传到上位机(14)中;
步骤4:将含有106个细胞的培养基以剪切力F2=F1+△F注入微流道(15)中,△F是剪切力步长,阻抗分析仪(10)测量到叉指电极(7)上的阻抗值Z2并上传到上位机(14)中;如此重复n次,依序地,施加的剪切力均在前一次基础上增加相同的步长△F,上位机(14)得到浓度为0μmol/L H2O2的培养基在每个剪切力F1,F2,……,Fn下分别对应的阻抗值Z1,Z2,……,Zn;
步骤5:上位机(14)先对阻抗值Z1、Z2……Zn作归一化处理得到归一化阻抗值:再使用Logistic函数拟合每一个剪切力下所对应的归一化阻抗值,得到S型函数y=f(x),然后根据S型函数的反函数计算出控制组的细胞粘附强度τ25(0μmol/L):
步骤6:重复步骤1-2,之后将浓度为50μmol/L H2O2的培养基作为样本组,以剪切力下限值F1注入微流道(15)中,阻抗分析仪(10)采集阻抗值C1并上传到上位机(14)中;
步骤7:重复步骤4-5,得到相对应的S型函数y=g(x);
步骤8:重复步骤6-7,所不同的仅是改变含有H2O2的培养基浓度,将浓度分别为200μmol/L、500μmol/L的H2O2的培养基作为样本组注入,分别得到相对应的S型函数y=g(x);
步骤9:分离75%细胞的归一化阻抗值为原来的25%,即为0.25NI0,利用S型函数y=g(x)的反函数计算出样本组的细胞粘附强度τ25(aμmol/L):
步骤10:将样本组的细胞粘附强度τ25(aμmol/L)除以控制组的细胞粘附强度τ25(0μmol/L)得到细胞活性值。
3.根据权利要求2所述的细胞活性评估方法,其特征是:步骤2中,注入微流道(15)中的含有106个细胞的培养基需培养8h。
4.根据权利要求2所述的细胞活性评估方法,其特征是:步骤3中,注入微流道(15)中的浓度为0μmol/L H2O2的培养基需要培养3h,当阻抗值Z1上传到上位机(14)后,再对细胞培养2min。
6.根据权利要求2所述的细胞活性评估方法,其特征是:步骤9中,分离75%细胞的归一化阻抗值为原来的25%,即为0.25NI0,利用S型函数y=g(x)的反函数x=g-1(0.25NI0)计算出样本组的细胞粘附强度τ25(aμmol/L)=g-1(0.25NI0)。
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