CN106153685B - 基于电化学检测精子顶体酶活性的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于电化学检测精子顶体酶活性的方法，其包含：将精子顶体酶底物修饰的电极分别于含有不同浓度精子顶体酶标准样品中充分浸渍，并分别测试所述电极的阻抗，由此建立活性精子顶体酶浓度与电极阻抗的标准曲线；以及，将所述电极分别于含有未知浓度精子顶体酶的待测样品中充分浸渍，并测试所述电极的阻抗，再依据所述标准曲线而获知所述待测试样中精子顶体酶的浓度；其中所述标准样品和待测样品均以适于使精子顶体酶专一结合并水解所述精子顶体酶底物的缓冲液作为溶剂。本发明还公开了一种试剂盒。藉由本发明的试剂盒及检测方法，能快速(3min左右)、可靠、灵敏(检测限可达0.001μM)且低成本的检测精子顶体酶的活性。

Description

基于电化学检测精子顶体酶活性的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种精子顶体酶的活性评价方法，特别是一种基于电化学检测精子顶体酶活性的方法及试剂盒，属于生物检测领域。

背景技术

顶体酶活性可反映精子质量，顶体酶活力不足可能导致不育，是评价(同意修改)精子功能和生育力强弱的重要指标，结合(同意修改)精液常规分析、精子形态染色等常规指标，能更全面反映精子质量。

顶体酶的检测早期多利用顶体酶抗体进行放射免疫法或荧光免疫法检测，通过观察精子顶体内顶体酶的数量判断精子受精能力。后来Kennedy等人首先报道了计算顶体酶水解底物效率的方法判断精子顶体酶的活性，此方法首先将精子裂解，再将裂解液置于加入酶水解底物的检测管中，通过观察底物水解后的显色深浅，计算吸光值检测顶体酶的水解活力。此方法得出指标更能反应精子顶体酶的生理功能，现已成为标准检测方法。

近年来又有学者根据精子顶体反应更深入的认识提出，精子顶体酶的活性应由发生顶体反应的精子判断才更符合精子受精的实际生理过程。目前已有报道先进性诱导顶体反应，然后检测发生顶体反应后释放出的顶体酶的活性，以此标示整个精液样本中精子群体的顶体酶活性。然而，目前的检测方法需要借助复杂的仪器，检测花费时间长。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种基于电化学检测精子顶体酶活性的方法，其能实现对精子顶体酶快速、灵敏、实时检测，从而克服了现有技术的不足。

本发明的另一目的在于提供一种精子顶体酶活性检测试剂盒。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

一种基于电化学检测精子顶体酶活性的方法，其特征在于包含：

提供精子顶体酶底物修饰的电极，

将所述电极分别于含有不同浓度精子顶体酶标准样品中充分浸渍，并分别测试所述电极的阻抗，由此建立活性精子顶体酶浓度与电极阻抗的标准曲线；

以及，将所述电极分别于含有未知浓度精子顶体酶的待测样品中充分浸渍，并测试所述电极的阻抗，再依据所述标准曲线而获知所述待测试样中精子顶体酶的浓度；

其中，所述标准样品和待测样品均以适于使精子顶体酶专一结合并水解所述精子顶体酶底物的缓冲液作为溶剂。

进一步的，所述基于电化学检测精子顶体酶活性的方法还包括：以选定官能团修饰所述电极表面而形成复数个精子顶体酶底物的结合位点。

一种精子顶体酶活性检测试剂盒，其包括：

精子顶体酶底物修饰的电极，

适于使精子顶体酶专一结合并水解所述精子顶体酶底物的缓冲液，

其中，当所述电极被浸于所述缓冲液中时，所述电极的阻抗变化幅度与所述缓冲液中精子顶体酶的浓度变化幅度呈正比。

进一步的，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书记载的所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

将所述电极分别于含有不同浓度精子顶体酶标准样品中充分浸渍，并分别测试所述电极的阻抗，由此建立活性精子顶体酶浓度与电极阻抗的标准曲线；

以及，将所述电极分别于含有未知浓度精子顶体酶的待测样品中充分浸渍，并测试所述电极的阻抗，再依据所述标准曲线而获知所述待测试样中精子顶体酶的浓度；

其中，所述标准样品和待测样品均以所述缓冲液作为溶剂。

进一步的，所述精子顶体酶底物物理吸附或偶联于所述电极表面。

进一步的，所述电极包括金电极。

进一步的，所述精子顶体酶底物包括ZP3蛋白。

在一实施方案之中，所述基于电化学检测精子顶体酶活性的方法包括：

将具有洁净表面的金电极于胱氨二盐酸盐溶液中充分浸渍后取出、干燥，再浸入含戊二醛和精子顶体酶底物的缓冲溶液，之后晾干，获得精子顶体酶底物修饰的电极。

进一步的，所述缓冲液采用磷酸缓冲盐溶液。

藉由本发明的试剂盒及检测方法，能快速(3分钟左右)、可靠、灵敏(检测限可达0.001μM)且低成本的检测精子顶体酶的活性。

附图说明

图1是本发明一典型实施方案之中在金电极表面修饰精子顶体酶底物的原理图；

图2是本发明一典型实施方案之中以精子顶体酶底物修饰的金电极检测精子顶体酶的示意图；

图3是本发明一典型实施方案之中以精子顶体酶底物修饰的金电极检测精子顶体酶的检测结果曲线图。

具体实施方式

如前所述，鉴于现有技术的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，非常惊奇的发现，当以电极，特别是金电极作为任一种精子顶体酶底物的载体时，其阻抗大小会被周围环境的介电常数显著影响，特别是，当存在有活性精子顶体酶(即使是非常少量的、浓度在nM级别)时，载于金电极上的精子顶体酶底物被活性精子顶体酶底物水解时，金电极的阻抗会相应发生非常剧烈的变化，基于这一意外发现，本案发明人得以提出本发明的技术方案，即提供了一种基于电化学检测精子顶体酶活性的方法及试剂盒，并经大量实验验证了其效果。

进一步的，本发明的一个方面所提供的一种试剂盒包括：

精子顶体酶底物修饰的电极，

以及，适于使活性精子顶体酶与所述精子顶体酶底物与专一结合并水解的缓冲液。

本发明中的电极，其主要作用是将底物被酶水解过程的生物或者化学信号转变成电信号，应当能够高效稳定的固定精子顶体酶底物并且不影响精子顶体酶的活性，其他任何满足该条件的材料都可以用来作为电极。

在一实施方案之中，所述电极优选采用金电极，其具有较好的生物相容性好，作为电极材料能保证精子顶体酶底物以及精子顶体酶的活性。

在本发明的一实施方案之中，所述精子顶体酶底物可通过物理方式或化学反应修饰在金电极表面。

在一较为优选的方案之中，可先以选定官能团对金电极表面进行修饰，以在金电极表面提供大量的可以与精子顶体酶蛋白结合的位点，继而，精子顶体酶底物可以通过物理方式或与修饰在金电极表面的官能团反应(特别是偶联反应)，尤其优选通过后一种方式而固定在金电极的表面。

其中，用于将精子顶体酶底物修饰在金电极上的官能团可来源于任何合适的而不限于某些特定的偶联物质，本领域技术人员依据本说明应当能够很容易的理解，凡是能修饰在金电极表面并能与精子顶体酶底物作用的官能团都是适用的。

较为优选的，可以采用胱氨二盐酸盐，其优点在于：a、其具有良好的生物相容性和水溶性，不会破坏精子顶体酶和精子顶体酶地物的活性；b、可以通过金硫酸键(Au-S)和金电极结合，并且可以提供大量的氨基。

本发明中所采用的精子顶体酶底物可以是能与精子顶体酶反应(例如水解)的任何合适种类，例如ZP3蛋白等，其主要特点是能与精子顶体酶专一结合，任意一种精子顶体酶底物都可以用来修饰所述电极。

本发明中所采用的缓冲液可以是PBS缓冲液等，其pH值优选为7左右。

本发明的另一个方面提供的一种基于电化学检测精子顶体酶活性的方法主要包括：提供精子顶体酶底物修饰的电极；绘制精子顶体酶浓度与电极阻抗的标准曲线；对含有精子顶体酶的样品进行交流阻抗分析，得到其阻抗，根据所述标准曲线计算待测样品中的精子顶体酶的浓度，实现对精子顶体酶快速、灵敏、实时检测。

在本发明的一实施方案之中，该方法可以包含：

将所述电极分别于含有不同浓度精子顶体酶标准样品中充分浸渍，并分别测试所述电极的阻抗，由此建立活性精子顶体酶浓度与电极阻抗的标准曲线；

以及，将所述电极分别于含有未知浓度精子顶体酶的待测样品中充分浸渍，并测试所述电极的阻抗，再依据所述标准曲线而获知所述待测试样中精子顶体酶的浓度；

其中，所述标准样品和待测样品均以适于使精子顶体酶专一结合并水解所述精子顶体酶底物的缓冲液作为溶剂。

在一更为具体的实施方案之中，一种基于电化学检测精子顶体酶活性的方法具体可以包括：

a.制备功能化的金电极；

b.通过化学或者物理方法将精子顶体酶高效固定在金电极上；

c.精子顶体酶底物修饰的金电极检测顶体酶，包括：

建立工作曲线(标准曲线)，首先测定精子顶体酶底物修饰的金电极在磷酸缓冲盐溶液中的阻抗G0，然后配制一系列浓度的精子顶体酶的溶液，精子顶体酶的浓度记为Cn，将精子顶体酶底物修饰的金电极在不同浓度的精子顶体酶溶液中浸泡30min以上，以保证精子顶体酶充分水解金电极上的精子顶体酶底物，再测定金电极的阻抗Gn，电极交流阻抗差值记为ΔG＝Gn-G0，精子顶体酶的浓度Cn与ΔG成正比；

对于待测的精子顶体酶溶液中精子顶体酶的浓度，可以通过金电极的阻抗，然后对照工作曲线即可推算出其浓度。

又，在本发明的一典型实施案例中，本发明的技术方案可通过如下方式实现：

(1)金电极修饰(请参阅图1)：

将金电极用乙醇、二次蒸馏水超声清洗后备用；

将金电极浸泡在浓度约10-50mL的(30-50mM)胱氨二盐酸盐溶液中于50-80℃超声30-90min以上，之后在室温下晾干；

将金电极浸泡在含有约5wt％戊二醛和10-30mg/mL的精子顶体酶底物PBS(浓度0.01M，pH值约7.4)溶液中孵育1-3h以上之后将金电极晾干；

(2)精子顶体酶底物修饰的金电极检测顶体酶。首先建立一条工作曲线，测首先测定精子顶体酶底物修饰的金电极在磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH值约7.4)中的阻抗G0，然后配制一系列浓度的精子顶体酶的溶液，精子顶体酶的浓度记为Cn，将精子顶体酶底物修饰的金电极在不同浓度的精子顶体酶溶液中浸泡30min以上，以保证精子顶体酶充分水解金电极上的精子顶体酶底物(可参阅图2)，再测定金电极的阻抗Gn，电极交流阻抗差值记为ΔG＝Gn-G0,精子顶体酶的浓度Cn与ΔG成正比。对于待测的精子顶体酶溶液中精子顶体酶的浓度，可以通过金电极的阻抗，然后对照工作曲线即可推算出其浓度。

此外，适合利用本发明的试剂盒和检测方法进行检测的精子顶体酶应当不限于人类的精子，而还可以是一般性哺乳动物如猪、狗、马等动物的精子顶体酶。

以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：使用精子顶体酶底物修饰的金电极检测人类精子顶体酶

1)金电极修饰：将金电极用乙醇、二次蒸馏水超声清洗后备用，参阅图1，将金电极浸泡在30mM的胱氨二盐酸盐溶液中在50℃条件下超声30min，在室温下晾干，再将金电极浸泡在含有5％戊二醛和10mg/mL的精子顶体酶底物PBS(0.01M，pH7.4)溶液中孵育1h后，将金电极晾干；

2)精子顶体酶底物修饰的金电极检测顶体酶，其原理可参阅图2。首先建立一条工作曲线(标准曲线图)，测首先测定精子顶体酶底物修饰的金电极在磷酸缓冲盐溶液(PBSpH 7.4)中的阻抗G0(参阅图3中的A)，然后配制一系列浓度的精子顶体酶的溶液，精子顶体酶的浓度记为Cn(参阅图3中的B)，将精子顶体酶底物修饰的金电极在不同浓度的精子顶体酶溶液中浸泡30min，以保证精子顶体酶充分水解金电极上的精子顶体酶底物，再测定金电极的阻抗Gn，电极交流阻抗差值记为ΔG＝Gn-G0,精子顶体酶的浓度Cn与ΔG成正比。对于待测的精子顶体酶溶液中精子顶体酶的浓度，可以通过金电极的阻抗，然后对照工作曲线即可推算出其浓度。

3)参考所做标准曲线图，测定样品中精子顶体酶的浓度为0.5μM，检测范围为0.001μM～50μM。

实施例2：使用精子顶体酶底物修饰的金电极检测猪精子的精子顶体酶

1)金电极修饰：将金电极用乙醇、二次蒸馏水超声清洗后备用，将电极浸泡在10mL30mM的胱氨二盐酸盐溶液中在50℃条件下超声30min，在室温下晾干，再将金电极浸泡在含有5％戊二醛和10mg/mL的精子顶体酶底物PBS(0.01M，pH7.4)溶液中孵育1h后将金电极晾干；

2)精子顶体酶底物修饰的金电极检测顶体酶，其原理可参阅图2。首先建立一条工作曲线，测首先测定精子顶体酶底物修饰的金电极在磷酸缓冲盐溶液(PBS pH 7.4)中的阻抗G0，然后配制一系列浓度的精子顶体酶的溶液，精子顶体酶的浓度记为Cn，将精子顶体酶底物修饰的金电极(图2中的A)在不同浓度的精子顶体酶溶液中浸泡30min，以保证精子顶体酶充分水解金电极上的精子顶体酶底物(图2中的B)，再测定金电极的阻抗Gn，电极交流阻抗差值记为ΔG＝Gn-G0，精子顶体酶的浓度Cn与ΔG成正比。对于待测的精子顶体酶溶液中精子顶体酶的浓度，可以通过金电极的阻抗，然后对照工作曲线即可推算出其浓度。

3)参考标准曲线图，测定样品中精子顶体酶的浓度为1μM，检测范围为0.001μM～50μM。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

本领域技术人员应当理解，以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种精子顶体酶活性检测试剂盒，其特征在于包括：

精子顶体酶底物修饰的金电极，所述精子顶体酶底物物理吸附或偶联于所述金电极表面，

适于使精子顶体酶专一结合并水解所述精子顶体酶底物的磷酸盐缓冲液，以及

说明书，其中记载的所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

将所述金电极分别于含有不同浓度精子顶体酶标准样品中充分浸渍，并分别测试所述金电极的阻抗，探知所述金电极的阻抗变化幅度与所述标准样品中精子顶体酶的浓度变化幅度呈正比，由此建立活性精子顶体酶浓度与电极阻抗的标准曲线；

以及，将所述金电极分别于含有未知浓度精子顶体酶的待测样品中充分浸渍，并测试所述金电极的阻抗，再依据所述标准曲线而获知所述待测试样中精子顶体酶的浓度；

其中，所述标准样品和待测样品均以所述磷酸盐缓冲液作为溶剂。

2.根据权利要求1所述的精子顶体酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述精子顶体酶底物修饰的金电极的制备方法包括：以选定官能团修饰所述电极表面而形成复数个精子顶体酶底物的结合位点。

3.根据权利要求2所述的精子顶体酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述精子顶体酶底物修饰的金电极的制备方法包括：将具有洁净表面的金电极于胱氨二盐酸盐溶液中充分浸渍后取出、干燥，再浸入含戊二醛和精子顶体酶底物的缓冲溶液，之后晾干，获得精子顶体酶底物修饰的电极。