CN108088841A - 一种同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片，包括由上到下设置的进样层、第一通道层、第一反应层、第二通道层、第二反应层、第三通道层及显色层；进样层上设有进样区和分样区，进样区通过进样通道与分样区连通；第一反应层上设有A1、B1、C1、D1四个检测区，第二反应层上设有A2、B2、C2、D2四个检测区，显色层上设有A3、B3、C3、D3四个显色区，第一通道层上、第二通道层上及第三通道层上均设有流体通道。本发明制备出的纸基微流控芯片在肝功酶检测时无需仪器设备和专业操作人员，可同时直观显示血液四种肝功酶检测结果，具有线性范围宽，重复性、稳定性良好，高通量，检测速度快，操作简单和互不干扰等特点。
Description
技术领域
本发明属于分析器件技术领域，具体涉及一种同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片及其制备方法。
背景技术
肝脏是人体最大的解毒器官，承担着代谢、消化及解毒等重要功能，是维持生命的重要因素。当肝脏受到损伤时，人身体健康则受到威胁。在我国约有4亿人口患有肝脏疾病，肝病是常见病和多发病。然而，目前临床暂无单一指标或简单实验室检查能完全反应全部肝功能。因此，临床上通常采用多个指标联合的检测方法，这在一定程度上提高了肝功能异常诊断的准确性。酶作为有关器官是否正常的特异性指标，其诊断价值突出。由于肝脏含酶丰富，当肝脏病理变化时，肝中酶就会进入血液而导致血清酶类发生异常改变。血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨酰转移酶(GGT)是肝脏疾病筛查中四个重要的酶学检测指标，在临床肝脏诊断中价值突出。
医院常用大型生化仪借助测定试剂盒检验血清肝功酶，结果虽然准确，但过程繁琐、操作复杂。而电化学法、荧光法、化学发光法和表面增强拉曼光谱法等仪器法，则需要依赖专业的操作人员借助专门的仪器才能完成检测。另外，没有一种方法能同时高通量地检测上述四种肝功酶。相比之下，纸基微流控芯片具有低试剂消耗、操作简单、快速、直观，可实现多物质同时检测等优点，是近几年发展的一种新型微流控芯片。作为一次性分析器件，纸基微流控芯片被广泛应用于医学诊断、食品安全快速检测等领域，这对于贫困偏远地区肝病个性化医疗和诊断的普及有一定的推动作用，应用前景广阔。
发明内容
本发明提供了一种同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片，解决了现有技术中没有一种方法能同时高通量地检测四种肝功酶的问题。
本发明的第一个目的是提供一种同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片，包括由上到下依次设置的尺寸相同的进样层、第一通道层、第一反应层、第二通道层、第二反应层、第三通道层以及显色层；
所述进样层上设有进样区和分样区，所述分样区为四个，所述进样区通过四个独立进样通道与四个分样区连通；
所述第一反应层上设有四个第一检测区，四个第一检测区包括A1、B1、C1、D1四个检测区，四个第一检测区与所述进样层上四个分样区分别上下对应设置，所述A1检测区内设有丙氨酸氨基转移酶催化底物，所述B1检测区内设有天冬氨酸氨基转移酶催化底物，所述C1检测区内设有碱性磷酸酶催化底物，所述D1检测区内设有γ-谷氨酰转移酶催化底物；
所述第二反应层上设有四个检测分流区，每个检测分流区通过独立的流体通道连通两个第二检测区，所述第二检测区包括A2、B2、C2、D2检测区，四个检测分流区与所述第一反应层上A1、B1、C1、D1检测区上下对应设置，与所述A1检测区相对应的检测分流区通过流体通道连通两个A2检测区，与所述B1检测区相对应的检测分流区通过流体通道连通两个B2检测区，与所述C1检测区相对应的检测分流区通过流体通道连通两个C2检测区，与所述D1检测区相对应的检测分流区通过流体通道连通两个D2检测区；所述A2检测区内设有丙氨酸氨基转移酶催化中间反应物，所述B2检测区内设有天冬氨酸氨基转移酶催化中间反应物，所述C2检测区内设有碱性磷酸酶催化中间反应物，所述D2检测区内设有γ-谷氨酰转移酶催化中间反应物；
所述显色层上设有第三检测区，所述第三检测区与第二检测区上下对应设置，所述第三检测区包括A3、B3、C3、D3四个显色区，所述A3显色区内设有丙氨酸氨基转移酶显色试剂，所述B3显色区内设有天冬氨酸氨基转移酶显色试剂，所述C3显色区内设有碱性磷酸酶显色试剂，所述D3显色区内设有γ-谷氨酰转移酶显色试剂；
分样区与对应的第一检测区之间的第一通道层上，第一检测区与对应的检测分流区之间的第二通道层上，第二检测区与对应的第三检测区之间的第三通道层上均开设有流体通道。
优选的，所述进样层、所述第一反应层、所述第二反应层以及所述显色层均为滤纸；所述第一通道层、所述第二通道层以及所述第三通道层均为双面胶。
优选的，所述进样层、所述第一通道层、所述第一反应层、所述第二通道层、所述第二反应层、所述第三通道层以及所述显色层的尺寸均为3cm×3cm。
优选的，所述A1检测区内设有的丙氨酸氨基转移酶催化底物为0.45-0.89mg L-丙氨酸、0.98-1.96mgα-酮戊二酸、0.68-0.70mg磷酸二氢钠以及0.12-0.14mg磷酸氢二钠的混合物；
所述B1检测区内设有的天冬氨酸氨基转移酶催化底物为0.67-1.33mg L-天冬氨酸、0.98-1.96mgα-酮戊二酸、0.68-0.70mg磷酸二氢钠以及0.12-0.14mg磷酸氢二钠的混合物；
所述C1检测区内设有的碱性磷酸酶催化底物为2.6-3.4μg的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐与19.6-26.6μg Tris的混合物；
所述D1检测区内设有的γ-谷氨酰转移酶催化底物为0.61-0.63mg L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺、0.44-0.46mg磷酸二氢钠以及2.2-2.4mg磷酸氢二钠的混合物。
优选的，所述A2检测区内设有的丙氨酸氨基转移酶催化中间反应物与所述B2检测区内设有天冬氨酸氨基转移酶催化中间反应物均为8-12μg 2，4-二硝基苯肼；
所述C2检测区内设有碱性磷酸酶催化中间反应物为0.66-1.10μg氯化硝基四氮唑蓝；
所述D2检测区内设有γ-谷氨酰转移酶催化中间反应物为0.50-0.75μg双甘肽。
优选的，所述A3显色区内设有的丙氨酸氨基转移酶显色试剂与所述B3显色区内设有的天冬氨酸氨基转移酶显色试剂均为7.0-7.5mg的NaOH；
所述C3显色区内设有的碱性磷酸酶显色试剂为0.66-1.10μg的氯化硝基四氮唑蓝；
所述D3显色区内设有的γ-谷氨酰转移酶显色试剂为0.6-0.8μg的双甘肽。
本发明的第二个目的是提供一种同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，在进样层上划分进样区和非进样区；在第一反应层、第二反应层上划分检测区和非检测区；在显色层上划分显色区和非显色区；
步骤2，在进样层上的非进样区、第一反应层以及第二反应层上的非检测区、显色层上的非显色区表面涂满石蜡，再将上述涂有石蜡的各层在120-135℃下加热3-5min，加热完毕后冷却至室温后在各层上形成疏水区与亲水区，进样层上的亲水区为进样区、分样区以及进样通道，第一反应层上的亲水区为四个第一检测区、第二反应层上的亲水区为均包含有流体通道连通两个第二检测区的四个检测分流区，显色层上的亲水区为第三检测区；
步骤3，对第一反应层上的第一检测区进行区域划分并进行字母标记，其中，血清丙氨酸氨基转移酶检测区处标记A1检测区，天冬氨酸氨基转移酶检测区处标记B1检测区，碱性磷酸酶检测区处标记C1检测区，γ-谷氨酰转移酶检测区处标记D1检测区；
然后将50μL含有8.9-17.8g/L L-丙氨酸溶液、19.6-39.2g/Lα-酮戊二酸的磷酸盐溶液的丙氨酸氨基转移酶催化底物滴加到A1检测区内；其中，α-酮戊二酸的磷酸盐溶液中还含有13.6-14.0g/L的磷酸二氢钠和2.4-2.8g/L磷酸氢二钠；
将50μL含有13.3-26.6g/L L-天冬氨酸溶液、19.6-39.2g/Lα-酮戊二酸的磷酸盐溶液的天冬氨酸氨基转移酶催化底物滴加到B1检测区内；其中，α-酮戊二酸的磷酸盐溶液中还含有13.6-14.0g/L的磷酸二氢钠和2.4-2.8g/L磷酸氢二钠；
将2μL含有1.3-1.7g/L 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐、9.8-13.3g/L Tris的Tris-HCl缓冲液的碱性磷酸酶催化底物滴加到C1检测区内；其中，Tris-HCl缓冲液的pH值为8.0；
将20μL含有30.5-31.5g/L的L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺磷酸盐溶液的γ-谷氨酰转移酶催化底物滴加到D1检测区内；其中，L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺磷酸盐溶液中还含有22.0-23.0g/L的磷酸二氢钠和120-140g/L磷酸氢二钠；
步骤3的各溶液滴加完毕后避光室温晾干，备用；
步骤4，在第二反应层上与第一反应层上A1、B1、C1、D1检测区相对应的第二检测区处分别标记A2、B2、C2、D2四个检测区；
然后将50μL含有0.16-0.24g/L 2，4-二硝基苯肼的丙氨酸氨基转移酶催化中间反应物滴加到A2检测区内；
将50μL含有0.16-0.24g/L 2，4-二硝基苯肼的天冬氨酸氨基转移酶催化中间反应物滴加到B2检测区内；
将2μL含有0.33-0.55g/L氯化硝基四氮唑蓝溶液的碱性磷酸酶催化中间反应物滴加到C2检测区内；
将50μL含有0.01-0.015g/L双甘肽溶液的γ-谷氨酰转移酶催化中间反应物滴加到D2检测区内；
步骤4的各溶液滴加完毕后避光室温晾干，备用；
步骤5，在显色层上与第二反应层上A2、B2、C2、D2检测区相对应的第三检测区处分别标记A3、B3、C3、D3四个检测区；
然后将50μL含有140-150g/L NaOH溶液的丙氨酸氨基转移酶显色试剂滴加到A3显色区内；
将50μL含有140-150g/L NaOH溶液的天冬氨酸氨基转移酶显色试剂滴加到B3显色区内；
将2μL含有0.33-0.55g/L氯化硝基四氮唑蓝溶液的碱性磷酸酶显色试剂滴加到C3显色区内；
将50μL含有0.012-0.016g/L双甘肽溶液的γ-谷氨酰转移酶显色试剂滴加到D3显色区内；
步骤5的各溶液滴加完毕后避光室温晾干，备用；
步骤6，在分样区与对应的第一检测区之间的第一通道层上，第一检测区与对应的检测分流区之间的第二通道层上，第二检测区与对应的第三检测区之间的第三通道层上均开设流体通道，然后在每个流体通内均填充纤维素糊；
步骤7，将上述处理好的进样层、第一通道层、第一反应层、第二通道层、第二反应层、第三通道层以及显色层依次粘结组装，即得到所述同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片。
优选的，所述步骤1中使用金属印戳在滤纸表面涂满石蜡。
优选的，所述步骤5中纤维素糊为纤维素粉与水按照1:1-1.5的质量比混合而成的。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供了石蜡压印法制备能同时检测四种肝功酶的三维纸基微流控芯片，该方法一方面解决了纸基微流控芯片制备过程中聚合物油墨绘画或压印法不能批量生产，石蜡浸渍法不能批量生产、重现性差，光刻法制作过程复杂、易被光刻胶污染，石蜡打印法仪器不够普及，喷墨侵蚀法需多次打印、不能批量生产等问题；另一方面，解决了纸基微流控芯片制备仍需借助仪器的问题。此外，本发明制备出的芯片结合显色法在肝功酶检测时，无需仪器设备和专业操作人员，可同时直观显示血液四种肝功酶检测结果，具有线性范围宽，重复性、稳定性良好，高通量，检测速度快，操作简单，检测成本低和互不干扰等特点。
附图说明
图1为本发明提供的同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片的分解结构示意图；
图2为本发明提供的同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片的正面结构示意图；
图3为本发明提供的同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片的背面结构示意图。
附图标记说明：1-进样层、2-第一通道层，3-第一反应层，4-第二通道层，5-第二反应层，6-第三通道层，7-显色层。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
实施例1
一种同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片，具体如图1-3所示，包括由上到下依次设置的尺寸相同的进样层1、第一通道层2、第一反应层3、第二通道层4、第二反应层5、第三通道层6以及显色层7；
进样层1、第一反应层3和第二反应层5纸基采用中速定性滤纸，显色层7纸基为层析滤纸；第一通道层2、第二通道层4以及第三通道层6均为双面胶；
进样层1上设有进样区和分样区，分样区为四个，进样区通过四个独立进样通道与四个分样区连通；
第一反应层3上设有四个第一检测区，四个第一检测区包括A1、B1、C1、D1四个检测区，四个第一检测区与进样层1上四个分样区分别上下对应设置，且A1检测区内设有的丙氨酸氨基转移酶催化底物为0.45mg L-丙氨酸、0.98μgα-酮戊二酸、0.68mg磷酸二氢钠以及0.12mg磷酸氢二钠的混合物；B1检测区内设有的天冬氨酸氨基转移酶催化底物为0.67mgL-天冬氨酸、0.98mgα-酮戊二酸、0.68mg磷酸二氢钠以及0.12mg磷酸氢二钠的混合物；
C1检测区内设有的碱性磷酸酶催化底物为2.6μg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐与19.6μg Tris的混合物；D1检测区内设有的γ-谷氨酰转移酶催化底物为0.61mg L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺、0.44mg磷酸二氢钠以及2.2mg磷酸氢二钠的混合物；
第二反应层5上设有四个检测分流区，每个检测分流区通过独立的流体通道连通两个第二检测区，第二检测区包括A2、B2、C2、D2检测区，四个检测分流区与第一反应层3上A1、B1、C1、D1检测区上下对应设置，与A1检测区相对应的检测分流区通过流体通道连通两个A2检测区，与B1检测区相对应的检测分流区通过流体通道连通两个B2检测区，与C1检测区相对应的检测分流区通过流体通道连通两个C2检测区，与D1检测区相对应的检测分流区通过流体通道连通两个D2检测区；
A2检测区内设有丙氨酸氨基转移酶催化中间反应物，B2检测区内设有天冬氨酸氨基转移酶催化中间反应物，C2检测区内设有碱性磷酸酶催化中间反应物，D2检测区内设有γ-谷氨酰转移酶催化中间反应物；
且A2检测区内设有的丙氨酸氨基转移酶催化中间反应物与B2检测区内设有天冬氨酸氨基转移酶催化中间反应物均为8μg 2，4-二硝基苯肼；C2检测区内设有碱性磷酸酶催化中间反应物为0.66μg氯化硝基四氮唑蓝；D2检测区内设有γ-谷氨酰转移酶催化中间反应物为0.50μg双甘肽。
显色层7上设有第三检测区，第三检测区与第二检测区上下对应设置，第三检测区包括A3、B3、C3、D3四个显色区，A3显色区内设有丙氨酸氨基转移酶显色试剂，B3显色区内设有天冬氨酸氨基转移酶显色试剂，C3显色区内设有碱性磷酸酶显色试剂，D3显色区内设有γ-谷氨酰转移酶显色试剂；且A3显色区内设有的丙氨酸氨基转移酶显色试剂与B3显色区内设有的天冬氨酸氨基转移酶显色试剂均为7.0mg的NaOH；C3显色区内设有的碱性磷酸酶显色试剂为0.66μg的氯化硝基四氮唑蓝；D3显色区内设有的γ-谷氨酰转移酶显色试剂为0.6μg的双甘肽；
分样区与对应的第一检测区之间的第一通道层2上，第一检测区与对应的检测分流区之间的第二通道层4上，第二检测区与对应的第三检测区之间的第三通道层6上均开设有流体通道。
本发明中，四种肝功酶显色原理为：
丙氨酸氨基转移酶/天冬氨酸氨基转移酶：L-丙氨酸或L-天冬氨酸与α-酮戊二酸分别在丙氨酸氨基转移酶或天冬氨酸氨基转移酶催化下产生L-谷氨酸和α-丙酮酸，α-丙酮酸与终止和显色剂2,4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯肼，在碱性环境下丙酮酸-2,4-二硝基苯肼形成红棕色苯腙硝醌化合物。
碱性磷酸酶：5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐能被碱性磷酸酶水解为吲哚中间体，氯化硝基四氮唑蓝可与吲哚中间体反应生成深蓝紫色甲臜，该显色反应颜色可从无色变为深蓝色甚至黑色。
γ-谷氨酰基转移酶：γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺和双甘肽在γ-谷氨酰基转移酶的催化作用下生成L-γ-谷氨酰-双甘肽和5-氨基-2-硝基苯甲酸，产物5-氨基-2-硝基苯甲酸呈现红色。
具体制备方法如下：
步骤1，在进样层1上划分进样区和非进样区；在第一反应层3、第二反应层5上划分检测区和非检测区；在显色层7上划分显色区和非显色区；
步骤2，分别在三张3cm×3cm中速定性滤纸上用刻有进样层1、第一反应层3和第二反应层5图案的金属印戳将非进样区和非反应区表面均匀涂满石蜡，在3cm×3cm层析滤纸上用刻有显色层7图案的金属印戳将非显色区表面也均匀涂满石蜡，将印有石蜡图案的各层在135℃下加热3min，冷却至室温，获得具有不同形状亲水和疏水区的各层滤纸，其中进样层1上的亲水区为进样区、分样区以及进样通道，第一反应层3上的亲水区为四个第一检测区、第二反应层5上的亲水区为均包含有流体通道连通两个第二检测区的四个检测分流区，显色层7上的亲水区为第三检测区；
以上各层中亲水圆形区直径均为3mm，进样层1液体通道宽2mm、长9.8mm，第一反应层3中四个检测区间距为16mm，第二反应层5中串形孔道宽3mm、长2mm，显色层7中同一种检测项目显色区间距为7mm、垂直方向不同检测区间距离为3mm、两列间距离为16mm。
步骤3，对第一反应层3上的第一检测区进行区域划分并进行字母标记，其中，血清丙氨酸氨基转移酶检测区处标记A1检测区，天冬氨酸氨基转移酶检测区处标记B1检测区，碱性磷酸酶检测区处标记C1检测区，γ-谷氨酰转移酶检测区处标记D1检测区；
然后将50μL含有8.9g/L的L-丙氨酸溶液、19.6g/L的α-酮戊二酸的磷酸盐溶液的丙氨酸氨基转移酶催化底物滴加到A1检测区内；其中，α-酮戊二酸的磷酸盐溶液中还含有13.6g/L的磷酸二氢钠和2.4g/L磷酸氢二钠；
将50μL含有13.3g/L L-天冬氨酸溶液、19.6g/Lα-酮戊二酸的磷酸盐溶液的天冬氨酸氨基转移酶催化底物滴加到B1检测区内；其中，α-酮戊二酸的磷酸盐溶液中还含有13.6g/L的磷酸二氢钠和2.4g/L磷酸氢二钠；
将2μL含有1.3g/L 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐、Tris-HCl缓冲液的碱性磷酸酶催化底物滴加到C1检测区内；其中，Tris-HCl缓冲液含有9.8g/L的Tris，且Tris-HCl缓冲液的pH值为8.0；
将20μL含有30.5g/L L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺磷酸盐溶液的γ-谷氨酰转移酶催化底物滴加到D1检测区内；其中，L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺磷酸盐溶液中还含有22.0g/L的磷酸二氢钠和120g/L磷酸氢二钠；
步骤3的各溶液滴加完毕后避光室温晾干，备用；
步骤4，在第二反应层5上与第一反应层3上A1、B1、C1、D1检测区相对应的第二检测区处分别标记A2、B2、C2、D2四个检测区；
然后将50μL含有0.16g/L 2，4-二硝基苯肼的丙氨酸氨基转移酶催化中间反应物滴加到A2检测区内；
将50μL含有0.16g/L 2，4-二硝基苯肼的天冬氨酸氨基转移酶催化中间反应物滴加到B2检测区内；
将2μL含有0.33g/L氯化硝基四氮唑蓝溶液的碱性磷酸酶催化中间反应物滴加到C2检测区内；
将50μL含有0.01g/L双甘肽溶液的γ-谷氨酰转移酶催化中间反应物滴加到D2检测区内；
步骤4的各溶液滴加完毕后避光室温晾干，备用；
步骤5，在显色层7上与第二反应层5上A2、B2、C2、D2检测区相对应的第三检测区分别标记A3、B3、C3、D3四个检测区；
然后将50μL含有140g/L NaOH溶液的丙氨酸氨基转移酶显色试剂滴加到A3显色区内；
将50μL含有140g/L NaOH溶液的天冬氨酸氨基转移酶显色试剂滴加到B3显色区内；
将2μL含有0.33g/L氯化硝基四氮唑蓝溶液的碱性磷酸酶显色试剂滴加到C3显色区内；
将50μL含有0.012g/L双甘肽溶液的γ-谷氨酰转移酶显色试剂滴加到D3显色区内；
步骤5的各溶液滴加完毕后避光室温晾干，备用；
步骤6，在分样区与对应的第一检测区之间的第一通道层2上，第一检测区与对应的检测分流区之间的第二通道层4上，第二检测区与对应的第三检测区之间的第三通道层6上均开设流体通道，然后在每个流体通内均填充纤维素糊；
步骤7，将上述处理好的进样层1、第一通道层2、第一反应层3、第二通道层4、第二反应层5、第三通道层6以及显色层7依次粘结组装，即得到所述同时检测肝功酶的纸基微流控芯片。
需要说明的是，步骤5中纤维素糊为纤维素粉与水按照1:1-1.5的质量比混合而成的。
实施例2
一种同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片，其结构和实施例1完全相同，不同之处在于：
A1检测区内设有的丙氨酸氨基转移酶催化底物为0.68mg L-丙氨酸、1.56mgα-酮戊二酸、0.69mg磷酸二氢钠以及0.13mg磷酸氢二钠的混合物；B1检测区内设有的天冬氨酸氨基转移酶催化底物为1.12mg L-天冬氨酸、1.86mgα-酮戊二酸、0.69mg磷酸二氢钠以及0.13mg磷酸氢二钠的混合物；
C1检测区内设有的碱性磷酸酶催化底物为3.0μg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐与21.2μg Tris的混合物；D1检测区内设有的γ-谷氨酰转移酶催化底物为0.62mg的L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺、0.45mg的磷酸二氢钠以及2.3mg磷酸氢二钠的混合物；
A2检测区内设有的丙氨酸氨基转移酶催化中间反应物与B2检测区内设有天冬氨酸氨基转移酶催化中间反应物均为10μg的2，4-二硝基苯肼；C2检测区内设有碱性磷酸酶催化中间反应物为0.88μg氯化硝基四氮唑蓝；D2检测区内设有γ-谷氨酰转移酶催化中间反应物为0.65μg的双甘肽。
A3显色区内设有的丙氨酸氨基转移酶显色试剂与B3显色区内设有的天冬氨酸氨基转移酶显色试剂均为7.2mg的NaOH；C3显色区内设有的碱性磷酸酶显色试剂为0.88μg的氯化硝基四氮唑蓝；D3显色区内设有的γ-谷氨酰转移酶显色试剂为0.70μg的双甘肽。
具体制备方法同实施例1，不同之处如下：
步骤2，将印有石蜡图案的各层在130℃下加热4min后冷却至室温；
步骤3，将50μL含有13.6g/L L-丙氨酸溶液、31.2g/Lα-酮戊二酸的磷酸盐溶液的丙氨酸氨基转移酶催化底物滴加到A1检测区内；其中，α-酮戊二酸的磷酸盐溶液中还含有13.8g/L的磷酸二氢钠和2.6g/L磷酸氢二钠；
将50μL含有22.4g/L L-天冬氨酸溶液、37.2g/Lα-酮戊二酸的磷酸盐溶液的天冬氨酸氨基转移酶催化底物滴加到B1检测区内；其中，α-酮戊二酸的磷酸盐溶液中还含有13.8g/L的磷酸二氢钠和2.6g/L磷酸氢二钠；
将2μL含有1.5g/L 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐、Tris-HCl缓冲液的碱性磷酸酶催化底物滴加到C1检测区内；其中，Tris-HCl缓冲液含有10.6g/L的Trisl，且Tris-HCl缓冲液的pH值为8.0；
将20μL含有31.0g/L L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺磷酸盐溶液的γ-谷氨酰转移酶催化底物滴加到D1检测区内；其中，L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺磷酸盐溶液中还含有22.5g/L的磷酸二氢钠和115g/L磷酸氢二钠；
步骤3的各溶液滴加完毕后避光室温晾干，备用；
步骤4，将50μL含有0.2g/L 2，4-二硝基苯肼的丙氨酸氨基转移酶催化中间反应物滴加到A2检测区内；将50μL含有0.2g/L 2，4-二硝基苯肼的天冬氨酸氨基转移酶催化中间反应物滴加到B2检测区内；将2μL含有0.44g/L氯化硝基四氮唑蓝溶液的碱性磷酸酶催化中间反应物滴加到C2检测区内；将50μL含有0.013g/L双甘肽溶液的γ-谷氨酰转移酶催化中间反应物滴加到D2检测区内；步骤4的各溶液滴加完毕后避光室温晾干，备用；
步骤5，将50μL含有144g/L NaOH溶液的丙氨酸氨基转移酶显色试剂滴加到A3显色区内；将50μL含有144g/L NaOH溶液的天冬氨酸氨基转移酶显色试剂滴加到B3显色区内；将2μL含有0.44g/L氯化硝基四氮唑蓝溶液的碱性磷酸酶显色试剂滴加到C3显色区内；将50μL含有0.014g/L双甘肽溶液的γ-谷氨酰转移酶显色试剂滴加到D3显色区内；步骤5的各溶液滴加完毕后避光室温晾干，备用。
实施例3
一种同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片，其结构和实施例1完全相同，不同之处在于：
A1检测区内设有的丙氨酸氨基转移酶催化底物为0.89mg L-丙氨酸、1.96mgα-酮戊二酸、0.70mg磷酸二氢钠以及0.134mg磷酸氢二钠的混合物；B1检测区内设有的天冬氨酸氨基转移酶催化底物为1.33mg L-天冬氨酸、1.96mgα-酮戊二酸、0.70mg磷酸二氢钠以及0.14mg磷酸氢二钠的混合物；C1检测区内设有的碱性磷酸酶催化底物为3.4μg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐与26.6μg Tris的混合物；D1检测区内设有的γ-谷氨酰转移酶催化底物为0.63mg L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺、0.46mg磷酸二氢钠以及2.4mg磷酸氢二钠的混合物；
A2检测区内设有的丙氨酸氨基转移酶催化中间反应物与B2检测区内设有天冬氨酸氨基转移酶催化中间反应物均为12μg 2，4-二硝基苯肼；C2检测区内设有碱性磷酸酶催化中间反应物为1.10μg氯化硝基四氮唑蓝；D2检测区内设有γ-谷氨酰转移酶催化中间反应物为0.75μg双甘肽。
A3显色区内设有的丙氨酸氨基转移酶显色试剂与B3显色区内设有的天冬氨酸氨基转移酶显色试剂均为7.5mg的NaOH；C3显色区内设有的碱性磷酸酶显色试剂为1.10μg的氯化硝基四氮唑蓝；D3显色区内设有的γ-谷氨酰转移酶显色试剂为0.80μg的双甘肽。
具体制备方法同实施例1，不同之处如下：
步骤2，将印有石蜡图案的各层在120℃下加热5min后冷却至室温；
步骤3，将50μL含有17.8g/L L-丙氨酸溶液、39.2g/Lα-酮戊二酸的磷酸盐溶液的丙氨酸氨基转移酶催化底物滴加到A1检测区内；其中，α-酮戊二酸的磷酸盐溶液中还含有14.0g/L的磷酸二氢钠和2.8g/L磷酸氢二钠；
将50μL含有26.6g/L L-天冬氨酸溶液、39.2g/Lα-酮戊二酸的磷酸盐溶液的天冬氨酸氨基转移酶催化底物滴加到B1检测区内；其中，α-酮戊二酸的磷酸盐溶液中还含有14.0g/L的磷酸二氢钠和2.8g/L磷酸氢二钠；
将2μL含有1.7g/L 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐、Tris-HCl缓冲液的碱性磷酸酶催化底物滴加到C1检测区内；其中，Tris-HCl缓冲液含有13.3g/L的Tris，且Tris-HCl缓冲液的pH值为8.0；
将20μL含有31.5g/L L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺磷酸盐溶液的γ-谷氨酰转移酶催化底物滴加到D1检测区内；其中，L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺磷酸盐溶液中还含有23.0g/L的磷酸二氢钠和140g/L磷酸氢二钠；
步骤3的各溶液滴加完毕后避光室温晾干，备用；
步骤4，将50μL含有0.24g/L 2，4-二硝基苯肼的丙氨酸氨基转移酶催化中间反应物滴加到A2检测区内；将50μL含有0.24g/L 2，4-二硝基苯肼的天冬氨酸氨基转移酶催化中间反应物滴加到B2检测区内；将2μL含有0.55g/L氯化硝基四氮唑蓝溶液的碱性磷酸酶催化中间反应物滴加到C2检测区内；将50μL含有0.015g/L双甘肽溶液的γ-谷氨酰转移酶催化中间反应物滴加到D2检测区内；步骤4的各溶液滴加完毕后避光室温晾干，备用；
步骤5，将50μL含有150g/L NaOH溶液的丙氨酸氨基转移酶显色试剂滴加到A3显色区内；将50μL含有150g/L NaOH溶液的天冬氨酸氨基转移酶显色试剂滴加到B3显色区内；将2μL含有0.55g/L氯化硝基四氮唑蓝溶液的碱性磷酸酶显色试剂滴加到C3显色区内；将50μL含有0.016g/L双甘肽溶液的γ-谷氨酰转移酶显色试剂滴加到D3显色区内；步骤5的各溶液滴加完毕后避光室温晾干，备用。
实施例4
由于实施例1-3制备出的同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片性能基本相同，因此仅以实施例1制得的纸基微流控芯片进行显色检测，具体为：
使用pH为7.4的磷酸盐缓冲液将丙酮酸钠配制成浓度为2mmol/L丙酮酸标准溶液，再将浓度为2mmol/L的丙酮酸溶液分别稀释至0.17mmol/L、0.33mmol/L、0.50mmol/L和0.67mmol/L。分别取浓度为0.17mmol/L-0.67mmol/L的一系列丙酮酸溶液50μL，滴加至实施例1制得的纸基微流控芯片进样层1上进样区的中心入口，然后将纸芯片在37℃下静置10min后观察显色区A3、B3、C3和D3的颜色变化。丙酮酸经显色后，丙氨酸氨基转移酶显色区A3和天冬氨酸氨基转移酶显色区B3均变成红棕色，整体颜色依照丙酮酸浓度的由高到低的变化呈由深到浅的渐变效果；而碱性磷酸酶显色区C3和γ-谷氨酰转移酶显色区D3显示为丙酮酸自身黄色，整体颜色依照丙酮酸浓度的由高到低的变化呈由深到浅的渐变效果。
使用pH为8.8的Tris-HCl缓冲液将碱性磷酸酶配制成30U/L标准溶液。再将浓度为30U/L的碱性磷酸酶溶液分别稀释至25U/L、20U/L、15U/L、10U/L和5U/L，分别取浓度为5U/L-30mmol/L的一系列碱性磷酸酶溶液50μL，滴加至实施例1制得的纸基微流控芯片进样层1上进样区的中心入口，将纸芯片在37℃下静置10min后观察显色区A3、B3、C3和D3的颜色变化。碱性磷酸酶显色后，碱性磷酸酶显色区C3变为深蓝色，整体颜色依照碱性磷酸酶浓度的由高到低的变化呈由深到浅的渐变效果；而丙氨酸氨基转移酶显色区A3、天冬氨酸氨基转移酶显色区B3和γ-谷氨酰转移酶显色区D3显示无色。
使用pH为7.4磷酸盐缓冲液将γ-谷氨酰转移酶配制成浓度为50U/L标准溶液。再将浓度为50U/L的γ-谷氨酰转移酶溶液分别稀释至40U/L、30U/L、20U/L和10U/L。分别取浓度为10U/L-50U/L的一系列γ-谷氨酰转移酶溶液50μL，滴加至实施例1制得的纸基微流控芯片进样层1上进样区的中心入口，将纸芯片在37℃下静置10min后观察显色区A3、B3、C3和D3的颜色变化。γ-谷氨酰转移酶显色后，γ-谷氨酰转移酶显色区D3变为红色，而丙氨酸氨基转移酶显色区A3、天冬氨酸氨基转移酶显色区B3和碱性磷酸酶显色区C3显示无色。
实施例5
对实施例1所制得同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片进行显色检测，具体为：
将50μL血清或EDTA抗凝血浆滴加至实施例1制得的纸基微流控芯片进样层1上进样区的中心入口，将纸芯片在37℃下静置10min后，观察丙氨酸氨基转移酶显色区A3、天冬氨酸氨基转移酶显色区B3、碱性磷酸酶显色区C3和γ-谷氨酰转移酶显色区D3的颜色变化。利用手机对纸芯片检测区拍照，照片用ImageJ软件处理，获得A3、B3、C3和D3显色区灰度值，利用灰度值-丙氨酸氨基转移酶、灰度值-天冬氨酸氨基转移酶、灰度值-碱性磷酸酶和灰度值-γ-谷氨酰转移酶标准曲线可获得血清四种肝功酶含量。10个血清样本丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转移酶含量测定结果见表1。
需要说明的是，实验中采用OLYMPUS5421全自动生化分析仪(湿法)和强生VITROS5600全自动干化学分析仪(干法)的测定结果作为对比。
表1血清样品中ALT、AST、ALP和GGT检测结果
从表1可以看出，与OLYMPUS5421全自动生化分析仪(湿法)和强生VITROS5600全自动干化学分析仪(干化学法)测定结果相比较，其误差小于4％，可满足临床检验要求。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例1-5相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (9)
1.一种同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片，其特征在于，包括由上到下依次层叠设置的进样层(1)、第一通道层(2)、第一反应层(3)、第二通道层(4)、第二反应层(5)、第三通道层(6)以及显色层(7)；
所述进样层(1)上设有进样区和分样区，所述分样区为四个，所述进样区通过四个独立进样通道与四个分样区连通；
所述第一反应层(3)上设有四个第一检测区，四个第一检测区包括A1、B1、C1、D1四个检测区，四个第一检测区与所述进样层(1)上四个分样区分别上下对应设置，所述A1检测区内设有丙氨酸氨基转移酶催化底物，所述B1检测区内设有天冬氨酸氨基转移酶催化底物，所述C1检测区内设有碱性磷酸酶催化底物，所述D1检测区内设有γ-谷氨酰转移酶催化底物；
所述第二反应层(5)上设有四个检测分流区，每个检测分流区通过独立的流体通道连通两个第二检测区，所述第二检测区包括A2、B2、C2、D2检测区，四个检测分流区与所述第一反应层(3)上A1、B1、C1、D1检测区上下对应设置，与所述A1检测区相对应的检测分流区通过流体通道连通两个A2检测区，与所述B1检测区相对应的检测分流区通过流体通道连通两个B2检测区，与所述C1检测区相对应的检测分流区通过流体通道连通两个C2检测区，与所述D1检测区相对应的检测分流区通过流体通道连通两个D2检测区；所述A2检测区内设有丙氨酸氨基转移酶催化中间反应物，所述B2检测区内设有天冬氨酸氨基转移酶催化中间反应物，所述C2检测区内设有碱性磷酸酶催化中间反应物，所述D2检测区内设有γ-谷氨酰转移酶催化中间反应物；
所述显色层(7)上设有第三检测区，所述第三检测区与第二检测区上下对应设置，所述第三检测区包括A3、B3、C3、D3四个显色区，所述A3显色区内设有丙氨酸氨基转移酶显色试剂，所述B3显色区内设有天冬氨酸氨基转移酶显色试剂，所述C3显色区内设有碱性磷酸酶显色试剂，所述D3显色区内设有γ-谷氨酰转移酶显色试剂；
分样区与对应的第一检测区之间的第一通道层(2)上，第一检测区与对应的检测分流区之间的第二通道层(4)上，第二检测区与对应的第三检测区之间的第三通道层(6)上均开设有流体通道。
2.根据权利要求1所述的同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片，其特征在于，所述进样层(1)、所述第一反应层(3)、所述第二反应层(5)以及所述显色层(7)均为滤纸；所述第一通道层(2)、所述第二通道层(4)以及所述第三通道层(6)均为双面胶。
3.根据权利要求2所述的同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片，其特征在于，所述进样层(1)、所述第一通道层(2)、所述第一反应层(3)、所述第二通道层(4)、所述第二反应层(5)、所述第三通道层(6)以及所述显色层(7)的尺寸均为3cm×3cm。
4.根据权利要求1所述的同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片，其特征在于，所述A1检测区内设有的丙氨酸氨基转移酶催化底物为0.45-0.89mg L-丙氨酸、0.98-1.96mgα-酮戊二酸、0.68-0.70mg磷酸二氢钠以及0.12-0.14mg磷酸氢二钠的混合物；
所述B1检测区内设有的天冬氨酸氨基转移酶催化底物为0.67-1.33mg L-天冬氨酸、0.98-1.96mgα-酮戊二酸、0.68-0.70mg磷酸二氢钠以及0.12-0.14mg磷酸氢二钠的混合物；
所述C1检测区内设有的碱性磷酸酶催化底物为2.6-3.4μg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐与19.6-26.6μg Tris的混合物；
所述D1检测区内设有的γ-谷氨酰转移酶催化底物为0.61-0.63mg L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺、0.44-0.46mg磷酸二氢钠以及2.2-2.4mg磷酸氢二钠的混合物。
5.根据权利要求1所述的同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片，其特征在于，所述A2检测区内设有的丙氨酸氨基转移酶催化中间反应物与所述B2检测区内设有天冬氨酸氨基转移酶催化中间反应物均为8-12μg 2，4-二硝基苯肼；
所述C2检测区内设有碱性磷酸酶催化中间反应物为0.66-1.10μg氯化硝基四氮唑蓝；
所述D2检测区内设有γ-谷氨酰转移酶催化中间反应物为0.50-0.75μg双甘肽。
6.根据权利要求1所述的同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片，其特征在于，所述A3显色区内设有的丙氨酸氨基转移酶显色试剂与所述B3显色区内设有的天冬氨酸氨基转移酶显色试剂均为7.0-7.5mg的NaOH；
所述C3显色区内设有的碱性磷酸酶显色试剂为0.66-1.10μg的氯化硝基四氮唑蓝；
所述D3显色区内设有的γ-谷氨酰转移酶显色试剂为0.6-0.8μg的双甘肽。
7.根据权利要求1所述的同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，在进样层(1)上划分进样区和非进样区；在第一反应层(3)、第二反应层(5)上划分检测区和非检测区；在显色层(7)上划分显色区和非显色区；
步骤2，在进样层(1)上的非进样区、第一反应层(3)以及第二反应层(5)上的非检测区、显色层(7)上的非显色区表面涂满石蜡，再将上述涂有石蜡的各层在120-135℃下加热3-5min，加热完毕后冷却至室温后在各层上形成疏水区与亲水区，进样层(1)上的亲水区为进样区、分样区以及进样通道，第一反应层(3)上的亲水区为四个第一检测区、第二反应层(5)上的亲水区为均包含有流体通道连通两个第二检测区的四个检测分流区，显色层(7)上的亲水区为第三检测区；
步骤3，对第一反应层(3)上的第一检测区进行区域划分并进行字母标记，其中，血清丙氨酸氨基转移酶检测区处标记A1检测区，天冬氨酸氨基转移酶检测区处标记B1检测区，碱性磷酸酶检测区处标记C1检测区，γ-谷氨酰转移酶检测区处标记D1检测区；
然后将50μL含有8.9-17.8g/L L-丙氨酸溶液、19.6-39.2g/Lα-酮戊二酸的磷酸盐溶液的丙氨酸氨基转移酶催化底物滴加到A1检测区内；其中，α-酮戊二酸的磷酸盐溶液中还含有13.6-14.0g/L的磷酸二氢钠和2.4-2.8g/L磷酸氢二钠；
将50μL含有13.3-26.6g/L L-天冬氨酸溶液、19.6-39.2g/Lα-酮戊二酸的磷酸盐溶液的天冬氨酸氨基转移酶催化底物滴加到B1检测区内；其中，α-酮戊二酸的磷酸盐溶液中还含有13.6-14.0g/L的磷酸二氢钠和2.4-2.8g/L磷酸氢二钠；
将2μL含有1.3-1.7g/L 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐、9.8-13.3g/L Tris的Tris-HCl缓冲液的碱性磷酸酶催化底物滴加到C1检测区内；其中，Tris-HCl缓冲液的pH值为8.0；
将20μL含有30.5-31.5g/L L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺磷酸盐溶液的γ-谷氨酰转移酶催化底物滴加到D1检测区内；其中，L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺磷酸盐溶液中还含有22.0-23.0g/L的磷酸二氢钠和120-140g/L磷酸氢二钠；
步骤3的各溶液滴加完毕后避光室温晾干，备用；
步骤4，在第二反应层(5)上与第一反应层(3)上A1、B1、C1、D1检测区相对应的第二检测区处分别标记A2、B2、C2、D2四个检测区；然后将50μL含有0.16-0.24g/L的2，4-二硝基苯肼的丙氨酸氨基转移酶催化中间反应物滴加到A2检测区内；
将50μL含有0.16-0.24g/L的2，4-二硝基苯肼的天冬氨酸氨基转移酶催化中间反应物滴加到B2检测区内；
将2μL含有0.33-0.55g/L氯化硝基四氮唑蓝溶液的碱性磷酸酶催化中间反应物滴加到C2检测区内；
将50μL含有0.01-0.015g/L双甘肽溶液的γ-谷氨酰转移酶催化中间反应物滴加到D2检测区内；
步骤4的各溶液滴加完毕后避光室温晾干，备用；
步骤5，在显色层(7)上与第二反应层(5)上A2、B2、C2、D2检测区相对应的第三检测区处分别标记A3、B3、C3、D3四个检测区；
然后将50μL含有140-150g/L NaOH溶液的丙氨酸氨基转移酶显色试剂滴加到A3显色区内；
将50μL含有140-150g/L NaOH溶液的天冬氨酸氨基转移酶显色试剂滴加到B3显色区内；
将2μL含有0.33-0.55g/L氯化硝基四氮唑蓝溶液的碱性磷酸酶显色试剂滴加到C3显色区内；
将50μL含有0.012-0.016g/L双甘肽溶液的γ-谷氨酰转移酶显色试剂滴加到D3显色区内；
步骤5的各溶液滴加完毕后避光室温晾干，备用；
步骤6，在分样区与对应的第一检测区之间的第一通道层(2)上，第一检测区与对应的检测分流区之间的第二通道层(4)上，第二检测区与对应的第三检测区之间的第三通道层(6)上均开设流体通道，然后在每个流体通内均填充纤维素糊；
步骤7，将上述处理好的进样层(1)、第一通道层(2)、第一反应层(3)、第二通道层(4)、第二反应层(5)、第三通道层(6)以及显色层(7)依次粘结组装，即得到所述同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片。
8.根据权利要求7所述的同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤1中使用金属印戳在滤纸表面涂满石蜡。
9.根据权利要求7所述的同时检测四种肝功酶的纸基微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤5中纤维素糊为纤维素粉与水按照1:1-1.5的质量比混合而成的。
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