CN113640198B - 一种单细胞计数的方法及其系统 - Google Patents
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Abstract
本发明的方法以荧光标记的单细胞为检测对象，基于微流控芯片形成微米级的流道实现类似流式的“液流聚焦”，直接识别单细胞产生的荧光信号并计数，最后根据一定的数学模型得到样本中的细胞浓度。采用微米级的微流控芯片作为样本流道，依托微流控芯片精细的的加工工艺，直接通过缩小中央流道宽高的方式实现样本流聚焦(无需鞘液挤压)，与传统流式细胞仪的液流系统相比液路更简单，更稳定。作为一种高灵敏度，高准确性的细胞定量方法，是一种潜在的计量基准方法，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种单细胞计数的方法及其系统，属于计量科学领域。
背景技术
随着生物科学技术不断取得突破性进展，生命科学研究已逐渐从定性科学发展为精准定量的科学。细胞不仅是生物体的结构和功能的基本单位，也是生物体个体发育和系统发育的基础。因此细胞含量的定量测量技术已广泛应用于临床诊断(如免疫状态监控、血液疾病预后)和基础科学研究(如单细胞测序、肿瘤信号通路传导)等各个领域。
细胞定量测量方法有多种，但多数计数方法的准确性相对较差，其中目前准确度较高的测量方法主要有显微镜计数和流式细胞计数两种。前者将细胞样本均匀分布于细胞计数板后进行显微成像，通过人工计数或软件自动识别的方法统计样本中细胞的浓度。流式细胞计数(结合绝对计数微球)是基于已知含量的微球与待测细胞结合荧光抗体的效率基本一致的原则，通过流式细胞仪计算细胞拷贝数浓度。
显微镜计数是细胞计数的基本方法，也是确定其它计数方法有效性的参考。它将细胞样本均匀分布于细胞计数板上，通过人工计数的方法统计显微图像中单位体积的细胞数量。整个计数过程比较耗时费力，且当检测高浓度样本时，反复稀释以及人工误差都会影响最后计数，造成重复性较差。随着技术发展，使用图像分析软件(如ImageJ等)可自动识别显微成像中的细胞颗粒，即根据图片中细胞的灰度值、面积、形状、颜色等特征，将目的细胞与背景区分开，从而替代人工计数自动统计图片中细胞的数量。但当图像目标和背景色差小，图像质量差或细胞重叠交叉时，细胞分界模糊，通过软件难以准确计数。
流式细胞计数法是主要利用流式细胞仪实现单细胞计数。目前一种被认为准确性较高的方法是在细胞样本中加入绝对计数微球作为内参，通过流式细胞仪识别检测流动中的单个细胞和计数微球，并基于两者与抗体结合效率一致原则，根据已知的微球数量来计算细胞浓度。该方法认可度较高，在临床诊断领域得到较广泛的应用。但作为一种间接计数的方法，在体系中引入了微球这一变量，不仅检测成本显著提高，而且在测量中引入新的不确定度来源。例如当微球保存不当、或未充分混匀时都会影响细胞计数结果。
这两种方法细胞计数的前提是将样本制备成单细胞悬液，显微成像或流式检测时细胞间彼此分离，这是进行单细胞计数的基础。但实际上细胞样本中不可避免的存在少量的黏连和细胞分布不均的情况，因此显微成像中细胞间的交叉重叠容易造成计数结果偏低，定量结果重复性下降；流式检测虽然可以通过流动中的物理剪切力可一定程度上减少细胞多聚体的出现，但细胞或微球形成的二聚体、或冲突事件仍然会少量存在，其定量结果需要修正。并且流式细胞计数法在反应体系中引入绝对定量微球，其与细胞结合抗体的效率可能存在少量差别，在增加检测成本的同时影响定量结果的准确性。
以“微流控芯片”作为流道，使荧光抗体标记的细胞样本以单细胞状态逐个经过芯片中央的检测区并被激光激发产生荧光。通过依次识别每个细胞被发出的荧光信号，对样本中细胞个数进行计数，从而实现对细胞浓度的绝对定量。与前述方法相比，“基于微流控芯片的单细胞计数”方法具有下列显著优势：
1.相对传统流式细胞计数，细胞计数更准确。改进两方面：(1)采用微米级的微流控芯片，显著降低检测区的细胞样本流宽度高度。这一设计不仅增强了荧光检测的信噪比，更保证样本中更多细胞以单细胞状态逐个经过检测区。这是信号采集装置有效鉴别每个细胞颗粒，实现准确定量的关键。(2)建立了修正原始计数值的数学模型，减少“二聚体/冲突事件”对计数结果的影响，使定量结果更准确。
2.不需要内标，降低单次检测成本，并提高了定量测量的重复性。通过微弱荧光信号解析技术，直接识别单细胞发出的荧光信号，对样本中细胞直接计数。因次无需内标，减少了体系中的测量不确定度分量，提高定量测量的重复性。
3.具有极高的检测灵敏度，定量下限低。该方法通过微流控系统实现单细胞的荧光检测，，灵敏度很高，适用于对微量细胞样本的绝对定量，测量线性范围下限低至约10copies/μL。
因此，研究建立“基于微流控芯片的单细胞计数”定量方法，是对现有细胞定量方法的重
要补充，将显著提升对痕量细胞样本的精准定量测量能力。因此亟需建立一种高灵敏度、无需参照物，可对细胞浓度直接进行准确定量方法，进一步推动微量细胞样本精准定量体系的发展。
发明内容
本发明提供基于微流控芯片的单细胞计数的方法，该定量方法以荧光标记的单细胞为检测对象，基于微流控芯片形成微米级的流道实现类似流式的“液流聚焦”，直接识别单细胞产生的荧光信号并计数，最后根据一定的数学模型得到样本中的细胞浓度。该定量方法需要解决两个核心问题：1.单个细胞通过抗原表位结合的荧光抗体，在激光激发下产生的荧光信号较弱，必须尽可能增强激发效率，提升检测的灵敏度才能高效识别单细胞的荧光信号；2.流动态下，实际细胞样本中存在的少量二聚体细胞或冲突事件，影响计数结果。必须需要建立一定的数学模型，来修正原始计数值，实现准确定量。
为解决上述问题，本发明参照“流式细胞术”(通过鞘液流挤压实现“样本流聚焦”，使荧光标记的单个细胞彼此分离，在流道中以直线状态流动并被依次检测)，采用微米级的微流控芯片作为样本流道，依托微流控芯片精细的的加工工艺，直接通过缩小中央流道宽高的方式(无需鞘液挤压)，与传统流式计数相比液路更简单，更稳定。尤其是使样本流聚焦后宽度高度更小，这在三方面具有显著优势：(1)进一步提升了荧光检测的信噪比，提高了检测灵敏度；(2)更好的实现了流动态单个细胞的分离，使信号采集模块可更有效的识别单细胞产生的荧光信号，因此计数结果更准确；(3)使激光光斑在保证激发效率的同时完全覆盖样本流，从而实现不依赖于微球等内标物，直接识别样本中的每个细胞并计数，并且因未引入其他不确定度分量，提高了定量的重复性，使绝对测量更直接，更简单。因此，本发明的目的是克服现有细胞精准定量测量方法的不足，提供一种无需内标，直接测定细胞样本含量的高灵敏度绝对定量方法。该方法对单个细胞分子进行检测，通过构建的数学模型实现细胞定量，测量结果可直接溯源到国际基本单位(摩尔)。
基于微流控芯片的单细胞计数的定量方法与目前已广泛应用于“流式细胞计数”方法有相似之处在于：均属于高灵敏度的单细胞分析方法，通过显著缩小样本流宽度使激光照射到流动的单个细胞，提高检测的灵敏度；均采用了荧光检测技术，细胞经荧光抗体标记后被激发产生的荧光信号，都需要特定的荧光检测装置采集。但两者之间也存在显著的差异，包括：(1)“样本流聚焦”的方式和程度不同：“流式计数法”是使用的流式细胞仪流是通过在流动池中鞘液流在外围挤压中央样本流的方式实现“样本流聚焦”，聚焦后的样本流宽度通常为>100微米；而本发明采用的微流控芯片，整个液流系统中只含有细胞样本流，无需鞘液挤压，直接通过减小芯片检测区流道宽度高度(检测区流道宽度高度为20-35μm，优选均为25-30μm)的方式实现“样本流聚焦”。与前者相比本发明的“样本流聚焦”方式更简单，液流系统稳定性更强，样本流聚焦程度更显著。(2)细胞定量的方法不同：“流式计数法”主要以已知数量的绝对计数微球作为内标，基于微球和细胞分别与抗体结合比例一致的理论计算样本中细胞的数量。定量结果受到实际微球有效分离程度、微球与抗体结合效率等因素的影响，属于间接的定量方法；而本发明通过单细胞直接计数的方法直接对细胞样本浓度定量，并建立了一个修正原始计数值的数学模型，修正样本中少量存在的细胞二聚体和冲突事件对定量结果的影响，使细胞浓度的定量更为准确。
将单细胞样本稀释至较低的适当浓度后，使用耦联荧光基团的抗体结合细胞表面表达的分化抗原。在压力的作用下将标记后的细胞样本导入微流控芯片，流经流道尺寸显著缩小的检测区时单个细胞在微米级通道中流动，依次逐个的被激光激发产生荧光信号。这些荧光被特定波长的滤光片过滤后通过光电元件进行光学成像和光电转换放大，然后由电脑的分析软件识别信号并读取细胞个数，通过数学模型运算得到最终定量结果，从而实现对样本的绝对定量。其中，根据细胞表面的抗原不同来选择相应的抗体，例如标记人淋巴细胞的CD3/CD4/CD8的流式抗体，而CD3/CD4/CD8是不同的抗原，每种抗原可耦联很多种荧光基团，如FITC/PE/APC/BV421等等，本领域可以根据需要来选择。
本发明提供一种用于单细胞计数的微流控芯片装置，由注射泵和储液池、引流导管、微流控芯片组成，所述微流控芯片含有圆柱形样本流入口和输出口，荧光检测区。其中，微流控芯片内置流道，分别与样本流入口、输出口连通，其入口端和出口端流道尺寸到中央处宽度和高度逐渐减小，至中央处流道宽度高度达到最小且保持恒定不变，优选其宽度高度均为20-35微米；该中央处流道的中部为荧光检测区。此外，优选地，还包括还具有流量调节装置，以调节液流的流速。
其中，本发明的“微流控芯片”结构与本发明人之前的专利申请(202011378175.8)中的计数系统不同。本发明根据细胞的特点，选用的微流控芯片只有单一流道，流道中央处紧缩(即流道宽度高度缩小)，使细胞样本流经中央处(即荧光检测区)时液流宽度高度随之显著缩小(如图1所示)。因此是通过改变流道中心处的物理尺寸实现“液流聚焦”，从而提升检测灵敏度。相比之前的专利申请的计数系统，本发明选用的芯片结构更简单，且因只导入样本流而无需鞘液流，液流系统更稳定。而之前的专利申请中的“微流控芯片”结构采用的是“十字交叉”的微流控芯片，在流道中存在样本流和鞘液流两股液流。在流道中心的十字交叉处，鞘液流挤压样本流使后者液流宽度高度缩小，即通过液流挤压的方式实现“液流聚焦”，从而提升检测灵敏度。
荧光检测装置用于检测输出口中的样品，例如采用光电倍增管对荧光显微镜获取的荧光信号进行光电转换，再通过采集卡进行数据采集。最后采集的数据由计数模块识别特定的荧光信号，并定量记录细胞样本产生的荧光粒子数量，完成计数。
进一步，本发明提供一种基于微流控芯片的单细胞计数的系统，其特征在于，其包括上述的用于单细胞计数的微流控芯片装置、荧光检测装置、和数据处理装置；其中，荧光检测装置用于检测输出口中的样品；数据处理装置包括实时采集计数模块和修正计数的数学计算处理模块，进一步包括数据显示装置。
优选地，所述修正计数的数学计算处理模块包括下述数据修正模型：
先根据公式(1)排除DT造成的计数影响：
其中，DT是识别相邻光子间存在的时间间隔，N0指经DT优化后的计数结果，Nr指DT优化前的计数结果，τ为平均波峰宽度，T为总的计数时间；
再根据公式(2)以得到修正后的计数结果Nc：
Nc＝N0+Ndw+Ndh-Nnoise (2)
其中，Ndw和Ndh分别表示通过峰宽和峰高鉴定的二聚体和冲突事件的计数值；Nnoise是通过设置缓冲液中只含有荧光染料的空白对照管，根据背景信号的强度设定阈值后检测空白对照管的计数；
然后，通过流量计以确定检测的样本体积V，并得出核酸样本的浓度Cc:
其中，D为稀释倍数。
在一个具体实施方式中，所述荧光检测装置采用光电倍增管对荧光显微镜获取的荧光信号进行光电转换，再通过电路采集卡进行数据采集。
本发明还提供采用上述系统的单细胞计数方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)样本制备：使用经滤膜过滤后的磷酸盐缓冲液PBS，溶解稀释高浓度细胞样本，记录稀释倍数D；将荧光抗体加入该细胞样本中，对细胞进行充分标记；标记后的样本立即进行后续检测或短暂置于4℃保存各用；
2)上样前先通入疏水剂15min以上，然后用超纯水冲洗管路15min；
3)先导入阴性对照样本，例如1×PBS中只含有与细胞样本等浓度的荧光抗体，并调节流速0.5μL/min，通过检测装置的CCD成像观察液流实时流动状态，保证液流稳定；在实时信号采集软件中设置荧光信号的采集条件，调节信号采样率和阳性信号的最小波峰宽度参数；当液流系统稳定后，打开荧光检测装置开始测量，获得因背景荧光信号产生的计数值；优选地，重复测量6次，将这6次测量结果的平均数记为Nnoise；
4)然后再将稀释后的前述制备的检测细胞样本上样，在相同的实验条件进行荧光信号的识别和采集；优选地，测量重复6次，将这6次测量结果的平均数记为Nr；
4)原始计数结果的修正：
a)经过检测获得的Nr、τ、T数值代入公式(1)得到原始计数结果N0。
b)然后计算得到N0以及测量获得的Nnoise，Ndw和Ndh分代入公式(2)，得到修正后的计数结果Nc：
c)通过压力泵确定检测的样本体积V，基于稀释倍数D，则根据公式(3)计算获得细胞样本的浓度Cc。
优选地，步骤(1)中，将缓冲液经0.22μm滤膜过滤后作为细胞样本的稀释液；步骤(3)中，每次测量1μL样本。
具体地，所述细胞是动物细胞，如人、老鼠、兔子等的细胞。
本发明采用微米级的微流控芯片作为样本流道，依托微流控芯片精细的的加工工艺，直接通过缩小中央流道宽高的方式(无需鞘液挤压)，与传统流式细胞仪的液流系统相比液路更简单，更稳定。尤其是使样本流聚焦后宽度高度更小，这对细胞样本的准确定量非常重要。与传统“流式计数”相比，这种设计使样本流聚焦后宽度高度更小，因此在三方面具有显著优势：(1)进一步提升了荧光检测的信噪比，提高了检测灵敏度；(2)更好的实现了流动态单个细胞的分离，使信号采集模块可更有效的的识别单细胞产生的荧光信号，计数结果更准确；(3)使激光光斑在保证激发效率的同时完全覆盖样本流，从而实现不依赖于微球等内标物，直接识别样本中的每个细胞并计数，并且因未减少了不确定度分量的引入，提高了定量的重复性，使绝对测量更直接，更简单。同样重要的是，建立了对细胞样本浓度定量的数学模型，可有效修正“二聚体/冲突事件”对定量结果的干扰。通过计算荧光信号的峰宽、峰高和峰面积，鉴定统计“二聚体/冲突事件”的数量，使定量结果更准确。
附图说明
图1本发明液流系统结构示意图。
图2.本发明“基于微流控芯片的流式单细胞计数”定量方法工作原理示意图。
图3.本发明方法中实时信号采集模块识别的样本中细胞荧光信号。
图4.本发明方法中样品中单个细胞产生的荧光信号。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但并不构成对本发明的限制。
实施例一
用于流式单细胞计数方法的系统主要由液流系统、微流控芯片、荧光检测装置以及数据处理装置组成，进一步包括数据显示装置。上述的系统组成的流式细胞单分子计数平台，其工作流程示意图如图2所示，其中微流控芯片7，物镜8，二色镜9，光源10。
用于单细胞计数的微流控芯片装置由注射泵和储液池1、引流导管2、微流控芯片7组成，所述微流控芯片7含有圆柱形样本流入口3和输出口5，荧光检测区4，以及用于调节样本流液的流速的流量调节装置。其中微流控芯片7的内置的流道11分别与样本流入口、输出口连通，流入口方向的引流导管将注射泵和储液池1与流入口相连，输出口方向的引流导管2将输出口5与废液储池6相连。微流控芯片内置的流道11的长度约2.5至3.5cm，，其入口端和出口端流道尺寸较大，从两端到中央处宽度和高度不断减小。在中央处200-400微米的长度范围内，流道宽度高度最小且保持恒定不变，为20-35微米(本实施例具体可以为25μm或30μm)。因此细胞样本在微流控芯片7中流经流道11中央处液流宽度和高度显著缩小，在通过该区域后液流宽度高度再度变大，最后样本从微流控芯片7输出口5流出，经引流导管2进入废液存储池6，如此构成液流系统，如图1所示(箭头为液流方向)。
所述荧光检测装置用于检测通过流道中央处(在流道中央压缩区的中部设置检测窗口)的细胞样本，数据处理装置则根据检测的参数计算得出单细胞荧光信号的检测数据。所述荧光检测装置采用光电倍增管对荧光显微镜获取的荧光信号进行光电转换，再通过电路采集卡进行数据采集。最后采集的数据由计数模块识别特定的荧光信号，并定量记录细胞样本产生的荧光粒子数量，完成计数。
所述数据处理装置包括实时采集计数模块和修正计数的数学计算处理模块。
(1)实时采集计数模块可以基于Labview系统开发的自动计数程序来实现，以实时的将采集信号拟合成高斯分布的曲线。自动统计单位体积内细胞样本产生的荧光粒子数。开发的软件时可以调节设定不同的信号采集条件，如采样率、信号阈值、波峰宽度等，并实时显示荧光信号的相对强度、面积等参数。当细胞颗粒产生的荧光信号高于设定的阈值时，就会对其计数，从而实现对细胞样本浓度的定量测量。同时自动存储荧光强度的原始数据，方便数据的后续处理。
(2)修正计数的数学计算处理模块包括通过数学模型，对原始计数结果进行两方面的修正得到准确的细胞浓度：a)排除光电子件响应间隔时间的影响：电子元件在识别相邻光子间存在一定时间间隔(Dead Time,DT)，即当DNA分子产生高密度光量子时，在该段间隔时间产生的信号不会被元件采集，从而造成计数偏低。b)计算非特异信号的影响：设置缓冲液中只含有荧光抗体的空白对照管，根据背景信号的强度设定阈值后检测空白对照管仍有少量计数(Nnoise)，则在对细胞样本计数时需要进行“背景扣除”；c)计算二聚体和偶发冲突事件的数量：实际检测时样本中少量细胞会形成二聚体、或发生冲突事件，即两个细胞相距很近被当成一个计数，造成定量结果偏低。
其中N0指经DT优化后的计数结果，Nr指DT优化前的计数结果，τ为平均波峰宽度，T为总的计数时间。根据公式(1)排除DT造成的计数影响：
图3示例表示检测细胞样本时电子系统采集的荧光信号，图4示例表示单细胞产生的荧光脉冲信号，即每个阳性信号都可以拟合成一个“峰”。可通过分析原始荧光数据，比较对应荧光信号的峰高和峰宽，来鉴别二聚体和冲突事件的数量。若两个细胞形成二聚体通过，则信号峰的高度(最大荧光信号强度)是单分子峰高的近2倍；若双细胞间距很小几乎同时到达检测区时，则双峰连在一起，总峰宽(通过检测区的时间)是单分子峰的近两倍。因此比较峰的高度和宽度，就可以鉴别出二聚体和冲突事件的信号，从而确定两者各自的数量。其中用Ndw和Ndh分别表示通过峰宽和峰高鉴定冲突事件和二聚体的计数值；
因此细胞数量的计算：整合公式(1)后，根据公式(2)得到最后的计数结果Nc(其中N0为实时采集计数模块读取的细胞样本原始计数结果，Nnoise是空白对照管的计数值)：
Nc＝N0+Ndw+Ndh-Nnoise (2)
通过流量计确定检测的样本体积V，D样品稀释倍数，则细胞样本的浓度Cc:
实施例二
本发明方法的具体操作过如下：
1.样本制备：使用经0.22μm滤膜过滤后的磷酸盐缓冲液(PBS)，溶结稀释高浓度细胞样本；将适量荧光抗体加入该细胞样本中，对细胞进行充分标记；标记后的样本立即进行后续检测或短暂置于4℃保存各用。
2.上样前先通入疏水剂15min以上，然后用超纯水冲洗管路15min。先导入阴性对照样本(1×PBS中只含有与细胞样本等浓度的荧光抗体)，并调节流速0.2—0.8μL/min，通过检测装置的CCD成像观察液流实时流动状态，保证液流稳定。在实时信号采集软件中设置荧光信号采集率为10000-50000次每秒，荧光信号的基线值为0.2—0.5，调整阳性信号的最小波峰宽度是3—10个。液流系统稳定后，打开荧光检测装置开始测量。每次测量1μL，重复测量6次，记录该样本产生的背景计数值Nnoise；
3.然后再将前述制备的检测细胞样本稀释10倍后上样，在相同的实验条件(样本流速、采样率、基线值和阈值等)进行荧光信号的识别和采集。同样每次测量1μL样本，重复6次，记录原始计数结果N0。
4.原始计数结果的修正，对原始计数结果进行两方面的修正，得到最终的细胞样本浓度：
a)经过检测获得的Nr、τ、T数值代入公式(1)得到N0。
b)然后计算得到N0以及根据获得的Nnoise，Ndw和Ndh分代入公式(2)，得到Nc：
c)通过压力泵确定检测的样本体积V，稀释倍数D，则根据公式(3)计算获得细胞样本的浓度Cc。
实施例三
采用本发明“基于微流控芯片的单细胞计数”方法测量人淋巴细胞标准品的浓度作为计数举例。具体步骤为：
1、样本制备：
配置阴性对照管和样本管。在阴性对照管中加入1×PBS缓冲液，并添加终浓度1×CD4-PE抗体。在样本管中，用1×PBS缓冲液溶解人淋巴细胞，并加入终浓度1×CD4-PE抗体，常温下避光反应30min。
2、液流系统的调节
通过压力泵在微流控芯片中先后通入含有2％BSA的PBS溶液(通入时间约15min)和双蒸水(通入时间为15min)，接着导入阴性对照溶液。根据成像装置的CCD观察液路移动状态，通过压力泵控制样本流速0.5μL/min，保证微流控芯片中液流稳定。
3、单分子荧光检测
启动荧光检测装置，设置样本体积为1μL。先检测阴性对照，根据统计产生的少量非特异信号产生的计数结果，重复6次，其平均计数结果经DT修正(测量时间T＝120s，τ＝0.005s，代入公式(1))，计算得到Nnoise＝23。
接着检测稀释10倍后的细胞溶液，在相同条件下重复测定6次初始计数结果Nr经DT修正后得N0分别为2003、1969、1956、2033、2052和1979。
4计数结果的修正
使用软件Matlab分析原始荧光数据(包括采样时间和对应的相对荧光强度)。通过信号峰宽和峰高分别鉴定出二聚体/冲突事件数量Ndh和Ndw，则6次测量的相关数据如表1所示。
表1：六次重复计数的结果
将Nnoise＝23代入公式(1)，计算出6次测量的Nc分别为2057、2013、1992、2086、2110和2041。将Nc值分别代入公式(3)，则可得到该细胞样本6次测量的平均浓度Cc：(2057+2013+1992+2086+2110+2041)/(6×1×10)＝20490个/微升。
Claims (2)
1.一种用于动物细胞单细胞计数的微流控芯片装置，其特征在于，由注射泵和储液池(1)、引流导管(2)、微流控芯片(7)组成，所述微流控芯片(7)具有样本流入口(3)和输出口(5)，荧光检测区(4)，其中微流控芯片内置流道(11)，分别与样本流入口(3)、输出口(5)连通，样本流入口(3)方向的引流导管(2)将注射泵和储液池(1)与样本流入口(3)相连；微流控芯片(7)内置的流道(11)，其入口端和出口端流道尺寸到中央处宽度和高度逐渐减小，至中央处流道宽度高度达到最小且保持恒定不变，其宽度高度均为20-35微米，中央处的长度为200-400微米；该中央处流道的中部为荧光检测区；
所述装置还具有流量调节装置，以调节液流的流速；进一步包括废液存储池(6)，从微流控芯片输出口(5)流出样品，经引流导管(2)进入废液存储池(6)；
微流控芯片(7)内置的流道(11)的长度为2.5至3.5cm；样本流入口(3)和输出口(5)为圆柱形。
2.一种基于微流控芯片的单细胞计数的系统，其特征在于，其包括如权利要求1所述的用于单细胞计数的微流控芯片装置、荧光检测装置和数据处理装置；其中，荧光检测装置用于检测输出口中的样品；数据处理装置包括实时采集计数模块和修正计数的数学计算处理模块，进一步包括数据显示装置；
所述修正计数的数学计算处理模块包括下述数据修正模型：
先根据公式(1)排除识别相邻光子间存在的时间间隔DT造成的计数影响：
其中，DT是识别相邻光子间存在的时间间隔，N0指经DT优化后的计数结果，Nr指DT优化前的计数结果，τ为平均波峰宽度，T为总的计数时间；
再根据公式(2)以得到修正后的计数结果Nc：
NC＝N0+Ndw+Ndh-Nnoise (2)
其中，Ndw和Ndh分别表示通过峰宽和峰高鉴定的冲突事件和二聚体的计数值；Nnoise是通过设置缓冲液中只含有荧光染料的空白对照管，根据背景信号的强度设定阈值后检测空白对照管的计数；
然后，通过流量计以确定检测的样本体积V，并得出核酸样本的浓度Cc:
其中，D为稀释倍数；
所述荧光检测装置采用光电倍增管对荧光显微镜获取的荧光信号进行光电转换，再通过电路采集卡进行数据采集；
所述基于微流控芯片的单细胞计数的系统的单细胞计数流程包括：
1)样本制备：使用经滤膜过滤后的磷酸盐缓冲液PBS，溶解稀释的细胞样本，记录稀释倍数D；将荧光抗体加入该细胞样本中，对细胞进行充分标记；标记后的样本立即进行后续检测或短暂置于4℃保存各用；
2)上样前先通入疏水剂15min以上，然后用超纯水冲洗管路15min；
3)先导入阴性对照样本，并调节流速0.5μL/min，通过检测装置的CCD成像观察液流实时流动状态，保证液流稳定；在实时信号采集软件中设置荧光信号的采集条件，调节信号采样率和阳性信号的最小波峰宽度参数；当液流系统稳定后，打开荧光检测装置开始测量，获得因背景荧光信号产生的计数值Nnoise；
4)然后再将稀释后的前述制备的检测细胞样本上样，在相同的实验条件进行荧光信号的识别和采集；
5)原始计数结果的修正：
a)经过检测获得的Nr、τ、T数值代入公式(1)得到原始计数结果N0；
b)然后计算得到N0以及测量获得的Nnoise，Ndw和Ndh分代入公式(2)，得到修正后的计数结果Nc：
c)通过压力泵确定检测的样本体积V，基于稀释倍数D，则根据公式(3)计算获得细胞样本的浓度Cc；
所述阴性对照样本是1×PBS中只含有与细胞样本等浓度的荧光抗体；
重复测量6次，将这6次测量结果的平均数记为Nnoise；
步骤(1)中，将缓冲液经0.22μm滤膜过滤后作为细胞样本的稀释液；
步骤(3)中，每次测量1μL样本；
所述细胞是动物细胞。
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