CN113671168A - 用于检测黄曲霉毒素b1的酶联免疫试剂盒及其制备方法、以及检测方法 - Google Patents

用于检测黄曲霉毒素b1的酶联免疫试剂盒及其制备方法、以及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒及其制备方法、以及检测方法，所述用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒包括酶标板、黄曲霉毒素B1标准品、黄曲霉毒素B1‑牛血清白蛋白偶联物、抗体工作液、酶标二抗工作液以及底物液，其中，所述酶标二抗工作液为负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液，所述底物液包括姜黄素溶液和尿素溶液。本发明旨在提供一种具有高灵敏度的试剂盒和检测方法。

Description

用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒及其制备方法、以及 检测方法
技术领域
本发明涉及食品安全技术领域，特别涉及一种用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒及其制备方法、以及检测方法。
背景技术
黄曲霉毒素(aflatoxins，AFs)主要由黄曲霉菌、寄生曲霉菌和集蜂曲霉产生的一组结构相似的次生代谢产物，对人类和动物具有极强的毒性和致癌性，是世界卫生组织公认的IA致癌物，广泛存在于霉变的农产品、食品及饲料中，严重危害人类健康。黄曲霉毒素对光、热和酸稳定，导致常规加热处理对其破坏小；此外，黄曲霉毒素还容易通过水和土壤环境富集。目前已发现的黄曲霉毒素有20多种，常见的有B1、B2、G1、G2、M1和M2，其中黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)毒性最强，常见于花生、玉米、大豆、小麦等粮食及其制品中。黄曲霉毒素M1和M2主要存在于奶制品中，其毒性和致病性比较弱。AFs可在粮食的生长、收获、储运、加工、流通等环节中发生污染，对食品安全及人体健康构成巨大威胁。为了监控粮食中黄曲霉毒素污染情况，保障粮食安全，保证消费者的身体健康，需要开发准确、快速的现场检测技术来监控粮食在生产加工、流通等环节中的AFB1污染情况。
AFs的传统检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱(LC-MS)联用法等。色谱法是国标中检测AFs的金标法，具有检测结果准确、灵敏度高、重复性好等优点，但存在样品前期处理复杂、设备昂贵、检测程序复杂、需要专业的检测人员等缺陷，不适合大批量样品的检测，难以满足基层监管过程中快速出检测结果的需求，不便推广应用。为了有效降低AFs污染，保障食品安全，快速、准确、简便的AFs检测方法，如免疫法、近红外光谱、图像法和生物传感器法等被开发出来。其中，免疫分析法是以抗原-抗体的特异性结合为基础的分析技术，与其他方法相比，具有特异性强、灵敏度高、分析容量大、安全可靠等优点，已成为极具竞争力的分析检测技术之一。特别是，酶联免疫吸附法(ELISA)方法因具有快速、灵敏、特异、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高，特别适用于大批量样品的检测等优点，已成为AFB1快速筛查检测的主要方法。现有技术中针对AFB1的ELISA检测方法普遍基于辣根过氧化物酶标记的抗体或抗原催化双氧水生成羟自由基，进而氧化无色的化学显色底物四甲基联苯二胺(TMB)形成蓝色产物，然后使用终止液(2mol/L H2SO4)终止反应形成黄色溶液，再于450nm处记录吸光度值。然而，该类方法因其显色强度较低，检测灵敏度相对较低，当待测样品中目标物含量较低时易出现假阴性结果，从而无法满足实际应用的要求。
近年来，一些新型的信号传导机制被报道用于替代传统ELISA的信号传导机制用于提高ELISA的灵敏度，如放射免疫分析底物、化学发光底物、荧光底物以及共振胶体金溶液等。然而，发光体系的构建需要充分考虑被检测对象的分子生物学性质，例如，在方法层面，需要考虑抗体的包被及其与抗原的结合性能，选用何种标记物酶及其与抗体的偶联方法，显色底物的选择以及具体发光方法等；在效果层面，既要保证显色反应的灵敏性，又应满足显色强度与目标物含量的线性关系。因此，针对黄曲霉毒素AFB1的ELISA检测方法，尤其以提升其检测灵敏性为目的的方法改进，具有突出的技术难度。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒及其制备方法、以及检测方法，旨在提供一种具有高灵敏度的试剂盒和检测方法。
为实现上述目的，本发明提出一种用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，所述用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒包括酶标板、黄曲霉毒素B1标准品、黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、抗体工作液、酶标二抗工作液以及底物液，其中，所述酶标二抗工作液为负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液，所述底物液包括姜黄素溶液和尿素溶液。
可选地，所述姜黄素溶液包括含有聚乙烯吡咯烷酮的姜黄素-乙醇溶液；和/或，
所述尿素溶液为尿素的水溶液。
可选地，所述姜黄素-乙醇溶液溶液中姜黄素的摩尔浓度为0.5～1.5mmol/L；和/或，
所述尿素溶液的浓度为0.01～0.5mol/L。
可选地，所述负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液中，所述二抗免疫球蛋白G为羊抗鼠免疫球蛋白G抗体。
可选地，所述酶联免疫试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液为含有吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，所述洗涤液的浓度为0.005～0.02mol/L，pH为7.0～7.5，所述洗涤液中吐温-20的体积分数为0.2～0.8％；和/或，
所述酶联免疫试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为BSA-PBST溶液，且所述封闭液中BSA的质量分数为1％～2％。
此外，本发明还提出一种用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒的制备方法，该方法能够制备如上文所述的用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，所述用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒的制备方法包括酶标二抗工作液的制备，所述酶标二抗工作液的制备包括以下步骤：
步骤S100，将N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐分散于纳米金水溶液中，振摇混匀，得到纳米金预处理溶液；
步骤S200，向所述纳米金预处理溶液中注入脲酶，冰浴反应得到负载有脲酶的纳米金溶液；
步骤S300，向所述负载有脲酶的纳米金溶液中加入二抗免疫球蛋白G，于0～4℃条件下进行反应，得到负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液；
步骤S400，将所述负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液固液分离，收集沉淀分散于碳酸钠的水溶液中，得到酶标二抗工作液。
此外，本发明还提出一种黄曲霉毒素B1的检测方法，所述黄曲霉毒素B1的检测方法包括以下步骤：
以负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液为酶标二抗，以姜黄素和尿素为底物，采用间接竞争酶联免疫法检测样品中黄曲霉毒素B1的含量。
可选地，以负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液为酶标二抗，以姜黄素和尿素为底物，采用间接竞争酶联免疫法检测样品中黄曲霉毒素B1的含量的步骤包括：
步骤S10，获取包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的酶标板，所述酶标板具有样品孔和标准液孔；
步骤S20，在所述标准液孔中加入黄曲霉毒素B1标准溶液和抗体工作液，同时，在所述样品孔中加入样品液和抗体工作液，孵育；
步骤S30，向经步骤S20处理后的所述样品孔和所述标准液孔中分别加入酶标二抗工作液，孵育；
步骤S40，向经步骤S30处理后的所述样品孔和所述标准液孔中分别加入底物液，于室温下反应显色，其中，所述底物液包括姜黄素溶液和尿素溶液；
步骤S50，取经步骤S30处理后的所述样品孔中溶液A和所述标准液孔中溶液B，采用酶标仪检测溶液A和溶液B各自在428nm和550nm两处的吸光度值；
步骤S60，获取标准曲线；
步骤S70，基于所述标准曲线，根据所述溶液A的吸光度值计算得出所述样品中黄曲霉毒素B1的含量。
可选地，步骤S20中，所述样品液为样品加标溶液。
可选地，所述样品液的制备包括储备液的制备，所述储备液的制备包括以下步骤：
取样品粉末，加入甲醇-水提取液，剧烈震荡使样品粉末被充分提取后，离心处理，收集上清液并用磷酸盐缓冲溶液稀释，得到储备液，备用，其中，所述甲醇-水提取液中甲醇和水的体积比为3～5:1。
本发明提供的试剂盒适用于使用间接竞争酶联免疫法对黄曲霉毒素B1进行快速检测，本试剂盒以负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液为酶标二抗工作液，以姜黄素溶液和尿素溶液为底物液，一方面通过利用姜黄素溶液在检测体系中由黄色到红棕色等不同的视觉可辨的颜色变化，大大提升检测的灵敏度，另一方面，利用脲酶标记的二抗与一抗的免疫识别，实现大分子抗体的表面结合，进一步放大了信号响应，使得本试剂盒在用于检测时相对于传统ELISA至少提高了2～3数量级；此外，本发明提供的试剂盒分析成本低、适用于复杂基质的检测，且步骤简单，检测时间不超过1小时，分析速度快，且检测灵敏度高，下限能够达到67pg/mL，分析精度相对误差在10％以内，能够达到我国粮食中黄曲霉毒素B1的限量标准，在粮食安全检测中适用性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明提出的黄曲霉毒素B1的检测方法的原理示意图；
图2为图1中姜黄素显色的原理示意图；
图3为实施例5和实施例6中获得的吸光度-AFB1浓度标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
现有技术中针对黄曲霉毒素B1的ELISA检测方法普遍基于辣根过氧化物酶标记的抗体或抗原催化双氧水生成羟自由基，进而氧化无色的化学显色底物四甲基联苯二胺(TMB)形成蓝色产物，然后使用终止液(2mol/L H2SO4)终止反应形成黄色溶液，再于450nm处记录吸光度值。然而，该类方法因其显色强度较低，检测灵敏度相对较低，当待测样品中目标物含量较低时易出现假阴性结果，从而无法满足实际应用的要求。
近年来，一些新型的信号传导机制被报道用于替代传统ELISA的信号传导机制用于提高ELISA的灵敏度，如放射免疫分析底物、化学发光底物、荧光底物以及共振胶体金溶液等。然而，发光体系的构建需要充分考虑被检测对象的分子生物学性质，例如，在方法层面，需要考虑抗体的包被及其与抗原的结合性能，选用何种标记物酶及其与抗体的偶联方法，显色底物的选择以及具体发光方法等；在效果层面，既要保证显色反应的灵敏性，又应满足显色强度与目标物含量的线性关系。因此，针对AFB1的ELISA检测方法，尤其以提升其检测灵敏性为目的的方法改进，具有突出的技术难度。
鉴于此，本发明提供一种用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，所述用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒包括酶标板、黄曲霉毒素B1标准品、黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)偶联物(简写AFB1-BSA)、抗体工作液、酶标二抗工作液以及底物液，其中，所述酶标二抗工作液为负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)的纳米金溶液，所述底物液包括姜黄素溶液和尿素溶液。
参阅图2，基于脲酶能够将底物尿素水解产生氨，氨分子会增加溶液的pH值，姜黄素中的酚羟基在碱性条件下电离成酚氧负离子，供电性大大增强，使姜黄色素中的供吸电子协同作用加强，从而导致姜黄素的颜色从黄色转变为棕红色，产生视觉可见的颜色变化。
本发明提供的试剂盒适用于使用间接竞争酶联免疫法对黄曲霉毒素B1进行快速检测，本试剂盒以负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液为酶标二抗工作液，以姜黄素溶液和尿素溶液为底物液，一方面通过利用姜黄素溶液在检测体系中由黄色到红棕色等不同的视觉可辨的颜色变化，大大提升检测的灵敏度，另一方面，利用脲酶标记的二抗与一抗的免疫识别，实现大分子抗体的表面结合，进一步放大了信号响应，使得本试剂盒在用于检测时相对于传统ELISA至少提高了2～3数量级；此外，本发明提供的试剂盒分析成本低、适用于大米和小麦制品等复杂基质的检测，且步骤简单，检测时间不超过1小时，分析速度快，且检测灵敏度高，下限能够达到67pg/mL，分析精度相对误差在10％以内，能够达到我国粮食中AFB1的限量标准，在粮食安全检测中适用性高。
由于姜黄素易氧化变色，为了维持姜黄素的稳定性，在检测中顺利显色，本试剂盒中的姜黄素溶液包括含有聚乙烯吡咯烷酮的姜黄素-乙醇溶液，通过添加聚乙烯吡咯烷酮能够提升姜黄素溶液的稳定性，避免姜黄素氧化变色。具体地，姜黄素溶液的制备方法为：将姜黄素溶于60％的乙醇中，再加入聚乙烯吡咯烷酮，得到姜黄素溶液，所述姜黄素溶液中聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为2％。进一步地，姜黄素溶液中姜黄素的摩尔浓度为0.5～1.5mmol/L，例如，姜黄素溶液中姜黄素的摩尔浓度可以为0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.1mmol/L、1.3mmol/L、1.5mmol/L，优选为1mmol/L。
本试剂盒中，尿素溶液为尿素的水溶液。所述尿素溶液的浓度为0.01～0.5mol/L，例如，尿素溶液的浓度可以为0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L，优选为0.1mol/L。
考虑到成本和免疫识别问题，所述负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液中，所述二抗免疫球蛋白G为羊抗鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)抗体。羊抗鼠免疫球蛋白G抗体易于捕获与黄曲霉毒素B1结合的抗黄曲霉毒素黄曲霉毒素B1单克隆抗体。
此外，所述酶联免疫试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液为含有吐温-20的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)。具体地，所述洗涤液的浓度为0.005～0.02mol/L，例如，0.005mol/L、0.008mol/L、0.01mol/L、0.015mol/L、0.02mol/L；所述洗涤液的pH为7.0～7.5，例如，pH7.0、pH7.1、pH7.2、pH7.3、pH7.4、pH7.5；所述洗涤液中吐温-20的体积分数为0.2～0.8％，例如，0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％，优选为0.5％。
此外，所述酶联免疫试剂盒还包括封闭液，所述封闭液能够封闭没有包被抗原的多余的部分。本实施例中，所述封闭液为BSA-PBST溶液，且所述封闭液中BSA的质量分数为1％～2％，例如，1％、1.2％、1.3％、1.5％、1.6％、2％，优选为1.5％。
此外，所述抗体工作液可以取抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶于PBS得到，抗体工作液的浓度可以为0.1mg/mL；所述酶标板可以选用96孔酶标板；所述酶联免疫试剂盒还包括稀释液，所述稀释液可以为PBS溶液。
此外，本发明还提出一种用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒的制备方法，该方法能够制备如上文所述的用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，所述用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒的制备方法包括酶标二抗工作液的制备，所述酶标二抗工作液的制备包括以下步骤：
步骤S100，将N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐分散于纳米金水溶液中，振摇混匀，得到纳米金预处理溶液。
本实施例在纳米金水溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，以活化纳米金表面的羧基，以便于负载脲酶和二抗IgG，从而得到纳米金预处理溶液。具体地，在一实施例中，步骤S100按照如下步骤实施：将40μL浓度为0.4mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺和40μL浓度为0.2mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混合于1.0mL的纳米金的水溶液中，振摇30min，得到纳米金预处理溶液。
步骤S200，向所述纳米金预处理溶液中注入脲酶，冰浴反应得到负载有脲酶的纳米金溶液。
具体地，在一实施例中，步骤S200按照如下步骤实施：将50μL浓度为10mg/mL的脲酶注入1.0mL纳米金预处理溶液中，冰浴1h，得到负载有脲酶的纳米金溶液。
步骤S300，向所述负载有脲酶的纳米金溶液中加入二抗IgG，于0～4℃条件下进行反应，得到负载有脲酶和二抗IgG的纳米金溶液。
具体地，在一实施例中，步骤S300按照如下步骤实施：向步骤S200制得的负载有脲酶的纳米金溶液中加入20μL浓度为0.5mg/mL的羊抗鼠IgG抗体，放入0℃～4℃冰箱里过夜，得到负载有脲酶和二抗IgG的纳米金溶液。
步骤S400，将所述负载有脲酶和二抗IgG的纳米金溶液固液分离，收集沉淀分散于碳酸钠的水溶液中，得到酶标二抗工作液。
其中，固液分离的方法有多种，例如，过滤、离心、抽滤等；所述碳酸钠的水溶液的pH为7.4，浓度为2mmol/L。本实施例中，将所述负载有脲酶和二抗IgG的纳米金溶液离心，将得到的沉淀分散在500μL pH 7.4，浓度为2mmol/L的Na2CO3水溶液中，得到酶标二抗工作液，0℃～4℃温度保藏。
此外，本发明还提出一种黄曲霉毒素B1的检测方法，所述黄曲霉毒素B1的检测方法包括以下步骤：
步骤S1，以负载有脲酶和二抗IgG的纳米金溶液为酶标二抗，以姜黄素和尿素为底物，采用间接竞争酶联免疫法检测样品中黄曲霉毒素B1的含量。
本发明方法可以采用上述试剂盒实施，也可以自行配制需要的溶液并按照间接竞争酶联免疫法进行检测。具体地，本发明方法的原理如图1所示，原理为：
样品中的AFB1与固定在酶标板上的AFB1-BSA偶联物去竞争加入的固定浓度的抗AFB1单克隆抗体，清洗移除未结合抗体后加入负载有脲酶和二抗IgG的纳米金溶液，其中，二抗IgG会去捕获与AFB1结合的抗AFB1单克隆抗体，通过测定结合在酶标板上信号分子的量就能确定AFB1浓度。本发明方法以姜黄素和尿素为反应底物，以姜黄素为显色底物，当加入一定浓度的姜黄素和尿素后，与AFB1抗体结合之后的负载有脲酶和二抗IgG的纳米金中的脲酶会分解尿素产生氨，氨引起溶液pH值的变化，最终导致姜黄素呈现由黄色到红棕色等不同的视觉可辨的颜色变化，通过在酶标仪下测量吸光度的变化来判断样品中黄曲霉毒素AFB1的含量，一旦样品中的AFB1浓度超过，则没有游离的抗体可与AFB1-BSA结合，脲酶标记的未结合二抗会在洗涤过程中被除去，因此，脲酶标记的二抗在酶标板上没有结合位点，因此，AFB1的浓度高，则溶液颜色浅，并且吸光度值与AFB1浓度呈反比。该方法可直接用于检测大米及小麦制品中的AFB1。本发明的检测方法操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于复杂基质的检测。
具体地，上述步骤S1可以按照如下步骤实施：
步骤S10，获取包被有AFB1-BSA偶联物的酶标板，所述酶标板具有样品孔和标准液孔。
本实施例中，在酶标板中加入AFB1-BSA偶联物后，孵育以使AFB1-BSA偶联物固定在酶标板上，然后加入封闭液封闭处理，最后弃去封闭液并用洗涤液进行洗涤。
具体地，在一实施例中，步骤S10按照如下步骤操作：在酶标板中加入50μL浓度为0.1mg/mL的AFB1-BSA，并在37℃下孵育2h；去除酶标板上的液体后利用洗涤液洗涤酶标板，再加入100μL质量分数为1.5％的BSA-PBST封闭液，于37℃下封闭1h，而后弃去封闭液，并用洗涤液洗涤酶标板，得到包被有AFB1-BSA偶联物的酶标板。在酶标板上标识出若干个标准液孔和若干个样品孔。
其中，AFB1-BSA的加入量优选为30～70μL/孔，更优的是50μL/孔；封闭液的加入量优选为50～100μL/孔，更优的是100μL/孔。
步骤S20，在所述标准液孔中加入AFB1标准溶液和抗体工作液，同时，在所述样品孔中加入样品液和抗体工作液，孵育。
向每个样品孔中加入样品液和抗体工作液，并孵育，可以理解的是，根据实际实验的需要，每个样品孔中加入的样品液浓度可以相同，也可以不同，例如，当需要做多个平行实验时，每个样品孔中加入的样品液浓度相同，当需要做加标回收的实验时，可以根据实验设计在不同的样品孔中对应加入不同浓度的样品加标分析液；与此同时，向每个标准液孔中加入AFB1标准溶液和抗体工作液，并孵育，可以理解的是，基于绘制标准曲线的需要，不同的标准液孔中加入的AFB1标准溶液的浓度不同。
其中，所述AFB1标准溶液可以取AFB1标准品溶于二甲基亚砜(DMSO)，再用PBS溶液稀释而成，也可以直接在市面上购得。所述AFB1标准溶液用于绘制标准曲线时，可以设置呈梯度分布的多组AFB1标准溶液，多组AFB1标准溶液的浓度可以依次为0ng/mL、0.02ng/mL、0.01ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL。
所述样品液的制备包括储备液的制备，当样品为大米和小麦制品等复杂基质时，所述储备液的制备包括以下步骤：
取样品粉末，加入甲醇-水提取液，剧烈震荡使样品粉末被充分提取后，离心处理，收集上清液并用PBS稀释，得到储备液，备用，其中，所述甲醇-水提取液中甲醇和水的体积比为3～5:1，优选为V甲醇：V水＝8:2。
由于大米和小麦制品等多数待测样品中AFB1的含量均偏低，为提高实验方法的检测灵敏度和准确性，可以采用加标回收方法进行检测，此时，所述样品液为样品加标溶液，即上述储备液和预设浓度的标准溶液等体积混合的溶液，其中，标准溶液的预设浓度可以为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL等。
具体地，在一实施例中，步骤S20按照如下步骤操作：
标准液孔：向9组标准液孔中依次加入浓度为0ng/mL、0.02ng/mL、0.01ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL的AFB1标准溶液各50μL，然后向9组标准液孔中分别加入50μL 0.1mg/mL抗体工作液，于37℃孵育1h。
样品孔：向4组样品孔中分别加入4组不同浓度的样品加标溶液各50μL，然后向4组样品孔中分别加入50μL 0.1mg/mL抗体工作液，于37℃孵育1h。其中，4组不同浓度的样品加标溶液分别由储备液和4组不同浓度的标准溶液(浓度依次为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL)按照1:1体积比混合而成。
其中，所述抗体工作液和样品液/标准溶液的总加入量为80～120μL/孔，优选为100μL/孔，即各50μL/孔。
步骤S30，向经步骤S20处理后的所述样品孔和所述标准液孔中分别加入酶标二抗工作液，孵育。
具体地，在一些实施例中，步骤S30具体包括：
将经步骤S20处理后的所述样品孔和所述标准液孔中的液体去除后，用洗涤液洗涤，再于每个样品孔/标准液孔中加入50μL酶标二抗工作液，于37℃孵育1h。
其中，酶标二抗工作液的制备方法如上文所述，在此不做赘述。此外，酶标二抗工作液的加入量优选为30～70μL/孔，更优的是50μL/孔。
步骤S40，向经步骤S30处理后的所述样品孔和所述标准液孔中分别加入底物液，于室温下反应显色，其中，所述底物液包括姜黄素溶液和尿素溶液。
具体地，在一些实施例中，步骤S40具体包括：
将经步骤S30处理后的所述样品孔和所述标准液孔中的液体去除后，用洗涤液洗涤，再于每个样品孔/标准液孔中加入50μL 1mmol/L的姜黄素溶液和50μL 0.1mol/L尿素溶液，于室温下反应。
其中，姜黄素溶液和尿素溶液的制备方法如上文所述，在此不做赘述。此外，尿素和姜黄素的加入量优选为30～70μL/孔，更优的是50μL/孔。
步骤S50，取经步骤S30处理后的所述样品孔中溶液A和所述标准液孔中溶液B，采用酶标仪检测溶液A和溶液B各自在428nm和550nm两处的吸光度值；
步骤S60，获取标准曲线。
本实施例中，基于不同浓度的AFB1标准溶液以及各溶液分别对应的A550/A428，绘制吸光度-黄曲霉毒素AFB1浓度标准曲线图。
步骤S70，基于所述标准曲线，根据所述溶液A的吸光度值计算得出所述样品中黄曲霉毒素B1的含量。
可以理解的是，标准曲线的绘制和样品吸光度的测试步骤可以先后进行，也可以同时进行。当标准曲线的绘制和样品吸光度的测试步骤先后进行时，可以先依次进行上述步骤中涉及AFB1标准溶液的部分，再依次进行上述步骤中涉及样品液的部分；当标准曲线的绘制和样品吸光度的测试步骤同时进行时，按照如上所述的步骤顺序操作即可。相较而言，标准曲线的绘制和样品吸光度的测试步骤同时进行时，由于二者所处的实验环境、条件更相似，精确度更高。
此外，需要说明的是，上文中涉及的抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体，AFB1-BSA偶联物、AFB1标准溶液、脲酶、尿素、姜黄素等试剂均可以在市面上购得；此外，各试剂在使用前均可以先于室温平衡30min以上再使用。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本试剂盒包括酶标板、AFB1标准品、AFB1-BSA偶联物、抗体工作液、酶标二抗工作液、底物液、洗涤液以及封闭液。
其中，所述酶标二抗工作液为负载有脲酶和羊抗鼠IgG抗体的纳米金溶液；所述底物液包括姜黄素溶液和尿素溶液，所述姜黄素溶液包括含有聚乙烯吡咯烷酮的姜黄素-乙醇溶液，所述姜黄素-乙醇溶液溶液中姜黄素的摩尔浓度为1mmol/L；所述尿素溶液为尿素的水溶液，所述尿素溶液的浓度为0.1mol/L；所述洗涤液为含有吐温-20的PBS溶液，所述洗涤液的浓度为0.01mol/L，pH为7.3，所述洗涤液中吐温-20的体积分数为0.5％；所述封闭液为BSA-PBST溶液，且所述封闭液中BSA的质量分数为1.5％。
实施例2
本试剂盒包括酶标板、AFB1标准品、AFB1-BSA偶联物、抗体工作液、酶标二抗工作液、底物液、洗涤液以及封闭液。
其中，所述酶标二抗工作液为负载有脲酶和羊抗鼠IgG抗体的纳米金溶液；所述底物液包括姜黄素溶液和尿素溶液，所述姜黄素溶液包括含有聚乙烯吡咯烷酮的姜黄素-乙醇溶液，所述姜黄素-乙醇溶液溶液中姜黄素的摩尔浓度为0.5mmol/L；所述尿素溶液为尿素的水溶液，所述尿素溶液的浓度为0.01mol/L；所述洗涤液为含有吐温-20的PBS溶液，所述洗涤液的浓度为0.005mol/L，pH为7.0，所述洗涤液中吐温-20的体积分数为0.2％；所述封闭液为BSA-PBST溶液，且所述封闭液中BSA的质量分数为1％。
实施例3
本试剂盒包括酶标板、AFB1标准品、AFB1-BSA偶联物、抗体工作液、酶标二抗工作液、底物液、洗涤液以及封闭液。
其中，所述酶标二抗工作液为负载有脲酶和羊抗鼠IgG抗体的纳米金溶液；所述底物液包括姜黄素溶液和尿素溶液，所述姜黄素溶液包括含有聚乙烯吡咯烷酮的姜黄素-乙醇溶液，所述姜黄素-乙醇溶液溶液中姜黄素的摩尔浓度为1.5mmol/L；所述尿素溶液为尿素的水溶液，所述尿素溶液的浓度为0.5mol/L；所述洗涤液为含有吐温-20的PBS溶液，所述洗涤液的浓度为0.02mol/L，pH为7.5，所述洗涤液中吐温-20的体积分数为0.8％；所述封闭液为BSA-PBST溶液，且所述封闭液中BSA的质量分数为2％。
实施例4
酶标二抗工作液的制备方法：将40μL浓度为0.4mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺和40μL浓度为0.2mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混合于1.0mL的纳米金的水溶液中，振摇30min，得到纳米金预处理溶液；将50μL浓度为10mg/mL的脲酶注入1.0mL纳米金预处理溶液中，冰浴1h，得到负载有脲酶的纳米金溶液；加入20μL浓度为0.5mg/mL的羊抗鼠IgG抗体，放入0℃～4℃冰箱里过夜，得到负载有脲酶和二抗IgG的纳米金溶液；将所述负载有脲酶和二抗IgG的纳米金溶液离心，将得到的沉淀分散在500μL pH 7.4，浓度为2mmol/L的Na2CO3水溶液中，得到酶标二抗工作液，0℃～4℃温度保藏。
下述实施例5和实施例6中采用实施例1所示的试剂盒，按照间接竞争酶联免疫法进行检测。其中，酶标二抗工作液由实施例4制得。
应用实施例5
(1)取不同量的AFB1标准品溶于PBS溶液，分别得到浓度为0ng/mL、0.02ng/mL、0.01ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL的AFB1标准溶液，备用。
(2)取大米米粉样品粉末4g，加入甲醇-水提取液10mL，剧烈震荡5min使样品粉末被充分提取后，在6000rpm/min离心20min，用有机针筒过滤器过滤三次；取1mL滤液用5mLPBS稀释，得到储备液，备用，其中，所述甲醇-水提取液中甲醇和水的体积比为8:2。取储备液分别和浓度为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL的AFB1标准溶液按照1:1体积比混合，得到四组样品加标溶液，备用。
(3)在酶标板中加入50μL浓度为0.1mg/mL的AFB1-BSA，并在37℃下孵育2h；去除酶标板上的液体后利用洗涤液洗涤酶标板，再加入100μL质量分数为1.5％的BSA-PBST封闭液，于37℃下封闭1h，而后弃去封闭液，并用洗涤液洗涤酶标板，得到包被有AFB1-BSA偶联物的酶标板。在酶标板上标记9组标准液孔和4组样品孔(每组设置3个孔，以备平行实验)。
(4)加样：
标准液孔：向9组标准液孔中依次加入浓度为0ng/mL、0.02ng/mL、0.01ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL的AFB1标准溶液各50μL，然后向9组标准液孔中分别加入50μL 0.1mg/mL抗体工作液，于37℃孵育1h。
样品孔：向4组样品孔中分别加入4组不同浓度的样品加标溶液各50μL，然后向4组样品孔中分别加入50μL 0.1mg/mL抗体工作液，于37℃孵育1h。
(5)将经步骤(4)处理后的4组样品孔和9组标准液孔中的液体去除后，用洗涤液洗涤，再于每个样品孔/标准液孔中加入50μL酶标二抗工作液，于37℃孵育1h。
(6)将经步骤(5)处理后的4组样品孔和9组标准液孔中的液体去除后，用洗涤液洗涤，再于每个样品孔/标准液孔中加入50μL 1mmol/L的姜黄素溶液和50μL 0.1mol/L尿素溶液，于室温下反应。
(7)取经步骤(6)处理后的4组样品孔和9组标准液孔中的液体，用酶标仪检测各液体在428nm和550nm两处的吸光度值，并计算出各液体对应的A550/A428。绘制吸光度-黄曲霉毒素AFB1浓度标准曲线图如图3所示。
(8)根据样品孔液体对应的A550/A428值和标准曲线，计算得到四个样品孔液体中AFB1浓度分别为0.43±0.05ng/mL、1.1±0.1ng/mL、2.04±0.1ng/mL和4.56±0.03ng/mL，回收率在86～110％之间，说明本发明方法能够用于米粉中黄曲霉毒素AFB1的检测。
应用实施例6
(1)取不同量的AFB1标准品溶于PBS溶液，分别得到浓度为0ng/mL、0.02ng/mL、0.01ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL的AFB1标准溶液，备用。
(2)取面粉样品粉末4g，加入甲醇-水提取液10mL，剧烈震荡5min使样品粉末被充分提取后，在6000rpm/min离心20min，用有机针筒过滤器过滤三次；取1mL滤液用5mL PBS稀释，得到储备液，备用，其中，所述甲醇-水提取液中甲醇和水的体积比为8:2。取储备液分别和浓度为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL的AFB1标准溶液按照1:1体积比混合，得到四组样品加标溶液，备用。
(3)在酶标板中加入50μL浓度为0.1mg/mL的AFB1-BSA，并在37℃下孵育2h；去除酶标板上的液体后利用洗涤液洗涤酶标板，再加入100μL质量分数为1.5％的BSA-PBST封闭液，于37℃下封闭1h，而后弃去封闭液，并用洗涤液洗涤酶标板，得到包被有AFB1-BSA偶联物的酶标板。在酶标板上标记9组标准液孔和4组样品孔。
(4)加样：
标准液孔：向9组标准液孔中依次加入浓度为0ng/mL、0.02ng/mL、0.01ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL的AFB1标准溶液各50μL，然后向9组标准液孔中分别加入50μL 0.1mg/mL抗体工作液，于37℃孵育1h。
样品孔：向4组样品孔中分别加入4组不同浓度的样品加标溶液各50μL，然后向4组样品孔中分别加入50μL 0.1mg/mL抗体工作液，于37℃孵育1h。
(5)将经步骤(4)处理后的4组样品孔和9组标准液孔中的液体去除后，用洗涤液洗涤，再于每个样品孔/标准液孔中加入50μL酶标二抗工作液，于37℃孵育1h。
(6)将经步骤(5)处理后的4组样品孔和9组标准液孔中的液体去除后，用洗涤液洗涤，再于每个样品孔/标准液孔中加入50μL 1mmol/L的姜黄素溶液和50μL 0.1mol/L尿素溶液，于室温下反应。
(7)取经步骤(6)处理后的4组样品孔和9组标准液孔中的液体，用酶标仪检测各液体在428nm和550nm两处的吸光度值，并计算出各液体对应的A550/A428。绘制吸光度-黄曲霉毒素AFB1浓度标准曲线图如图3所示。
(8)根据样品孔液体对应的A550/A428值和标准曲线，计算得到四个样品孔液体中AFB1浓度分别为0.48±0.05ng/mL、1.13±0.1ng/mL、2.14±0.09ng/mL和5.10±0.09ng/mL，回收率在96％～113％之间，说明本发明方法能够用于面粉中黄曲霉毒素AFB1的检测。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括酶标板、黄曲霉毒素B1标准品、黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、抗体工作液、酶标二抗工作液以及底物液，其中，所述酶标二抗工作液为负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液，所述底物液包括姜黄素溶液和尿素溶液。
2.如权利要求1所述的用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述姜黄素溶液包括含有聚乙烯吡咯烷酮的姜黄素-乙醇溶液；和/或，
所述尿素溶液为尿素的水溶液。
3.如权利要求1所述的用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述姜黄素-乙醇溶液溶液中姜黄素的摩尔浓度为0.5～1.5mmol/L；和/或，
所述尿素溶液的浓度为0.01～0.5mol/L。
4.如权利要求1所述的用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液中，所述二抗免疫球蛋白G为羊抗鼠免疫球蛋白G抗体。
5.如权利要求1所述的用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒还包括洗涤液，所述洗涤液为含有吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，所述洗涤液的浓度为0.005～0.02mol/L，pH为7.0～7.5，所述洗涤液中吐温-20的体积分数为0.2～0.8％；和/或，
所述酶联免疫试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为BSA-PBST溶液，且所述封闭液中BSA的质量分数为1％～2％。
6.一种如权利要求1至5任意一项所述的用于检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，包括酶标二抗工作液的制备，所述酶标二抗工作液的制备包括以下步骤：
步骤S100，将N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐分散于纳米金水溶液中，振摇混匀，得到纳米金预处理溶液；
步骤S200，向所述纳米金预处理溶液中注入脲酶，冰浴反应得到负载有脲酶的纳米金溶液；
步骤S300，向所述负载有脲酶的纳米金溶液中加入二抗免疫球蛋白G，于0～4℃条件下进行反应，得到负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液；
步骤S400，将所述负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液固液分离，收集沉淀分散于碳酸钠的水溶液中，得到酶标二抗工作液。
7.一种黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
以负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液为酶标二抗，以姜黄素和尿素为底物，采用间接竞争酶联免疫法检测样品中黄曲霉毒素B1的含量。
8.如权利要求7所述的黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，以负载有脲酶和二抗免疫球蛋白G的纳米金溶液为酶标二抗，以姜黄素和尿素为底物，采用间接竞争酶联免疫法检测样品中黄曲霉毒素B1的含量的步骤包括：
步骤S10，获取包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的酶标板，所述酶标板具有样品孔和标准液孔；
步骤S20，在所述标准液孔中加入黄曲霉毒素B1标准溶液和抗体工作液，同时，在所述样品孔中加入样品液和抗体工作液，孵育；
步骤S30，向经步骤S20处理后的所述样品孔和所述标准液孔中分别加入酶标二抗工作液，孵育；
步骤S40，向经步骤S30处理后的所述样品孔和所述标准液孔中分别加入底物液，于室温下反应显色，其中，所述底物液包括姜黄素溶液和尿素溶液；
步骤S50，取经步骤S30处理后的所述样品孔中溶液A和所述标准液孔中溶液B，采用酶标仪检测溶液A和溶液B各自在428nm和550nm两处的吸光度值；
步骤S60，获取标准曲线；
步骤S70，基于所述标准曲线，根据所述溶液A的吸光度值计算得出所述样品中黄曲霉毒素B1的含量。
9.如权利要求8所述的黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，步骤S20中，所述样品液为样品加标溶液。
10.如权利要求8所述的黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，步骤S20中，所述样品液的制备包括储备液的制备，所述储备液的制备包括以下步骤：
取样品粉末，加入甲醇-水提取液，剧烈震荡使样品粉末被充分提取后，离心处理，收集上清液并用磷酸盐缓冲溶液稀释，得到储备液，备用，其中，所述甲醇-水提取液中甲醇和水的体积比为3～5:1。
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